CN104764774B

CN104764774B - 一种检测大肠杆菌的生物传感器及其制备方法

Info

Publication number: CN104764774B
Application number: CN201510031787.2A
Authority: CN
Inventors: 王玉; 郭玉娜; 黄加栋; 刘素; 徐伟; 王虹智; 许颖; 邱婷婷; 崔洁
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2015-01-22
Publication date: 2018-01-30
Anticipated expiration: 2035-01-22
Also published as: CN104764774A

Abstract

本发明公开了一种检测大肠杆菌的生物传感器，从内到外依次为金电极、戊二醛‑大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层，同时公开了生物传感器的制备方法，本发明提供的生物传感器的电极性能稳定，重复性好，检出限为1.6×10cfu mL^‑1。

Description

一种检测大肠杆菌的生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及传感器技术领域，特别涉及一种检测大肠杆菌的电化学传感器，还涉及一种检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法。

背景技术

近年来,致病性大肠杆菌对生产发展的危害越来越严重。分析原因主要有以下几点:单纯由致病性大肠杆菌所引起的原发病较少,并发、继发的形式增多,间接增加了大肠杆菌病的危害。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。

如果食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求，将会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，使食品失去食用价值。消费者食用微生物超标严重的食品，很容易患痢疾等肠道疾病，可能引起呕吐、腹泻等症状，危害人体健康安全。而大肠菌群超标，也同样会引起腹泻、肠胃感染等。

检测大肠杆菌的传统方法主要有三种，分别是多管发酵法、滤膜法和平板计数法，这些方法有仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点。

滚环复制放大技术是借鉴自然界中环状DNA分子滚环式的扩增机制而发展起来的一种核酸扩增技术，这种扩增形式能在同温下对单链环状DNA进行相对无限单链扩增，不需要特定的热循环仪，且每条链使用1-2个引物就能实现指数扩增，并具有快速、特异、灵敏等特点，因而近年来在一些基因检测技术的研究中被广泛采用。由于滚环复制的模板必须是封闭的单链环状DNA，因而许多研究者将这一特性用于单核苷酸多态性检测、基因表达图谱和病毒基因检测等的研究中，还有一些实验直接将滚环的无限复制作为一种信号放大系统，并在此基础上开发出许多相关的技术。

发明内容

针对现有检测方法中仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺陷，本发明提供了一种检测大肠杆菌的电化学传感器。

本发明还提供了检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种检测大肠杆菌的电化学传感器，从内到外依次为金电极、戊二醛-大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层。

所述的戊二醛-大肠杆菌抗体层厚度为120±10nm，牛血清白蛋白封闭层厚度为100±10nm，RCA产物层厚度为55±10nm。

所述的电化学传感器，是通过如下步骤制备得到的：

1．制备环状挂锁探针：

（1）取3μL挂锁探针9ｕＬ连接探针于已灭菌的１００ｕＬ离心管内，加入６ｕｌＴ４DNA连接酶缓冲溶液，50μL灭菌水，震荡均匀，生料带封闭；

（2）将此离心管放入95℃恒温10min,37℃恒温2h，使之杂交完全；

（3）加入2μLT4DNA连接酶，封口膜封口，16℃恒温2h,是挂锁探针连接完全后，65℃恒温20min使T4DNA连接酶变性；

（4）加入1μl核酸外切酶Ⅰ在37℃保温1h将连接探针水解后80℃恒温20min使核酸外切酶Ⅰ变性；

2．金电极的预处理；

3. 配制2%的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干燥，用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的抗体，得戊二醛-大肠杆菌抗体层；

4.待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白封闭未特异性结合的位点，得牛血清白蛋白封闭层；

5.电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，并用PBS缓冲液冲,大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上得大肠杆菌层；

6. PBS冲洗，在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的强识别能力，被修饰在电极表面，再在其上修饰步骤1所得环状挂锁探针，后加入到含1μldNTP、1μlphi29DNA聚合酶、1μlBSA的溶液中37℃孵育2h完成RCA反应得RCA产物层。

所述的电化学传感器，优选RCA产物制备中挂锁探针和适配体-引物物质的量比为3:1。

所述的牛血清白蛋白的浓度为0.1%。

检测时采用三电极系统，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，修饰电极为工作电极，以含对苯二酚和双氧水的PBS为工作底液采用差分脉冲伏安法检测，电位设置为0到-0.6 V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06 S，进行检测。

本发明的工作原理：

本发明试用到包括以下的DNA探针：

1、挂锁探针5’-p- TAGC ACGGACATTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTT GTAACTGTTTCCTTC -3’（ SEQ ID NO：1）；

2、连接探针5’- TGT CCG TGC TAG AAG GAA ACA GTT AC-3’ （ SEQ ID NO：2）；

3、适配体-引物：5’- GCAATGGTACGGTACTTCCACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGC TTGCTGGCGCATCCACTGAGCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAATTTTTTTTTTTGCTAGAAGGAAACAGTTAC-3’ （ SEQ ID NO：3）；

4、适配体-血红素适配体GCAATGGTACGGTACTTCCACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGC TTGCTGGCGCATCCACTGAGCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAATTTTTTTTTTGG GTA GGG CGG GTTGGG（ SEQ ID NO：4）；

