CN104845969A - 一种调控和提高脱氧核酶催化活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种调控和提高G-四聚体脱氧核酶(DNAzyme)-氯化血红素(hemin)复合物催化双氧水(H2O2)氧化2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)反应的方法。在本方法中，通过对已知DNAzyme的序列进行拆分，选择出高活性的核酸片段，然后通过与一定长度的多胸腺嘧啶(T)核酸序列将两条高活性的片段进行重组连接，通过调节多T核酸序列的长度即可调控并且有效提高重组DNAzyme的催化活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种调控和提高脱氧核酶催化活性的方法，特别涉及一种调控和提高具有G-四聚体结构的脱氧核酶(DNAzyme)-氯化血红素(hemin)复合物催化H2O2氧化2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS2+)反应的催化活性的方法，属于生物分析技术领域。
背景技术
G-四聚体(G-quadruplex)是指由含有多个连续鸟嘌呤碱基G的DNA或RNA形成的一种特殊的核酸二级结构。它首先由四个G碱基通过Hoogsteen氢键的配对方式首尾连接构成了一个由4个G形成的平面，然后不同平面之间通过π-π堆积作用而形成多层结构，即为G-四聚体。
具有G-四聚体结构的核酸因其高度有序的碱基空间排列结构，具备多种特殊性质和广泛的潜在应用前景。其中，用来调控和稳定线状染色体末端的端粒即是由6个碱基重复序列(TTAGGG)的单链DNA及一些蛋白组合而成。G-四聚体核酸结构及活性的研究对于开发出潜在的新型抗肿瘤药物有重大意义。另外最近在非编码区和多种核酸适配体中也发现了G-四聚体结构。此外，部分具有G-四聚体结构的脱氧核酸具有特别的催化功能，被称为脱氧核酶(DNAzyme)。脱氧核酶相比传统蛋白质酶具有易于化学合成和修饰、热稳定性好、不易水解等优点，因此在生物模拟酶的研究中占有极其重要的地位。
其中有一类DNAzyme在K+、Na+、NH4 +等阳离子存在的条件下形成G-四聚体结构，此时氯化血红素嵌入G-四聚体结构的空穴之中，显著提高氯化血红素(hemin)催化H2O2氧化2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS2+)或鲁米诺的反应。由于该反应的产物在紫外可见范围内有特征吸收或化学发光，近年来，该类具有过氧化氢酶活性的DNAzyme-hemin复合物被广泛用于一系列高灵敏度、高特异性的化学及生物传感器，用于实现DNA分子(端粒酶活性，单碱基突变)、蛋白(凝血酶)、离子(钾离子、汞离子)等多种分析物的检测分析。
在G-四聚体DNA中，多层结构的形成可以由一条完整的DNA链弯曲结合而成，也可以由多条裂分的多G序列共同组合而成。因此，G-四聚体可分为单链、双链和四链等几种形式。此外，根据多G序列弯曲形成G-四聚体结构时各棱上DNA折叠方向的不同，G-四聚体DNA的结构又可被定义为平行、反平行和混合等模式。不同结构的DNAzyme的过氧化氢酶的活性各异，通常具有平行结构的DNAzyme的活性高于具有反平行结构的DNAzyme。
目前，具有过氧化氢酶活性的脱氧核酶最初由体外筛选技术(SELEX)获得。由于该技术本身的局限性，所获得的脱氧核酶的催化活性有限。近些年来国内外研究人员采用多种不同方法来提高脱氧核酶的催化活性，主要包括下列方法：(1)嫁接法：在原始的脱氧核酶上嫁接上一部分双链结构(J.Am.Chem.Soc.2009,131,10320–10333；PLoS ONE,2009,4,e5126.)；(2)碱基变异：将原始脱氧核酶中的环(loop)的碱基进行变化(Anal.Chem.2013,85,5430-5435)；(3)化学修饰：将原始脱氧核酶的碱基进行化学修饰(Chem.Commun.,2012,48,8347–8349)。
发明内容
本发明的目的在于提出一种调控和提高具有G-四聚体结构的脱氧核酶(DNAzyme)-氯化血红素(hemin)复合物催化H2O2氧化2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS2+)反应的催化活性的方法。其特征在于首先通过对已知核酶AB(5'-AGGGACGGGATGTGGAGGGT-3')的核酸序列进行拆分，选择出高活性核酸片段A(5'-AGGGACGGGA-3')，然后具有不同长度胸腺嘧啶(T)碱基的DNA链分别连接两个高催化活性片段A，形成一系列新的重组脱氧核酶ATnA。通过对这些重组的脱氧核酶进行结构分析和催化活性的测试，发现调控T碱基的数量可以调控脱氧核酶的结构和提高催化双氧水(H2O2)氧化ABTS2+的活性。
