CN114729359A

CN114729359A - 程序性dna驱动的自组装rna水凝胶

Info

Publication number: CN114729359A
Application number: CN202080076713.XA
Authority: CN
Inventors: 安昭衍; S·维拉姆帕蒂·克里希纳穆尔蒂; 严崇互; 吴晟; 申承沅
Original assignee: Protein Technology Pioneer Co
Current assignee: Protein Technology Pioneer Co
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2020-10-29
Publication date: 2022-07-08
Also published as: JP2024057094A; CA3154593A1; AU2020373280A1; WO2021084481A1; EP4051797A4; MX2022005148A; US11814662B2; US20210130864A1; JP2023500643A; BR112022008485A2; EP4051797A1

Abstract

本申请提供了涉及构建具有重复单体单元的核酸水凝胶(例如RNA水凝胶)的方法和组合物，每个单体单元包括一个或多个G‑四重体序列。这些G‑四重体序列交联核酸多联体使其在适当的条件下自组装成水凝胶。在一些实施方案中，核酸多联体的每个单体单元包含目的多肽的编码序列；且由核酸多联体形成的核酸水凝胶可用于大量表达该多肽。在一些实施方案中，产生至少两个包含G‑四重体序列的RNA多联体，一个进一步包含间隔区，且另一个进一步包含编码目的多肽的序列。将这两个RNA多联体进行组合并自组装以形成单一的宽带RNA水凝胶。

Description

程序性DNA驱动的自组装RNA水凝胶

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年10月30日提交的韩国申请第10-2019-0136416号；和2020年6月24日提交的韩国申请第10-2020-0077146号的优先权和权益；出于所有目的，其各自通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及在无细胞系统中生产核酸或多肽。

背景技术

RNA目前被用于治疗应用，其通过使用RNA干扰将突变的靶点从蛋白质重定向到基因组中的RNA。RNA部分同时作为遗传来源编码和催化库(catalytic repertoire)的独特能力使得它们除了用作调节蛋白产生的行为蓝图之外，还成为出色的药物靶标。然而，由于其固有的化学不稳定性和生产设备的低产率，RNA的实际应用受到相当限制。

水凝胶是承载水性介质的超分子组装体，既具有液体的溶质转移性质，也具有固体的机械性质。水凝胶由于其高水含量、有利的结构特征和生物相容性而特别适用于生物医学应用。虽然核酸水凝胶通常是已知的，但是用于生产核酸水凝胶的传统方法通常需要复杂的程序，如共价交联。因此，这些技术不能以商业生产所需的足够产率产生RNA水凝胶。目前RNA水凝胶的稳定性、机械性能和功能特性也是不足的。

发明内容

在一些实施方案中，本文公开了环状DNA模板，其包含(i)启动子序列和(ii)与第一G-四重体基序互补的序列。

在一些实施方案中，启动子序列与互补核酸序列杂交以形成第一部分双链的DNA分子；所述第一部分双链的DNA分子包含双链区和单链区；所述双链区包含与所述互补核酸序列杂交的第一启动子序列；并且所述单链区包含与所述第一G-四重体基序互补的序列。

在一些实施方案中，环状DNA模板还包含间隔区，其中所述间隔区包含多胸腺嘧啶(即两个或更多个胸腺嘧啶)。在一些实施方案中，第一环状DNA模板包含目的多肽的编码序列。在一些实施方案中，与第一G-四重体基序互补的序列包含序列ACCCTAACCCTA(SEQ IDNO:1)。在一些实施方案中，第一启动子序列选自T7启动子、T3启动子、Lac启动子、araBad启动子、Trp启动子、Tac启动子和SP6启动子。

本文还提供了包含多个单体的核酸多联体，其中每个单体包含(i)G-四重体基序，和(ii)包含多胸腺嘧啶的间隔区或目的多肽的编码序列。在一些实施方案中，核酸多联体是RNA多联体，其中G-四重体基序包含UAGGGUUAGGGU(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，G-四重体基序包含TAGGGTTAGGGT(SEQ ID NO:20)。

本文还提供了一种核酸水凝胶，其包含上述任何实施方案的核酸多联体。

本文还提供了一种蛋白质表达系统，其包含上述的核酸水凝胶、核糖体和/或氨基酸的混合物。

本文还提供了一种组合物，其包含第一环状DNA模板和第二环状DNA模板，其中所述第一环状DNA模板包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)包含多胸腺嘧啶的间隔区，其中所述第二环状DNA模板包含(i)第二启动子序列，(ii)与第二G-四重体基序互补的序列，和(iii)目的多肽的编码序列；并且其中所述第一环状DNA模板相对于第一和第二环状DNA模板的总量的摩尔分数在25％至75％的范围内。

在一些实施方案中，第一启动子序列与互补核酸序列杂交以形成第一部分双链的DNA分子。所述第一部分双链的DNA分子包含双链区和单链区。所述第一部分双链的DNA分子的双链区包含与互补核酸序列杂交的第一启动子序列，并且所述第一部分双链的DNA分子的单链区包含与第一G-四重体基序互补的序列。

在一些实施方案中，第二启动子序列与互补核酸序列杂交以形成第二部分双链的DNA分子。所述第二部分双链的DNA分子包含双链区和单链区。所述第二部分双链的DNA分子的双链区包含与互补核酸序列杂交的第二启动子序列，并且所述第二部分双链的DNA分子的单链区包含与第二G-四重体基序互补的序列。

在一些实施方案中，第一G-四重体基序和第二G-四重体基序包含相同的核苷酸序列。第一启动子序列和第二启动子序列可以包含相同或不同的核苷酸序列。在一些实施方案中，间隔区包含30-120个胸腺嘧啶(SEQ ID NO:32)。在一些实施方案中，编码序列具有在20至300个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，编码序列与间隔区的长度比在1:0.2至1:2的范围内。在一些实施方案中，目的多肽选自胰岛素、反式激活转录激活子(TAT)、HiBiT和单结构域抗体。

上述任何实施方案的组合物可进一步包含一种或多种RNA聚合酶、核糖核苷酸的混合物和/或缓冲剂。在一些实施方案中，组合物进一步包含具有链置换活性并因此能够进行滚环扩增的DNA聚合酶。

本文还提供了一种组合物，其包含环状DNA模板和双链DNA构建体，并且所述环状DNA模板包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)包含多胸腺嘧啶的间隔区。所述双链DNA构建体包含(i)第二启动子序列，(ii)与第二G-四重体基序互补的序列，和(iii)目的多肽的编码序列。

本文还提供了一种核酸水凝胶，其包含第一核酸多联体和第二核酸多联体。所述第一核酸多联体是通过本公开中提供的第一环状DNA模板的滚环转录或扩增产生的，并且所述第二核酸多联体是通过本公开中提供的第二环状DNA模板的滚环转录或扩增产生的。

本文还提供了一种核酸水凝胶，其包含第一RNA分子和第二RNA分子，其中所述第一RNA分子包含(i)第一G-四重体基序，和(ii)包含多腺嘌呤(即两个或更多个腺嘌呤)的间隔区，并且其中所述第二RNA分子包含(i)第二G-四重体基序，和(ii)目的多肽的编码序列。

在一些实施方案中，所述第一RNA分子是包含多个单体的RNA多联体，并且其中每个单体包含第一G-四重体基序，及包含多腺嘌呤的间隔区或目的多肽的编码序列。

本文还公开了一种蛋白质表达系统，其包含本文公开的任何核酸水凝胶、核糖体和/或氨基酸的混合物。

本文还公开了一种用于表达目的多肽的试剂盒，并且所述试剂盒包含(1)能够通过与第一夹板寡核苷酸杂交形成第一环状DNA模板的第一DNA分子，其中所述第一环状DNA模板包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)包含多胸腺嘧啶的间隔区，(2)与所述第一启动子序列互补的第一夹板寡核苷酸，其中所述第一DNA模板可与第一夹板寡核苷酸杂交并被环化以形成第一环状DNA模板，和/或(3)能够通过与第二夹板寡核苷酸杂交形成第二环状DNA模板的第二DNA分子，其中所述第二环状DNA模板包含(i)第二启动子序列，(ii)与第二G-四重体基序互补的序列，和(iii)目的多肽的编码序列，和(4)与所述第二启动子序列互补的第二夹板寡核苷酸，其中所述第二DNA模板可与所述第二夹板寡核苷酸杂交并被环化以形成第二环状DNA模板。

在一些实施方案中，试剂盒包含本文公开的包含第一环状DNA模板和第二环状DNA模板的任何组合物。在一些实施方案中，第一G-四重体基序和第二G-四重体基序具有相同或不同的序列。在一些实施方案中，第一启动子序列和第二启动子序列相同或不同。在一些实施方案中，间隔区包含30-120个胸腺嘧啶(SEQ ID NO:32)。在一些实施方案中，所述编码序列具有20-300个核苷酸的长度。在一些实施方案中，编码序列与间隔区的长度比在1:0.2至1:2的范围内。在一些实施方案中，目的多肽选自胰岛素、HiBiT、反式激活转录激活物(TAT)和单结构域抗体。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含一种或多种DNA连接酶、RNA聚合酶、核糖核苷酸的混合物和/或一种或多种缓冲剂。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含具有链置换活性并因此能够进行滚环扩增的DNA聚合酶。

本文还公开了一种制备核酸水凝胶的方法，其包括：(1)提供第一环状DNA模板，其包含(i)第一启动子序列，和(ii)与第一G-四重体基序互补的序列；以及(2)对第一环状模板进行滚环转录或扩增以产生第一核酸多联体，其中所述第一核酸多联体形成核酸水凝胶。

在一些实施方案中，第一环状DNA模板进一步包含间隔区，所述间隔区包含多胸腺嘧啶，其中步骤(1)进一步包括提供包含(i)第二启动子序列，(ii)第二G-四重体基序，和(iii)目的多肽的编码序列的第二环状DNA模板，并且其中步骤(2)进一步包括对第二环状DNA模板进行滚环转录或扩增以产生第二核酸多联体，其中所述第一和第二核酸多联体形成核酸水凝胶。

本文还公开了用于在无细胞合成系统中生产蛋白质的方法，并且所述方法包括在允许目的多肽翻译的条件下将本文公开的任何核酸水凝胶与无细胞合成系统组合。在一些实施方案中，所述无细胞合成系统包含核糖体和/或氨基酸的混合物。

附图说明

图1A-1F示出自组装滚环转录(RCT)产物形成具有固有功能的RNA G-四重体(RG4)凝胶。图1A示出RNA部分通过RCT形成RG4的自组装过程的示意性框架。包含与G-四重体(G4)基序互补的序列和适合于用户规定应用的功能序列的环状DNA被用作RCT的模板。交联体区域和功能序列的相对位置和序列可以变化。使用重复的G-四重体基序由RCT合成的串联重复的长单链RNA(RNA多联体)用作3D水凝胶组装的理想支架。图1B是RCT产物相对于胶凝时间的图形表示(从左到右，RGx多联体的0、48小时，RG4多联体的0、3、6、9、12、24、48小时)。白色箭头指示了RCT产物的位置(RG4水凝胶中的凝胶相和RGx溶液中的溶液相)。图1C示出在各种不同多边形模具中图案化的RG4水凝胶，比例尺表示10mm。图1D示出在3D圆柱形模具中制造的RG4水凝胶的侧视图，比例尺表示5mm。图1E示出用SYBR green II染色的RG4水凝胶的共焦显微图像(比例尺为60μm)，以显示孔隙和重复性微结构。图1F示出冷冻干燥的RG4水凝胶的FE-SEM图像，比例尺为100μm。图1G是图1F的一部分的放大视图，其中比例尺表示20μm。

图2A-2C示出RG4的光谱验证和鉴定。图2A示出在各种不同盐条件下作为RCT产物的含有半单位G4和乱序G4基序(非G4)的sG4s和sGxs的圆形二色性(CD)分析。当经历100mMKCl和NaCl的条件时，sG4在262nm处明显的正峰和在240nm处的沟槽证实了二级结构中的改变，这是一种已知与水凝胶的形成相关的现象，其中对于sGx在无盐和100mM MgCl₂条件下没有观察到变化。图2B示出硫黄素T(ThT)在与sG4和sGx相互作用时的荧光光谱，其中观察到荧光强度的显著增强，证明了ThT探针与RG4的特异性结合(插图)。当与显示出对ThT较差的选择性的sGx相比时，sG4具有7.1倍的增强，在t检验中统计学P值为0.001。图2C示出，当在pH5.4下与氯化血红素复合时，通过RG4和RGx促进ABTS^2-氧化为ABTS^·-的酶活性的比较(插图)。RG4和RGx二者都增加了氯化血红素的过氧化物酶活性，这可能是由于氯化血红素与RG4和RGx的自封闭保守模块之间的相互作用。然而，与RG4凝胶复合的氯化血红素的过氧化物酶活性增加得更快。

图3A-3F示出RG4凝胶的物理性质分析。图3A示出RG4凝胶和RGx的应力-应变曲线，其在万能拉力机上进行压缩试验。图3B示出RG4凝胶和RGx相对于制造时间的储能模量，其在50.12rad/s的旋转角频率下进行流变学分析。图3C分别示出新鲜制备的和再水化的RG4水凝胶的水保持和吸收能力。图3D示出ThT扩散至水凝胶中的实验和理论评价。从左到右的6幅图像或260s间隔的共焦显微图像。验证了关于ThT和核糖体的理论假设1和2(在本公开中也称为理论估计1和2)，以估计它们的扩散速度。图3E示出来自AFM分析的显微图像，以估计RG4的孔径。图3F是放大的AFM图像，其清楚地展示了多孔性质。主图和放大图中的比例尺分别表示200nm和50nm。

图4A-4F示出RG4水凝胶在富含RNA酶的FBS血清中的稳定性。图4A示出用于稳定性研究的血清中RCT产物的图形表示。定量估计RG4网络中(从底部)和上清液中(RG4水凝胶的解离产物)的RNA量。从不同时间下的RG4上清液(图4B)和RG4(图4C)凝胶图像的条带强度分析FBS血清中退火后转录产物的基于曝光时间的降解。箭头指示RG4降解的开始。对于RG4上清液观察到48小时下通过RNA量降低指示的RNA降解(图4D)。图4E示出使用条带强度估计可归因于血清的RNA分子的半衰期，其中RGx具有比RG4更快的降解。图4F示出RG4水凝胶和RGx的基于时间的定量凝胶电泳评估。预计RG4中的G4形成会延长RNA合成时间和合成RNA的总量。

图5A-5D示出蛋白质表达系统和所表达的蛋白质的翻译产率的图形表示。图5A示出来自RG4水凝胶模板的蛋白质表达过程的示意图。将切下的RG4水凝胶添加到具有核糖体的无细胞蛋白质表达裂解混合物中。图5B示出从DNA和RNA模板表达的HiBiT肽的相对量，其通过产生的相对发光(RL)信号进行表征。*RNA表示切下的W-RG4水凝胶。退火的RG4表现出较低的产率，因为它失去了它的水凝胶化。图5C示出了使用各种不同模板表达的TAT和胰岛素的相对量，如通过切下和尿素处理的翻译产物的RL表征的。图5D示出使用小麦胚芽无细胞表达系统对HiBiT表达的蛋白质与fRNA和W-RG4水凝胶的非偶联翻译的比较。W-RG4 150表示翻译反应混合物的体积为150μL，其中观察到产率增加了8倍。

图5E是使用质粒克隆技术的宽条带RG4水凝胶(W-RG4)的示意图。W-RG4水凝胶通过将从包含SEQ ID NO:7序列的间隔区模板转录的60T RG4与来自载体pK7-Letolizumab的RNA转录本整合来产生。图5E公开了作为SEQ ID NO:34的“60T”。图5F示出定量对应于Letolizumab的检测条带的强度的结果。图5G示出通过SDS-PAGE分析Letolizumab蛋白表达的结果，用方括号表示具有60TRG4的各种不同浓度的间隔区模板。

