CN109696430A - 一种测定微囊藻毒素浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定微囊藻毒素浓度的方法，基于二硫化钼量子点可以与金纳米颗粒通过内滤效应发生作用，然而微囊藻毒素可以影响其适配体修饰的金纳米颗粒在高盐溶液中的聚散程度，实现了水环境中微囊藻毒素浓度的检测。本发明中使用的二硫化钼的上转换荧光能够有效地避免水环境中背景基质荧光的干扰，光学稳定性好，检测结果准确可靠，成本低廉，操作简单，绿色环保，检测专一性好，避免其它常见金属离子或阴离子对微囊藻毒素的测定的影响，抗干扰能力强，且结果灵敏可靠，检测限低，响应速度快，整个反应过程只需要20min，大大的提高了检测效率，稳定性好，能够实现实时在线的快速、专一性检测，可以用于实际水环境微囊藻毒素的简单快速检测。
Description
技术领域
本发明属于环保技术领域，具体涉及一种基于上转换荧光的二硫化钼量子点测定微囊藻毒素浓度的方法。
背景技术
微囊藻毒素（MCs）是有害蓝藻水华释放的一类环状七肽类肝毒素，具有强烈的致癌作用，是诱发肝癌、肠胃炎等疾病的重要环境因素。鉴于MCs的毒性及其危害，世界卫生组织（WHO）已将MCs列为饮用水中需控制的有害污染物。MCs与肝炎病毒、黄曲毒素共同被列为诱发我国南方原发性肝癌高发的三大环境危险因素，对此我国在2006年新颁布的《生活饮用水卫生标准》（GB5749—2006）中对MCs含量进行了规定，其含量不得高于1 μg/L。蓝藻水华引发的MCs次生污染及其对人体健康的危害已引起了人们的关注，已成为全球共同面临的一个环境科学问题。
目前，国内外针对水体中MCs的分析检测技术主要在实验室展开，包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用、酶联免疫法、放射性免疫、盐水虾法和生物探针等方法，具有检测灵敏度高、选择性好、特异性强等优点，但操作繁琐、检测时间较长、或是检测成本太高，不易于现场监测和实现突发性污染事件的监控，严重制约了对水体中MCs污染的及时动态了解。由于荧光方法操作简单、成本低、检测灵敏并且具有实时监测等优点备受研究者青睐，近几年在生物和环境监测方面也得到了广泛的运用。但是由于MCs本身缺少直接影响荧光基团发光的结构，故涉及利用荧光方法检测环境中MCs的工作报道就很少。已有的几种测定MCs的荧光方法往往面临复杂的抗体抗原修饰、成本比较高和易失活的抗体或是所采用的荧光信号分子荧光染料和半导体量子点具有高毒性和易光漂白、易受到自然水体中腐殖酸的背景荧光干扰等问题。如发明专利201610980678.X公开了一种可循环使用的用于检测微囊藻毒素的荧光传感器及其应用方法，利用目标物微囊藻毒素影响DNA修饰的石墨烯量子点“Y字型”聚集体的形成，从而通过荧光光谱的变化来进行检测，但该方法易受环境水样中腐殖酸的背景荧光干扰，导致检测结果的准确度较低。因此，针对水体中MCs污染现状(低浓度、高毒性、多种有机和无机污染物共存)，发展快速、高灵敏、特异性强、避免机制干扰、环境友好型和现场适用的MCs传感检测技术，对于监控水体中MCs污染控制措施的实施情况和保障饮水安全具有重大意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供了一种测定微囊藻毒素浓度的方法，解决现有检测方法具有操作复杂、成本高和选择性低的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下方案：一种测定微囊藻毒素浓度的方法，具体包括以下步骤：
1）二硫化钼量子点原液的制备：
