TWI606058B - Nucleic acid complex and nucleic acid polysaccharide complex - Google Patents

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Shin-Ichi Mochizuki
Motoko Tanaka
Sadaharu Higuchi
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Description

核酸複合體及核酸多醣複合體
本發明係關於一種提昇包含DNA(Deoxyribonucleic acid，去氧核糖核酸)與RNA(Ribonucleic acid，核糖核酸)之核酸複合體於血清中之穩定性的技術。
人類基因組(Human Genome)之解碼已於自1953年發現DNA雙螺旋(double helix)結構起50年後之2003年完成。目前正在查明各種蛋白質之活性機制與其相互作用。此外，最近發現未對蛋白質進行編碼之RNA可控制基因之轉錄(transcription)或轉譯(translation)。作為應用此種成果之一種方法，提出使用具有生理活性之短的人工核酸(核酸藥物(Nucleic acid medicine))來操縱生物體功能之技術。
siRNA(small interfering RNA，小干擾RNA)係包含21至23個鹼基對之低分子雙鏈RNA。siRNA參與被稱為RNA干擾(RNAi)之現象(參照非專利文獻1)，其可序列特異性(sequence-specific)地阻礙傳訊RNA(mRNA)，並抑制蛋白質之表達。可認為該現象係作為針對病毒感染等生物體防禦機制之已進化的一環。由於可僅根據基因序列之資訊進行設計，因此不需要如先前之針對低分子藥物之大規模篩選，又，由於可特異性地阻礙特定基因，因此可認為副作用低，可期待作為下一代之治 療藥物。
然而，作為天然型之核酸之磷酸酯型RNA於生物體內，會因與核酸分解酵素或蛋白質之非特異性吸附而於極短之時間內失活。因此，天然型之核酸藥品於人類之臨床研究中未帶來有意義之效果。為了解決天然型之核酸於生物體環境內或於培養液中在短時間內失活這一問題點，已提出許多對天然型之核酸進行化學修飾而形成之化學修飾核酸。例如，利用甲氧基(2'-O-甲基)(參照非專利文獻2)、氟(F)(參照非專利文獻3)、LNA(locked nucleic acid，鎖核酸)(參照非專利文獻4)對核糖之2'-位之羥基進行化學修飾而成者尤其為人所知。此外，亦有研究藉由此種化學修飾，提昇siRNA與目標mRNA之鍵結親和性。
將此種經化學修飾之核酸稱為核酸類似物(nucleic acid analogue)。與天然型之核酸相比，核酸類似物成功地大幅度地延長失活時間。其原因在於：核酸分解酵素無法識別核酸類似物。然而，於生物體內與蛋白質非特異性地吸附、產生意想不到之生理活性、嚴重之肝病等因非天然而引起之毒性正成為問題。
亦提出如下之技術：使具有生物體相容性之化合物內含有天然型之核酸，一面保護核酸不被分解，一面提昇膜通透性，並將核酸導入至細胞內。以逆轉錄病毒(retrovirus)(參照非專利文獻5)或腺病毒(adenovirus)(參照非專利文獻6)等作為基因載體，已於體外(in vitro)獲得極有希望之結果，但該等源自天然之病毒之炎症性、免疫原性、以及突變誘發(mutation induction)及朝細胞基因組中之導入之危險性已被指出，使該等病毒於體內(in vivo)之使用受到限制。
因此，作為源自天然之基因載體之代替物，已存在使用不僅較病毒易於處理，且可使DNA確實且高效率地朝細胞內集中之人工材料之非病毒載體(參照非專利文獻7)。迄今為止，作為非病毒性之人工核酸載體，已開發出經聚乙二醇修飾之聚陽離子(參照非專利文獻8)、聚乙烯亞胺(參照非專利文獻9)、陽離子性聚合物之嵌段共聚物(參照非專利文獻10)、樹枝狀聚合物(dendrimer)(參照非專利文獻11)等。然而，此種陽離子性高分子之安全性並未得到確認。為了具有陽離子性，胺基之存在不可或缺，但胺基之生理活性高、且存在體內毒性等危險。
本發明者等人迄今為止著眼於以β-1,3-葡聚糖作為基因載體，發現β-1,3-葡聚糖與核酸藥物(反義DNA，CpG DNA)形成新型之複合體(參照專利文獻1、專利文獻2、非專利文獻12、非專利文獻13、非專利文獻14)。
發現當以三重螺旋之形態自然存在之β-1,3-葡聚糖溶解於DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞碸)等非質子性極性有機溶劑、或0.1N以上之鹼性溶液中，而解離成單鏈後，添加單鏈之核酸，將溶劑恢復成水或中性，可藉此形成包含1分子之核酸與2分子之多醣的三重螺旋複合體。於此情況下，一般認為三重螺旋複合體中之多醣分子與核酸分子主要係藉由氫鍵與疏水性相互作用而形成分子間鍵結(參照非專利文獻15)。
如上所述，與β-1,3-葡聚糖進行複合化之核酸為單鏈核酸，且研究發現尤其以聚去氧腺嘌呤(poly dA)或聚胞苷酸(poly C)與以裂褶菌多糖(SPG，Schizophyllan)為首之β-1,3-葡聚糖顯示強親和性。
對於以β-1,3-葡聚糖作為siRNA之載體而應用於RNAi亦進行了研究。然而，由於siRNA係雙鏈核酸，因此無法直接與β-1,3-葡聚糖形成複合體。因此，為了與SPG等β-1,3-葡聚糖進行複合化，使siRNA之有義鏈(sense strand)上附加poly(dA)而成之DNA-RNA雜核酸，使其與siRNA之反義鏈進行黏接(annealing)，而製作poly(dA)-siRNA。其後，利用該poly(dA)部分與SPG進行複合化。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際專利公開號第01/34207號
[專利文獻2]國際專利公開號第02/072152號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Y. Dorsett, T. Tuschl, Nat. Rev. Drug Discovery 3 (2004) 318-329.
[非專利文獻2]Evaluation of 29-modified oligonucleotides containing 29-deoxy gaps as antisense inhibitors of gene expression. B. Monia, E. Lesnick, C. Gonzalez, W. Lima, D. McGee, C. Guinosso, A. Kawasaki, P. Cook, S. Freier, J. Biol. Chem. 268 (1993) 14514-14522.
[非專利文獻3]Potent gene-specific inhibitory properties of mixed-backbone antisense oligonucleotides comprised of 2'-deoxy-2'-fluoro-D-arabinose and 2'-deoxyribose nucleotides. C.N. Lok, E. Viazovkine, K. L. Min, C. J. Wilds, M. J. Damha, M. A. Parniak, Biochemistry 41 (2002) 3457-3467.