图5H是体外翻译过程中相分离的RNA滴的示意图。RNA和RNA结合蛋白(RBPs)是构成核糖核蛋白(RNPs)滴的体内关键组分。这些RNP模拟细胞可以如何以时空和功能调节的方式组织自身。类似于细胞内RNP系统的RNA水凝胶可以促进蛋白质组分的扩散，从而提高蛋白质效率。

图5I和5J示出来自裂解物包埋的W-RG4凝胶的HiBiT的无细胞表达产率的结果。图5I比较了不同模板制备条件下，来自各种不同裂解物包埋的W-RG4与无裂解物的W-RG4的HiBiT表达。在包埋的裂解物的存在下，使用HiBiT模板组合150T W-RG4的间隔区模板产生的W-RG4水凝胶在3小时转录反应(凝胶形成)和随后2小时翻译之后显示出了最高的蛋白质表达。表达水平高于无裂解物的W-RG4的表达水平。图5I公开了作为SEQ ID NO:33的“30T”、作为SEQ ID NO:35的“90T”，和作为SEQ ID NO:37的“150T”。图5J示出来自无裂解物的W-RG4水凝胶和裂解物包埋的W-RG4水凝胶的HiBiT表达的结果。裂解物包埋的水凝胶(L-凝胶)成功地表达了HiBiT，而无需向翻译反应混合物中进一步添加裂解物组分。添加到翻译反应混合物中的额外的裂解物进一步加强了裂解物包埋的水凝胶(L-L-凝胶)的HiBiT表达。

图6A-6D示出DNA RCT模板的制备和RNA产物的转录。图6A是制备DNA滚环转录(RCT)模板并随后转录RNA产物的示意图。将含有T7启动子引物的互补链、G-四重体交联序列和多胸腺嘧啶间隔区的前体模板进行退火以在T7启动子区域中形成部分双链。成功连接的模板可以参与由T7启动子启动的长且重复的RNA链与G-四重体(RG4)的转录。图6B示出30T RG4、30T RGx和各种胸腺嘧啶间隔区(3T、10T(SEQ ID NO:38)、30T(SEQ ID NO:33)、60T(SEQ ID NO:34)、90T(SEQ ID NO:35)和120T(SEQ ID NO:36))的裸、退火和连接的前体模板的PAGE分析。作为巨大的网络，RG4凝胶没有迁移，而非凝胶化的RGx产物少量迁移。条带迁移的差异确保在每个制造步骤中成功地形成具有不同间隔区的模板。实心菱形(◆)表示样品的成功制造。3T和10T(SEQ ID NO:38)的间隔区长度不能合成环状DNA模板，如空心菱形(◇)所示，而30T(SEQ ID NO:33)及以上的间隔区长度显示了条带迁移的显著差异。3T远离其余的条带，这可能表明长的线性DNA模板，且其RNA产物仅轻度凝胶化。图6C示出具有各种不同长度的间隔区的RG4的凝胶化，其通过小瓶倒置测试来评估。因为空间长度不足以使线性DNA环化，具有间隔区长度3T和10T(SEQ ID NO:38)的RG4是非凝胶化的(由向下箭头指示)，而30T(SEQ ID NO:33)及以上的间隔区长度足以使环状模板形成并凝胶化(由向上箭头指示)。图6D示出转录过程中来自具有各种不同间隔区长度的模板的总RNA的浓度。尽管没有制造3T和10T的环状DNA模板，但是3T的RNA转录产率与环状模板相当。图6A-6D公开了作为SEQ ID NO:38的“10T”、作为SEQ ID NO:33的“30T”、作为SEQ ID NO:34的“60T”、作为SEQ ID NO:35的“90T”和作为SEQ ID NO:36的“120T”。

图7示出RG4凝胶的恢复试验的结果。进行恢复试验以研究胶凝过程是否是可逆的。RG4凝胶首先在95℃变性2小时。然后将变性的RG4凝胶在4℃、25℃或37℃下退火48小时，RG4凝胶丧失其自组装凝胶特性。朝上的箭头表示形成的水凝胶，并且朝下的箭头代表在热处理之后不能返回到其凝胶状态的液体。

图8示出用于表面拓扑表征的RG4凝胶的AFM成像。图8A示出AFM探针以间歇接触模式扫描在云母基底上制备的RG4凝胶的表面以获得拓扑图像的示意图。保持在悬臂末端的小探针扫描感兴趣的表面，引起振荡振幅的衰减并从而产生形貌图像。图8B至图8E示出分别具有30T(SEQ ID NO:33)、60T(SEQ ID NO:34)、90T(SEQ ID NO:35)和120T(SEQ ID NO:36)的不同间隔区长度的RNA分子的AFM图像，其在RCT过程中进行自组装，并显示出孔径的形态学差异。随着间隔区长度增加，凝胶变得更柔性，并且孔径也随着间隔物长度增加。比例尺表示200nm。图8F至图8H示出分别表示具有30T(SEQ ID NO:33)、60T(SEQ ID NO:34)和120T(SEQ ID NO:36)的RG4凝胶的孔径(面积)分布的直方图，其使用ImageJ软件和AFM图像进行分析。

图9A和9B示出RG4凝胶的共焦显微图像。图9A示出载有SYBR green II的RG4凝胶的共焦显微图像。在微米尺度上制备样品，如箭头所示(图中提及的短宽度和长宽度分别为69.1和128.4μm)。图9B示出在厘米尺度上制备的RG4凝胶的3D共焦显微图像。周期性互连的多孔结构是明显的，表明了水凝胶的形成。比例尺表示50μm。

图10示出RGx的场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)图像。RGx具有无孔隙的平坦、无瑕疵形态，并且不能形成水凝胶。比例尺表示100μm。

图11A-11F示出在各种不同盐条件下的合成sG4和sGx的圆二色性(CD)分析。来自具有G-四重体部分(sG4)和乱序的G-四重体部分(sGx)的合成RNA类似物的剂量依赖性CD光谱。预期sG4的椭圆率谱和RNA片段的稳定性相对于盐浓度(分别如图11A-11C中的KCl、NaCl和MgCl₂)发生了改变。在存在KCl和NaCl但不存在MgCl₂的条件下，观察到sG4在264nm处的明显峰和在240nm处的谷。单价阳离子，特别是K⁺和Na⁺，特异性地配合到两个鸟嘌呤四联体之间的空腔中，从而通过其适当的离子半径以形成复合物来稳定G-四元体结构。通过将盐溶液中KCl、NaCl或MgCl₂的浓度从0.1mM改变至100mM，260nm处的峰以KCl和NaCl浓度依赖性方式增加，而对sG4没有观察到MgCl₂的明显的改变。如图11D-11F所示，在提及的盐条件和无盐条件之间，乱序的、非凝胶化的sGx寡核苷酸与阳离子之间的结构-活性关系在二级结构分布中没有差异。

图12A-12H示出具有和不具有G-四重体的RCT产物中氯化血红素的过氧化物酶样活性的优化。在H₂O₂的存在下，G-四重体与氯化血红素的相互作用用于ABTS底物的氧化催化的示意图。在4.4至7.9的pH范围内测试了RCT产物在催化反应中的时间和pH依赖性动力学。在ABTS^2-氧化为ABTS^·-的过程中，氯化血红素与RG4凝胶复合物之间的动力学行为通过λ＝395nm处的吸光度增加进行表征。RG4凝胶在4.4至7.9的pH范围内表现出提高的过氧化物酶活性，因为酶促反应对pH具有抗性，有助于形成的产物和酶促反应的稳定性。RGx产物显示出类似的趋势，尽管过氧化物酶活性的增加比RG4慢，表明氯化血红素和自包封模块之间可能存在较小的相互作用。RG4和RGx在5.4至7.9的pH范围内的反应缓冲剂中表现出有效的酶活性，而对于游离氯化血红素没有观察到活性或观察到可忽略的活性，这是由于RCT复合物中氯化血红素的去质子化，及由于在碱性环境中容易受到H₂O₂的影响且具有低活性(43，44)。因此，与RGx相比，氯化血红素-RG4凝胶表现出增强的过氧化物酶活性，尽管游离氯化血红素的活性在pH>4.9时无效。

图13A-13D示出通过AFM图像研究过氧化物酶活性期间RCT产物的自生物素化的结果。研究了在H₂O₂和生物素酪胺存在下由氯化血红素催化的G-四重体的自生物素化(45)。为了鉴定RG4和RGx中的生物素化位点，添加链霉亲和素，因为它选择性地结合G4区域中的自生物素化位点。在用催化试剂处理之前和之后捕获AFM图像，并评估它们的截面高度。测量裸RCT产物和经处理RCT产物上由于链霉亲和素结合(识别为亮点)所致的截面高度差异，以证实链霉亲和素与生物素化位点的结合。裸和处理的RG4的平均阶梯高度变化分别为6.6nm和22.9nm。尽管链霉亲和素结合不均匀，但从形态上证实了G4区域中存在链霉亲和素。对于裸和处理的样品，RGx的表面形态没有表现出孔隙，且高度变化为30-40nm。这证实了G-四重体的缺失，因为没有发生自生物素化或链霉亲和素结合。比例尺表示200nm。

图14A-14D显示出G4凝胶和RGx产物的模量测量的结果。图14A示出使用AFM压痕法获得的力曲线，该方法测量了纳米尺度上的压痕深度。在其最佳拟合区域使用Hertz拟合模型获得弹性模量。图14B示出相对于凝胶化时间从力模式获得RCT产物的杨氏模量。在0、3和6小时，模量接近于零，这表明尽管6小时后没有开始凝胶化，但模量增加影响凝胶特性。注意到对施加的力的时间依赖性阻力。RGx产物的模量在测试的所有时间间隔内保持为零。图14C和图14D分别示出描述材料的弹性部分和固态行为的储能模量，以及表征样品的粘度和液态行为的损耗模量(46)。RG4凝胶表现出非牛顿、非线性行为，在各种不同制造时间和宽范围的角频率下，储能模量和损耗模量中都具有凹形分布。RG4凝胶表现出大的储能模量和低的损耗模量，表明了固体状性质。观察到两种模量都逐渐增加，并且在制造之后的12小时开始响应显著降低。RGx的模量接近于零，表明了其粘度。

图15示出RG4水凝胶中G-四重体的定量和密度计算。使用Qubit^TM RNA BR测定试剂盒中提供的RNA特异性荧光染料测量总RNA的浓度。基于总RNA和G-四重体的浓度计算一个单元的RCT循环的浓度。为了计算扩散率，基于RG4水凝胶中的RNA量计算G-四重体结构之间的平均距离。在三维分布中，G-四重体之间的估计距离为21.11nm。

图16A和16B示出预测RCT产物在血清中稳定性的代表性电泳图谱。使用凝胶电泳以评价RG4水凝胶的稳定性，证明了RNA水凝胶在不同暴露时间对富含RNA酶的胎牛血清(FBS)的响应性(存在或降解)。图16A示出通过琼脂糖凝胶电泳定量评价退火后转录产物在FBS环境中基于反应时间的稳定性。在RG4和RGx中都观察到了RNA降解，这由48小时下减少的RNA量表明。观察到RG4中RNA分子的丰度和RGx中的不稳定性。图16B示出RGx对降解的血清延长暴露48小时。箭头指示RGx降解的开始。

图17A-17D示出编码HiBiT的RCT产物的制备结果。图17A示出在玻璃小瓶中制备的编码HiBiT的RG4(H-RG4)和RGx(H-RGx)产物的比较，将其倒置以确认水凝胶化。与从包含30T间隔区(SEQID NO:33)和与G-四重体基序互补的序列的DNA模板转录的RNA多联体(其水凝胶化以形成30T RG4水凝胶)相反，编码HiBiT的RCT产物没有显示水凝胶化的宏观证据，并且粘着在小瓶的底部。向上的箭头指示形成的凝胶，向下的箭头指示不能凝胶化的液体。图17B示出HiBiT-G4和HiBiT-Gx模板的环状模板形成的PAGE分析。根据制造步骤可以看到不同的迁移位置，尽管水凝胶化是不成功的。用实心菱形(◆)表示由各方法成功制造的模板。图17C示出H-RG4中被认为阻碍水凝胶形成的预期二级结构。水凝胶化的失败可能是由于H-RG4s中复杂的二级结构形成而发生，其阻碍了与G4基序的相互作用。通过oxDNA估计结构1和2形成的概率分别为96.48％和25.39％。G-四重体部分标记为灰色。图17C按出现的顺序分别公开了SEQ ID NOS 29-31。图17D示出通过HiBiT肽的相对发光(RL)来表征各种编码HiBiT的RNA模板的蛋白质表达效率。H-RG4产物似乎是非水凝胶化的，并且在蛋白质表达效率上与H-RGx没有表现出差异。当退火时，H-RG4的蛋白表达产率往往比H-RGx下降更多，这可能是由于G4形成。使用下表1中给出的操作条件，通过oxDNA粗粒度分子动态模拟模型估计结构1和2的出现概率。由于刚性、非特异性二级结构的空间位阻，怀疑在一个循环的RCT生产时的部分互补键阻碍RG4的水凝胶化。通过结合表现为宽条带的支持性RG4抑制这种位阻。

图18A-18E说明了可用于水凝胶化RCT产物的宽条带系统。图18A是宽条带RG4水凝胶(W-RG4)制造的示意图。为了使程序化的、自组装RG4水凝胶用于蛋白表达的优势最大化，我们设计了一种通过水凝胶化的RG4组分使先前非水凝胶化的的RCT产物能够水凝胶化的方法。这些产物显示形成了类似于30T RG4水凝胶(由具有SEQ ID NO:6序列的DNA模板的滚环转录产生的RNA多联体形成的水凝胶)的稳定的水凝胶(W-RG4)。图18A公开了作为SEQ IDNO:33的“30T”。图18B示出具有不同摩尔分数的30T RG4的W-RG4的形成通过小瓶倒置来检查水凝胶化和同时转录。所示摩尔分数(25％、50％和75％)是指间隔区模板30T RG4的摩尔分数。尽管编码蛋白的RG4模板(H-RG4)似乎是非水凝胶化的，但包埋的G-四重体与支持RG4产物中的部分相互作用以产生了成功的水凝胶。正如所预期的，当H-RG4的摩尔分数增加并且30T RG4的摩尔分数降低时，水凝胶的刚性降低。图18C示出退火之后宽条带RNA水凝胶的琼脂糖凝胶电泳分析。编码HiBiT的RG4水凝胶从转录阶段显示出快速的和改进的表达模式，并且当G-四重体形成实体的摩尔分数降低时RNA消失。由于交联G4s导致水凝胶化的RG4s的迁移程度低于非水凝胶化的100％H-RG4。图18D示出使用来自表达的HiBiT的相对发光(RL)信号表征W-RG4水凝胶的蛋白质表达效率。与25％和100％的H-RG4相比，水凝胶化的W-RG4表现出增加的效率。蛋白质产生产率在摩尔分数为75％时最大化。图18E示出使用AFM对75％W-RG4进行纳米压痕测量获得的力曲线。在最佳拟合区域，杨氏模量估计为9.71kPa。

图19示出具有不同切割数目的W-RG4的蛋白质表达效率。通过切割水凝胶进行从W-RG4的蛋白质表达的优化，以提高翻译组分的可接近性。当切割数为300时效率最大化，其与未切割样品相反，通过模拟薄水凝胶垫(33)以促进参与蛋白质表达的酶和底物的扩散显著增强了蛋白质效率。