实验中首先设计了挂锁探针和连接探针，挂锁探针5’磷酸化，以便和3’端结合成环，挂锁探针上含有可与连接探针互补配对的部分，即斜体部分，这是为了让连接探针拉近挂锁探针的3’端和5’端以便成环，另外我们又对挂锁探针进行另一设计，即含有两段血红素适配体的互补序列的单链DNA，即挂锁探针的加粗部分，为避免其相互影响，我们在两段血红素适配体间插入10个T，为避免斜体部分即与连接探针互补的部分对血红素适配体互补序列的影响，我们也引入无关序列T。我们还设计了适配体-引物探针，适配体即与大肠杆菌特异性结合的DNA单链，引物是与成环后的环状探针互补配对结合的部分，RCA反应也是基于此引物进行的。为避免适配体和引物的相互影响，我们在他们之间引入无关序列T。我们还设计了适配体-血红素适配体探针主要是为了和RCA实验做对比。

如附图1A所示，具体的实验是这样进行的，将连接探针与挂锁探针混合，互补配对完全后加入T4 DNA连接酶，在酶和ATP的存在下将挂锁探针3’端和5’端间的这个切口连接起来形成锁式拓扑环（环状探针）。加入核酸外切酶Ⅰ,核酸外切酶Ⅰ可以水解单链，加入后可将连接探针水解而不影响环状探针，将环状探针放置备用。

构建传感器时将抗体交联到电极表面后，由BSA封闭未特异性结合的探针，如附图1B所示，此时将电极在大肠杆菌菌液中孵育，由于大肠杆菌与抗体的特异性结合而被捕获到电极上，修饰预先设计适配体-引物链，适配体由于和大肠杆菌的特异性结合而被固定到电极上，修饰环状探针，环状探针的双下划线部分与适配体-引物的双下划线部分是可以互补配对的，可与之结合二修饰在电极上，在phi29 DNA 聚合酶缓冲液、phi29 DNA 聚合酶、dNTP的作用下以适配体-引物探针以环状探针环为模板进行滚环复制，形成多个与该环序列互补的高分子量DNA，即RCA产物，该RCA产物的含丰富血红素适配体，血红素适配体在血红素和钾离子的存在下形成G-四连体结构，该结构的DNA具有类似辣根过氧化物酶（HRP）的功能，即催化溶液中的双氧水（H₂O₂）发生还原反应，检测H₂O₂的电化学还原信号可对大肠杆菌进行定量。若大肠杆菌的浓度不同，那么捕获的适配体-引物DNA链的量也不同，RCA产物也不同，最后根据酶催化底液反应的量的不同，产生的不同的电化学信号可以定量出大肠杆菌的浓度。即被检测物越多，固定的DNA酶的量也越多，催化产生的电信号也越强。

本发明采用的滚环复制放大（RCA）这一反应，在短时间内形成了大量的血红素的适配体，在血红素的存在下，该适配体表现出类辣根过氧化氢酶（HRP）的功能，即能催化HQ与H₂O₂的氧化反应，通过这一氧化反应表征电化学信号。文章中对RCA的应用是一大亮点，使检测更为灵敏同时对挂锁探针完美设计，使得制备的传感器灵敏度高，检测速度快；检测E.coli的方法，操作简单、快速、灵敏，便于现场检测。

本发明的有益效果：

1、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

2、设计挂锁探针，使用RCA技术使反应中产生大量的具有类HRP酶功能的DNA序列，产生较高的酶功能。

3、电极性能稳定，重复性好，适用于食品安全中大肠杆菌的检测和生物传感器产业化的实际应用，实施例中检验了其稳定性；

4、以金电极为固定载体固定抗体和RCA产物的夹心型电化学传感系统，可实现对食品中大肠杆菌的快速在线检测，发现该传感器的检测范围为1.8×10-1.8×10⁷cfu mL^-1检出限为1.6×10cfu mL^-1。

附图说明

图1为生物传感器的制作流程图，右下角曲线图为该传感器在大肠杆菌存在和不存在时分别产生的电流响应；

图2为生物传感器的横截面的结构示意图，其中，1为金电极、2为戊二醛-大肠杆菌抗体层、3为牛血清白蛋白封闭层、4为大肠杆菌层、5为RCA产物层。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

1．首先制备环状挂锁探针，通过以下步骤：

（1）取3μL挂锁探针9μL连接探针于已灭菌的100μL离心管内，加入6μL T4 DNA连接酶缓冲溶液，50μL灭菌水，震荡均匀，生料带封闭；

（4）加入1μl核酸外切酶Ⅰ在37℃保温1h将连接探针水解后80℃恒温20min使核酸外切酶Ⅰ变性。

2．金电极1的预处理；

3. 配制2%的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干燥，用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的抗体，得戊二醛-大肠杆菌抗体层2；

4.待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白封闭未特异性结合的位点，得牛血清白蛋白封闭层3；

5.电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，并用PBS缓冲液冲,大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上得大肠杆菌层4；