[非專利文獻4]2'-0,4'-C-ethylene-bridged nucleic acids (ENA): highly nuclease-resistant and thermodynamically stable oligonucleotides for antisense drug. K. Morita, C. Hasegawa, M. Kaneko, S. Tsutsumi, J. Sone, T. Ishikawa, T. Imanishi and M. Koizumi, Med. Chem. Lett., 12, 73-76 (2002)
[非專利文獻5]Human gene therapy comes of age. A.D. Miller, Nature, 357, 455-460 (1992)
[非專利文獻6]The basic science of gene therapy. R.C. Mulligan, Science, 14, 926-932 (1993)
[非專利文獻7]Controllable gene therapy pharmaceutics of non-viral gene delivery systems. E. Tomlinson and A. P. Rolland, J. Control Release, 39, 357-372 (1996)
[非專利文獻8]Breathing Life into Polycations: Functionalization with pH-Responsive Endosomolytic Peptides and Polyethylene Glycol Enables siRNA Delivery. M.Meyer, A. Philipp, R. Oskuee, C. Schmidt and E. Wagner, J. Am. Chem. Soc., 130, 3272-3273 (2008)
[非專利文獻9]RNA interference-mediated gene silencing of pleiotrophin through polyethylenimine-complexed small interfering RNAs in vivo exerts antitumoral effects in glioblastoma xenografts. M. Grzelinski, B. Urban-Klein, T. Martens, K. Lamszus, U. Bakowsky, S. Hobel, F. Czubayko and A. Aigner, Hum. Gene. Ther., 17, 751-766 (2006)
[非專利文獻10]Monomolecular Assembly of siRNA and Poly(ethylene glycol)-Peptide Copolymers. J. DeRouchey, C.Schmidt, G. F. Walker, C. Koch, C. Plank, E. Wagner and J. O. Raedler, Biomacromolecules, 9, 724-732 (2008)
[非專利文獻11]Tat-conjugated PAMAM dendrimers as delivery agents for antisense and siRNA oligonucleotides. H. Kang, R. DeLong, M.H. Fisher and R.L. Juliano, Pharm. Res., 22, 2099-2106 (2005)
[非專利文獻12]Molecular Recognition of Adenine, Cytosine, and Uracil in a Single-Stranded RNA by a Natural Polysaccharide: Schizophyllan. K. Sakurai and S. Shinkai, J. Am. Chem. Soc., 122, 4520-4521 (2000)
[非專利文獻13]Polysaccharide-Polynucleotide Complexes. 2. Complementary Polynucleotide Mimic Behavior of the Natural Polysaccharide Schizophyllan in the Macromolecular Complex with Single-Stranded RNA and DNA. K. Sakurai, M. Mizu and S. Shinkai, Biomacromolecules, 2, 641-650 (2001)
[非專利文獻14]Dectin-1 targeting delivery of TNF-α antisense ODNs complexed with β-1,3-glucan protects mice from LPS-induced hepatitis. S. Mochizuki, K. Sakurai, J. Control. Release, 151, (2011) 155-161.
[非專利文獻15]Structural Analysis of the Curdlan/Poly (cytidylic acid) Complex with Semiempirical Molecular Orbital Calculations. K. Miyoshi, K. Uezu, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomacromolecules, 6, 1540-1546 (2005)
然而，由於相較於廣泛存在於生物體內之核糖核酸酵素(ribonuclease)，DNA-siRNA核酸複合體較不穩定，因此其與RNA同樣存在於生物體內容易迅速受到分解這一問題。事實上，為了評估DNA-siRNA核酸複合體於血清中之穩定性，於10%血清中對核酸複合體進行培養後，利用丙烯醯胺凝膠電泳確認分子量之變化，結果於DNA與siRNA之鍵結部分確認到被切斷之條帶(band)。在與β-1,3-葡聚糖進行複合化之核酸複合體中亦觀察到該條帶，可認為即便將複合體投予至生物體內，亦會被迅速地切斷成DNA與RNA，而導致DNA-siRNA核酸複合體之細胞導入效率下降、或目標基因之靜默活性之下降等。
本發明係鑒於該課題而完成之發明，其提供一種即便於生物體內，亦不會在DNA與RNA之鍵結部被分解之核酸複合體。
本發明之第1態樣係藉由提供如下之核酸複合體來解決該課題，該核酸複合體係由單鏈DNA之3'側末端之去氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)殘基之3'位與雙鏈RNA之一個核糖核苷酸(ribonucleotide)鏈之5'側末端之核糖核苷酸殘基之5'位鍵結而成的核酸複合體，且與該單鏈DNA鍵結之核糖核苷酸鏈之5'側末端核苷酸中的2'位之羥基係經烷氧基或鹵素原子取代。