取四水钼酸铵、N-乙酰基-L-半胱氨酸和硫脲加入水中并在冰浴下充分混合，得到混合溶液，再将所述混合溶液转移至水热反应釜中加热反应后，自然冷却，然后将其离心分离取上清液，即得到二硫化钼量子点原液；
所述四水钼酸铵、N-乙酰基-L-半胱氨酸和硫脲的质量比为3.16:1:0.39。
2）绘制标准曲线：
取微囊藻毒素核酸适配体溶液、硼氢化钠还原的金纳米溶液和可溶盐混合均匀得到混合溶液，再将一系列浓度梯度的微囊藻毒素标准溶液分别加入所述混合溶液中得到反应液，充分反应15min后，再加入步骤1）得到的二硫化钼量子点原液混合反应，然后用超纯水定容至相同体积，取定容后的溶液在激发波长862 nm，发射波长505 nm处测定荧光强度，以微囊藻毒素浓度为横坐标，相对荧光强度（I-I 0 ）/I 0 为纵坐标绘制标准曲线；其中，I 0 为微囊藻毒素浓度为零时，二硫化钼量子点的荧光强度，I为二硫化钼量子点与不同浓度微囊藻毒素共同存在时对应的荧光强度；
所述微囊藻毒素核酸适配体的5´端修饰了巯基；所述金纳米修饰了柠檬酸。
其中，反应液中微囊藻毒素的终浓度分别为0.00 μg L-1，0.05 μg L-1，0.10 μg L-1，0.30 μg L-1，0.70 μg L-1，1.00 μg L-1，3.00 μg L-1，5.00 μg L-1，7.00 μg L-1，10.00 μg L-1，13.00 μg L-1，15.00 μg L-1，20.00 μg L-1，23.00 μg L-1，25.00 μg L-1，30.00 μgL-1，33.00 μg L-1，35.00 μg L-1和40.00 μg L-1。
（3）待测样品检测：
将待测样品加入步骤2）所述的混合溶液中，并按照步骤2）所述方法检测待测样品的荧光强度；将所得荧光强度数值带入步骤2）获得的标准曲线中，再通过计算即得到待测样本中的微囊藻毒素浓度。
优选的，所述混合溶液中四水钼酸铵与水的质量体积比为1g：64.7 mL。
优选的，所述反应釜的反应温度为180~220℃，反应时间为3~6h。
优选的，所述离心转速为25000 ~ 18000 r/min，时间为8~15 min。
优选的，所述微囊藻毒素适配体核苷酸序列如下所示：
5’-SH-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC -3’。
优选的，所述微囊藻毒素核酸适配体溶液、硼氢化钠还原的金纳米溶液和微囊藻毒素标准溶液的摩尔比为1:0.1~0.2:0~0.04。
优选的，所述反应液中可溶盐的浓度为1~7 mM。该浓度盐溶液可以使Au NPs（金纳米颗粒）发生团聚，且效果较优。
优选的，所述可溶盐为NaCl、KCl、MgCl2、K2SO4或KNO3。
优选的，所述标准曲线回归方程为y =0.0246 + 0.0616x（0.05-1.00 μg L-1），R =0.9868；y =0.0909 + 0.0073x（1.00-40.00 μg L-1），R = 0.9954，其中，y为（I-I 0 ）/I 0 ，x为微囊藻毒素浓度，单位为μg L-1，R为相关系数。
优选的，所述方法测定微囊藻毒素的浓度范围为0.1~40 μg L-1。
本发明的检测原理：通过构建测定MCs的“turn-on”型荧光探针，具体的，微囊藻毒素核酸适配体的5´端修饰了巯基，当其与柠檬酸修饰的Au NPs（金纳米颗粒）混合后，微囊藻毒素核酸适配体通过Au-S键能自主装连接到Au NPs表面，在高盐度环境下该结构能避免Au NPs发生团聚，再将其与MoS2 QDs（二硫化钼量子点）混合便会发生有效的IEF（内滤作用），导致MoS2 QDs发生荧光猝灭现象；然而如果微囊藻毒素存在时，其会与微囊藻毒素核酸适配体发生特异性的结合并导致适配体的构象发生变化，阻止适配体自主装连接到AuNPs表面，因此，在高盐度环境下Au NPs就会发生团聚，进而不能与MoS2 QDs发生有效的IEF，从而能使MoS2 QDs的荧光强度恢复（图1）。