6. PBS冲洗，在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的强识别能力，被修饰在电极表面，再在其上修饰步骤1所得环状挂锁探针，后加入到含1μldNTP、1μlphi29DNA聚合酶、1μlBSA的溶液中37℃孵育2h完成RCA反应得RCA产物层5。

实施例2

一种检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法的对比实验，步骤如下：

a、2支金电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用二次水冲洗；

b、配制2%的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干燥，用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的抗体；

c、待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白封闭未特异性结合的位点；

检测方法如下：

d、在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，用PBS缓冲液冲洗，大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上；

e、1号电极PBS冲洗，在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的强识别能力，被修饰在电极表面；

f、1号电极将成环挂锁探针修饰与电极表面，加入到含1μldNTP、1μlphi29DNA聚合酶、1μlBSA的溶液中37℃孵育2h完成RCA反应；

g、2号电极将适配体-血红素适配体探针修饰于大肠杆菌层后；

h、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.6 V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化。

i、实验发现，下表为实验结果，1为非RCA的实验检测情况，2为RCA的检测情况，实验发现，采用了RCA的实验检测出的电信号是不用RCA的10倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例3

一种检测大肠杆菌的电化学传感器的稳定性分析，步骤如下：

a、4支金电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用二次水冲洗；

检测方法如下：

d、电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，用PBS缓冲液冲洗，大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上；

e、PBS冲洗，在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的强识别能力，被修饰在电极表面；

f、将成环挂锁探针修饰与电极表面，加入到含1μldNTP、1μlphi29DNA聚合酶、1μlBSA的溶液中37℃孵育2h完成RCA反应；

g、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.6 V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化，检测目标物，进行标准曲线的绘制；

h、在冰箱中放置7天，拿出后进行检测，与没有放入冰箱前的数据进行比较，下表为对比结果，1为放置于冰箱前，2为放置于冰箱后，实验发现，冰箱放置后所测得的实验结果与放置前相差无几，表明了该传感器具有稳定性好这一特点。

实施例4

一种检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法的标准曲线的绘制及实际应用，步骤如下：

a、6支金电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用二次水冲洗；

检测方法如下：

d、电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中0, 1.8×10, 1.8×10², 1.8×10³, 1.8×10⁴, 1.8×10⁵, 1.8×10⁶, 1.8×10⁷ cfu mL^-1孵育，用PBS缓冲液冲洗，大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上；

e、PBS冲洗，干在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的强识别能力，被修饰在电极表面；

g、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.6 V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化，检测目标物，进行标准曲线的绘制。标准曲线检测结果如下表所示，电流为平行三次检测测得的平均值，可以看出电流响应随大肠杆菌的浓度的增加而增加，且在1.8×10-1.8×10⁷cfu mL^-1的大肠杆菌浓度内，响应电流与大肠杆菌浓度的对数呈线性关系，即该传感器的线性检测范围为1.8×10-1.8×10⁷cfu mL^-1：

h、采用加标回收的方法，检测牛奶和矿泉水样品，平行测定3次，测定回收率，并与传统检测方法平板计数法进行比较，下表为比较结果，向样品中加入不同的大肠杆菌量，由传感器和平板计数分别后检测，检测结果相差无几，表明该传感器有应用于实际检测的潜力。

Claims

1.一种检测大肠杆菌的生物传感器，其特征在于，从内到外依次为金电极、戊二醛-大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层；

所述的戊二醛-大肠杆菌抗体层厚度为120±10nm，牛血清白蛋白封闭层厚度为100±10nm，RCA产物层厚度为55±10nm；

制备步骤如下：

1)制备环状挂锁探针：取3μL挂锁探针、9μL连接探针于已灭菌的100μL离心管内，加入6μL T4 DNA连接酶缓冲溶液，50μL灭菌水，震荡均匀，生料带封闭；

将此离心管放入95℃恒温10min，37℃恒温2h，使之杂交完全；

加入2μL T4 DNA连接酶，封口膜封口，16℃恒温2h，等挂锁探针连接完全后，65℃恒温20min使T4 DNA连接酶变性；

加入1μL核酸外切酶Ⅰ在37℃保温1h将连接探针水解后80℃恒温20min使核酸外切酶Ⅰ变性；

2)金电极预处理；

3)配制2％的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干燥，用二次水和PBS缓冲液冲洗电极除去未结合的抗体，得戊二醛-大肠杆菌抗体层；

4)待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白封闭未特异性结合的位点，得牛血清白蛋白封闭层；

5)电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，并用PBS缓冲液缓冲，大肠杆菌由于和电极之间的特异性结合而结合到电极上得大肠杆菌层；

6)PBS缓冲液冲洗，在适配体-引物的PBS缓冲液中孵育，适配体通过与大肠杆菌之间的强识别能力，被修饰在电极表面，再在其上修饰步骤1所得环状挂锁探针，后加入到含1μLdNTP、1μL phi29 DNA聚合酶、1μL牛血清白蛋白的溶液中37℃孵育2h完成RCA反应得RCA产物层；所述挂锁探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述连接探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述适配体-引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，挂锁探针和适配体-引物的物质的量比为3:1。

3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的牛血清白蛋白的浓度为0.1％。