CN110672695A - 基于随机g4串联体的智能逻辑门构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于随机G4串联体的智能逻辑门构建及应用，具体步骤如下：取DNA溶液滴涂于Au表面，在4℃冰箱孵育过夜；将蒸馏水、5×TdT缓冲液、dNTP(dTTP+dGTP或者dATP+dGTP)、TdT，混合均匀，滴于DNA/Au表面；聚合反应后，再加入缓冲液(Tris‑HCl，KCl，pH 7.4)，向上述电极上滴加hemin，室温放置0.3～1h。以上每一步制备电极后，用蒸馏水缓缓冲洗电极以除去杂质。成功制备传感器，一方面，实现了TdT活性检测和H2O2浓度检测，另一方面，基于TdT、H2O2、dATP、dTTP和dGTP的五种逻辑门(YES、OR、AND)成功设计，在TdT和H2O2相关的生物分析以及疾病诊断方面具有广阔的应用前景。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学传感检测方法，尤其是涉及基于随机G4串联体的智能逻辑门构建及应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
在现代信息化社会中，计算机对于许多人来说是一种几乎不可或缺的沟通，共享信息和处理数据的工具。这些操作需要计算，而逻辑运算则是实现计算的基础和焦点。为此目的，规定以“位”的形式，即利用二进制数字对信息进行编码而实现逻辑运算。这意味着一个位可以由两个不同的值的其中之一表示，即0或1。由于与0和1相关的模拟值是连续的，因此定义了阈值极限。在正逻辑约定中，高于阈值的任何连续值被认为是1。负逻辑约定以相反的方式定义，即低于阈值的任何连续值被认为是0。在常规的基于硅电路的计算机中，电信号用作输入和输出。分子逻辑计算不仅为生物计算机的发展奠定了扎实的基础，其在生物传感领域也发挥了一定的作用，尤其是基于DNA的传感器和DNA计算机相结合将具有更大的潜力。就像Leonard Adleman在1994年演讲中说道，一定的计算问题可以通过巧妙的使用DNA具有的分子识别力来解决。后来，研究者们发现DNA处理信息的潜力可以应用于简单的逻辑运算。这种装置的计算能力远比那种经典的DNA计算要简单，在很多情况下，可以视为具有内在信息处理能力的生物传感器。与传统的传感器相比，它能报告多种分析物的同时存在(也就是分子的AND逻辑门)或者是进行复杂的逻辑分析。如果将分子器件和分子计算用于重大疾病的影响因子的智能实时检测，将会给医学领域带来一场新的革命。
一般来说鸟嘌呤四链体(G4)包含三个或者四个相邻的鸟嘌呤(G平面)。鸟嘌呤四链体结构不是通过最常见的Watson-Crick碱基互补配对构成，其结构单元是通过四个鸟嘌呤之间的氢键两两连接，形成一个方形的平面结构，再通过这些平面之间的堆叠作用，形成四链体结构。这些结构的形成强烈依赖单价阳离子，比如钾离子或者钠离子。因而这种结构在生理条件下也是稳定的。G4这种结构最开始被认为是一个新奇的结构，但是后来的发现表明G4结构涉及到一系列生命过程的关键功能。这些发现导致G4结构一度成为核酸研究的热门方向，被广泛应用于各种生物分析中。
研究表明，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和过氧化氢(H2O2)在人体身体中含量异常将会导致一些重大疾病的发生发展，因此构建一种简单、快速、灵敏的逻辑运算器件具有十分重要的意义。本发明提出了一种通过TdT扩增聚合制备随机富含G的DNA序列的简便方法，并证明这种随机富含G的DNA能够形成G-四链体。巯基修饰的DNA探针通过金-硫键组装在金电极上，利用TdT催化dTTP和dGTP随机引入DNA末端，随后将该电极表面浸入到含有钾离子的缓冲溶液中，用钾离子诱导形成游离的G-四链体单体溶液使之在电极上形成G-四链体结构。G-四链体结构通过与hemin的结合，可以形成具有类辣根过氧化物酶催化性能的DNA酶。给定一个外加电压，H2O2在3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)存在下发生化学反应，产生可以用于测定的还原电流。通过实验我们发现：①基于TdT所形成的G4对H2O2具有催化活性，并发现TMB的加入极大地增加了电化学响应；②在dATP或是dTTP与dGTP存在的情况下，均可产生较大的电化学信号，基于此我们可以发展多种智能逻辑运算。目前，国内外尚未发现基于随机G4串联体的智能逻辑门构建及应用的相关报导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于随机G4串联体的智能逻辑门构建及应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于随机G4串联体的智能逻辑门构建及应用，具体步骤如下：