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明基于二硫化钼量子点可以与金纳米颗粒通过内滤效应发生作用，然而微囊藻毒素可以影响其适配体修饰的金纳米颗粒在高盐溶液中的聚散程度，从而进一步影响了金纳米颗粒与二硫化钼量子点的内滤效应，表现出二硫化钼量子点的荧光恢复强度与微囊藻毒素的浓度呈线性关系，所以通过建立二硫化钼量子点的上转换荧光强度与微囊藻毒素含量的标准曲线，从而实现了对待测样品中微囊藻毒素的浓度的快速检测。本发明选用具有上转换荧光性能的二硫化钼量子点作为荧光信号，利用较低激发能量即长波激发得到短波的荧光发射，有利于避免环境水样中腐殖酸的背景荧光干扰，有效提高检测的准确度和灵敏度。
2、本发明在检测微囊藻毒素的过程中，样品不需要前处理，不需要昂贵的化学试剂和仪器，不涉及有毒有害化学试剂，大大的降低了成本，操作简单，绿色环保，检测专一性好，避免其它常见金属离子或阴离子对微囊藻毒素的测定的影响，抗干扰能力强，且结果灵敏可靠，检测限低，响应速度快，整个反应过程只需要20min，大大的提高了检测效率，稳定性好，能够实现实时在线的快速、专一性检测，可以用于实际水环境微囊藻毒素的简单快速检测。本发明在检测分析领域具有良好的应用前景和潜在应用价值。
3、本发明采用核酸适配体作为靶向识别分子，其能特异性结合Au NPs，从而影响金纳米颗粒的聚散状况；采用上转换荧光MoS2 QDs作为荧光信号分子，有效消除水体背景干扰提高检测灵敏度。本发明通过纳米材料和分析化学相结合，具有成本低、选择性高，能够灵敏地和高选择性地检测出水环境中微囊藻毒素的含量，有助于丰富和发展MCs的快速检测方法，有利于环境污染监测与控制。
附图说明
图1为本发明检测方法的原理示意图；
图2为不同浓度的微囊藻毒素与荧光强度变化图；
图3为水环境中常见阳离子或阴离子对测定微囊藻毒素的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例所用的微囊藻毒素核酸适配体的序列如下所示：
5’-SH-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC -3’
一、一种测定微囊藻毒素的方法
实施例1
1）具有上转换荧光的二硫化钼量子点原液的制备：
将四水钼酸铵、N-乙酰基-L-半胱氨酸和硫脲按照质量比3.16:1:0.39称取，并将其加入水中在冰浴下充分混合，得到混合溶液，其中，每克四水钼酸钠需加入64.7 mL水，再将所述混合溶液转移至水热反应釜中200℃下加热反应4h，自然冷却，然后将其使用转速为20000 r/min的离心机进行离心分离10min，取上清液，即得到二硫化钼量子点原液。
2）绘制标准曲线：
分别取浓度为2 μM微囊藻毒素核酸适配体溶液、浓度为14.4 nM硼氢化钠还原的金纳米溶液、浓度为100 mM NaCl溶液和不同浓度的微囊藻毒素标准溶液，并按照体积比1:20:6:1混合得到反应液，充分反应15min，其中，反应液中微囊藻毒素终浓度分别为0.00 μg L-1，0.05 μg L-1，0.10 μg L-1，0.30 μg L-1，0.70 μg L-1，1.00 μg L-1，3.00 μg L-1，5.00 μgL-1，7.00 μg L-1，10.00 μg L-1，13.00 μg L-1，15.00 μg L-1，20.00 μg L-1，23.00 μg L-1，25.00 μg L-1，30.00 μg L-1，33.00 μg L-1，35.00 μg L-1和40.00 μg L-1；然后向上述溶液中分别加入25 μL步骤1）制备的二硫化钼量子点原液充分反应，用超纯水定容至1 mL，取定容后的溶液在激发波长862 nm，发射波长505 nm处测定荧光强度，以微囊藻毒素浓度为横坐标，相对荧光强度（I-I 0 ）/I 0 为纵坐标绘制标准曲线；其中，I 0 为微囊藻毒素浓度为零时，二硫化钼量子点的荧光强度，I为二硫化钼量子点与不同浓度微囊藻毒素共同存在时对应的荧光强度，结果如图2所示。