图20示出逐步制备线性HiBiT-Gx模板和转录的RNA的PAGE分析。线性HiBiT模板在与T7启动子退火之前和之后模板的条带位置存在可分辨的差异。线性HiBiT-GxRNA转录自退火的线性HiBiT-Gx模板，其在DNA模板的位置处显示出明显的条带。由于转录的RNA的瞬时降解，残留条带也是可见的。实心菱形(◆)表示在每个步骤中成功制造的模板或转录的RNA。

图21A-21E示出增强的蛋白质表达的反应参数的优化：反应时间、离液处理、反应温度和模板量。(A)相对于反应时间的游离DNA(fDNA)和具有W-RG4的RNA(fRNA)的相对发光(RL)的比较。尽管W-RG4的性能优于其它模板，但是随着翻译反应时间超过2小时，观察到RL下降，这与可溶HiBiT的量减少相对应。怀疑表达的HiBiT肽之间存在包涵体的干扰。(B)用于增溶聚集肽的尿素处理之前和之后的HiBiT翻译产物的RL。DIW、裂解物和HiBiT分别对应于蒸馏水、没有任何模板的翻译混合物和HiBiT-翻译混合物。DIW*、裂解物*和HiBiT*表示尿素处理的样品。对于翻译产物在尿素处理之后观察到RL的显著增加。(C)如在翻译产物经尿素处理之后通过RL表征的，来自各种不同模板的表达HiBiT肽的相对量。(D)HiBiT相对于RL的温度依赖性表达产率。在37℃以下未观察到包涵体引起的RL的时间依赖性降低，并且在25℃达到最佳表达。(E)各种RNA模板体积相对于蛋白质效率产量的影响。当使用3至22μL的RCT产物用于翻译时，观察到一致的产率。

图22A-22B示出HiBiT标记的TAT和胰岛素G-四重体模板的PAGE分析。图22A示出HiBiT标记的TAT和胰岛素G-四重体的编码环状模板的制备。观察到连续过程的条带迁移的可分辨差异，表明模板的成功环化和连接。图22B示出线性HiBiT标记的TAT和胰岛素乱序G-四重体模板显示在退火之前和之后条带迁移的明显差异。所有实心菱形(◆)表示在每个步骤中成功制造的模板。

图23示出无细胞翻译混合物中反映产率的批体积变化的影响。通过添加去离子水增加翻译混合物的体积以克服空间障碍和通过提供为产物移动的足够搜索空间来提高蛋白质产量。产率增加直至150μL，从而使得表达的蛋白质扩散到水凝胶之外，而水凝胶支架提供了适合于在翻译过程中的更佳周转率的局限空间。用DIW进一步增加体积后，由于裂解物不足或稀释，产率下降。

具体实施方式

概述

本申请提供了涉及由具有重复的单体单元的核酸多联体构建核酸水凝胶(例如，RNA水凝胶)的方法和组合物。每个单体单元包括一个或多个G-四重体序列。这些G-四重体序列交联核酸多联体，使得多联体自组装(即不需要任何外部交联剂)到水凝胶中。核酸多联体可以通过环状DNA模板的滚环扩增或滚环转录产生。在一些实施方案中，核酸多联体的每个单体单元包含目的多肽的编码序列。由核酸多联体形成的核酸水凝胶可用于大量表达多肽。在一些实施方案中，产生了至少两个包含G-四重体序列的RNA多联体，一个进一步包含间隔区，且另一个进一步包含编码目的多肽的序列。这两个RNA多联体组合和自组装以形成单一RNA水凝胶，在本公开中称为宽条带RNA水凝胶。

核酸水凝胶(例如，RNA水凝胶)可以模制成不同的尺寸和形状，并且这些核酸水凝胶表现出良好的、软性的机械性能和优异的物理化学稳定性。本文公开的核酸水凝胶可用作广泛的生物应用(例如催化、蛋白质表达)的平台。RNA水凝胶蛋白质生产系统与细胞内环境非常类似，其中RNA由一束DNA产生且蛋白质在由细胞骨架包围的细胞质中的有限空间内突然表达(42)。水凝胶中的凝胶基质模拟了为细胞提供机械支持的细胞骨架的作用。核酸水凝胶具有足够的水性空间，这有益于酶促反应(例如在蛋白质表达期间)。核酸水凝胶具有多孔性和与蛋白质编码序列密切邻近的有用特性，这使得在核酸水凝胶中核糖体可以自由接近RNA模板。这些特征使本文公开的核酸水凝胶用作理想的无细胞蛋白质生产平台。

使用本文公开的核酸水凝胶生产蛋白质是一种易于遵循的简单且合理化的过程。核酸水凝胶蛋白质生产系统还可以被配置为在较长的反应期中以连续模式生产蛋白质，以进一步提高蛋白质生产效率和通用性。由于具有多种工程化功能性，核酸水凝胶可以在多个领域扩大现有技术应用的范围，如多重实时病原体检测；用于无毒、不可燃、环境友好的能源的生物燃料电池；以及生物植入物和抗体-药物偶联物。

术语

如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代，除非本文另有明确规定。因此，例如，提及“一个抗体”任选地包括了两个或更多个该类分子的组合等。

如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围，例如±20％、±10％或±5％在所述值的预期含义内。

如本文所用，术语“包含”和“包括”是开放式的。当与主题核酸(或氨基酸序列)结合使用时，它是指包括主题序列作为一部分或作为其完整序列的核酸序列(或氨基酸序列)。

术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，且如本文所用，指的是RNA、cDNA、基因组DNA的正义链和反义链，以及上述的合成形式和混合聚合物。在特定实施方案中，核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式，及其组合。该术语还包括但不限于单链和双链形式的DNA。此外，本文公开的多核苷酸，例如本文公开的环状DNA模板、核酸多联体，可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸任一或两者。本领域技术人员将容易理解，核酸分子可能化学或生物化学修饰，或可能含有非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个自然发生的核苷酸、核苷酸间的饰，如不带电荷的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧链部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰的键(例如，α-异头核酸等)。上述术语也旨在包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体、发夹、环状和锁型构象。除非另有说明，提及核酸序列涵盖其互补序列。因此，提及具有特定序列的核酸分子应理解为涵盖其互补链及其互补序列。该术语还包括编码相同多肽序列的密码子优化的核酸。

如本文所用，术语“多联体”是指包含核酸序列的串联重复的核酸分子。核酸多联体可以通过核酸合成，或通过例如环状DNA模板的滚环扩增或滚环转录产生。

如本文所用，术语“无细胞合成”是指在包含生物提取物和/或限定试剂的反应混合物中体外合成核酸、多肽、小分子和/或病毒颗粒。反应混合物将包含用于产生大分子的模板，例如DNA、mRNA等；用于待合成的大分子的单体，例如氨基酸、核苷酸等；以及合成所需的辅因子、酶和其它试剂，例如核糖体、不带电荷的tRNA、带有天然和/或非天然氨基酸的tRNA、聚合酶、转录因子、tRNA合成酶等。

术语“裂解物”是包含蛋白质合成机构所需组分的任何细胞来源的制剂，其中这样的细胞组分能够表达编码所需蛋白质的核酸，其中大多数生物组分以由细胞裂解得到的而不是经过重组的浓度存在。可以进一步改变裂解物，使得裂解物补充有另外的细胞组分，例如氨基酸、核酸、酶等。还可以改变裂解物，使得在裂解后去除或降解另外的细胞组分。

本文所用的术语“RGx”是指由RNA多联体形成的非-G四重体结构。

如本文所用，与“sGx”互换使用的术语“RGx多联体”是指形成RGx的RNA多联体。在一个实施方案中，RGx多联体包含SEQ ID NO:13的多个拷贝。

如本文所用，术语“RGx溶液”是指由RGx形成的粘性溶液。

本文所用的术语“RG4”是指由RNA多联体形成的RNA G-四重体。在一些实施方案中，所述RNA多联体通过滚环转录产生。

如本文所用，与“sG4”互换使用的术语“RG4多联体”是指形成RG4的RNA多联体。

如本文所用，与“RG4凝胶”互换使用的术语“RG4水凝胶”是指由RG4的凝胶化产生的水凝胶。

如本文所用，术语“H-RG4水凝胶”或“H-RG4凝胶”是指由包含SEQ ID NO:14的序列的DNA模板滚环转录产生的RNA多联体形成的水凝胶。

如本文所用，术语“W-RG4水凝胶”或“宽条带RG4水凝胶”是指由两种不同的RNA分子形成的水凝胶，其中至少一种是RG4多联体。在一个实施方案中，两种RNA分子都是RG4多联体，一种包含多腺嘌呤，且另一种编码目的多肽。在一个实施方案中，两个RNA分子中的一个是包含多腺嘌呤的RG4多联体，且另一个是编码目的多肽的RNA分子。

如本文所用，术语“nT RG4”是指由包含n个胸腺嘧啶的DNA模板滚环转录产生的RNA多联体。例如，术语“30T RG4”、“60T RG4”、“90T RG4”、“120T RG4”或“150T RG4”是指由包含30(SEQ ID NO:33)、60(SEQ ID NO:34)、90(SEQ ID NO:35)、120(SEQ ID NO:36)或150个胸腺嘧啶(SEQ ID NO:37)的DNA模板的滚环转录产生的RNA多联体。n可以是任何整数。在一些实施方案中，n在3至400的范围内，例如10至300、20至200、25至180或30至150。转录以产生nT RG4的DNA模板称为nT RG4的间隔区模板。在一个实例中，30T RG4的间隔区模板包含SEQ ID NO:6的序列。

在整个本公开中，术语“凝胶”和术语“水凝胶”可互换使用。

如本文所用，术语“编码序列”、“编码蛋白质的序列”、“蛋白质编码序列”是指DNA序列，其可被转录以形成RNA转录物，并且所述RNA转录物可被翻译以产生目的多肽。根据上下文，本文提及的目的蛋白质的编码序列或编码目的蛋白质的编码序列可以是编码目的蛋白质的有义链的序列(例如SEQ ID NO:26)或反义链的序列(例如SEQ ID NO:21)。本文所用的编码序列也称为靶序列。

如本文所用，术语“非编码序列”是指可转录但不可翻译的基因组序列。

如本文所用，术语“摩尔分数”是指混合物中试剂的摩尔数的百分比。例如，含有间隔区模板和编码模板分子的混合物中间隔区模板的75％摩尔分数是指间隔区模板分子的摩尔数百分比是75％，且编码模板分子的摩尔数的百分比是25％。

G四重体基序

本文公开的G-四重体基序包含至少两个、至少三个或至少四个连续的鸟嘌呤(Gs)。在一些情况下，G四重体基序中至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的核苷酸是鸟嘌呤。G-四重体基序的非限制性实例公开于Phan,FEBS J.277,1107–1117(2010)和Platella et al.,Biochimica et Biophysica Acta 1861(2017)1429–1447，其全部公开内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，G-四重体基序是RNA序列(RNA G-四重体基序)。RNA G-四重体基序的非限制性实例包括UAGGGUUAGGGU(SEQ ID NO:2)和GGGUUAGGGU(SEQ ID NO:22)。在一些实施方案中，G-四重体基序是DNA序列(DNA G-四重体基序)。DNAG-四重体基序的非限制性实例包括TAGGGTTAGGGT(SEQ ID NO:20)。

本公开中还涵盖RNA G-四重体基序，其可衍生自本文公开的或通过引用并入的相应DNA G-四重体基序。例如，RNA G-四重体基序可以衍生自DNA G-四重体基序，例如通过用各自的相应核糖核苷酸替代DNA G-四重体基序中的脱氧核糖核苷酸和用尿嘧啶替代含氮碱基胸腺嘧啶。作为实例，UAGGGUUAGGGU(SEQ ID NO:2)可以使用上述方法衍生自TAGGGTTAGGGT(SEQ ID NO:20)。反过来，DNA G-四重体基序也可以衍生自本文所公开或通过引用并入的任何RNA G-四重体基序，例如通过用各自的相应脱氧核糖核苷酸替代核糖核苷酸和用胸腺嘧啶替代含氮碱基尿嘧啶。这些DNA G-四重体基序也涵盖在本公开中。

具有G-四重体基序的RNA多联体的产生

在一些实施方案中，本公开中的方法和组合物可用于通过滚环转录产生RNA多联体。

环状DNA模板

用于滚环转录的环状DNA模板可由单链线性DNA产生，并且所述线性DNA包含与所需RNA序列互补的序列。单链线性DNA可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备，包括从核酸文库化学合成分离或通过重组技术制备。

单链线性DNA可以通过DNA连接酶在夹板寡核苷酸的帮助下进行环化以形成环状DNA模板。夹板寡核苷酸包含与DNA的一端互补的第一序列和与线性DNA分子的另一端互补的第二序列。夹板寡核苷酸通过与单链线性DNA两个末端的序列杂交而使两个末端接近。然后用DNA连接酶用于接合DNA分子的两端以形成环状单链DNA模板。然后夹板寡核苷酸可以用作引物以引发滚环扩增而形成DNA多联体，或者引发滚环转录而形成RNA多联体。图1A示出一个说明性的实施方案，其中夹板寡核苷酸具有与环状模板中的T7启动子序列互补的序列。作为非限制性实例，具有SEQ ID NO:6的序列的单链DNA分子与具有SEQ ID NO:12的序列的夹板寡核苷酸进行退火，DNA分子的两个末端合在一起并与夹板寡核苷酸杂交。在DNA连接酶的存在下，两个末端将连接以形成环状DNA模板。

环状单链DNA模板包含可操作地连接至间隔区或目的编码序列的至少一个启动子序列。在一些实施方案中，夹板寡核苷酸与环状DNA模板中的启动子序列互补。在一个实施方案中，夹板寡核苷酸具有SEQ ID NO:12的序列。本文所用的启动子序列可来源于广泛的启动子。启动子可以是突变型启动子、截短型启动子或杂合型启动子。启动子可以是组成型或诱导型启动子。合适启动子的非限制性实例包括T7启动子、T3启动子、Lac启动子、araBad启动子、Trp启动子、Tac启动子或SP6启动子。

环状单链DNA模板可进一步包括一种或多种其它调控序列，包括但不限于阻抑物、激活子、转录和翻译增强子、DNA结合蛋白等。

环状DNA模板也可以包含一个或多个功能性序列，例如如下文进一步描述的目的多肽的编码序列或间隔区序列。

间隔区

间隔区位于环状DNA模板中的启动子序列和G4四重体基序之间。通常，间隔区是非编码序列。间隔区可以包括多个胸腺嘧啶。在一些实施方案中，间隔区包含15-220，例如20-200、25-150或30-120个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区中至少50％、至少60％、至少90％、至少95％的核苷酸是胸腺嘧啶(T)。在一些实施方案中，间隔区包含至少10个(SEQ IDNO:39)、至少12个(SEQ ID NO:40)、至少13个(SEQ ID NO:41)、至少14个(SEQ ID NO:42)、至少15个(SEQ ID NO:43)、至少16个(SEQ ID NO:44)、至少20个连续的胸腺嘧啶(SEQ IDNO:45)。在一些实施方案中，间隔区中的所有核苷酸是胸腺嘧啶。在一些实施方案中，间隔区包含3T、10T(SEQ ID NO:38)、30T(SEQ ID NO:33)、60T(SEQ ID NO:34)、90T(SEQ ID NO:35)、120T(SEQ ID NO:36)或150T(SEQ ID NO:37)。在一些实施方案中，间隔区由3T、10T(SEQ ID NO:38)、30T(SEQ ID NO:33)、60T(SEQ ID NO:34)、90T(SEQ ID NO:35)、120T(SEQID NO:36)或150T(SEQ ID NO:37)组成。在一些实施方案中，环状DNA模板包含间隔区，并且所述间隔区包含选自SEQ ID NO:6-9和11的序列。