(1)DNA预处理：DNA溶液(0.3～1.1μM，30～150μL)+TCEP(1～70mM，0.5～10μL)混合均匀，冷冻备用。
(2)电极1：金电极使用前用直径为0.3μm的Al2O3粉末进行打磨，利用超纯水通过超声清洗3次，之后置于氮气流中干燥，再将其浸泡于H2SO4(0.2～1.5M)溶液中，在-0.3V～+1.2V范围内进行循环伏安扫描5～20min，最后再经超纯水清洗后氮气吹干备用。
(3)电极2：取DNA溶液(0.08～1.2μM，2～8μL)，80～95℃下加热3～8min，然后逐渐冷却至室温，滴涂于Au表面，在4℃冰箱孵育过夜，捕获探针DNA通过末端标记的巯基与金电极表面自发形成Au-S共价键结合而固定于金电极表面。修饰了捕获探针DNA的金电极，用蒸馏水缓缓冲洗电极，采用0.8～1.5mM巯基己醇(MCH)处理16～45min，通过MCH与金表面的Au-S共价结合而置换电极表面非Au-S键固定的捕获探针。蒸馏水缓缓冲洗。
(4)电极3：将0.3～2.7μL蒸馏水，0.3～2μL 5×TdT缓冲液(5*TdT buffer)，dNTP(0.1～1μL dTTP+0.15～1.5μL dGTP，2～20mM)，TdT(0.2～3μL，1～1000U/mL)，混合均匀，滴于DNA/Au表面，在20～40℃下放置1h后，用蒸馏水缓缓冲洗电极。聚合反应后，再加入2～7μL缓冲液(1～20mM Tris-HCl，5～100mM KCl，pH 7.4)，室温放置0.2～1h后，蒸馏水缓缓冲洗电极。向上述电极上滴加hemin(1μM，2.5μL)，室温放置0.3～1h。
(5)电化学检测：修饰电极于PBS溶液(含2mM TMB，2mM H2O2)中用循环伏安法扫描检测电极对该溶液的响应。
为了实现TdT和H2O2的智能检测，在步骤(4)中改变TdT浓度，得到一系列不同的TdT电化学传感器，或在步骤(5)中改变H2O2浓度得到一系列不同的H2O2电化学传感器，其它条件及步骤同(1)～(5)；为了构建智能逻辑门，在步骤(4)中将dTTP替换为dATP构建传感器，其它条件及步骤同(1)～(5)。
发明原理：本发明提出了一种通过TdT扩增聚合制备随机富含G的DNA序列的简便方法，并证明这种随机富含G的DNA能够形成G-四链体。巯基修饰的DNA探针通过金-硫键组装在金电极上，利用TdT催化dTTP或dATP和dGTP随机引入DNA末端，随后将该电极表面浸入到含有钾离子的缓冲溶液中，用钾离子诱导形成游离的G-四链体单体溶液使之在电极上形成G-四链体结构。G-四链体结构通过与hemin的结合，可以形成具有类辣根过氧化物酶催化性能的DNA酶。给定一个外加电压，H2O2在3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)存在下发生化学反应，产生可以用于测定的还原电流。通过实验我们发现：①基于TdT所形成的G4对H2O2具有催化活性，并发现TMB的加入极大地增加了电化学响应；②在dATP或是dTTP与dGTP存在的情况下，均可产生较大的电化学信号，基于此我们可以发展多种智能逻辑运算。显然，在浓度一定范围内，目标物浓度越大，电流响应越明显。实验结果表明，电流的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测，基于此我们也够了一系列智能逻辑门。其优点在于：
(1)高灵敏度。实验得出传感器的电流响应对过氧化氢浓度的线性相关方程为y＝＝-7.26x-3.10，R2＝0.9941，检测限为0.3μM，由此说明传感器对过氧化氢可实现高灵敏度检测；传感器的电流响应对TdT浓度的对数线性相关方程为y＝-13.65x-42.79，R2＝0.9991，检测限为0.27U/L，说明传感器对TdT酶活性实现高灵敏度检测。
(2)高特异性。其他常见的物质对本检测体系均无干扰。