从图中可以看出，二硫化钼量子点的荧光强度随着微囊藻毒素浓度的增加而降低，这说明二硫化钼量子点可用于微囊藻毒素的测定。
当微囊藻毒素的浓度为0.05~1.00 μg L-1范围内，标准曲线回归方程为y =0.0246 + 0.0616x，R = 0.9868；
当微囊藻毒素的浓度为1.00~40.00 μg L-1范围内，标准曲线回归方程为y = 0.0909+ 0.0073x，R = 0.9954；
其中，y为（I-I 0 ）/I 0 ，x为微囊藻毒素浓度，单位为μg L-1，R为相关系数。
3）待测样品的测定：
采取2 mL嘉陵江水样作为待测样品，经0.45 µm 醋酸纤维素滤膜过滤后，待用。取5 μL微囊藻毒素核酸适配体(浓度为2 μM)、100 μL金纳米 (浓度为14.4 nM)、30 μL NaCl (浓度为100 mM)和400 μL待测样品，混合反应15min后，取25 μL步骤1）制备的二硫化钼量子点原液加入上述混合溶液中反应，再用超纯水定容至1 mL，取定容后的溶液在激发波长862nm，发射波长505 nm处测定荧光强度，根据标准曲线回归方程为y =0.0246 + 0.0616x，即可得出待测样品中微囊藻毒素（MC-LR）的浓度，测定结果表明嘉陵江水样中不含有微囊藻毒素，与高效液相色谱法测定结果一样。因此本方法可以用于实际水样中MC-LR的测定。
实施例2
1）具有上转换荧光的二硫化钼量子点原液的制备：
将四水钼酸铵、N-乙酰基-L-半胱氨酸和硫脲按照质量比3.16:1:0.39称取，并将其加入水中在冰浴下充分混合，得到混合溶液，其中，每克四水钼酸钠需加入64.7 mL水，再将所述混合溶液转移至水热反应釜中220℃下加热反应4h，自然冷却，然后将其使用转速为20000 r/min的离心机进行离心分离10min，取上清液，即得到二硫化钼量子点原液。
2）绘制标准曲线：
取5 μL浓度为2 μM微囊藻毒素核酸适配体溶液、100 μL浓度为14.4 nM硼氢化钠还原的金纳米溶液和30μL浓度为100 mM KCl溶液混合得到混合溶液，再向上述混合溶液中分别加入5μL浓度梯度的微囊藻毒素标准溶液得到反应液，其中，反应液中微囊藻毒素终浓度分别为0.00 μg L-1，0.05 μg L-1，0.10 μg L-1，0.30 μg L-1，0.70 μg L-1，1.00 μg L-1，3.00μg L-1，5.00 μg L-1，7.00 μg L-1，10.00 μg L-1，13.00 μg L-1，15.00 μg L-1，20.00 μg L-1，23.00 μg L-1，25.00 μg L-1，30.00 μg L-1，33.00 μg L-1，35.00 μg L-1和40.00 μg L-1，混合反应15min后，然后分别加入25 μL步骤1）制备的二硫化钼量子点原液充分反应，用超纯水定容至1 mL，取定容后的溶液在激发波长862 nm，发射波长505 nm处测定荧光强度，以微囊藻毒素浓度为横坐标，相对荧光强度（I-I 0 ）/I 0 为纵坐标绘制标准曲线；其中，I 0 为微囊藻毒素浓度为零时，二硫化钼量子点的荧光强度，I为二硫化钼量子点与不同浓度微囊藻毒素共同存在时对应的荧光强度。