编码序列

编码序列编码目的多肽。在一些实施方案中，编码序列的长度可以在20至300个核苷酸的范围内，例如25至200个核苷酸或30至166个核苷酸。就下限而言，编码序列具有至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少50个核苷酸或至少100个核苷酸的长度。就上限而言，编码序列的长度不超过300、不超过200或不超过166个核苷酸。

目的多肽的非限制性实例包括抗体，如单结构域抗体、单链抗体、抗体片段(例如scFv或Fab片段)、生长激素(例如胰岛素)、激素或生长因子的受体；CD蛋白如CD-3、CD4、CD8和CD-19；白介素；干扰素；T细胞受体；酶；病毒抗原；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白(例如TAT蛋白)；和任何上述多肽的片段。在一些实施方案中，目的多肽是单结构域抗体，其包含单个单体可变抗体结构域，例如单个VHH结构域。在一些实施方案中，所述单结构域抗体是抗CD40配体(“抗CD40L”)单结构域抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是Letolizumab。

在一些实施方案中，编码序列编码选自SEQ ID NO:23、24、25和27的氨基酸序列。

在一些实施方案中，编码序列位于环状DNA模板中的启动子序列和G4四重体基序之间。在一些实施方案中，编码序列在表达构建体中。在一些实施方案中，编码序列具有选自SEQ ID NO:14、16、18和26的序列。

本发明产生的目的多肽可用于一种或多种以下目的或作用：抑制传染原的生长、感染或功能，或杀灭传染原，包括但不限于细菌、病毒、真菌和其它寄生虫；影响(抑制或增强)身体特征，包括但不限于身高、体重、毛发颜色、眼睛颜色、皮肤、脂肪-瘦肉比或其他组织色素沉着，或者器官或身体部分大小或形状(例如，乳房增大或缩小，骨形式或形状的改变)；影响生物节律或生理周期或节律；影响雄性或雌性受试者的生育力；影响膳食脂肪、脂质、蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质、辅因子或其它营养因子或组分的代谢、分解代谢、合成代谢、加工、利用、储存或消除；影响行为特征，包括但不限于食欲、性欲、压力、认知(包括认知障碍)、抑郁(包括抑郁障碍)和暴力行为；提供止痛作用或其它疼痛减轻作用；促进造血谱系以外的谱系中的胚胎干细胞的分化和生长；激素或内分泌活性；在酶的情况下，纠正酶的缺陷并治疗缺陷相关的疾病；治疗过度增殖性障碍(例如银屑病)；免疫球蛋白样活性(例如，结合抗原或补体的能力)；以及在疫苗组合物中作为抗原引起针对这种蛋白质或与这种蛋白质交叉反应的另一种物质或实体的免疫反应的能力。

本发明产生的多肽可用于本领域技术人员已知的任何目的。优选的用途包括医疗用途，包括诊断用途、预防和治疗用途。例如，这些蛋白质可用于局部施用或其他类型的施用。另一种优选的医疗用途是制备疫苗。因此，将本发明产生的蛋白质溶解或悬浮在药理学上可接受的溶液中，以形成用于向受试者施用的药物组合物。用于医疗目的的合适的缓冲剂和药物组合物的施用方法在下文进一步阐述。本领域技术人员将会理解，医用组合物也可以施用于除人之外的受试者，例如用于兽用目的。

RNA聚合酶

本公开中的RNA聚合酶可以是任何能够识别上述DNA模板中的启动子的RNA聚合酶。RNA聚合酶的非限制性实例包括T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶或T3RNA RNA聚合酶。

转录

滚环转录可以在包含一种或多种以下组分的反应混合物中进行：如上所述的环状DNA模板、识别目的基因与之可操作连接的启动子的RNA聚合酶(例如T7聚合酶)和任选地一种或多种针对与模板可操作地连接的任选的调控序列的转录因子、核糖核苷酸三磷酸(rNTP)、缓冲剂和任选地其它转录因子和辅因子。

滚环转录可以在合适的温度例如25℃-40℃或约37℃下进行。转录反应可持续1小时至过夜的时间段。

任选地，在滚环转录结束时，使用本领域熟知的方法从反应混合物中纯化RNA转录物。在一个实施方案中，可以使用管式PAGE柱，例如获自Bio-Rad(Hercules，CA)的Prepcell491，从转录混合物中纯化RNA。

具有G-四重体基序的DNA多联体的产生

在一些实施方案中，具有G-四重体基序的DNA多联体可以通过使用如上所公开的环状DNA模板进行滚环扩增来产生。这些DNA多联体可以形成DNA水凝胶。

可以使用具有链置换活性的DNA聚合酶进行滚环扩增，即能够置换合成过程中遇到的下游DNA。具有链置换活性的DNA聚合酶能够产生具有与环状DNA模板互补的序列的多个拷贝的DNA多联体。可用于进行滚环扩增的合适DNA聚合酶包括但不限于Phi29聚合酶、Bst DNA聚合酶、大片段和Deep-Ventr DNA聚合酶，所有这些都可获自新英格兰生物实验室(Ipswich，MA)。

G-四重体

如上所述产生的核酸多联体可以形成G-四重体。图1A示出示意性框架，其中将核酸多联体中的G-四重体基序进行组装以形成RNA G-四重体(图1A中显示为“G4”)。包含编码HiBiT的序列的RNA G-四重体被称为H-RG4。如图1A所示，G-四重体通常包括四链螺旋核酸结构，其包含多个堆叠的G-四联体，其每个由四个通过Hoogsteen氢键以环状方式结合的鸟嘌呤碱基组成。这些G-四联体可进一步通过与中心的阳离子(例如K⁺或Na⁺)配位进行稳定。堆叠的G-四联体的主体(包含总共2层或更多层)统称为G-四联体核心。构成G-四联体核心的四个鸟嘌呤列中的每一个可以由单个(连续列)或两个(不连续列)单独的鸟嘌呤片段产生。在Phan,FEBS J.277,1107–1117(2010)中讨论了G-四重体的性质，其全部公开内容通过引用并入本文。

G四重体可通过众所周知的结合测定进行检测。在一些实施方案中，它们可以通过涉及荧光开启配体硫黄素T(ThT)的测定进行检测。Umar等人(2019)和Mohanty等人(2013)。G四重体与ThT的结合将显著增强荧光强度，荧光强度的显著增强的检测将表明G四重体的存在。通过滚环转录产生的RNA转录物能够产生G四重体。图2B显示了一个说明性实施例，其中使用ThT检测方法在488nm处观察到荧光强度的显著增强，表明G-四重体的存在。

在一些实施方案中，当G四重体与氯化血红素复合时，也可以通过检测与自生物素化相关的信号可视化，如Li等人(2019)所公开的。在一个说明性实施方案中，在H₂O₂和生物素酪胺的存在下将G-四重体与氯化血红素混合。适当形成的G-四重体自生物素化，并且添加到G-四重体的生物素基团将能够与链霉亲和素结合并产生明亮的信号。如图13所示，包含短的G四重体RNA的拷贝UAGGGUUAGGGU(SEQ ID NO:2)产生亮斑点，证明其能够形成RG4四重体。相反，如缺乏这些斑点所表明的，包含短的乱序的RNA：UACUGUUACUGU(SEQ ID NO:13)的拷贝的RGx多联体不能形成四重体。

宽条带水凝胶

在一些实施方案中，将两个核酸多联体组合以形成单一水凝胶，其被称为宽条带水凝胶。两个核酸多联体中的每一个可以通过从环状DNA模板滚环转录或滚环扩增产生，并且每一个包含启动子和G4四重体基序。两个环状DNA模板中的一个还包含间隔区，另一个还包含目的多肽的编码序列。上述任何间隔区和编码序列可用于本文公开的环状DNA模板中以产生宽条带水凝胶。

在一些实施方案中，两个核酸多联体都是DNA多联体。在一些实施方案中，这两个核酸多联体是RNA多联体。由两个RNA多联体形成的宽条带水凝胶称为W-RG4。图18A说明了由两个环状DNA模板的滚环转录形成的示例性宽条带水凝胶。

用于两个环状DNA模板的启动子可以相同或不同。类似地，两个环状DNA模板中的G四重体基序可以相同或不同。本申请中公开的任何启动子和G四重体基序可用于形成本申请中公开的宽条带水凝胶。

两个模板的比率

本发明人惊讶地发现以适当的比例使用两个DNA环状模板可以提高翻译效率。第一环状DNA包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)包含多胸腺嘧啶的间隔区。第二环状DNA模板包含(i)第二启动子序列，(ii)与第二G-四重体基序互补的序列，和(iii)目的多肽的编码序列。包含间隔区的环状DNA模板也称为“间隔区模板”，包含编码序列的环状DNA模板也称为“编码模板”。在一些实施方案中，在间隔区和编码模板的混合物中间隔区模板的摩尔分数范围为25％至75％。如图18B-18D所示，包含摩尔分数为25％至75％的间隔区模板的混合物均产生足够高量的目的多肽(图18中的HiBiT多肽)。摩尔分数为75％的间隔区模板显示出了最高的产量。

在一些实施方案中，间隔区模板包含选自SEQ ID NO:6-9的序列，且编码模板包含选自SEQ ID NO:14、16和18的序列。

在一些实施方案中，编码序列的长度与间隔区序列的长度的比率在1:0.2至1:2的范围内或为约1:1。

质粒宽条带水凝胶

在一些实施方案中，宽条带水凝胶通过1)从包含间隔区(“间隔区模板”)和G四重体基序的环状模板的RCT产生的RNA多联体，和2)从包含如上所述的目的多肽的编码序列的表达构建体转录的mRNA的凝胶化形成。在一些实施方案中，由表达构建体中的编码序列编码的目的肽由至少20个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少60个氨基酸残基组成。在一个实施方案中，编码序列编码单结构域抗体。在一个实施方案中，编码序列编码抗CD40L单结构域抗体(SEQ ID NO:26)。在一些实施方案中，表达构建体包含SEQ ID NO:27的序列。在一个实施方案中，W-RG4水凝胶通过1)从包含SEQ ID NO:7的环状DNA模板的RCT产生的RNA多联体和2)从包含SEQ ID NO:26的质粒转录的mRNA的凝胶化形成。

在一些实施方案中，表达构建体与间隔区模板的摩尔比可以在1:2至1:400的范围内，例如1:5至1:200、1:10至1:120或1:12至1:102。

可使用的表达构建体(例如质粒)的非限制性实例包括pK7、pIVEX、pET、pTXB、pUC和pF3K。在一些实施方案中，转录混合物中使用的间隔区模板与质粒的摩尔比在1:1至1000:1，例如10:1至200:1的范围内。

凝胶化

由核酸多联体(或如宽条带系统中的两个核酸多联体)形成的G-四重体(例如RG4)可以自组装成水凝胶。该形成通过由G-四重体基序中鸟嘌呤之间的非共价相互作用促进。G-四重体水凝胶可以通过在环境温度(例如，20℃-40℃)下向核酸中添加各种流体，如血清、人工泪液或细胞培养基，或磷酸盐缓冲盐水来即时制备。在一些实施方案中，凝胶化可能需要0-100小时，例如3-60小时或3-48小时。在一些实施方案中，凝胶化可能需要例如3、6、9、12、24或48小时。

凝胶化可通过各种方法进行检测。凝胶化的常见诊断测试之一是小瓶倒置测试。通过颠倒放置含有样品的小瓶并观察样品是否在其自身重量下流动来进行小瓶倒置测试。如果样品在其自身重量下不流动，则它是凝胶。

如图1A-1G所示，包含SEQ ID NO:2序列的拷贝的示例性RG4形成了水凝胶(RG4水凝胶)。水凝胶的形成立即可见，并且水凝胶体积在0-48小时的时间内增长。RG4的凝胶化形成了单块材料，当使用小瓶倒置测试进行测试时，该材料表现出对抗重力的强弹性。相反，包含SEQ ID NO:13的序列的拷贝的RGx不形成水凝胶；相反，它产生立即滑动到容器底部的粘性非凝胶溶液。

水凝胶表征

结构

当放置在各种不同多边形模具中时，如上所述形成的水凝胶(RG4或W-RG水凝胶)可以模制成不同的形状。例如，本文公开的水凝胶可模制成圆形、三角形、矩形和星形(图1C)以及3D圆柱形(图1D)。本文公开的水凝胶全部具有互连的多孔结构，其可以通过成像分析例如共焦成像分析进行检测。示例性成像结果展示于图9和图1E中，其表明在RG4水凝胶中存在周期性互连的多孔结构。

粘弹性和机械性能

本文公开的RG4凝胶具有优异的粘弹性和机械性能，使得它们成为可用于多种生物应用的理想平台。可以使用各种方法来评估这些性质。在一些实施方案中，水凝胶的粘弹性能可使用本领域熟知的方法测试，例如旋转测定法、振荡测定法和垂直测定法，如www.rheologytestingservices.com/中所述，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，温度扫描流变测试用于测量随温度斜坡增加和减少的粘度变化。在一些实施方案中，水凝胶的粘弹性能可通过使用旋转流变仪例如ARES-G2(TA Instruments，Newcastle，DE)进行测试。

在一些实施方案中，水凝胶的刚度可以使用杨氏模量测试来评估。杨氏模量测试定义了在单轴变形的线性弹性方案下材料中应力(单位面积的力)和应变(比例变形)之间的关系。在一个实施方案中，如Hermann等人所述(2001)，通过在从曲线斜率获得的厘米尺度上的压缩测试来测定杨氏模量。通过在本文公开的RG4凝胶的厘米尺度上的压缩测试测定的杨氏模量通常在12kPa-100kPa的范围内，例如20kPa-58kPa或约38.4kPa。如图3A所示，本文制备的RG4凝胶的模量在6-50kPa的范围内，这与先前报道的软凝胶(23，24，25)相当。

在一个实施方案中，使用纳米尺度上的基于原子力显微镜(AFM)的压痕测试方法。基于AFM的测试通常使用力曲线来分析软和水化样品的弹性模量。使用基于AFM的压痕测试的方法是众所周知的并且如(26，27)中所述。本文公开的RG4凝胶表现出优异的模量的时间依赖性增加，并且模量的时间依赖性增加令人惊讶地显著高于对于基于DNA的凝胶所报道的。在一个实施方案中，48小时下的模量的时间依赖性增加在5至20kPa(例如，约10.93kPa)的范围内。图14A和图14B中示出了一个说明性示例。

在一些实施方案中，水凝胶的储能模量可以使用动态力学分析方法测定。参见Encyclopedia of Polymer Science and Technology,DOI:10.1002/0471440264.pst102.pub2。通常，这些方法通过进行强制振荡测量来分析聚合物材料的粘弹性。在一个实施方案中，可以使用动态频率扫描测量水凝胶的储能模量。如24h下高于损耗模量的储能模量(图14C和14D)所表明的，本文公开的RG4凝胶具有主要的固体样结构。此外，RG4凝胶显示出高储能模量，比RGx溶液的储能模量高10倍以上，参见图3B。

水凝胶的水保持和吸收能力可以使用(31)中大体描述的方法进行分析。在一个实施方案中，通过测量凝胶的体积脱水和再水化比率来测定水保持和吸收能力。具体地，测量初始质量所需的新鲜制备的水凝胶的质量和再水化质量所需的干燥水凝胶的质量以评估RG4水凝胶的保水性和吸水性。水保持和吸收能力可使用以下等式1计算。