本發明之第2態樣係藉由提供如下之核酸複合體來解決該課題，該核酸複合體係單鏈DNA之3'側末端之去氧核糖核苷酸殘基之3'位與雙鏈RNA之一個核糖核苷酸鏈之5'側末端之核 糖核苷酸殘基之5'位鍵結而成的核酸複合體，且與該單鏈DNA鍵結之最初之核糖核苷酸之3'位及與其鄰接之核糖核苷酸之5'位之間的磷酸二酯基係經硫代磷酸酯基(硫代磷酸酯基：-O-PO(S)-O-：具有將磷酸基之P=O取代成P=S之結構)、二硫代磷酸二酯基(-O-PS(S)-O-)及三硫代磷酸二酯基(-O-PS(S)-S-)之任一者取代。
於本發明之第1及第2態樣中，該單鏈DNA之核苷酸(nucleotide)數目可為10以上。此外，於本發明之第1及第2態樣中，該單鏈DNA可為聚去氧腺嘌呤(poly deoxyadenylate)。
於本發明之第1及第2態樣中，該單鏈DNA之磷酸二酯基中之至少一部分可經硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代。又，於此情況下，該單鏈DNA中至少50%以上之磷酸二酯基可經硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代。
於本發明之第1及第2態樣中，該雙鏈RNA可為siRNA。又，於此情況下，該siRNA可為21mer型或27mer型。此外，該siRNA之目標基因可為於Dectin-1表達細胞中表達之基因。
本發明之第3態樣係藉由提供如下之核酸多醣複合體來解決該課題，該核酸多醣複合體係由1分子之本發明之第1及第2態樣之核酸複合體之單鏈DNA部位與2分子之具有β-1,3-葡聚糖骨架之多醣所形成之三重螺旋結構之核酸多醣複合體。
於本發明之第3態樣中，該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多醣較佳為裂褶菌多糖。
本發明之第4態樣係藉由提供如下之醫藥組合物來解決該課題，該醫藥組合物包含如本發明之第3態樣之核酸多醣複合體。
本發明之第5態樣係藉由提供如下之穩定核酸複合體之方法來解決該課題，該核酸複合體之穩定化方法係使單鏈DNA之3'側末端之去氧核糖核苷酸殘基之3'位與雙鏈RNA之一個核糖核苷酸鏈之5'側末端之核糖核苷酸殘基之5'位鍵結而成的核酸複合體對於RNA分解酵素之穩定性增大的方法，且利用烷氧基或鹵素原子取代與該單鏈DNA鍵結之核糖核苷酸鏈之5'側末端核苷酸中之2'位之羥基。
本發明之第6態樣係藉由提供如下之核酸複合體之穩定化方法來解決該課題，該核酸複合體之穩定化方法係使單鏈DNA之3'側末端之去氧核糖核苷酸殘基之3'位與雙鏈RNA之一個核糖核苷酸鏈之5'側末端之核糖核苷酸殘基之5'位鍵結而形成的核酸複合體對於RNA分解酵素之穩定性增大的方法，且利用硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代與該單鏈DNA鍵結之最初之核糖核苷酸之3'位及與其鄰接之核糖核苷酸之5'位之間的磷酸二酯基。
於由單鏈DNA之3'側末端之去氧核糖核苷酸殘基之 3'位與雙鏈RNA之一個核糖核苷酸鏈之5'側末端之核糖核苷酸殘基之5'位鍵結而成的DNA-RNA核酸複合體中，利用烷氧基或鹵素原子取代與該單鏈DNA鍵結之核糖核苷酸鏈之5'側末端核苷酸中之2'位之羥基，或利用硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代與該單鏈DNA鍵結之最初之核糖核苷酸之3'位及與其鄰接之核糖核苷酸之5'位之間的磷酸二酯基，藉此提昇聚去氧核糖核苷酸與聚核糖核苷酸之鍵結部之穩定性，使其即便於生物體內亦不易受到水解。因此，本發明之核酸複合體於生物體內不會迅速受到分解而喪失功能，可維持原本之功能。例如，若將本發明之核酸複合體應用於由如下之核酸複合體與β-1,3-葡聚糖形成之核酸多醣複合體中，該核酸複合體係在siRNA之5'側末端側鍵結poly(dA)等與β-1,3-葡聚糖(裂褶菌多糖等)形成穩定複合體之聚去氧核苷酸而成的核酸複合體，則於細胞質內不會受到分解，可確實地將siRNA輸送至細胞核中，而期待改進利用RNA干擾來抑制造成疾病之基因之表達的核酸藥物之有用性及治療效果。
第1圖係表示dA40-siRNA於血清中之分解實驗(實施例1)之結果的凝膠螢光圖像。
第2A圖係表示使用在5'側末端附加FITC而形成之反義鏈所製備之經螢光修飾之dA10-siRNA於血清中之分解物之鑑定實驗 (實施例2)之結果的凝膠螢光圖像。
第2B圖係表示使用在3'側末端附加FITC而形成之反義鏈所製備之經螢光修飾之dA10-siRNA於血清中之分解物之鑑定實驗(實施例2)之結果的凝膠螢光圖像。
第2C圖係表示dA-siRNA之分解反應之影像圖。
第3圖係表示2'-O-甲基修飾對RNA之分解所帶來之效果(實施例3)的凝膠螢光圖像。
第4圖係表示2'-O-甲基修飾對單鏈RNA之分解所帶來之效果(實施例4)的凝膠螢光圖像。
第5圖係表示2'-O-甲基修飾位置對核酸複合體於血清中之分解所帶來之效果(實施例5)的凝膠螢光圖像。
第6圖係表示鹼基之種類對DNA之分解所帶來之影響(實施例6、實施例7)的凝膠螢光圖像。
第7圖係表示硫代磷酸酯修飾對RNA之分解所帶來之效果(實施例8)的凝膠螢光圖像。
第8圖係表示DNA與RNA之3'側末端接合時之影響(實施例9)的凝膠螢光圖像。
以下，對用以將本發明具體化之實施態樣進行說明。
本發明之第一實施態樣之核酸複合體係由單鏈DNA之3'側末端之去氧核糖核苷酸殘基之3'位與雙鏈RNA之一個核糖核苷酸鏈之5'側末端之核糖核苷酸殘基之5'位鍵結而成的核酸複合體，且 與該單鏈DNA鍵結之核糖核苷酸鏈之5'側末端核苷酸中之2'位之羥基係經烷氧基或鹵素原子取代。即，本實施態樣之核酸複合體相當於在下述通式(I)中，R2為烷氧基或鹵素原子之情況。再者，在式(I)中，R1為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)及胞嘧啶(C)之任一者，R3及R5為磷酸酯基(-PO2-O-)。再者，作為烷氧基之具體例子可例如為碳數為1至5之直鏈或支鏈烷氧基、碳數為5至15之芳基烷基、O-丙烯基(allyl)等烷基烯基等，較佳為碳數為1至3之烷氧基，更佳為甲氧基。又，作為鹵素原子之具體例子可例如為氟原子(F)、氯原子(Cl)、溴原子(Br)及碘原子(I)，更佳為氟原子。
例如，於核酸複合體中，與聚去氧核苷酸部分鍵結之聚核糖核苷酸部分可與具有互補之鹼基序列之RNA形成雙鏈，而構成siRNA。所謂siRNA，係指如下之短鏈之雙鏈RNA：參與被稱為RNA干擾(RNAi)之現象，破壞包含互補之鹼基序列之mRNA，並具有序列特異性地抑制基因表達之功能。
siRNA之鹼基數為20至27個鹼基(對)。於人類之 情況下，若鹼基數為17個以上，則所獲得之聚核苷酸之總數(417=1.7×1010)超過人類之基因總數(6×109)，因此於統計上可阻礙僅特定基因之表達。siRNA可為廣泛使用之21mer型，亦可為對於dicer之特異性進一步提昇之27mer型。