本发明基于对已知脱氧核酶进行拆分和重组，通过调节连接两个高催化活性片段的连接链的长度来调控核酶结构和催化活性的方法，具有如下的技术效果：1、应用本发明可以设计出比已知脱氧核酶催化活性更高的新型脱氧核酶；2、应用本发明可以通过简单调节连接多T链的长度调控脱氧核酶的催化活性，设计出一系列催化活性渐变的脱氧核酶。3、应用本发明可以通过简单调节连接多T链的长度调控核酶的结构，实现从反平行结构到平行结构的渐变。
附图说明
图1A–图1C是四种脱氧核酶与氯化血红素(hemin)催化活性的直接比较。脱氧核酶AB-hemin、拆分序列A-hemin、拆分序列B-hemin、重组序列AT8A-hemin及hemin自身催化双氧水氧化ABTS反应4min时的紫外可见光谱图(A)；四种脱氧核酶与氯化血红素(hemin)复合物分别催化双氧水氧化ABTS2+反应30min时的显色效果比较图(B)。四种脱氧核酶与氯化血红素(hemin)催化过氧化物反应的动力学数据比较(C)。测量产物的最大紫外可见吸收波长(418nm)处在0-8min的吸光度并绘制动力学曲线。在图1A和图1C中，至上而下分别是AT8A、AB、A、B、hemin，其中B和hemin的曲线是重叠在一起的。
图2A-图2D是测定三种脱氧核酶AT8A(A)，AB(B)和A(C)-hemin复合物的解离常数Kd的原始数据与数据处理图(插图)，图2D为解离常数。
图3A-图3B是12种含不同数量T的连接链的系列重组核酶ATnA(n＝1-12)与氯化血红素复合物催化过氧化物反应的活性的动力学数据比较图(A)和相对催化活性的比较图(B)。测量产物(自由基正离子ABTS·+的最大紫外可见吸收波长(418nm)处在0-8min的吸光度并绘制动力学曲线。相对活性以AB的催化活性为1进行计算。
图4A-图4B是四种脱氧核酶AB,AT1A、AT2A和AT3A(A)和10种重组脱氧核酶ATnA(n＝3-12)(B)的圆二色谱图。
图5是本发明设计的重组脱氧核酶ATnA(n＝1-12)的二级结构与连接链长度的关系图。
具体实施方式
表1：本发明中使用的核酸序列。
| 名称 |
| AB | AGGGACGGGATGTGGAGG GT |
| A | AGGGACGGGA |
| B | TGTGGAGG GT |
| ATnA(n＝1-12) | AGGGACGGGATnAGGGACGGGA |
实施例1：四种脱氧核酶(A、B、AB和AT8A)-氯化血红素复合物的催化过氧化氢氧化ABTS2+的反应活性的比较。
将四种核酶(A、B、AB和AT8A,序列见表1)溶解在反应缓冲液Ι中(4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(25mM),KNO3(20mM),NaNO3(200mM),TritonX-100(0.025％(w/v)),DMSO(1％(v/v)),pH 5.3)中，其终浓度为0.125μM.将上述溶液先于95℃水浴加热6分钟，然后缓慢冷却2小时至室温(约25℃)。将氯化血红素(hemin)(终浓度为0.2μM)加入上述热处理后的溶液中，于室温孵育1小时，形成脱氧核酶-hemin复合物。加入反应物ABTS2+(终浓度0.5mM)和H2O2(终浓度1mM)于上述溶液中。记录反应进行4分钟时绿色产物ABTS·+的紫外吸收光谱。产物在418nm处的最大吸光光度值用来定量分析脱氧核酶的催化活性(图1A)。
结果表明：比较4分钟时418nm处的产物最大吸光光度值(图1A)和30分钟时的反应产物的颜色(图1B)可知，四种脱氧核酶-hemin复合物的催化活性均优于hemin本身。它们催化H2O2氧化ABTS的反应活性顺序为——AT8A-hemin>AB-hemin>拆分序列A-hemin>拆分序列B-hemin。
实施例2：四种脱氧核酶(A、B、AB和AT8A)-与氯化血红素催化过氧化物反应的动力学数据比较。