Q：溶胀度，溶胀水凝胶相对于干燥凝胶(无介质的纯凝胶材料)体积的体积比，表示水凝胶在溶胀时的体积增加

ρ_1：溶胀介质(DI水)的密度

ρ_2：聚合物(不包括溶胀介质的凝胶组分)的密度

m_sw：溶胀凝胶的质量

m_d：干燥凝胶的质量

本申请中公开的RG4凝胶具有优异的水保持和吸收能力。本文公开的RG4水凝胶通常具有500％至5000％的溶胀度。图3C中显示了一个说明性实例，其中溶胀度为1164.1％。

另外，RG4水凝胶能够经历溶胀-再水化循环，表现出至少400％、至少500％的再溶胀度。在一个说明性实施方案中，RG4水凝胶显示出734.2％的再溶胀度(或再水合度)(图3C，“再水化”)。再溶胀度是当脱水凝胶与水或水溶液接触并变得再水化时的溶胀度。在一个实施方案中，再溶胀度由再水化水凝胶(与水或水溶液接触后)与脱水水凝胶的体积比表示。因此，RG4水凝胶能够保持高水含量环境，翻译可以在该环境中以高效率发生。

本文公开的RG4凝胶具有高扩散性。它允许反应组分和产物(例如核糖体)自由扩散，并且还允许它们通过水凝胶的孔进入和外出。这些特征使翻译效率得以进一步提高。水凝胶的扩散性可以通过测量试剂(例如ThT或核糖体)在水凝胶上的扩散速度来评估。扩散速度可由共聚焦显微镜上捕获的试剂的传播距离和扩散所需的时间来确定。在一个示例性实施方案中，进入G4-RNA水凝胶的扩散速度的理论计算可使用以下等式(32)计算。

r_s：溶质半径，硫黄素T(47)为0.7nm，原核核糖体大亚基为5nm(48)。k：介质的水力渗透性。

无限稀释时的扩散率(D₀)，不考虑水凝胶的孔隙率，由以下Stokes-Einstein溶液扩散定律(49)给出：

K_b：玻尔兹曼系数，1.38065×10^-23JK^-1

η：介质溶剂的动态粘度，20℃时为1.0016mPa·s，37℃时为0.696mPa·s(50)

介质的水力渗透性给出如下(51)：

r_f：水凝胶的孔半径，通过AFM图像估计为5.65nm(图3E)，和通过定量RNA估计为13.1nm(图15)

聚合物在凝胶中的体积分数，由干燥水凝胶的质量估计，0.0852扩散溶质的摩尔扩散通量(J)由Fick第一定律(52)给出如下：

C：溶质摩尔浓度，ThT为10μM，核糖体为2.4μM

x：扩散溶质的移动距离，ThT为573.4μm，水凝胶垫为10μm

输送到多孔水凝胶中的溶质的扩散速度(v)如下给出(53)：

在一个实例中，核糖体完全扩散到20μm深的水凝胶(33)中所需的时间在4.5至5.5μm/s的范围内。在一些情况下，核糖体在水凝胶的一侧在1.8秒和2.2秒中扩散10μm。参见图3D。

可使用各种方法测量水凝胶的孔径。在一个实施方案中，孔径被估计为RG4水凝胶中G4结构之间计算的平均距离和/或基于来自AFM图像的孔径估计(图3E和图15)。在一些实施方案中，当使用由原子力显微镜(AFM)图像测定的水凝胶中G4结构之间的平均距离作为孔径时，RG4水凝胶的孔径在1-30nm的范围内，例如2-25nm、3-10nm或约5.65nm。

功能：

本文公开的RG4水凝胶不仅可以用作各种应用的支架，而且可以增强与其形成复合物的生物活性剂(例如酶)的活性。在一些实施方案中，当与酶形成复合物时，RG4可以增强过氧化物酶(例如氯化血红素)的活性。这种增强可以通过涉及酶的底物的比色反应进行检测，例如，2,2'-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的比色变化。参见图2C。在宽的pH范围(例如pH 4.9-pH 7.9)内检测到提高的过氧化物酶活性(由A₃₉₅nm吸光度的增加所反映)。参见图12。这表明凝胶中的G4交联除了用作支架外还可提高酶活性。

因此在一些实施方案中，本公开提供了与生物活性剂复合的上述公开的RG4水凝胶，并且任选地，RG4增强了生物活性剂的活性。相对于未与RG4水凝胶复合的生物活性剂的活性，增强可以是至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％。

合适的生物活性剂包括但不限于生物或化学化合物，如多肽、酶(例如过氧化物酶)、抗体、生长因子、抗原、脂质体、小干扰RNA或多核苷酸、治疗剂(例如药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、抗体、抗体-药物缀合物、光活性剂或染料和放射性同位素)或化学引诱物。生物活性剂可以是天然存在的或人工合成的。

稳定性

本文公开的RG4水凝胶是稳定的，具有至少30小时、至少35小时或至少40小时的半衰期。当与核酸水凝胶结合使用时，术语“半衰期”是指凝胶中的核酸含量减少至其初始量的50％所需的时间。RG4水凝胶的半衰期显著长于RGx溶液(图4E)。如实施例6，图4A所示，示例性RG4能够在48.9小时期间保持其初始RNA含量的至少53.4％；而RGx在38.3小时后仅保持其初始RNA含量的21.6％。在相同条件下，RG4凝胶比RGx降解得更慢，这可能是由于RG4具有高度整合性质的事实。

产率

不仅RG4中的RNA降解较慢，而且RG4中G四重体的形成延长了转录阶段中的RNA合成时间。如图4F所示，与RGx相反，RG4中RNA的量从转录反应开始4小时后持续增加。RG4凝胶的这种延长的转录时间和高稳定性使得在RCT期间可以产生大量的RNA。在图4F所示的一个说明性实例中，RG4水凝胶的RNA产率比RGx溶液高至少3倍。这种高RNA产率将有助于下游翻译过程中的高蛋白产量。

无细胞蛋白质生产

如本文所述制备的RG4水凝胶可用于无细胞蛋白质合成。在一些实施方案中，翻译与转录解偶联，使得RG4水凝胶在翻译起始之前形成。无细胞蛋白质合成翻译混合物可包括但不限于一种或多种细胞提取物/裂解物、ATP或能量源(例如丙酮酸，葡萄糖和谷氨酸)、辅因子、酶和多肽服务所必需的其它试剂，例如核糖体、tRNA、多胺聚合酶转录因子、氨酰合成酶、伴侣蛋白、延伸因子、起始因子等。可用于无细胞蛋白质合成系统的其它组分在Spirin&Swartz(2008)Cell-free Protein Synthesis,Wiley-VCH,Weinheim,Germany的无细胞合成方法中进行了描述。

在一些实施方案中，用于翻译反应的细胞裂解物(也称为裂解物)可以通过在保持转录和/或翻译机制的条件下裂解细胞来制备。可用于制备细胞裂解物的细胞类型的非限制性实例包括大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞、兔网织红细胞、小麦胚芽细胞和Hela细胞。在一些实施方案中，细胞裂解物包括翻译所需的组分。这些组分包括核糖体、氨基酸、tRNA、tRNA合成酶、能量源(磷酸肌酸)、肌酸激酶和/或其任意组合。细胞裂解物及其生产方法也公开于Kuruma and Ueda Nature Protocols 10,1328-1344(2015)和Gregorio et al.,Methods.Protoc.2019 Mar；2(1):24，其全部公开内容通过引用并入本文。无细胞蛋白质合成试剂是可商购的，例如从New England Biolabs(Ipswich，MA)。

如果水凝胶是DNA水凝胶，可以首先使用适合体外转录的试剂和条件将其转录成RNA，如上所讨论的，然后使用本文公开的无细胞蛋白质系统进行处理。

本文公开的核酸水凝胶，例如W-RG4凝胶，可以大量生产蛋白质。在一个说明性实例中，W-RG4的蛋白质表达产率显示出相对于游离DNA模板(fDNA)表达HiBiT(11个氨基酸的肽标签—)提高了117倍，并且相对于游离RNA(fRNA)模板提高了8倍。游离DNA/RNA模板是指溶液中的DNA/RNA。参见图5B。

任选地，可以改变参数如离液处理、反应时间、温度、体积以使核酸水凝胶蛋白质生产系统的蛋白质产率最大化。在一种方法中，控制翻译反应以使其持续不超过12小时、不超过10小时、不超过6小时、不超过5小时、不超过4小时、不超过3小时或不超过2小时。在一个示例性测定中，蛋白质生产在翻译起始后约2小时左右达到峰值。参见图21A。为了控制反应时间，在使翻译进行预定时间长度(例如从翻译起始起2、3、12或48小时)后，使反应混合物经受高温，例如约95℃，以使翻译所需的酶变性，从而终止蛋白质产生。或者，可添加一种或多种离液剂(例如8M尿素)以终止翻译。

在一种方法中，将反应温度控制在16℃至37℃范围内，例如25℃的温度。参见图21D。在另一种方法中，向翻译混合物中添加一种或多种可增加蛋白质溶解度的试剂，例如通过溶解聚集的肽，改善蛋白质表达。这类试剂的非限制性实例包括表面活性剂，例如吐温-20、Triton X-100、CHAPS或SDS。参见图21B。在又一种方法中，可以优化添加到无细胞合成系统中的W-RG4水凝胶的体积以增加蛋白质产量。在一个实施方案中，所使用的W-RG4的体积在3至22μL的范围内。在又一种方法中，将翻译反应混合物(包括W-RG4)的体积控制在50-200μL的范围内，例如150μL，以实现高蛋白质产率。参见图21E。

在翻译过程结束时可以收获并纯化蛋白质。用于蛋白质纯化的方法，色谱、电泳、离心和结晶描述在Coligan et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York。

裂解物包埋的水凝胶

在一些实施方案中，将如上所述的细胞裂解物添加到产生RG4多联体的转录反应中。由这些RG4多联体形成的水凝胶含有细胞裂解物，并因此它们在本文中称为裂解物包埋的水凝胶(例如裂解物包埋的W-RG4水凝胶)。相反，在不存在任何细胞裂解物的情况下由转录物形成的水凝胶被称为无裂解物的水凝胶。除非另外特别指出，本公开中公开的W-RG4水凝胶是无裂解物的W-RG4水凝胶。

细胞裂解物与转录混合物(不包括细胞裂解物)的体积比可以变化。在一些情况下，体积比在1:1至1:3的范围内，例如约1:2或约1:2.5。

令人惊讶的是，在相同的翻译条件下，这些裂解物包埋的水凝胶能够以比相应的无裂解物的水凝胶高得多的产率产生蛋白质，并且蛋白质产率在比相应的无裂解物的水凝胶更短的时间内达到峰值水平。裂解物包埋的W-RG4及其相应的无裂解物的W-RG4共有相同的核酸组分。图5J显示了一个说明性实例。图5J显示与含有由大肠杆菌细胞制备的裂解物的翻译混合物孵育3小时时，裂解物包埋的W-RG4(“L-L-凝胶”)产生的蛋白质量显著高于无裂解物的对应物(“原凝胶”)。

还发现，希望的是控制用于产生裂解物包埋的水凝胶的转录反应的持续时间。如果转录进行相对长的时间(例如48小时)，则W-RG4水凝胶的生产效率可能降低。参见图5I。因此，在一些实施方案中，当使用裂解物包埋的水凝胶时，转录反应时间的持续时间是48小时或更少，例如40小时或更少，30小时或更少，20小时或更少，10小时或更少，5小时或更少，或约3小时。在一些实施方案中，转录反应的持续时间范围为1小时至40小时，2小时至20小时，2.5小时至10小时或约3小时。

在一些实施方案中，裂解物包埋的水凝胶与不含任何细胞裂解物的翻译混合物组合。如图5J所示，当在翻译过程中仅与进料溶液(也称为蛋白质合成缓冲剂)孵育且无任何大肠杆菌细胞裂解物的补充时，裂解物包埋的水凝胶(“L-凝胶”)能够产生足够量的蛋白质。进料溶液通常包含氨基酸和一种或多种适用于翻译的缓冲剂和盐。在一些实施方案中，进料溶液还包含能量转换酶(例如肌酸激酶)。该结果表明裂解物包埋的W-RG4可用于植入或注射的治疗应用，其中优选或要求在翻译混合物中不提供外来裂解物。

进一步改进蛋白质生产的另外的修饰

如上所述，W-RG4水凝胶可以高效率和高产率生产蛋白质。在一些实施方案中，切割水凝胶以改善翻译组分的可接近性，从而进一步改善翻译效率。可以通过各种方式引入切割，例如通过使用移液管尖端刺穿水凝胶。对水凝胶进行的切割的数目称为切割数。在一些实施方案中，W-RG4具有在250至400范围内的切割数，例如约300。图19中示出一个说明性实例，其证明具有300的切割数的W-RG4凝胶可以进一步提高蛋白质生产。

试剂盒

本申请还提供了用于表达目的多肽的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含能够通过与夹板寡核苷酸杂交形成环状DNA模板的单链DNA分子。环状DNA包含(i)启动子序列，(ii)与G-四重体基序互补的序列，和(iii)目的多肽的编码序列或间隔区。夹板寡核苷酸与启动子序列互补。

在一些实施方案中，试剂盒包含能够通过与第一夹板寡核苷酸杂交形成第一环状DNA模板的第一单链DNA分子、能够通过与第二夹板寡核苷酸杂交形成第二环状DNA模板的第二单链DNA分子。第一环状DNA包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)或间隔区。第二环状DNA包含(i)第二启动子序列，(ii)与第二G-四重体基序互补的序列，和(iii)或间隔区。试剂盒可进一步包含具有与第一启动子序列互补的序列的第一夹板寡核苷酸和/或具有与第二启动子序列互补的序列的第二夹板寡核苷酸。在一个实施方案中，第一和/或第二裂解寡核苷酸具有SEQ ID NO:12的序列。

本文公开的试剂盒可以进一步包含一种或多种用于进行DNA模板的环化和/或滚环转录的试剂。这些试剂包括但不限于连接酶、RNA聚合酶、一种或多种核糖核苷三磷酸(rNTP)和适于转录的缓冲剂。

在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含一种或多种适于体外翻译的试剂，例如核糖体和氨基酸的混合物。

提供以下实施例用于说明性的目的，而不是为了限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到各种非关键参数，这些参数可以改变或修改以产生基本相同的结果。

实施方案1.第一环状DNA模板，其包含(i)第一启动子序列和(ii)与第一G-四重体基序互补的序列。

实施方案2.如实施方案1所述的第一环状DNA模板，其中所述第一启动子序列与互补核酸序列杂交以形成第一部分双链的DNA分子，其中所述第一部分双链的DNA分子包含双链区和单链区，其中所述双链区包含与所述互补核酸序列杂交的所述第一启动子序列，并且其中所述单链区包含与所述第一G-四重体基序互补的序列。

实施方案3.如前述实施方案中任一项所述的第一环状DNA模板，进一步包含间隔区，其中所述间隔区包含多胸腺嘧啶。

实施方案4.如前述实施方案任一项所述的第一环状DNA模板，进一步包含目的多肽的编码序列。

实施方案5.如前述实施方案中任一项所述的第一环状DNA模板，其中所述与第一G-四重体基序互补的序列包含序列ACCCTAACCCTA(SEQ ID NO:1)。

实施方案6.前述实施方案中任一项所述的第一环状DNA模板，其中所述第一启动子序列选自T7启动子、T3启动子、Lac启动子、araBad启动子、Trp启动子、Tac启动子和SP6启动子。

实施方案7.一种第一核酸多联体，其包含多个单体，其中每个单体包含(i)第一G-四重体基序，和(ii)包含多胸腺嘧啶的间隔区或目的多肽的编码序列。

实施方案8.如实施方案7所述的第一核酸多联体，其中所述第一核酸多联体是RNA多联体，其中所述第一G-四重体基序包含UAGGGUUAGGGU(SEQ ID NO:2)。