siRNA之鹼基序列之設計可藉由任意之公知之方法而進行。若選擇與在多個基因間保存性高之序列互補之序列，則有時抑制基因特異之表達變得困難，因此例如於目標基因中選擇與特異之序列互補之序列。於已知目標鹼基序列或基因產物所對應之胺基酸序列之情況下，可根據自GenBank(基因庫)、EMBL(European Molecular Biology Laboratory，歐洲分子生物學實驗室)、PDB(Protein Data Bank，蛋白質資料庫)、DDBJ(DNA Data Bank of Japan，日本DNA資料庫)等資料庫所獲得之該已知之序列資料，使用任意之公知之方法設計siRNA。
核酸複合體中之單鏈DNA(聚去氧核苷酸)部分可為其本身具有獨自之功能者，亦可為用以提昇雙鏈RNA(聚核糖核苷酸)部分之穩定性者，如後述般，亦可為具有如下之特定之鹼基序列(包含重複序列)者，該特定之鹼基序列用以提昇形成核酸複合體與β-1,3-葡聚糖之複合體(核酸多醣複合體)時之複合體形成能力。單鏈DNA之核苷酸數並無特別限制，但較佳為10個以上。為了提昇對於核酸分解酵素之穩定性，單鏈DNA中之磷酸二酯基(亦稱為磷酸二酯鍵、磷酸雙酯鍵等)及該通式(I)中之R5之一部分，更佳為50%以上可由硫代磷酸酯基(硫代磷酸酯 基：-O-PO(S)-O-：具有將磷酸基之P=O取代成P=S之結構)、二硫代磷酸二酯基(-O-PS(S)-O-)及三硫代磷酸二酯基(-O-PS(S)-S-)之任一者取代。
具有如上所述之鹼基序列之聚核苷酸可使用化學合成法、基因工程技術(genetic engineering technique)等任意之公知之方法來合成。
本發明之第二實施態樣之核酸複合體係單鏈DNA之3'側末端之去氧核糖核苷酸殘基之3'位、與雙鏈RNA之一個核糖核苷酸鏈之5'側末端之核糖核苷酸殘基之5'位鍵結而成的核酸複合體，且與單鏈DNA鍵結之最初之核糖核苷酸之3'位、與鄰接於其之核糖核苷酸之5'位之間的磷酸二酯基由硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代。即，本實施態樣之核酸複合體相當於下述通式(I)中，R3為硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者之情況。再者，式(I)中，R1為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)及胞嘧啶(C)之任一者，R2為羥基，R5為磷酸酯基(-PO2-O-)。
再者，在該通式(I)中，R2為烷氧基或鹵素原子，且R5可為硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者。
使以該方式獲得之核酸複合體與β-1,3-葡聚糖相互作用，而形成由1分子之核酸複合體之單鏈DNA部位與2分子之具有β-1,3-葡聚糖骨架之多醣所形成之三重螺旋結構之核酸多醣複合體。藉由與β-1,3-葡聚糖形成複合體，而保護聚核苷酸不被水解，可大幅度(例如10倍左右)地增大其於血液及體液中之半衰期。因此，可例如更確實地將含有siRNA之核酸複合體傳送至目標細胞中。
已知主鏈包含β-1,3-葡聚糖及β-1,3-木聚糖之多醣具有與poly(C)等核酸近似之螺旋參數(可參照如高橋、小畠、鈴木，Prog.Polym.Phys.Jpn.27卷，767頁；以及「Conformation of Carbohydrates」，Sharwood academic publisher，1998年)，且具有可與核酸鹼基進行氫鍵結之羥基，因此可與核酸相互作用，而形成具有三重螺旋結構之穩定之複合體。作為β-1,3-葡聚糖之具體例可例如為：裂褶菌多糖、卡特蘭多糖(curdlan)、蘑菇多糖(lentinan)、茯苓聚糖(pachyman)、灰樹花多糖(grifolan)、硬葡聚糖(scleroglucan)等。該等係主鏈以β-鍵(β-D-鍵)鍵結之葡聚糖，且為側鏈之頻率(frequency)不同之天然多醣。該等β-1,3-葡聚糖可不進行化學修飾等處理而直接使用，但亦可使用一般之 高碘酸化法將其側鏈適當地拉長間隔，藉此控制其溶解性。
β-1,3-葡聚糖之分子量應對應於在製備用於治療炎症性腸疾病之藥劑時所使用的聚核苷酸之鹼基長度、重複序列之鹼基長度等而適宜調節。然而，若分子量太小，則因所謂之群集效應(cluster effect)(高分子系之協同現象)難以顯現而不佳。通常，可與核酸形成複合體之β-1,3-葡聚糖之重量平均分子量係根據核酸鹼基之種類或高次結構(Higher-order structure)而不同，但較佳為2000以上，更佳為4000以上，尤佳為6000以上。又，與聚核苷酸上之核酸鹼基形成氫鍵之羥基之數量通常需要5個以上，較佳為需要8個以上，更佳為需要10個以上。
再者，β-1,3-葡聚糖之重量平均分子量可使用光散射法、沈降速度法(超離心法)等任意公知之方法來決定。
β-1,3-葡聚糖通常由菌類或真細菌(eubacteria)產生，因此可藉由如下方式獲得：於培養該等微生物後，使菌體均質化，然後利用超離心法等方法自細胞溶出部分或不溶性殘渣等雜質中分離。通常，以該方式獲得之β-1,3-葡聚糖為高分子量(重量平均分子量為幾十萬左右)且可獲三重螺旋結構，可直接使用，亦可視需要進行低分子化後使用。低分子化係對應於β-1,3-葡聚糖之種類或所期望之分子量，由酵素分解、酸水解等任意方法及條件中選擇適宜之方法及條件來進行。例如，於裂褶菌多糖之情況下，藉由利用80%DMSO-硫酸之水解等，可獲得具有各種分子量之單鏈裂褶菌多糖。
裂褶菌多糖等β-1,3-葡聚糖通常於水中呈現三重螺旋結構。因此，為了與聚核苷酸形成複合體，溶解於如DMSO(二甲基亞碸)之溶劑中來解除分子間氫鍵結、及由疏水性相互作用所產生之締合(association)狀態，而變成單鏈。若向其中添加含有聚核苷酸之水溶液(或醇等極性溶劑之溶液)，則隨著溶劑之極性增大，聚核苷酸與β-1,3-葡聚糖藉由疏水性相互作用而締合，一面導入聚核苷酸之分子鏈一面於分子內及分子間形成聚核苷酸與多醣之締合體。其結果為，形成包含1分子之聚核苷酸與2分子之β-1,3-葡聚糖分子之具有三重螺旋結構的複合體。複合體之形成例如可藉由測定CD(Circular Dichroism，圓偏光二色性)光譜，並藉由調查構形(conformation)變化來確認。所獲得之複合體通常為水溶性，藉由溫度變化或pH變化而進行解離及再鍵結。此外，複合體具有對於核酸分解酵素之耐受性，且聚核苷酸亦不會被破壞。
於形成如上所述之核酸多醣複合體之情況下，為了提昇複合體形成能力，核酸複合體之單鏈DNA部分較佳為具有poly(dA)序列、及poly(dT)序列之任一者之重複序列。構成較佳之重複序列之鹼基及核苷酸之種類以及鹼基數係對應於核糖核苷酸部分之長度、所使用之β-1,3-葡聚糖之種類及分子量等而適宜決定。例如，於使用裂褶菌多糖作為β-1,3-葡聚糖之情況下，聚去氧核苷酸部分較佳為具有poly(dA)序列作為重複序列，重複序列之長度例如較佳為10個鹼基長以上，更佳為10至80個鹼基 長。