(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
(4)智能逻辑门。通过更换不同的“输入”所得到的“输出”，实现了YES、OR和AND智能逻辑门构建。
(5)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对过氧化氢和脱氧核苷酸末端转移酶的高灵敏检测。
综上所述，本发明制备基于随机G4串联体的智能逻辑门构建及应用，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度过氧化氢和TdT活性的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的对TMB+H2O2或H2O2的电化学响应图；
图2为本发明传感器的在dTTP+dGTP或dTTP+dGTP的情况下的电化学响应图；
图3为本发明传感器的电化学响应对TdT活性对数的校准曲线图；
图4为本发明传感器的电化学响应对H2O2浓度的校准曲线图；
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1传感器的制备
(1)DNA预处理：DNA溶液(0.5μM，50μL)+TCEP(30mM，1μL)混合均匀，冷冻备用。
(2)电极1：金电极使用前用直径为0.3μm的Al2O3粉末进行打磨，利用超纯水通过超声清洗3次，之后置于氮气流中干燥，再将其浸泡于H2SO4(0.5M)溶液中，在-0.3V～+1.2V范围内进行循环伏安扫描10min，最后再经超纯水清洗后氮气吹干备用。
(3)电极2：取DNA溶液(0.1μM，5μL)，95℃下加热5min，然后逐渐冷却至室温，滴涂于Au表面，在4℃冰箱孵育过夜，捕获探针DNA通过末端标记的巯基与金电极表面自发形成Au-S共价键结合而固定于金电极表面。修饰了捕获探针DNA的金电极，用蒸馏水缓缓冲洗电极，采用1.0mM巯基己醇(MCH)处理30min，通过MCH与金表面的Au-S共价结合而置换电极表面非Au-S键固定的捕获探针。蒸馏水缓缓冲洗。
(4)电极3：将2μL蒸馏水，1μL 5×TdT缓冲液(5*TdT buffer)，dNTP(0.4μL dTTP+0.6μL dGTP，10mM)，TdT(1μL，5U/mL)，混合均匀，滴于DNA/Au表面，在37℃下放置1h后，用蒸馏水缓缓冲洗电极。聚合反应后，再加入2.5μL缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，pH 7.4)，室温放置0.5h后，蒸馏水缓缓冲洗电极。向上述电极上滴加hemin(1μM，2.5μL)，室温放置0.5h。
(5)电化学检测：修饰电极于PBS溶液(含2mM TMB，2mM H2O2)中用循环伏安法扫描检测电极对该溶液的响应。
如图1所示，修饰电极于PBS溶液(含2mM TMB，2m MH2O2)或PBS溶液(含2mM H2O2)中用循环伏安法扫描检测电极对该溶液的电化学响应，结果说明TMB的加入极大地改善了电化学信号，具有信号放大的作用。
如图2所示，在dTTP+dGTP或dATP+dGTP的情况下制作电化学传感器，在PBS溶液(含2mM TMB，2mM H2O2)中用循环伏安法扫描检测电极对该溶液的电化学响应，结果表明，这两种情况下，电化学信号差异小于20％，都适合用来构建电化学传感器。
实施例2 TdT活性检测
利用循环伏安法，设置电位范围为-1.1～0V，扫速为50mV/s，检测传感器在浓度为100.0mM、pH＝7.0的PBS缓冲液中对TdT的电化学响应，TdT浓度的范围为0～2U/mL(0、0.001、0.002、0.004、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8、1、1.5、2U/mL)。实验结果说明，如图3所示，说明随着TdT浓度的增大，传感器对TdT的电化学响应越明显；传感器对TdT的电流响应对浓度的线性相关方程为y＝-13.65x-42.79，R2＝0.9991，线性范围为0.001～1U/mL，根据S/N计算得知，检测限为0.27U/L。说明传感器对TdT可实现高灵敏度检测。
实施例3过氧化氢检测