当微囊藻毒素的浓度为0.05~1.00 μg L-1范围内，标准曲线回归方程为y =0.0246 + 0.0616x，R = 0.9868；
当微囊藻毒素的浓度为1.00~40.00 μg L-1范围内，标准曲线回归方程为y = 0.0909+ 0.0073x，R = 0.9954；
其中，y为（I-I 0 ）/I 0 ，x为微囊藻毒素浓度，单位为μg L-1，R为相关系数。
3）待测样品的测定：
采取2 mL超纯水并加入微囊藻毒素，得到浓度为1.00 μg L-1的MC-LR作为待测样品，经0.45 µm 醋酸纤维素滤膜过滤后，待用。取5 μL 微囊藻毒素核酸适配体（MC-LR适配体）(浓度为2 μM)、100 μL金纳米 (浓度为14.4 nM)、30 μL KCl (浓度为100 mM)和400 μL待测样品，混合反应15min后，取25 μL步骤1）制备的二硫化钼量子点原液加入上述混合溶液中反应，再用超纯水定容至1 mL，取定容后的溶液在激发波长862 nm，发射波长505 nm处测定荧光强度，根据标准曲线回归方程为y =0.0909 + 0.0073x，即可得出待测样品中微囊藻毒素（MC-LR）的浓度为1.08±0.10 μg L-1，与样品中加入实际值接近。说明本方法可以用于实际水样中MC-LR的测定。
二、其它离子对水环境中微囊藻毒素测定的影响
（1）将四水钼酸铵、N-乙酰基-L-半胱氨酸和硫脲按照质量比3.16:1:0.39称取，并将其加入水中在冰浴下充分混合，得到混合溶液，其中，每克四水钼酸钠需加入64.7 mL水，再将所述混合溶液转移至水热反应釜中200℃下加热反应4h，自然冷却，然后将其使用转速为20000 r/min的离心机进行离心分离10min，取上清液，即得到二硫化钼量子点原液。
（2）取5 μL MC-LR微囊藻毒素核酸适配体溶液 (2 μM)、100 μL硼氢化钠还原的金纳米溶液 (14.4 nM)、30 μL NaCl溶液 (100 mM)和30 μL MC-LR溶液 (1 mg L-1)混合得到混合溶液, 再分别向上述混合溶液中加入不同的阴阳离子和腐殖酸，终浓度分别为23.00mg L-1 Na+、39.00 mg L-1 K+、4.00 mg L-1 Ca2+、2.40 mg L-1 Mg2+、6.35 mg L-1 Cu2+、0.56mg L-1 Fe3+、6.50 mg L-1 Zn2+、1.35 mg L-1 Al3+、1.00 mg L-1 Hg2+、0.52 mg L-1 Cr3+、5.60mg L-1 Cd2+、1.04 mg L-1 Pb2+、0.30 mg L-1 Ni2+、0.30 mg L-1 Co2+；6.00 mg L-1尿素、0.01mg L-1腐殖酸（HA）以及31.64 mg L-1 PO4 3-、35.00 mg L-1 Cl-、9.60 mg L-1 SO4 2-和12.40 mgL-1 NO3 -（没有特别说明，都表示最终浓度）。然后分别取部分溶液加入荧光比色皿中，混合反应15min后，再分别将25 μL步骤1）制备的二硫化钼量子点原液加入比色管中，用超纯水定容至1 mL，在激发波长862 nm，发射波长505 nm处测定荧光强度，如图3所示。
从图中可以看出，其它金属离子、阴离子或是腐殖酸对二硫化钼量子点的荧光强度的影响较小，几乎可以忽略，而这说明了本方法对检测微囊藻毒素具有很好的选择性和特异性，水环境中其它常见的金属离子或阴离子对微囊藻毒素的测定不会产生干扰。可见，本发明适用于实际水环境微囊藻毒素的含量测定。