為了評估核酸複合體於血清中之穩定性，可無特別限制地使用任意公知之方法，舉例而言，可例如使用以下方法：選用FBS(Fatal Bovine Serum，胎牛血清)作為血清，以含有10%FBS之方式製備RPMI1640培養基，向其中添加DNA-siRNA核酸複合體並於37℃下培養1小時，以12%丙烯醯胺進行凝膠電泳後，利用SYBR Gold對核酸進行染色，然後利用凝膠攝影裝置進行觀察。
核酸多醣複合體可作為有效成分而用於製造以RNAi為首之用於基因治療之醫藥組合物。該醫藥組合物之製造可使用任意公知之成分(醫藥上可接受之任意載體、賦形劑及添加物)及製劑方法。例如，炎症性腸疾病之治療劑可採用錠劑、栓劑、膠囊劑、糖漿劑、奈米凝膠等微膠囊劑、殺菌劑、懸濁液劑等態樣。
該醫藥組合物可藉由經口及非經口之任一種路徑，投予至人類或恆溫動物(家鼠、田鼠、兔子、綿羊、豬、牛、馬、雞、貓、狗、猴等)。非經口投予路徑可例如為皮下及肌肉中注射、腹腔內投予、直腸投予、利用內視鏡等腸內投予等。
作為活性成分之核酸複合體與β-1,3-葡聚糖分子之複合體之用量係對應於活性、待治療對象之疾病、待投予對象之動物種類、體重、性別、年齢、疾病之嚴重度、投予方法等而不同。若以體重為60公斤之成人為例，於經口投予之情況下，每日 之用量通常為約0.1至約100毫克，較佳為約1.0至約50毫克，更佳為約1.0至約20毫克，於非經口投予之情況下，每日之用量通常為約0.01至約30毫克，較佳為約0.1至約20毫克，更佳為約0.1至約10毫克。於對其他動物進行投予之情況下，使用將該用量換算成每單位體重之用量後，乘以待投予對象之動物之體重所得之用量。
於使用核酸多醣複合體作為醫藥組合物之有效成分之情況下，核酸複合體之鹼基序列係對應於待治療對象之疾病或目標基因之種類而適宜選擇，但較佳為含有以可於Dectin-1表達細胞中表達之基因作為目標之siRNA。Dectin-1為樹狀細胞或巨噬細胞(macrophage)中表達之屬於C型凝集素(lectin)之膜蛋白質，具有與β-葡聚糖鍵結之性質，因此適宜特異性地導入核酸多醣複合體。
可用於製造核酸多醣複合體之核酸複合體(包含該第1及第2實施態樣之核酸複合體)具有如下述式(A)所示之部分鹼基序列。再者，該核酸複合體可為僅包含由式(A)所示之鹼基序列之核酸複合體，亦可為以該鹼基序列作為部分鹼基序列之核酸複合體。
[化3]5’-(dRN)x-(AN)y-(RN)z-3’ (A)
此外，於式(A)中，dRN表示去氧核糖核苷酸； AN表示對核糖核苷酸之2'-位之羥基及5'-位之磷酸酯基之一者或二者進行化學修飾而成之核糖核苷酸衍生物、肽核酸(PNA)、二醇核酸(GNA)、鎖核酸(LNA)、蘇糖核酸(TNA)以及嗎啉基核酸之任一者；RN表示核糖核苷酸；x及z分別獨立為1以上之整數；y為1以上、10以下之整數。
位於由式(A)所表示之鹼基序列中之5'側末端側之聚去氧核苷酸部分(dRN)x由下述式(III)表示，式中，鹼基B1為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)。又，由式(I)所表示之鹼基序列中之3'側末端側之聚核糖核苷酸部分(RN)z由下述式(IV)表示，式中，鹼基B2為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)。
於聚去氧核苷酸部分(dRN)x及聚核糖核苷酸部分(RN)z二者中，構成鹼基數x及z並無特別限制。又，聚去氧核苷酸部分(dRN)x及聚核糖核苷酸部分(RN)z各自之鹼基序列可為對具有某種生物體功能之基因或其一部分進行編碼者或引子序列(primer sequence)，亦可為將一定數量之單一鹼基排列而成 者、將多個鹼基規則地排列而成等不具有生物體功能者。
構成位於由式(I)所表示之鹼基序列中之聚去氧核苷酸部分與聚核糖核苷酸部分之間的(AN)y之重複單元之具體例子可例如為由下述通式(II)所表示之經取代核糖核苷酸、由下述式(V)所表示之肽核酸(PNA)、由下述式(VI)所表示之二醇核酸(GNA)、由下述式(VII)所表示之鎖核酸(LNA)、由下述式(VIII)所表示之蘇糖核酸(TNA)、由下述式(IX)所表示之嗎啉基核酸等。
[化7]
此外，於式(II)中之R1、式(V)至(IX)中之B3至B7為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)及非天然鹼基(例如胸腺嘧啶、8-氧代鳥嘌呤、2-胺基-6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基-6-噻吩基嘌呤、吡啶-2-酮、4-乙醯基胞苷、5-(羧基羥甲基)尿苷、2'-O-甲基胞苷、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基胺基甲基尿苷、二氫尿苷、2'-O-甲基假尿苷、β-D-半乳糖基辮苷、2'-O-甲基鳥苷、肌苷、N6-異戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基胺基甲基尿苷、5-甲氧基胺基甲基-2-硫代尿苷、β-D-甘露糖基辮苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基(ribofuranosyl)-2-甲硫基嘌呤-6-基)胺甲醯基)蘇胺酸、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基胺甲醯基)蘇胺酸、尿苷-5-羥乙酸-甲酯、尿苷-5-羥乙酸、wybutoxosine、假尿苷、辮苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、 5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)胺甲醯基)蘇胺酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、懷丁苷、3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿苷等)之任一者。
又，於式(II)中，R2為氫原子(H)、鹵素原子(F、Cl、Br、I)、羥基、碳數為1至5之直鏈或支鏈烷氧基、碳數為5至15之芳基烷基、O-丙烯基等烯基烷基之任一者，R5為磷酸二酯基、硫代磷酸酯基(硫代磷酸二酯基)、二硫代磷酸二酯基、及三硫代磷酸二酯基之任一者(然而，例外情況為R2為羥基、且R5為磷酸酯基)。
(AN)y部分之重複單元之中，更佳為於式(II)中，R2為O-甲基且R5為磷酸基之情況、以及R2為羥基且R5為硫代磷酸酯基之情況。
(AN)y部分之鹼基序列可與聚去氧核糖核苷酸部分及/或聚核糖核苷酸部分之鹼基序列相連，而構成編碼具有生物體功能之基因之鹼基序列之一部分，亦可含有獨立並具有某種功能之鹼基序列，亦可為並不特別具有功能之規則的或無規的鹼基序列。y為1以上、10以下之整數，且較佳為1以上、4以下，更佳為1。