四种核酶(A、B、AB和AT8A,序列见表1)溶解在反应缓冲液Ι中(HEPES(25mM),KNO3(20mM),NaNO3(200mM),Triton X-100(0.025％(w/v)),DMSO(1％(v/v)),pH＝5.3)中，其终浓度是0.125μM。将此溶液先在95℃水浴加热6分钟，然后缓慢冷却2小时至室温(约25℃)。将终浓度为0.2μM的氯化血红素(hemin)加入上述热处理后的溶液中，于室温共同孵育1小时，形成脱氧核酶-hemin复合物。加入反应物ABTS2+(终浓度0.5mM)和H2O2(终浓度1mM)于上述溶液中。每隔1分钟记录AB-hemin、A-hemin、B-hemin、AT8A-hemin及hemin本身催化H2O2氧化ABTS2+反应产物的最大紫外吸光光度值(418nm处),绘制0-8min的动力学曲线(图1C)。
由动力学曲线(图1C)可以看出，在相同的反应条件下，AT8A-hemin催化反应最先达到信号饱和，结果表明其催化H2O2氧化ABTS2+反应的效率最高。催化反应的初始反应速率由动力学曲线上反应进行1分钟时的切线斜率计算得到(图1C)。AT8A,AB,A和B与hemin复合物以及hemin本身催化反应在1分钟内的初始反应速率分别是1.5,0.78,0.42,0.25,and 0.22μM/min。结果表明，AT8A-hemin的催化反应初始速率是AB-hemin的1.92倍(摩尔消光系数ε＝3.6×104L·mol-1·cm-1)，是hemin本身的6.8倍。
实施例3：三种脱氧核酶解离常数Kd的测定与比较。
三种脱氧核酶AT8A、AB和A分别溶解在反应缓冲液Ι中，其终浓度范围是0nM、10nM、20nM、40nM、60nM、100nM、200nM、800nM、2μM到5μM。分别将此溶液先在95℃的水浴加热6分钟，然后缓慢冷却2小时至室温(约25℃)。将终浓度为0.2μM的氯化血红素(hemin)加入上述热处理后的DNA溶液中，于室温共同孵育1小时，形成脱氧核酶-hemin复合物。加入反应物ABTS2+(终浓度0.5mM)和H2O2(终浓度1mM)于上述溶液中。记录不同浓度下的反应混合物在1分钟时的紫外吸光光度值。
在内嵌图中，X表示脱氧核酶的浓度(单位μM)。Y的计算公式为，Y＝(Ax-A0)/(A∞-A0)，其中A0是反应的初始吸光光度值，即脱氧核酶浓度为0μM时产物的最大吸光光度值(418nm处)；A∞是反应达饱和时的吸光光度值，即脱氧核酶浓度为2μM反应饱和时，产物的最大吸收光度值(418nm处)。以1/Y对1/X作图，所得直线的斜率即为Kd。
计算结果表明，如图2所示，三种脱氧核酶-hemin复合物的解离常数分别是AT8A(81nM)、AB(186nM)、A(1812nM)。其中，重组序列AT8A的解离常数Kd最小，表明其与hemin的结合能力最强。
实施例4：12种含不同长度连接链的重组脱氧核酶与氯化血红素催化过氧化物反应的动力学数据比较。
12种重组脱氧核酶(ATnA,n＝1-12)溶解在反应缓冲液Ι中(终浓度0.125μM)，步骤同上进行热处理。加入hemin(终浓度0.2μM)于上述热处理后的溶液中，共同于室温孵育1小时，形成ATnA-hemin复合物。加入反应物ABTS2+(终浓度0.5mM)和H2O2(终浓度1mM)。记录每分钟催化反应产物ABTS·+的最大紫外吸光光度值(418nm处)，绘制12种重组脱氧核酶在0-8分钟内的反应动力学曲线。
结果表明：如图3A所示，将两个核酶序列片段A由不同长度的连接链相连，组成一系列新的脱氧核酶ATnA后，其催化活性顺序为AT11A>AT12≈AT10A>AT9A>AT8A>AT2A>AT7A≈AT1A>AT6A>AT5A≈AT4A≈AT3A≈AB。说明调节连接链的长度，可以用于方便地调控重组脱氧核酶的催化活性。在本例中，当连接链含11个T碱基时，催化活性最好，最先达到信号饱和。如图3B所示，所有重组的脱氧核酶ATnA的催化活性均高于AB，其中AT11A-hemin的催化反应初始速率达到AB-hemin的4倍。
实施例5：三种重组脱氧核酶(ATnA,n＝1-3)与原核酶AB的圆二色谱结构分析。
利用圆二色谱对重组脱氧核酶AT1A、AT2A、AT3A及原核酶AB进行结构表征。将上述脱氧核酶分别溶解在HEPES缓冲液Ⅱ(HEPES(25mM),KCl(20mM),NaCl(200mM),Triton X-100(0.002％(w/v)),pH＝5.3)，终浓度为2μM。将此溶液先在95℃的水浴加热6分钟，然后缓慢冷却2小时至室温(约25℃)，诱导形成G-四聚体结构，于4℃冰箱中过夜。用Jasco J-810圆二色光谱仪于室温条件下(约25℃)对其进行结构的测量。光谱记录范围220～340nm，测量池光路为0.1厘米，扫描速度100纳米/分钟，响应时间1秒，狭缝宽度2纳米，搜集数据波长间隔0.1纳米，所得图形为三次测量结果的累加平均值。