实施方案9.如实施方案7-8中任一项所述的第一核酸多联体，其中所述第一核酸多联体是DNA多联体，其中所述第一G-四重体基序包含TAGGGTTAGGGT(SEQ ID NO:20)。

实施方案10.一种核酸水凝胶，其包含实施方案7-9中任一项所述的第一核酸多联体。

实施方案11.一种蛋白质表达系统，其包含如实施方案10所述的核酸水凝胶、核糖体和/或氨基酸混合物。

实施方案12.一种组合物，其包含第一环状DNA模板和第二环状DNA模板，其中所述第一环状DNA模板包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)包含多胸腺嘧啶的间隔区，其中所述第二环状DNA模板包含(i)第二启动子序列，(ii)与第二G-四重体基序互补的序列，和(iii)目的多肽的编码序列；并且其中所述第一环状DNA模板相对于所述第一和第二环状DNA模板总量的摩尔分数在25％至75％的范围内。

实施方案13.如实施方案12所述的组合物，(1)其中所述第一启动子序列与互补核酸序列杂交以形成第一部分双链的DNA分子，其中所述第一部分双链的DNA分子包含双链区和单链区，其中所述第一部分双链的DNA分子的双链区包含与所述互补核酸序列杂交的第一启动子序列，并且其中所述第一部分双链的DNA分子的单链区包含与所述第一G-四重体基序互补的序列；且

(2)其中所述第二启动子序列与互补核酸序列杂交以形成第二部分双链的DNA分子，其中所述第二部分双链的DNA分子包含双链区和单链区，其中所述第二部分双链的DNA分子的双链区包含与所述互补核酸序列杂交的第二启动子序列，并且其中所述第二部分双链的DNA分子的单链区包含与所述第二G-四重体基序互补的序列。

实施方案14.如实施方案12或13所述的组合物，其中所述第一G-四重体基序和所述第二G-四重体基序包含相同的核苷酸序列。

实施方案15.如实施方案12-14中任一项所述的组合物，其中所述第一启动子序列和所述第二启动子序列包含相同的核苷酸序列。

实施方案16.如实施方案12-15中任一项所述的组合物，其中所述第一启动子序列和所述第二启动子序列包含不同的核苷酸序列。

实施方案17.如实施方案12-16中任一项所述的组合物，其中间隔区包含30-120个胸腺嘧啶(SEQ ID NO:32)。

实施方案18.如实施方案12-17中任一项所述的组合物，其中所述编码序列具有在20至300个核苷酸范围内的长度。

实施方案19.如实施方案12-18中任一项所述的组合物，其中编码序列与间隔区的长度比在1:0.2至1:2的范围内。

实施方案20.如实施方案12-19中任一项所述的组合物，其中所述目的多肽选自胰岛素、反式激活转录激活物(TAT)、HiBiT和单结构域抗体。

实施方案21.实施方案12-20中任一项所述的组合物，进一步包含一种或多种RNA聚合酶、核糖核苷酸的混合物和/或缓冲剂。

实施方案22.如实施方案12-20中任一项所述的组合物，其还进一步包含具有链置换活性并因此能够进行滚环扩增的DNA聚合酶。

实施方案23.一种组合物，其包含环状DNA模板和双链DNA构建体，其中所述环状DNA模板包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)包含多胸腺嘧啶的间隔区，其中所述双链DNA构建体包含(i)第二启动子序列，(ii)与第二G-四重体基序互补的序列，和(iii)目的多肽的编码序列。

实施方案24.一种核酸水凝胶，其包含第一核酸多联体和第二核酸多联体，其中所述第一核酸多联体通过实施方案12-20中任一项所述的组合物的第一环状DNA模板的滚环转录或扩增产生，并且其中所述第二核酸多联体通过如实施方案12-20中任一项所述的组合物的第二环状DNA模板的滚环转录或扩增产生。

实施方案25.一种核酸水凝胶，其包含第一RNA分子和第二RNA分子，其中所述第一RNA分子包含(i)第一G-四重体基序，和(ii)包含多腺嘌呤的间隔区，并且其中所述第二RNA分子包含(i)第二G-四重体基序，和(ii)目的多肽的编码序列。

实施方案26.如实施方案25所述的核酸水凝胶，其中所述第一RNA分子是包含多个单体的RNA多联体，其中每个单体包含所述第一G-四重体基序，及包含多腺嘌呤的所述间隔区或目的多肽的编码序列。

实施方案27.一种蛋白质表达系统，其包含实施方案24-26任一项所述的核酸水凝胶、核糖体和/或氨基酸混合物。

实施方案28.一种用于表达目的多肽的试剂盒，其中所述试剂盒包含(1)能够通过与第一夹板寡核苷酸杂交形成第一环状DNA模板的第一DNA分子，其中所述第一环状DNA模板包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)包含多胸腺嘧啶的间隔区，

(2)与所述第一启动子序列互补的第一夹板寡核苷酸，其中所述第一DNA模板可与第一夹板寡核苷酸杂交并进行环化以形成第一环状DNA模板，和/或

(3)能够通过与第二夹板寡核苷酸杂交形成第二环状DNA模板的第二DNA分子，其中所述第二环状DNA模板包含(i)第二启动子序列，(ii)与第二G-四重体基序互补的序列，和(iii)目的多肽的编码序列，

(4)与第二启动子序列互补的第二夹板寡核苷酸，其中所述第二DNA模板可与第二夹板寡核苷酸杂交并进行环化以形成第二环状DNA模板。

实施方案29.一种用于表达目的多肽的试剂盒，其中所述试剂盒包括如实施方案12-23中任一项所述的组合物。

实施方案30.如实施方案28或29所述的试剂盒，其中所述第一G-四重体基序和所述第二G-四重体基序具有相同或不同的序列。

实施方案31.如实施方案28或29所述的试剂盒，其中第一启动子序列和第二启动子序列相同或不同。

实施方案32.如实施方案28-31中任一项所述的试剂盒，其中间隔区包含30-120个胸腺嘧啶(SEQ ID NO:32)。

实施方案33.如实施方案28-32中任一项所述的试剂盒，其中所述编码序列具有20至300个核苷酸范围的长度。

实施方案34.如实施方案28-33中任一项所述的试剂盒，其中所述编码序列与所述间隔区的长度比在1:0.2至1:2的范围内。

实施方案35.如实施方案28-34中任一项所述的试剂盒，其中所述目的多肽选自胰岛素、HiBiT、反式激活转录激活物(TAT)和单结构域抗体。

实施方案36.如实施方案28-35中任一项所述的试剂盒，进一步包含一种或多种DNA连接酶、RNA聚合酶、核糖核苷酸的混合物和/或一种或多种缓冲剂。

实施方案37.如实施方案28-36中任一项所述的试剂盒，进一步包含具有链置换活性并因此能够进行滚环扩增的DNA聚合酶。

实施方案38.一种制备核酸水凝胶的方法，其包括：(1)提供第一环状DNA模板，所述第一环状DNA模板包含(i)第一启动子序列，和(ii)与第一G-四重体基序互补的序列；以及(2)对所述第一环状模板进行滚环转录或扩增以产生第一核酸多联体，其中所述第一核酸多联体形成核酸水凝胶。

实施方案39.如实施方案38所述的方法，其中所述第一环状DNA模板进一步包含间隔区，所述间隔区包含多胸腺嘧啶，其中所述步骤(1)进一步包括提供第二环状DNA模板，所述第二环状DNA模板包含(i)第二启动子序列，(ii)第二G-四重体基序，和(iii)目的多肽的编码序列，并且其中所述步骤(2)还包括对所述第二环状DNA模板进行滚环转录或扩增以产生第二核酸多联体，其中所述第一和第二核酸多联体形成核酸水凝胶。

实施方案40.一种在无细胞合成系统中生产蛋白质的方法，其中所述方法包括：将如权利要求10或24-26所述的核酸水凝胶与无细胞合成系统在允许目的多肽翻译的条件下进行组合。

实施方案41.如实施方案40所述的方法，其中所述无细胞合成系统包含核糖体和/或氨基酸混合物。

实施例

实施例1.材料

氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、琼脂糖、DMSO(二甲亚砜)、氯化血红素、ABTS和H₂O₂购自Sigma Aldrich。超纯无DNA酶/RNA酶蒸馏水、SYBR green II、ThT和FBS购自Invitrogen。30％丙烯酰胺-双-丙烯酰胺溶液(29：1)、APS(过硫酸铵)和10×TBE(Tris/硼酸/EDTA)缓冲液购自PanReac Applichem。生物素酪胺购自Iris Biotech，链霉亲和素购自Rockland Immunochemicals。尿素购自Daejung。

除非另有说明，否则将超纯无DNA酶/RNA酶蒸馏水用于所有实验。除非另外说明，否则本公开中的退火方案为以0.5℃/30秒从95℃逐渐冷却至4℃。

实施例2.RG4水凝胶的制备

通过使用滚环转录(RCT)转录的RNA的自组装制成RG4水凝胶。通过将线性模板与G-四重体部分、目的蛋白的编码序列和T7启动子连接来制备用于RCT的环状模板。将线性模板与包含部分互补序列和T7启动子引物的短链进行退火以形成环状模板。每条链的浓度在100mM NaCl中为45μM。退火的环状模板用T4DNA连接酶(Promega)连接。退火模板的浓度为10μM，且缓冲剂和T4DNA连接酶的体积由T4DNA连接酶试剂盒提供，其中0.1×的总连接溶液和混合物在16℃下孵育16小时。使用具有1μM连接的环状模板的Hiscribe T7高产量RNA合成试剂盒(New England Biolabs)转录RNA，随后在37℃下孵育。尽管预期在2小时的孵育后达到RNA的最大产率，但在转录起始后这一过程持续了48小时。所有模板使用相同摩尔数的起始材料。

用NdeI和SalI消化pIDTBlue质粒(Integrated DNAtechnologies，Coralville，IA)中的Letolizumab-G4，并克隆到pK7质粒中以产生pK7-Letolizumab-G4质粒。20ng的质粒用作无细胞表达的阳性对照，并将20ng质粒与0.125μM、0.25μM、0.5μM、0.75μM或1μM间隔区模板一起转录用于60T RG4以诱导凝胶化。

实施例3.水凝胶的表征

流变学分析

RCT产物的流变性质通过ARES-G2(TA Instruments)来表征，其中200μL的RCT产物在圆柱形模具中制备。

RG4水凝胶的显微分析

共焦显微镜分析。在盖玻片之间的薄制备RG4水凝胶用SYBRgreen II染色并通过LSM 710共焦显微镜(Zeiss)观察。

场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)分析。RG4水凝胶和RGx在-80℃下冷冻并冻干24小时。将冻干的样品用铱涂覆并使用SEM(JEM ARM200F,Jeol)在15.0kV的电压下表征。

AFM分析。使用具有铝回流涂层的市售DNP-S探针悬臂(0.12N/m的标称弹簧常数，10nm的尖端半径，16-28kHz的驱动频率)以ScanAsyst模式获得RCT产物的力-压痕曲线。趋近曲线通过拟合赫兹接触力学模型用于测量水凝胶的杨氏模量。使用具有Nanoscope V控制器(BrukerInc)的多模扫描探针显微镜在空气中使用峰值力轻敲模式分析RCT产物的表面形貌。将获得的形貌图像展平以去除背景斜率和对比度。我们将30μL转录混合物分配到云母基质上以确保RG4水凝胶的平坦制备。

链霉亲和素标记。在云母上制备RCT产物，并用200μL的100μM氯化血红素溶液(pH7.9的20mM磷酸盐缓冲液、1％DMSO、0.1％Triton-X，100mM NaCl，100mM KCl)孵育3小时。然后以5分钟间隔连续添加50μL 6mM的生物素酪胺(pH 7.9的20mM磷酸盐缓冲液、1％DMSO、0.1％Triton-X、100mM NaCl，100mM KCl)和50μL的4.5mM H₂O₂(pH 7.9的20mM磷酸盐缓冲液、1％DMSO、0.1％Triton-X、100mM NaCl，100mM KCl)。我们在去除反应溶液后添加10μL的10μM链霉亲和素溶液。在用100mM KCl彻底洗涤未结合的链霉亲和素之后进行形貌分析。

RG4水凝胶的光谱分析

RNA的定量。退火后使用RNA BR测定试剂盒(Invitrogen)用Qubit Flex荧光计(Invitrogen)测量转录的RCT产物的量，以确保所需的50倍稀释。

CD谱。用J-815CD谱仪(JASCO)在220nm至300nm的波长范围内记录CD谱以分别鉴定造成四重体和非四重体RNA形成类似物sG4和sGx的构象状态。

来自RG4-结合的ThT的荧光信号的表征。我们将10μL的1μM sG4和sGx与40μL的10μM ThT溶液在100mM NaCl和100mM KCl中混合，15分钟后通过荧光计(SpectraMax M5,Molecular Devices)测量荧光光谱(λ_ex＝440nm，λ_em＝460-510nm)。

RG4-结合的氯化血红素的酶活性。我们将10μL的转录的RCT产物与40μL的100μM氯化血红素溶液(pH 7.9的20mM磷酸盐缓冲液、1％DMSO、0.1％Triton-X、100mM NaCl，100mMKCl)一起孵育16小时。然后将25μL的3.2mM ABTS^2-(20mM磷酸盐缓冲液，pH从4.4至7.9变化、1％DMSO、0.1％Triton-X、100mM NaCl，100mM KCl)和25μL的0.3mM H₂O₂(20mM磷酸盐缓冲液，pH从4.4至7.9变化、1％DMSO、0.1％Triton-X、100mM NaCl，100mM KCl)伴随充分混合连续添加到溶液中。用分光光度计(SpectraMax M5,Molecular Devices)连续4小时对由ABTS^2-氧化成ABTS^·-引起的在λ＝390nm处的比色变化进行表征。

ThT向RG4水凝胶中的扩散。将浓度为10μM的ThT溶液添加到在盖玻片上制造的RG4水凝胶中，确保没有ThT被吸收到水凝胶的顶部或底部。

凝胶电泳分析

聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳(12％)用于对退火和连接的环状模板进行表征，且2％琼脂糖凝胶被用于对退火后的转录RNA进行表征。进行Pre-cast

Tris-tricine SDS-PAGE凝胶(16.5％)用于从总的无细胞表达中分离Letoluzimab蛋白。

降解的表征。我们将10μL RCT产物与40μL的100％FBS(胎牛血清)混合以提供富含核糖核酸酶的环境。为了表征RNA的总量，在每个时间间隔后将样品储存在-20℃以最小化血清的进一步影响，然后退火用于使用Weibull拟合模型进行凝胶电泳分析。

蛋白质表达

我们使用11μL的RCT产物作为模板，用于使用

无细胞大肠杆菌蛋白质合成系统(New England Biolabs)进行50μL批次的非偶联翻译。特意排除试剂盒中单独提供的T7聚合酶。除非另有说明，否则翻译在25℃下进行2小时。我们用移液管尖端刺穿蛋白质编码的RG4水凝胶以提高蛋白质表达产率，并且切割300次的凝胶显示了最佳的产率。将连接的DNA模板(1μM)、fDNA和fRNA模板以及等量的起始材料用作偶联翻译的对照模板。对于非偶联翻译，将11μL的75％W-RG4与小麦胚芽提取物在25℃下混合2小时，总体积为50μL，按制造商提供的说明书进行，除了使用10μg的fRNA。使用不同体积的模板溶液来估计蛋白质效率。

对于Letoluzimab的非偶联翻译，12μL的RCT产物作为模板，用于使用

无细胞大肠杆菌蛋白质合成系统(New England Biolabs)进行50μL批次的非偶联翻译。使用有意排除T7聚合酶的翻译试剂盒组分。发现当在30℃下翻译持续8小时时达到了最佳的蛋白质表达。