[實施例]
接著，對為了確認本發明之作用效果而進行之實施例進行說明。
實施例1：(dA)40-siRNA於血清中之分解之確認
使siRNA之有義鏈(5'-CAAAGACAACCAACUAGUGGU-3'：SEQ ID NO：1。以下，稱為「siRNA」、「siRNA之有義鏈」或「有義鏈」)之5'側末端附加去氧腺嘌呤(以下有時簡稱為「dA」)40聚體(mer)(dA40)而成之DNA-RNA核酸複合體、並與siRNA之反義鏈(5'-ACCACUAGUUGGUUGUCUUUG-3'：SEQ ID NO：2)進行黏接，而獲得DNA-siRNA核酸複合體(dA40-siRNA。以下，將由如下之DNA-RNA核酸複合體與反義鏈進行黏接而獲得之DNA-siRNA核酸複合體簡稱為「dAx-siRNA」，該DNA-RNA核酸複合體係藉由於有義鏈之5'末端側附加去氧腺嘌呤之x(x為自然數)聚體而成者)。
所使用之核酸全部購自北海道系統科技(Hokkaido System Science)股份有限公司。
添加DNA-siRNA核酸複合體至含有10%FBS之RPMI1640培養基中，於37℃下培養1小時，然後進行12%丙烯醯胺凝膠電泳(100伏特，1小時)。對凝膠進行SYBR Gold(生命技術(Life Technologies)公司：美國加利福尼亞州)染色，然後利用螢光成像儀進行凝膠之螢光圖像之攝影。
將所獲得之凝膠螢光圖像示於第1圖。培養前之dA40-siRNA核酸複合體之條帶係於較對照之dA40與siRNA(21bp)之條帶更高的分子量位置被檢測出。然而，於含有FBS之培養基中之培養後，於低分子量位置觀察到2條條帶。根據條帶之位置，可認為DNA-siRNA核酸複合體因FBS中所含之酵素 之作用而被切斷成DNA與siRNA。再者，即便於使用含有家鼠血清(MS)代替FBS之RPMI1640培養基進行相同之實驗時，亦獲得相同之結果。
實施例2：關於DNA-siRNA核酸複合體之切斷部位之研究
使用螢光修飾核酸研究血清中之酵素如何切斷DNA-siRNA核酸複合體。分別準備藉由對反義鏈之5'側末端側或3'側末端側進行FITC(fluorescein isothiocyanate，螢光異硫氰酸鹽)修飾而成者，使其與在具有由序列編號1所表示之鹼基序列之有義鏈之5'末端側附加去氧腺嘌呤10聚體(dA10)而成之DNA-RNA核酸複合體、及未附加dA10之有義鏈分別進行黏接。針對二者，於血清中進行培養後，進行凝膠電泳，然後利用FITC進行螢光觀察，繼而進行SYBR Gold染色，並同樣地進行螢光觀察。
將所獲得之螢光圖像示於第2A圖及第2B圖。可知於使未附加dA10之有義鏈與對5'側末端側進行了FITC修飾之反義鏈進行黏接而獲得之siRNA之情況下，於FITC與SYBR Gold染色後之螢光圖像中，二者之螢光條帶完全一致。又，根據於培養前後螢光條帶之位置無變化，可知RNA雙鏈於血清中幾乎未產生分解(第2A圖，泳道(lane)1、2)。另一方面，於dA10-siRNA之情況下，根據培養前後之SYBR Gold染色後之螢光條帶之位置的比較，已確認在與FBS培養後分子量減少，關於培養後之試樣，已確認源自SYBR Gold之螢光條帶與源自FITC之螢光條帶重疊 (第2A圖，泳道3、4)。進而，該等螢光條帶與對照siRNA之螢光條帶之位置大致重疊，由因可知在與血清培養後所看到之螢光條帶係源自具有包含接近21個鹼基對之siRNA之鹼基對數目之分解物。
於對反義鏈之3'側末端側進行了FITC修飾之siRNA的情況下，與該對反義鏈之5'末端側進行了FITC修飾之情況相同，源自FITC及SYBR Gold染色之螢光條帶之位置在FITC與FBS之培養之前後不變(第2B圖，泳道1、2)。因此，可知與FITC之導入部位(5'末端側及3'末端側)無關，siRNA不會因培養於血清中而分解，另一方面，若為dA10-siRNA，則在與FBS之培養後，可於非常低之分子量位置看到螢光條帶(第2B圖，泳道3、4)。又，於SYBR Gold染色後之螢光圖像中，與該情況同樣地，可於接近siRNA21bp之位置看到條帶。因此，可知所獲得之RNA雙鏈比21bp短，因FBS中之酵素蛋白，不僅切斷有義鏈，且亦切斷反義鏈。
根據該結果，可認為dA10-siRNA於血清中，與DNA之接合點之RNA附近被識別，並受到分解。可認為於分解後，被分成比21bp短之雙鏈RNA、以及由dA附加數個聚體之RNA而形成之單鏈與及RNA之互補鏈(將示意圖示於第2C圖)。
實施例3：藉由siRNA中之RNA殘基之2'-O-甲基化而避免DNA-siRNA核酸複合體之分解
根據實施例2之結果，可認為在DNA與siRNA之連結部附近 被分解，因此準備如下之dA40-siRNA核酸複合體，並與實施例2相同地，利用培養前後之試樣之凝膠電泳法評估於血清(FBS)中之穩定性，該dA40-siRNA核酸複合體係藉由將與DNA(dA40)之3'末端側接合之siRNA(有義鏈)之自5'末端側算起最初之1個、2個、3個、4個RNA殘基分別加以2'-O-甲基化而成者。
將所獲得之凝膠螢光圖像示於第3圖。先前未進行甲基化之DNA-siRNA若與血清進行1小時培養，則被切斷，但若進行甲基化，則已確認即便經過20小時，條帶之位置亦無變化。又，可知僅將與DNA接合之最初之(5'末端側之)RNA之1個部位加以2'-O-甲基化，便可充分地防止分解。
實施例4：DNA-siRNA核酸複合體與DNA-RNA核酸複合體之比較
根據先前之實驗，可認為在血清中培養所產生之DNA-siRNA核酸複合體之分解係發生於DNA與RNA雙鏈部分之鍵結點，為了研究該分解是否為RNA雙鏈中特異之現象，使用如下之dA40-RNA(單鏈)核酸複合體，進行與實施例3相同之實驗，該dA40-RNA核酸複合體係藉由將與DNA(dA40)之3'末端側接合之siRNA(有義鏈)之自5'末端側算起最初之1個、2個、3個、4個RNA殘基分別加以2'-O-甲基化而成者。
將所獲得之凝膠螢光圖像示於第4圖。可知不論經甲基化之RNA殘基之數量，於所有試樣中，在與FBS培養後分子量均減少。另一方面，dA40部分於1小時內幾乎不受到分解，因 此可認為因單鏈RNA部分(未經甲基化之部分)被分解，而導致分子量減少。
可知於雙鏈RNA之情況下，若將與DNA之3'末端側接合之RNA有義鏈之自5'末端側算起最初之RNA殘基加以2'-O-甲基化，則可充分地避免分解，但於單鏈RNA之情況下，即便將與DNA之3'末端側接合之RNA中之RNA殘基加以2'-O-甲基化，其他RNA部分亦被分解。即，已確認藉由鄰接於DNA之3'末端之RNA殘基之2'-O-甲基化而避免分解對於DNA-siRNA核酸複合體而言有效，而對於DNA-RNA核酸複合體而言不具有效果。
實施例5：對於避免DNA-siRNA核酸複合體之分解有效之RNA殘基之2'-O-甲基化部位的研究