结果表明：如图4A所示，AB基本上为平行的G-四聚体结构(240nm处出现负峰，265nm左右出现正峰，295nm处的正峰较弱)。与AB相比，AT1A和AT2A的反平行结构逐渐增强(265nm和240nm的峰减弱而295nm处的正峰增强)，大体上为混合型的结构(图5)。AT3A基本上为反平行的G-四聚体结构(260nm处出现负峰，295nm处强的正峰)(图5)。
实施例6：10种含不同长度连接链的重组重组脱氧核酶的圆二色谱图。
将12种重组脱氧核酶(ATnA,n＝3-12)分别溶解在HEPES缓冲液Ⅱ中，终浓度为2μM。热处理此核酸序列，诱导形成G-四聚体结构后，用Jasco J-810圆二色光谱仪表征结构信息。仪器参数及实验条件同上(实施例5)。
结果表明，如图4B所示，重组脱氧核酸ATnA(n＝3-12)随着连接链长度的逐渐增加，逐渐由反平行的G-四聚体结构(AT3A)过渡为平行的G-四聚体结构(AT12A)(图5)，此过渡趋势在圆二色谱图中表现明显(240nm处的正峰逐渐变为负峰，295nm处的峰逐渐减小)。
此系列重组脱氧核酶的圆二色谱构象分析结果与上述动力学曲线(图3)相符合，表明平行结构的G-四聚体脱氧核酶-hemin具有更高催化活性。这样通过调节连接链中T碱基的数目就可以方便地用来调节此类重组脱氧核酶的结构和催化活性。
Claims (10)
1.一种调控和提高核酶催化活性的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：第一步骤：通过对已知核酶的核酸序列进行拆分，选择出高活性核酸片段，第二步骤：具有不同长度胸腺嘧啶(T)碱基的DNA链分别连接两个高催化活性片段，形成一系列新的重组核酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一步骤为将已知的核酶序列AB切割为序列A与B两个核酸片段，分别测试这两个片段序列对于H2O2氧化ABTS反应的催化活性；第二步骤为选择A、B片段中活性较高的B部分作为重复单元，以含不同数量T的连接链连接两个B，得到系列重组核酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于还包括如下步骤：测试系列重组核酶的催化活性，通过圆二色谱表征其形成G-四聚体DNA的结构。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于还包括如下步骤：分析设计合成的系列核酶的结构及其催化活性的关系，总结出高催化活性核酶的结构特征与设计方法。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，第一步骤如下：将核酶溶解在反应缓冲液Ι中(4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(25mM),KNO3(20mM),NaNO3(200mM),Triton X-100(0.025％(w/v)),DMSO(1％(v/v)),pH 5.3)中，其终浓度为0.125μM.将上述溶液先于95℃水浴加热6分钟，然后缓慢冷却2小时至室温(约25℃)，将氯化血红素(hemin)(终浓度为0.2μM)加入上述热处理后的溶液中，于室温孵育1小时，形成脱氧核酶-hemin复合物，加入反应物ABTS2+(终浓度0.5mM)和H2O2(终浓度1mM)于上述溶液中，记录反应进行4分钟时绿色产物ABTS·+的紫外吸收光谱，产物在418nm处的最大吸光光度值用来定量分析脱氧核酶的催化活性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括绘制0-8min的动力学曲线。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酶序列AB为5'-AGGGACGGGATGTGGAGGGT-3'。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述连接链含11个T碱基。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述重组核酶为平行结构的G-四聚体DNA-hemin形成的复合物核酶。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述重组核酶为AT8A-hemin组成的复合物核酶。
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