表达的HiBiT标记蛋白的发光的表征

我们将2μL的处理后的翻译产物与8μL的HiBiT检测试剂在

HiBiT细胞外检测系统(Promega)中混合。在4分钟的轨道振荡后，通过光度计(SpectraMax M5,Molecular Devices)表征所得发光信号。然后，在95℃下进行热抑制10分钟。将混合物与等体积的8M尿素孵育2小时以溶解聚集的蛋白质。相对发光单位(RLU)相对于空白单元的发光进行归一化处理。

实施例4.程序化RNA凝胶的设计和组装

选择来自天然端粒RNA重复序列(12，13)的二级结构中的G-四重体基序以制备程序性DNA驱动的RNA凝胶，其中从DNA模板转录的RNA用作构件块、交联剂和功能项。我们还在装配中嵌入作为多胸腺嘧啶(poly T)的间隔区序列或功能性基序如蛋白质编码部分。将单链DNA模板(SEQ ID NO:4-10中的任一个)和T7启动子引物(SEQ ID NO:12)进行退火以形成环状DNA，随后进行T4酶促连接(图1A和图6A)。RG4通过G4的二级结构结合自组装成三维(3-D)凝胶。将不能形成G4的有意乱序的碱基序列(Gx)(SEQ ID NO:10)制备为比较组，称为RGx。通过PAGE分析表征RG4和RGx。作为整体结构实体的RG4凝胶不穿过并保持在孔附近，而RGx迁移通过孔(图6B)。

使用小瓶倒置测试评价RG4相对于合成时间的凝胶化。在该实验中，从左到右，胶凝时间为对于RGx的0、48小时及对于RG4的0、3、6、9、12、24、48小时(图1B)。白色箭头指示RCT产物的位置(RG4中的凝胶相和RGx中的溶液相)。凝胶化的RG4表现为单一的块状材料，其在相反的重力作用下表现出强的弹性，而RGx产生粘稠的非凝胶溶液，其即时滑动至容器的底部，如图1B中白色向下箭头所示。

还测试了具有不同数目胸腺嘧啶(3T、10T(SEQ ID NO:38)、30T(SEQ ID NO:33)、60T(SEQ ID NO:34)、90T(SEQ ID NO:35)和120T(SEQ ID NO:36))的间隔区的长度以评价RG4的多样化凝胶化行为(图6B和6C)。通过环状模板的成功构建，具有30T至120T的间隔区完全凝胶化，并且观察到提高的转录产率。有趣的是，具有3T和10T(SEQ ID NO:38)的短间隔区的RG4不胶凝并保持在溶液状态，因为空间长度不足以使线性DNA环化(14)(图6B和6D)。值得注意的是，退火的RG4凝胶丧失了它们的凝胶特性，且甚至在各种温度下孵育后也不会重新获得它们(图7)。因此，与转录偶联的G4交联剂的延迟形成对于成功制造RG4凝胶是必要的。使用来自原子力显微镜(AFM)图像上的孔下平均面积评估具有各种间隔区长度的RG4凝胶的孔尺寸的拓扑差异：对于30T(SEQ ID NO:33)、60T(SEQ ID NO:34)和120T(SEQID NO:36)间隔区分别为100.1nm²、437.2nm²和3071.6nm²(图8)。

我们以厘米和微米尺度(图9A)将RG4凝胶精确地图案化为圆形、三角形、矩形和星形(图1C)和3-D圆柱形(图1D)。证实了凝胶基质中的孔和交联的表征(图1E和图9B)。冻干的RG4凝胶显示出褶皱的表面形态，其对应于RNA凝胶的互连孔或支架支撑性质。相比之下，RGx不能形成凝胶；相反，它显示出无孔的规则、非卷曲形态(图10)。

实施例5.RNA凝胶基质中的G-四重体交联剂的验证

工程化的RG4多联体(包含SEQ ID NO:2)的结构特征及其对盐溶液剂量的特异性反应通过其圆二色性(CD)谱中的椭圆率变化进行分析，其显示了G-四重体的平行折叠(15-17)(图2A和图11)。为了检测RNA多联体(sG4，包含SEQ ID NO:2，及sGx，包含SEQ ID NO:13)形成G-四重体结构的能力，使用了荧光开启配体硫磺素T(ThT)(18，19)。在488nm处观察到荧光强度的显著增强(图2B)，表明了ThT探针与RG4的特异性结合。

研究了RG4凝胶在与氯化血红素复合时执行过氧化物酶活性的能力，以在pH范围4.4至7.9中验证RG4凝胶中G4s的存在及其内在功能(图2C和图12)。G4结构域与氯化血红素的相互作用引起过氧化物酶活性的显著增强，其通过2,2'-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的比色变化进行表征。在较宽的pH范围内，除了作为支架，过氧化物酶活性和总效率的提高表明了凝胶中的G4交联指导酶活性(20，21)。G4模块与氯高铁血红素的内在活性也用于在AFM图像中通过自生物素化和链霉亲和素结合使G4可视化(22)。对于RG4(处理前和处理后)，通过亮斑点观察到了高度分布的差异，而RGx缺乏这样的亮斑点，证实了不存在G4和自生物素化位点(图13)。

实施例6.RG4凝胶的物理化学和机械性能的变化

测试RG4凝胶的杨氏模量以评估凝胶的机械性能。通过压缩测试在厘米尺度上测定的杨氏模量为38.4kPa，从曲线的斜率获得(23)(图3A)。模量明显在先前报道的软凝胶的范围内(24，25)。此外，纳米尺度的基于AFM压痕测试方法用于利用力曲线(26，27)分析软和水化样品的弹性模量。观察到与小瓶倒置测试(图1B)紧密对应的模量的时间依赖性增加，并且其在48小时下约为10.93kPa(图14A和图14B)，其显著高于对于基于DNA凝胶(28)所报道的。在24小时下储能模量总是高于损耗模量(图14C和图14D)，表明由于RG4凝胶中的交联区域(29，30)(图3B)，固体样性质是主要的。

通过测量凝胶的定量脱水和再水化比率来分析RG4凝胶的水保持和吸收能力(31)(图3C和等式(1)，如上所讨论的)。我们的原始RG4水凝胶表现出优异的保水能力，溶胀度为1164.1％，并且由于水和水凝胶网络之间的强相互作用，其保持其原始体积的1064.1％(28)。另外，RG4水凝胶能够经历溶胀-去溶胀循环，表现出高达734.2％的再溶胀度(图3C)。这些特性通过抵抗由粘性环境引起的反应滞后来提高转录产率(图6D)。

我们在实验上和理论上分析了ThT和核糖体扩散进入多孔水凝胶中的行为。在共焦显微镜上捕获ThT行进的距离，其在1550秒内为573.4μm(图3D)。我们选择模型来证实我们的理论假设，其定义了在多孔介质(32)中传输的分子的扩散率(等式(2)-(6)，如上所讨论的)。使用理论估计1和2，核糖体完全扩散到20μm深的水凝胶(33)所需的时间分别为1.8秒和2.2秒(图3D和下表2)。

表2

配体的扩散速度表明它们不仅能够在水凝胶网络内自由移动，而且允许试剂通过其可控的孔径进出。基于RG4水凝胶中G4结构之间的平均距离和AFM图像中的孔径估计来估计孔径(图3E和图15)。

使用琼脂糖凝胶电泳(图4B，图16)按时间顺序评估RG4和RGx(RG4凝胶和上清液)中RNA的量的降解研究(图4A)。直到3小时，RG4上清液中存在可忽略的量的RNA，而在48小时下观察到高达74％的RNA(图4C和图4D)。RG4对RNA的耐受时间(即48.9小时)比RGx(即38.3小时)长，各自的量为53.4％和21.6％。在相同条件下RGx比RG4降解更快，因为与溶液相(11)相比，RG4水凝胶具有高度整合的性质及凝胶形式的富集的RNA量(图4E)。RG4中RNA的量持续增加，其在12小时具有更高的产率，与RGx不同(图4F)。从提高的转录产率和低降解速率中观察到的增加的RNA量也将有助于提高由翻译这些RNA得到的蛋白质产率。

实施例7.通过RG4水凝胶增强各种蛋白质的表达

1.HiBiT

受RG4水凝胶的这些性质的影响，我们按照简图评估了其蛋白质生产能力(图5A)。我们用编码蛋白的序列(SEQ ID NO:21)替代多胸腺嘧啶间隔区，然后制备了RG4水凝胶，随后进行了蛋白的非偶联翻译。HiBiT，一种11个氨基酸的肽标签，广泛用于研究内源性表达的蛋白和在体外系统中难以表达的短蛋白分子的动力学(34)。HiBiT对大亚基

的高亲和力产生明亮的发光信号并简化了所表达的蛋白的检测。编码HiBiT的RG4(H-RG4)(以类似方式制造的具有SEQ ID NO:14的序列的环状DNA模板的RCT产物)似乎是粘性的，显示出非坚固性，尽管其具有固有的G4s，而它们的30T RG4水凝胶(具有SEQ ID NO:6的序列的相应环状DNA模板的RCT产物)成功地形成(图17A)。为了用我们的系统实现最佳实践，我们使用了一种方法，该方法通过用30T RG4(具有SEQ ID NO:6的序列的环状DNA模板的RCT产物)对H-RG4进行补充能够使H-RG4水凝胶化，以制备宽条带RG4(W-RG4)。将这些模板融合通过在混合时它们的多价相互作用产生坚固的水凝胶(11)(图18A-18C)。W-RG4在75％的混合比下具有提高的蛋白质效率(图18D)，弹性强度为9.71kPa(图18E)。然后将W-RG4切割300次(图19)。将W-RG4的蛋白表达产率与游离模板的蛋白表达产率进行比较，其中观察到相对于游离DNA模板(fDNA)的117倍增强和相对于游离RNA(fRNA)模板的8倍增强(图5B)。此外，通过改变离液处理、反应时间、类型、体积和温度参数实现了增强的体外蛋白质表达(图21)。

2.TAT和胰岛素

在这种信心下，我们对治疗性蛋白生产方面进行进一步探索，这是卫生保健系统的迫切需要。选择反式激活转录激活物(TAT)和胰岛素蛋白是由于它们在治疗中的重要性，其中可以使用RNA水凝胶递送蛋白质治疗剂的合理的制剂。本研究中使用的TAT编码序列包括HIV(人免疫缺陷病毒)TAT蛋白SEQ ID NO:24(35)的部分10个氨基酸功能性基本区域。本研究中使用的胰岛素编码序列包括人胰岛素SEQ ID NO:23(36)的30个氨基酸的B链。

与fDNA模板相比，嵌入有HiBiT标签的TAT和胰岛素模板(分别为SEQ ID NOs：16和18)在W-RG4中分别具有10倍和18倍的增加(图5C和图22)。表达HiBiT的非偶联翻译也使用小麦胚芽系统进行，该系统是一个公认的且与cap无关的翻译系统，并且我们观察到产率增加了8倍(图5D)。RNA结合蛋白(RBPs)和相关的RNA分子缩合以形成被称为核糖核蛋白(RNPs)的无膜细胞器，促进相分离。由于我们缺乏在无细胞系统中的细胞器，如细胞骨架，我们开发了RNA在其中接种、成核和相分离的RNA水凝胶(图5H)。此外，无细胞系统不适合生产短肽。由于在限制的空间中的结构上长的RNA，其使得miRNA能够定位并因此增加表达产率。效率随参与蛋白质表达的序列的长度和类型而变化很大(39)。RBP(在我们的情况中为核糖体)在转录的RNA上的定位在支架内非常接近，从而促进翻译组分的容易接近。通过超过空间障碍(40)并通过对细胞功能进行无细胞评估(41)来解决全球性挑战，可以进一步提高效率(图23)。

3.单结构域抗体Letolizumab

我们还通过来源于pK7-Letolizumab-G4质粒的表达盒的mRNA，使用W-RG4方法测试了14kDa单结构域抗体Letolizumab的蛋白质生产(图5E)。Letolizumab，用于免疫调节目的的Fc修饰的人IgG1融合蛋白构建体靶向CD40L(37，38)。对于该测定，用NdeI和SalI消化pIDTBlue质粒(Integrated DNA technologies,Coralville,IA)中的Letolizumab-G4，并克隆到pK7质粒中以产生pK7-Letolizumab-G4质粒。将20ng的pK7-Letolizumab-G4质粒用作无细胞表达的阳性对照，并将20ng的pK7-Letolizumab-G4质粒与0.125μM、0.25μM、0.5μM、0.75μM或1μM间隔区模板(对于60T RG4，质粒与间隔区模板之间的摩尔比分别为1:12.76、1:25.51、1:51.02、1:76.53和1:102.04)一起转录以诱导凝胶化。

来自60T RG4模板的RCT产物和来自质粒的mRNA转录物一起形成W-RG4水凝胶。翻译在30℃下进行了8小时。图5F和5G显示，当使用60T-RG4模板时，表达增强高达2倍。

4.使用裂解物包埋的W-RG4凝胶的蛋白质生产

图5I示出使用裂解物包埋的W-RG4的蛋白质生产结果与在不存在任何细胞裂解物的情况下产生的W-RG4(无裂解物的W-RG4)的蛋白质生产结果。除非另外特别指出，否则本公开中公开的W-RG4是无裂解物的W-RG4。

通过混合下表3中所示的以下成分生产裂解物包埋的W-RG4凝胶。

表3

将1.1μL的模板混合物(含有75％HiBiT-RG4模板(SEQ ID NO:14)和25％的用于30T-RG4(SEQ ID NO:6)的间隔区模板、用于90T-RG4(SEQ ID NO:8)的间隔区模板或用于150T-RG4(SEQ ID NO:11)的间隔区模板)添加到上述转录反应混合物中。75％和25％是指总模板混合物中HiBiT-RG4模板和间隔区模板各自的摩尔分数。将转录反应混合物在37℃下孵育3小时或48小时，在此期间由这些模板产生RNA转录物并形成水凝胶。

除了不添加裂解物/RNA酶抑制剂混合物，使用与上述相同的方案生产表达HiBiT的无裂解物的W-RG4。另外，将3.3μL无DNA酶、无RNA酶的水用于生产无裂解物的W-RG4，与0.3μL无DNA酶、无RNA酶的水用于生产裂解物包埋的W-RG4相反。

水凝胶形成后，使用NEBExpress无细胞大肠杆菌蛋白质合成系统(NEB#E5360)进行翻译反应。11μL的无裂解物的W-RG4或裂解物包埋的W-RG4与25μL蛋白质合成缓冲剂、10μL裂解物/RNA酶抑制剂混合物(裂解物与RNA酶抑制剂的体积比为12比1)和104μL无DNA酶、无RNA酶的水进行孵育，以启动蛋白质翻译。将翻译反应保持在25℃下并在2小时后终止。

如图5I所示，与不含裂解物的对应物(“3h w/o裂解物”)相比，由3小时的转录反应形成的裂解物包埋的W-RG4(“3h w/裂解物”)产生更大量的HiBiT。由48小时的转录反应(凝胶制备时间)之后形成的W-RG4产生的HiBiT的量低于3小时转录反应后形成的W-RG4产生的HiBiT的量，这可能是由于与包埋在水凝胶中的细胞裂解物相关的RNA降解。