本方法不局限于列举的微囊藻毒素MC-LR，同样适用于微囊藻毒素MC-RR和MC-YR及其与之对应的适配体。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管申请人参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围的，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种测定微囊藻毒素浓度的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）二硫化钼量子点原液的制备：
取四水钼酸铵、N-乙酰基-L-半胱氨酸和硫脲加入水中并在冰浴下充分混合，得到混合溶液，再将所述混合溶液转移至水热反应釜中加热反应后，自然冷却，然后将其离心分离取上清液，即得到二硫化钼量子点原液；
所述四水钼酸铵、N-乙酰基-L-半胱氨酸和硫脲的质量比为3.16:1:0.39；
2）绘制标准曲线：
取微囊藻毒素核酸适配体溶液、硼氢化钠还原的金纳米溶液和可溶盐，混合均匀得到混合溶液，再将一系列浓度梯度的微囊藻毒素标准溶液分别加入所述混合溶液中得到反应液，充分反应15min后，再加入步骤1）得到的二硫化钼量子点原液混合反应，然后用超纯水定容至相同体积，取定容后的溶液在激发波长862 nm，发射波长505 nm处测定荧光强度，以微囊藻毒素浓度为横坐标，相对荧光强度（I-I 0 ）/I 0 为纵坐标绘制标准曲线；其中，I 0 为微囊藻毒素浓度为零时，二硫化钼量子点的荧光强度，I为二硫化钼量子点与不同浓度微囊藻毒素共同存在时对应的荧光强度；
所述微囊藻毒素核酸适配体的5´端修饰了巯基；所述金纳米修饰了柠檬酸；
3）待测样品检测：
将待测样品加入步骤2）所述的混合溶液中，并按照步骤2）所述方法检测待测样品的荧光强度；将所得荧光强度数值带入步骤2）获得的标准曲线中，再通过计算即得到待测样本中的微囊藻毒素浓度。
2.根据权利要求1所述测定微囊藻毒素浓度的方法，其特征在于，所述混合溶液中四水钼酸铵与水的质量体积比为1g：64.7 mL。
3.根据权利要求1所述测定微囊藻毒素浓度的方法，其特征在于，所述反应釜的反应温度为180~220℃，反应时间为3~6h。
4.根据权利要求1所述测定微囊藻毒素浓度的方法，其特征在于，所述离心转速为18000 ~ 25000 r/min，时间为8~15 min。
5.根据权利要求1所述测定微囊藻毒素浓度的方法，其特征在于，所述微囊藻毒素适配体核苷酸序列如下所示：
5’-SH-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC -3’。
6.根据权利要求1所述测定微囊藻毒素浓度的方法，其特征在于，所述微囊藻毒素核酸适配体溶液、硼氢化钠还原的金纳米溶液和微囊藻毒素标准溶液的摩尔比为1:0.1~0.2:0~0.04。
7.根据权利要求1所述测定微囊藻毒素浓度的方法，其特征在于，所述反应液中可溶盐的浓度为1~7 mM。
8.根据权利要求1所述测定微囊藻毒素浓度的方法，其特征在于，所述可溶盐为NaCl、KCl、MgCl2、K2SO4或KNO3。
9.根据权利要求1所述测定微囊藻毒素浓度的方法，其特征在于，所述标准曲线回归方程为y =0.0246 + 0.0616x（0.05-1.00 μg L-1），R = 0.9868；y =0.0909 + 0.0073x（1.00-40.00 μg L-1），R = 0.9954，其中，y为（I-I 0 ）/I 0 ，x为微囊藻毒素浓度，单位为μg L-1，R为相关系数。
10.根据权利要求1所述测定微囊藻毒素浓度的方法，其特征在于，所述方法测定微囊藻毒素的浓度范围为0.1~40 μg L-1。
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