根據實施例3之結果，可知為了阻止DNA-siRNA核酸複合體之分解，進行2'-O-甲基化之RNA殘基數為1個便足夠，但為了確認進行2'-O-甲基化之部位是否必須為與DNA之3'末端側接合之有義鏈之自5'末端側算起最初之RNA，而改變進行2'-O-甲基化之RNA殘基之位置來進行相同之實驗。對5'末端之RNA殘基或自5'末端起第2個RNA進行2'-O-甲基化。又，於該實施例中，考慮到與SPG進行複合化，而將dA之長度設為40聚體，並確認是否即便縮短dA之長度，亦觀察到相同之現象。
將所獲得之凝膠螢光圖像示於第5圖。即便將dA之長度縮短至10聚體，在與FBS之培養後亦觀察到短的條帶(與 siRNA相同程度)(第5圖，泳道3)。又，可知於改變了進行2'-O-甲基化之RNA殘基之位置的情況下，即便對自5'末端起第2個RNA進行甲基化，亦無法避免於血清中之分解(第5圖，泳道7)。
根據該結果，可知為了阻止DNA-siRNA核酸複合體之分解，必須對與DNA接合之最初之RNA殘基進行2'-O-甲基化。
實施例6：DNA-dsDNA核酸複合體於血清中之穩定性之研究
於上述實施例中，確認DNA-雙鏈RNA之核酸複合體於血清(FBS)中之分解，為了研究於DNA-雙鏈DNA(dsDNA)核酸複合體之情況下，是否亦觀測到相同之分解，準備將siRNA之序列(有義鏈及反義鏈二者)全部取代成DNA，並進行相同之實驗。
將所獲得之凝膠螢光圖像示於第6圖。可知於DNA-dsDNA核酸複合體中，在與血清之培養之前後無分子量之變化(第6圖，泳道1、2)。根據該結果，可知僅核酸複合體中之雙鏈RNA受到分解。
實施例7：DNA-siRNA核酸複合體中之DNA之鹼基序列與DNA-siRNA核酸複合體之穩定性之關連
於前述實驗中，考慮到與SPG之複合化，將DNA部分統一成dA10或dA40，為了研究DNA部分之鹼基序列對DNA-siRNA核酸複合體之穩定性帶來之影響，使用去氧胞嘧啶(dC)、去氧鳥嘌呤(dG)、去氧胸苷(dT)之10聚體代替dA10來製備與siRNA之核酸複合體，並進行相同之實驗。
將所獲得之凝膠螢光圖像示於第6圖。關於dT10-siRNA、dC10-siRNA，與dA10-siRNA同樣地，在與FBS培養後看到分子量下降(相當於與只有siRNA相同程度之分子量之螢光條帶)，因此可認為仍然於siRNA部分被切斷。關於dG10-siRNA，因具有於dG10部分凝聚之性質，故關於培養前之試樣，可於較其他DNA-siRNA核酸複合體更高分子量之位置看到螢光條帶，但在與FBS之培養後，在與siRNA相同程度之位置觀察到螢光條帶，因此可知即便係dG10-siRNA，亦同樣受到分解。
實施例8：藉由2'-O-甲基化以外之化學修飾而避免DNA-siRNA核酸複合體之分解
已知藉由對與DNA接合之最初之核糖核苷酸(鄰接於DNA之3'末端側之核糖核苷酸)進行2'-O-甲基修飾(將核糖之2'位之羥基取代成甲氧基)，可避免於血清中分解，除此以外，準備將與DNA之3'末端接合之最初之核糖核苷酸的3'位與第2個核糖核苷酸之5'位之間的磷酸二酯基取代成硫代磷酸酯基者，並進行相同之實驗。
將所獲得之凝膠螢光圖像示於第7圖。於經硫代磷酸酯取代之序列之情況下，約一半未受到分解而殘留，但剩餘之約一半被分解。硫代磷酸酯體係將磷酸二酯骨架中之磷酸基上所鍵結之一個氧原子取代成硫原子者，其作為外消旋混合物(racemic mixture)而獲得。因此，根據一半被分解、一半未受到分解而殘留這一事實，可認為僅其S型化合物或R型化合物之一者成為血 清中分解酵素之基質。
實施例9：DNA與RNA之3'側末端接合之情況
迄今為止，DNA係與siRNA之有義鏈之5'側末端接合，為了研究是否於DNA與有義鏈之3'側末端接合之情況下，亦同樣在與DNA接合之最初之RNA處受到分解，而準備使與迄今為止之序列相反者(於由SEQ ID NO：1所表示之寡核糖核苷酸之3'側末端側上鍵結有聚(dA)之核酸複合體)並進行實驗。
將所獲得之凝膠螢光圖像示於圖8。即便使DNA與siRNA有義鏈之3'側末端接合，亦未觀察到血清中之分子量變化(圖8，泳道3、4)。由此可認為分解酵素準確地識別出自DNA之5'側末端朝3'側末端、或自雙鏈RNA之5'側末端朝3'側末端延伸之DNA。
根據以上之結果，可知為了使DNA-RNA核酸複合體於血清中位置特異性地受到分解，DNA之序列是任選的，且RNA必須為雙鏈。
為了避免該分解，必須利用甲氧基等烷氧基、或氟原子等鹵素原子取代與DNA接合之最初之RNA(在與DNA接合之第2個以後之RNA殘基中看不到效果)之2'位的羥基，或者利用硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代與DNA之3'末端接合之最初之核糖核苷酸之3'位與第2個核糖核苷酸之5'位之間的磷酸二酯基。
實施例10：聚核苷酸與裂褶菌多糖之複合體之製備 (1)三重螺旋裂褶菌多糖之製備
根據文獻(A.C.S.38(1)，253(1997)，Carbohydrate Research(碳水化合物研究)，89,121-135(1981))記載之常規，製備三重螺旋裂褶菌多糖。即，使用基本培養基(minimal medium)，將由ATCC(American Type Culture Collection，美國菌種保存中心)獲得之裂褶菌(Schizophyllum commune.Fries)(ATCC 44200)震盪培養7日後，對細胞成分及不溶殘渣進行離心分離，並對所獲得之上澄液進行超音波處理，然後對其進行超過濾而將溶液置換成水，進行冷凍乾燥，從而獲得分子量為45萬之三重螺旋裂褶菌多糖。
(2)複合體之製備
將以該方式獲得之裂褶菌多糖以濃度變成15公克/分升之方式溶解於0.25N之NaOH水溶液中。混合10微升該溶液及10微升磷酸緩衝液(pH=4.5)、及3公克/分升之聚核苷酸溶液30微升，而製成複合體之水溶液。所獲得之溶液透明且均勻。
<110> 獨立行政法人科學技術振興機構
<120> 核酸複合體及核酸多醣複合體
<130> 無
<150> JP 2012-139250
<151> 2012-06-20
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA序列
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA之反義序列
<400> 2

Claims (17)

  1. 一種核酸複合體，其係由單鏈DNA之3'側末端之去氧核糖核苷酸殘基之3'位、與雙鏈RNA之一個核糖核苷酸鏈之5'側末端之核糖核酸殘基之5'位鍵結而形成的核酸複合體，且與該單鏈DNA鍵結之該核糖核苷酸鏈之5'側末端算起最初之核苷酸中的2'位之羥基係經烷氧基取代，其中該單鏈DNA之核苷酸數目為10個以上。
  2. 如請求項1所述之核酸複合體，其中該單鏈DNA為聚去氧腺嘌呤。
  3. 如請求項1所述之核酸複合體，其中該單鏈DNA之磷酸二酯基中之至少一部分係經硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代。