测试了翻译反应混合物中的细胞裂解物对蛋白质生产的影响，并将结果示于图5J。通过使用上述方法对包含150多胸腺嘧啶的间隔区模板(SEQ ID NO:11)和HiBiT-RG4模板(SEQ ID NO:14)进行滚环转录，产生无裂解物的W-RG4(“原始W-RG4”)和裂解物包埋的W-RG4凝胶。将无裂解物的W-RG4与含有12μL裂解物的翻译混合物(NEB#E5360)(“原凝胶”)一起孵育；将裂解物包埋的W-RG4与不含裂解物的翻译混合物(“L-凝胶”)一起孵育；并将裂解物包埋的W-RG4与含有10μL裂解物的翻译混合物(“L-L-凝胶”)一起孵育。所有三种翻译混合物都含有进料溶液(也称为蛋白质合成缓冲液)。这些反应的相对蛋白质生产水平由RLU值表示。来自30T RG4(SEQ ID NO:6)模板的翻译物用作阴性对照。所有翻译反应在3小时后终止。

图5J示出了在翻译步骤过程中引入额外的裂解物的裂解物包埋的W-RG4显示出最高的表达产率(“L-L-凝胶”)。令人惊讶的是，即使在翻译反应混合物中未添加细胞裂解物时(“L-凝胶”)，裂解物包埋的W-RG4也能够产生足够的蛋白质，尽管以较低的产率。裂解物包埋的W-RG4的成功表达表明，这些裂解物包埋的W-RG4凝胶可以潜在地充当自足的蛋白表达系统。因此，这些裂解物包埋的W-RG4凝胶可用于植入或注射治疗应用，其中优选或要求在翻译过程中不使用外来裂解物。

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通过引用并入

在美国出于所有目的，本公开中提及的每一份出版物和专利文件都是通过整体引用并入本文以用于所有目的，如同每一份出版物或文件是通过引用具体地和单独地说明并入本文一样。

虽然已经参考具体的实施例和说明描述了本发明，但作为常规开发和优化的问题，在本领域普通技术人员的能力范围内，可以进行改变并替换等同物，以适应特定上下文或预期用途，从而在不脱离所要求保护的范围及其等同物的情况下实现本发明的益处。

说明性序列

在该说明性序列的列表中，下划线表示G-四重体基序。双下划线表示乱序的G-四重体基序。所有序列均以5'→3'方向列出。

SEQ ID NO:1：G四重体部分

ACCCTAACCCTA

SEQ ID NO:2：G-四重体基序(RNA)

UAGGGUUAGGGU

SEQ ID NO:3(间隔区前的G-四重体模板的部分)

ATAGTGAGTCGTATTAACCCTAACCCTA

SEQ ID NO:4(3T G-四重体模板)

ATAGTGAGTCGTATTAACCCTAACCCTATTTATCCCT

SEQ ID NO:5(10T G-四重体模板)

ATAGTGAGTCGTATTAACCCTAACCCTATTTTTTTTTTATCCCT

SEQ ID NO:6(30T G-四重体模板)

ATAGTGAGTCGTATTAACCCTAACCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT ATCCCT

SEQ ID NO:7(60T G-四重体模板)

ATAGTGAGTCGTATTAACCCTAACCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATCCCT

SEQ ID NO:8(90T G-四重体模板)

ATAGTGAGTCGTATTAACCCTAACCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATCCCT

SEQ ID NO:9(120T G-四重体模板)

ATAGTGAGTCGTATTAACCCTAACCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATCCCT

SEQ ID NO:10(乱序的30T G-四重体模板)

SEQ ID NO:11(150T G-四重体模板)

TAGTGAGTCGTATTAACCCTAACCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATCCCT

SEQ ID NO:12(T7启动子引物)

TAATACGACTCACTATAGGGAT

SEQ ID NO:13(短的乱序的G-四重体RNA)

UACUGUUACUGU

SEQ ID NO:14(HiBiT G-四重体模板)

ATAGTGAGTCGTATTAACCCTAACCCTATTAGCTAATCTTCTTGAACAGCCGCCAGCCGCTCACCATATTTTTTCCTCCTTATACTTAATCCCT

SEQ ID NO:15(乱序的线性HiBiT G-四重体模板)

SEQ ID NO:16(TAT-HiBiT标签G-四重体模板；斜体部分是TAT编码序列，反义链)

SEQ ID NO:17(乱序的线性TAT-HiBiT标签G-四重体模板；斜体部分是TAT编码序列)

SEQ ID NO:18(胰岛素-HiBiT标签G-四重体模板；斜体部分是胰岛素编码序列，反义链)

SEQ ID NO:19(乱序的线性胰岛素-HiBiT标签G-四重体模板；斜体部分是胰岛素编码序列，反义链)

SEQ ID NO:20:G-四重体基序(DNA)

TAGGGTTAGGGT

SEQ ID NO:21(HiBiT编码序列，反义链)

TTAGCTAATCTTCTTGAACAGCCGCCAGCCGCTCAC

SEQ ID NO:22

GGGUUAGGGU

SEQ ID NO:23(胰岛素的氨基酸序列)

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPNT

SEQ ID NO:24(TAT的氨基酸序列)

GRKKRRQRRR

SEQ ID NO:25(HiBiT的氨基酸序列)

VSGWRLFKKIS

SEQ ID NO:26(单结构域抗体Letolizumab的编码序列序列；有义链，加下划线的是G-四重体基序)

CATATGATGGAGGTACAGTTACTGGAGAGTGGGGGCGGGTTGGTCCAACCAGGTGGGTCCCTGCGTTTGTCCTGTGCCGCATCTGGGTTCACATTCAACTGGGAATTGATGGGCTGGGCACGCCAAGCACCCGGCAAGGGACTTGAGTGGGTCTCGGGAATTGAAGGGCCGGGGGATGTCACCTATTATGCAGATTCAGTAAAGGGCCGGTTCACAATTTCGCGTGACAATTCGAAAAACACTCTTTACTTGCAGATGAACTCACTTCGGGCGGAAGACACAGCTGTGTATTACTGCGTAAAGGTCGGTAAGGACGCCAAGTCGGATTACAGAGGCCAAGGAACGCTTGTGACAGTATCAAGTGCCTCAACGTATCCATATGACGTACCCGATTATGCATGATAGGGTTAGGGTGTCGAC

SEQ ID NO:27(单结构域抗体Letolizumab的氨基酸序列)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNWELMGWARQAPGKGLEWVSGIEGPGDVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKVGKDAKSDYRGQGTLVTVSSAST

SEQ ID NO:28(HiBiT编码序列，有义链)

GTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTAA

SEQ ID NO:29:

GGUGAGCGGC

序列号30:

GCCGCUCACC

SEQ ID NO:31:

CUAAUAGGUUAGGGU

SEQ ID NO:32:

SEQ ID NO:33:

TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT

SEQ ID NO:34:

SEQ ID NO:35:

SEQ ID NO:36:

SEQ ID NO:37:

SEQ ID NO:38:

TTTTTTTTTT

SEQ ID NO:39:

TTTTTTTTTT

SEQ ID NO:40:

TTTTTTTTTT TT

SEQ ID NO:41：

TTTTTTTTTT TTT

SEQ ID NO:42:

TTTTTTTTTT TTTT

SEQ ID NO:43:

TTTTTTTTTT TTTTT

SEQ ID NO:44:

TTTTTTTTTT TTTTTT

SEQ ID NO:45:

TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT。

Claims

1.一种第一环状DNA模板，其包含(i)第一启动子序列和(ii)与第一G-四重体基序互补的序列。

2.如权利要求1所述的第一环状DNA模板，其中所述第一启动子序列与互补核酸序列杂交以形成第一部分双链的DNA分子，

其中所述第一部分双链的DNA分子包含双链区和单链区，

其中所述双链区包含与所述互补核酸序列杂交的所述第一启动子序列，并且

其中所述单链区包含与所述第一G-四重体基序互补的序列。

3.如权利要求1所述的第一环状DNA模板，进一步包含间隔区，其中所述该间隔区包含多胸腺嘧啶。

4.如权利要求1所述的第一环状DNA模板，进一步包含目的多肽的编码序列。

5.如权利要求1所述的第一环状DNA模板，其中与所述第一G-四重体基序互补的序列包含序列ACCCTAACCCTA(SEQ ID NO:1)。

6.如权利要求1所述的第一环状DNA模板，其中所述第一启动子序列选自T7启动子、T3启动子、Lac启动子、araBad启动子、Trp启动子、Tac启动子和SP6启动子。

7.一种第一核酸多联体，其包含多个单体，其中每个单体包含(i)第一G-四重体基序，和(ii)包含多胸腺嘧啶的间隔区或目的多肽的编码序列。

8.如权利要求7所述的第一核酸多联体，其中所述第一核酸多联体是RNA多联体，其中所述第一G-四重体基序包含UAGGGUUAGGGU(SEQ ID NO:2)。

9.如权利要求7所述的第一核酸多联体，其中所述第一核酸多联体是DNA多联体，其中所述第一G-四重体基序包含TAGGGTTAGGGT(SEQ ID NO:20)。

10.一种核酸水凝胶，其包含如权利要求7所述的第一核酸多联体。

11.一种蛋白质表达系统，其包含如权利要求10所述的核酸水凝胶、核糖体和/或氨基酸的混合物。

12.一种组合物，其包含第一环状DNA模板和第二环状DNA模板，

其中所述第一环状DNA模板包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)包含多胸腺嘧啶的间隔区，

其中所述第二环状DNA模板包含(i)第二启动子序列，(ii)与第二G-四重体基序互补的序列，和(iii)目的多肽的编码序列；以及

其中所述第一环状DNA模板相对于第一和第二环状DNA模板的总量的摩尔分数在25％至75％的范围内。

13.如权利要求12所述的组合物，

(1)其中所述第一启动子序列与互补核酸序列杂交以形成第一部分双链的DNA分子，

其中所述第一部分双链的DNA分子包含双链区和单链区，

其中所述第一部分双链的DNA分子的双链区包含与所述互补核酸序列杂交的所述第一启动子序列

其中所述第一部分双链的DNA分子的单链区包含与所述第一G-四重体基序互补的序列；且

(2)其中所述第二启动子序列与互补核酸序列杂交以形成第二部分双链的DNA分子，

其中所述第二部分双链的DNA分子包含双链区和单链区，

其中所述第二部分双链的DNA分子的双链区包含与所述互补核酸序列杂交的所述第二启动子序列，且

其中所述第二部分双链的DNA分子的单链区包含与所述第二G-四重体基序互补的序列。

14.如权利要求12所述的组合物，其中所述第一G-四重体基序和所述第二G-四重体基序包含相同的核苷酸序列。

15.如权利要求12所述的组合物，其中所述第一启动子序列和所述第二启动子序列包含相同的核苷酸序列。

16.如权利要求12所述的组合物，其中所述第一启动子序列和所述第二启动子序列包含不同的核苷酸序列。

17.如权利要求12所述的组合物，其中所述间隔区包含30-120个胸腺嘧啶。

18.如权利要求12所述的组合物，其中所述编码序列具有在20-300个核苷酸范围内的长度。

19.如权利要求12所述的组合物，其中所述编码序列与所述间隔区的长度比在1:0.2至1:2的范围内。

20.如权利要求12所述的组合物，其中所述目的多肽选自胰岛素、反式激活转录激活物(TAT)、HiBiT和单结构域抗体。

21.如权利要求12所述的组合物，进一步包含一种或多种RNA聚合酶、核糖核苷酸的混合物和/或缓冲剂。

22.如权利要求21的组合物，进一步包含具有链置换活性并因此能够进行滚环扩增的DNA聚合酶。

23.一种组合物，其包含环状DNA模板和双链DNA构建体，

其中所述环状DNA模板包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)包含多胸腺嘧啶的间隔区，

其中所述双链DNA构建体包含(i)第二启动子序列，(ii)与第二G-四重体基序互补的序列，和(iii)目的多肽的编码序列。

24.一种核酸水凝胶，其包含第一核酸多联体和第二核酸多联体，

其中所述第一核酸多联体是通过如权利要求12所述的组合物的所述第一环状DNA模板的滚环转录或扩增产生的，且

其中所述第二核酸多联体是通过如权利要求12所述的组合物的所述第二环状DNA模板的滚环转录或扩增产生的。

25.一种核酸水凝胶，其包含第一RNA分子和第二RNA分子，

其中所述第一RNA分子包含(i)第一G-四重体基序，和(ii)包含多腺嘌呤的间隔区，且

其中所述第二RNA分子包含(i)第二G-四重体基序，和(ii)目的多肽的编码序列。

26.如权利要求25所述的核酸水凝胶，其中所述第一RNA分子是包含多个单体的RNA多联体，并且其中所述每个单体包含所述第一G-四重体基序，和所述包含多腺嘌呤的间隔区或目的多肽的编码序列。

27.一种蛋白质表达系统，其包含如权利要求24所述的核酸水凝胶、核糖体和/或氨基酸的混合物。

28.一种用于表达目的多肽的试剂盒，其中所述试剂盒包含

(1)能够通过与第一夹板寡核苷酸杂交形成第一环状DNA模板的第一DNA分子，其中所述第一环状DNA模板包含(i)第一启动子序列，(ii)与第一G-四重体基序互补的序列，和(iii)包含多胸腺嘧啶的间隔区，

(2)与所述第一启动子序列互补的所述第一夹板寡核苷酸，

其中所述第一DNA模板能够与所述第一夹板寡核苷酸杂交并进行环化以形成第一环状DNA模板，和/或

(4)与所述第二启动子序列互补的第二夹板寡核苷酸，

其中所述第二DNA模板能够与所述第二夹板寡核苷酸杂交并进行环化以形成第二环状DNA模板。

29.一种用于表达目的多肽的试剂盒，其中所述试剂盒包含如权利要求23所述的组合物。

30.如权利要求28所述的试剂盒，其中所述第一G-四重体基序和所述第二G-四重体基序具有相同或不同的序列。

31.如权利要求28所述的试剂盒，其中所述第一启动子序列和所述第二启动子序列是相同或不同的。

32.如权利要求28所述的试剂盒，其中所述间隔区包含30-120个胸腺嘧啶。

33.如权利要求28所述的试剂盒，其中所述编码序列具有在20-300个核苷酸范围内的长度。

34.如权利要求28所述的试剂盒，其中所述编码序列与所述间隔区的长度比在1:0.2至1:2的范围内。

35.如权利要求28所述的试剂盒，其中所述目的多肽选自胰岛素、HiBiT、反式激活转录激活物(TAT)和单结构域抗体。

36.如权利要求28所述的试剂盒，进一步包含一种或多种DNA连接酶、RNA聚合酶、核糖核苷酸的混合物和/或一种或多种缓冲剂。

37.如权利要求36所述的试剂盒，进一步包含具有链置换活性并因此能够进行滚环扩增的DNA聚合酶。

38.一种制备核酸水凝胶的方法，其包括：

(1)提供第一环状DNA模板，其包含(i)第一启动子序列，和(ii)与第一G-四重体基序互补的序列；以及

(2)对所述第一环状模板进行滚环转录或扩增以产生第一核酸多联体，

其中所述第一核酸多联体形成核酸水凝胶。

39.如权利要求38所述的方法，

其中所述第一环状DNA模板还包含间隔区，所述间隔区包含多胸腺嘧啶，

其中所述步骤(1)进一步包括提供第二环状DNA模板，所述第二环状DNA模板包含(i)第二启动子序列，(ii)第二G-四重体基序，和(iii)目的多肽的编码序列，且

其中所述步骤(2)进一步包括对所述第二环状DNA模板进行滚环转录或扩增以产生第二核酸多联体，其中所述第一和第二核酸多联体形成所述核酸水凝胶。

40.一种在无细胞合成系统中生产蛋白质的方法，其中所述方法包括：

(i)将如权利要求10或24所述的核酸水凝胶与无细胞合成系统在允许所述目的多肽翻译的条件下组合。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述无细胞合成系统包含核糖体和/或氨基酸的混合物。