利用循环伏安法，设置电位范围为-1.1～0V，扫速为50mV/s，检测传感器在浓度为100.0mM、pH＝7.0的PBS缓冲液中对H2O2的电化学响应，H2O2浓度的范围为0～8mM(0、0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8mM)。试验结果说明，如图4所示，说明随着过氧化氢浓度的增大，传感器对过氧化氢的电化学响应越明显；传感器对过氧化氢的电流响应对浓度的线性相关方程为y＝-7.26x-3.10，R2＝0.9941，线性范围为0.001～6mM，根据S/N计算得知，检测限为0.3μM。说明传感器对过氧化氢可实现高灵敏度检测。
实施例4逻辑门构建
如表1所示，YES逻辑门中，对于“输入”，“1”表示TdT加入，“0”表示TdT未加入。对于“输出”“1”表示信号产生，“0”表示信号未产生，H2O2同TdT设计。
表1
| 输入(TdT) | 输出 | 输入(H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>) | 输出 |
| 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1 | 1 | 1 | 1 |
如表2所示，OR逻辑门中，对于“输入”，“1”表示dTTP或dATP加入，“0”表示dTTP或dATP未加入。对于“输出”“1”表示信号产生，“0”表示信号未产生。
表2
| 输入(dTTP) | 输入(dATP) | 输出 |
| 0 | 0 | 0 |
| 1 | 0 | 1 |
| 0 | 1 | 1 |
| 1 | 1 | 1 |
如表3所示，AND逻辑门中，对于“输入”，“1”表示dTTP或dGTP加入，“0”表示dTTP或dGTP未加入。对于“输出”“1”表示信号产生，“0”表示信号未产生，dATP+dGTP体系同dTTP+dGTP体系设计
表3
| 输入(dTTP) | 输入(dGTP) | 输出 | 输入(dATP) | 输入(dGTP) | 输出 |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
表1、表2、表3结果表明，五种逻辑门成功设计，在TdT和H2O2相关的生物分析以及疾病诊断方面具有广阔的应用前景。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.基于随机G4串联体的智能逻辑门构建及应用，其特征在于，机理如下：本发明提出了一种通过TdT扩增聚合制备随机富含G的DNA序列的简便方法，并证明这种随机富含G的DNA能够形成G-四链体。巯基修饰的DNA探针通过金-硫键组装在金电极上，利用TdT催化dTTP或dATP和dGTP随机引入DNA末端，随后将该电极表面浸入到含有钾离子的缓冲溶液中，用钾离子诱导形成游离的G-四链体单体溶液使之在电极上形成G-四链体结构。G-四链体结构通过与hemin的结合，可以形成具有类辣根过氧化物酶催化性能的DNA酶。给定一个外加电压，H2O2在3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)存在下发生化学反应，产生可以用于测定的还原电流。通过实验我们发现：①基于TdT所形成的G4对H2O2具有催化活性，并发现TMB的加入极大地增加了电化学响应；②在dATP或是dTTP与dGTP存在的情况下，均可产生较大的电化学信号，基于此我们可以发展多种智能逻辑运算，实现对目标物的检测。
2.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于，基于TdT所形成的G4对H2O2具有催化活性，并发现TMB的加入极大地增加了电化学响应。
3.根据权利要求1～2所述的电化学方法，其特征在于，在dATP或是dTTP与dGTP存在的情况下，均可产生较大的电化学信号。
4.根据权利要求1～3所述的电化学方法，其特征在于，可以检测到低浓度的TdT，检测限为0.27U/L。
5.根据权利要求1～3所述的电化学方法，其特征在于，可以检测到低浓度的过氧化氢，检测限为0.3μM。
6.根据权利要求1～5所述的电化学方法，其特征在于，基于TdT、H2O2、dATP、dTTP和dGTP的五种逻辑门(YES、OR、AND)成功设计，在TdT和H2O2相关的生物分析以及疾病诊断方面具有广阔的应用前景。
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