  4. 如請求項3所述之核酸複合體，其中該單鏈DNA中至少50%以上之磷酸二酯基係經硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代。
  5. 如請求項1所述之核酸複合體，其中該雙鏈RNA為siRNA。
  6. 如請求項5所述之核酸複合體，其中該siRNA為21mer型或27mer型。
  7. 如請求項5所述之核酸複合體，其中該siRNA之目標基因為於Dectin-1表達細胞中表達之基因。
  8. 一種核酸複合體，其係由單鏈DNA之3'側末端之去氧核糖核苷酸殘基之3'位與雙鏈RNA之一個核糖核苷酸鏈之5'側末端 之核糖核苷酸殘基之5'位鍵結而成的核酸複合體，且與該單鏈DNA鍵結之最初之核糖核苷酸之3'位及與其鄰接之核糖核苷酸之5'位之間的磷酸二酯基係經硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代，其中該單鏈DNA之核苷酸數目為10個以上。
  9. 如請求項8所述之核酸複合體，其中該單鏈DNA為聚去氧腺嘌呤。
  10. 如請求項8所述之核酸複合體，其中該單鏈DNA之磷酸二酯基中之至少一部分係經硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代。
  11. 如請求項10所述之核酸複合體，其中該單鏈DNA中至少50%以上之磷酸二酯基係經硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基之任一者取代。
  12. 如請求項8所述之核酸複合體，其中該雙鏈RNA為siRNA。
  13. 如請求項12所述之核酸複合體，其中該siRNA為21mer型或27mer型。
  14. 如請求項12所述之核酸複合體，其中該siRNA之目標基因為於Dectin-1表達細胞中表達之基因。
  15. 一種核酸多醣複合體，其係由1分子之如請求項1至14中任一項所述之核酸複合體之單鏈DNA部位與2分子之具有β-1,3-葡聚糖骨架之多醣所形成之三重螺旋結構之核酸多醣複合體。
  16. 如請求項15所述之核酸多醣複合體，其中該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多醣為裂褶菌多糖。
  17. 一種醫藥組合物，包含如請求項15所述之核酸多醣複合體。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015118789A1 (ja) * 2014-02-06 2015-08-13 独立行政法人科学技術振興機構 ペプチド／β－１，３－グルカン複合体及びその製造方法並びにそれを含む医薬組成物
CN110121558B (zh) * 2016-11-28 2023-06-13 日商那帕洁制药股份有限公司 化学修饰siRNA
JPWO2019230898A1 (ja) * 2018-05-30 2021-07-08 ナパジェン ファーマ, インコーポレテッドNapaJen Pharma, Inc. 化学修飾ｓｉＲＮＡとシゾフィランとの複合体を含む医薬組成物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007058323A1 (ja) * 2005-11-17 2007-05-24 Napa Jenomics Co., Ltd. 核酸ホモポリマー結合機能性核酸医薬品の製造法
US20100286230A1 (en) * 2005-10-20 2010-11-11 Sylentis S.A.U. Modulation of trpv expression levels
CN101918554A (zh) * 2007-12-18 2010-12-15 独立行政法人产业技术综合研究所 多糖/双链rna复合物
WO2012020795A1 (ja) * 2010-08-10 2012-02-16 ナパジェン ファーマ，インコーポレテッド 核酸多糖複合体

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1142591B1 (en) 1999-11-10 2008-04-23 Japan Science and Technology Agency Gene carriers
AU2002237559B2 (en) 2001-03-13 2006-10-26 Japan Science And Technology Agency Gene carriers with the use of polysaccharide and process for producing the same
JP2005204612A (ja) * 2004-01-26 2005-08-04 Japan Science & Technology Agency 新規な遺伝子導入法
KR101147147B1 (ko) * 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
GB0411537D0 (en) * 2004-05-24 2004-06-23 Midatech Ltd Nanoparticles comprising rna ligands
CN101148680B (zh) * 2007-10-23 2010-06-02 南京凯瑞尔纳米生物技术有限公司 由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100286230A1 (en) * 2005-10-20 2010-11-11 Sylentis S.A.U. Modulation of trpv expression levels
WO2007058323A1 (ja) * 2005-11-17 2007-05-24 Napa Jenomics Co., Ltd. 核酸ホモポリマー結合機能性核酸医薬品の製造法
CN101918554A (zh) * 2007-12-18 2010-12-15 独立行政法人产业技术综合研究所 多糖/双链rna复合物
WO2012020795A1 (ja) * 2010-08-10 2012-02-16 ナパジェン ファーマ，インコーポレテッド 核酸多糖複合体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mochizuki S et al., "ssDNA-dsRNAs are cleaved at the next to its chimera-junction point by an unknown RNase activity" Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 428(4):433-437. *

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