CN102031284A - 一种基于脱氧核酸酶的铅离子检测芯片、制作及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于脱氧核酸酶的Pb²⁺检测芯片、制作及其使用方法，其特征在于对具有特异性强响应的脱氧核酸酶8-17的17E酶链催化切断17DS底物链，造成切断后17DS底物链的部分或全部脱落。所述的17DS底物链预先进行荧光标记，则切断使荧光信号降低。使用方法特征在于使用所述的铅离子检测芯片进行铅离子的检测只需要将待测样品添加到芯片上，并保持一段时间，然后利用芯片信号分析系统扫描芯片，并对荧光信号进行分析；通过荧光信号的变化，实现对的Pb²⁺检测；样品中Pb²⁺浓度越高，荧光信号减弱越多。Pb²⁺检测浓度范围是1nM～10μM。

Description

一种基于脱氧核酸酶的铅离子检测芯片、制作及使用方法

技术领域

本发明涉及一种基于脱氧核酸酶(DNAZyme)的铅离子检测芯片制作及其应用方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

由于铅在燃料、建筑材料、涂料、油漆及工业加工中的广泛应用，所以铅在环境包括土壤、水、甚至食物链中普遍存在。铅的污染向来是一个很严重的环境问题。以铅离子为代表的无机污染物一旦进入环境后，不会像有机污染物那样在环境中被快速分解，它们可能长期残留于环境中，产生经久不衰的污染。而进入人体的铅离子对人体的健康也存在着巨大危害，当人体内铅含量超过一定水平时，将严重影响人们的身体健康，特别是儿童的健康。铅中毒至少损害到三种人体器官：(1)周围及中枢神经系统；(2)亚铁血红细胞的生物合成途径；(3)肾脏功能。

如何有效地进行环境中铅离子含量的测定，成为摆在广大分析工作者面前的一个问题。目前传统的铅检测技术：原子吸收光谱、高效液相色谱、毛细管电泳、双硫腙比色法、X射线荧光技术、中子活化分析或电感耦合等离子体质谱分析法等，尽管能够得到比较精确的检测结果，但这些技术往往要依赖大型仪器设备、耗费耗时、需进行样品预处理，需要专门的技术人员进行操作，检测成本高，很难满足产地现场快速检测的要求，并且其中有些方法还需要用到有毒试剂，难以被分析人员接受。因此，在很多重要的场合，人们迫切需要简便、快速、经济、准确的分析检测铅离子的方法。目前，国内外对铅离子进行现场检测的方法在灵敏度和专一性上不能够满足要求。

脱氧核酸酶(DNAzyme)是通过体外筛选技术(SELEX技术)得到的具有酶活性的小分子单链DNA，其催化的反应范围很广：DNA或RNA的剪切反应、DNA的连接反应、磷酸化反应等。一些脱氧核酸酶的活性与特定二价金属离子辅因子密切相关。由于DNAzyme具有易于合成和修饰、稳定性好及对环境污染小等特点，使其在金属离子检测中的应用备受关注，其中较为典型的是Lu等人发现的对Pb²⁺特异的8-17E DNAzyme(Brown，A.K.；Li，J.；Pavot，C.M.B.；Lu，Y.Biochemtstry 2003，42，7152-7161.)，并由此发展了各种基于8-17E DNAzyme检测Pb²⁺的方法：如均相荧光法(Li，J.；Lu，Y.J.Am.Chem.Soc.2000，122，10466-10467)、纳米金聚集比色法(Liu，J.W.；Lu，Y.J.Am.Chem.Soc.2003，125，6642-6643)，在金表面上组装8-17E DNAzym进行液相荧光检测的方法(Swearingen，C.B.；Wernette，D.P.；et al.Anal.Chem.2005，77(2)，442-448.)在微流控芯片中PMMA表面上组装8-17E DNAzym进行荧光检测的方法(Dalavoy，T.S.；Wernette，D.P.；et al.LabChip，2008，8，786-793.)这些方法普遍具有选择性好、特异性强等特点，但操作繁琐，并不适合高通量的检测。

生物芯片是本世纪八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他物质的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化，能够实现对微量样品快速、准确的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于脱氧核酸酶的Pb²⁺检测芯片、制作方法及其使用方法，本发明将脱氧核酸酶和生物芯片的优点相结合，以实现对Pb²⁺低成本、高灵敏、准确、快速的检测。本发明的特征在于：利用具有Pb²⁺特异性强响应信号的脱氧核酸酶8-17DNAzyme，在Pb²⁺存在的情况下，17E酶链催化断裂为17DS底物链。具体地说，将合成的17E酶链固定在经修饰的玻片上；然后荧光标记的底物链17DS与玻片上的酶链杂交，形成双链结构，制备成Pb²⁺检测芯片；再加入待测样品，检测荧光信号。若待测样品中含Pb²⁺时，则Pb²⁺能够极大的提高17E酶链催化切断底物链的速度，底物链切断后，则荧光信号减弱。铅离子存在与否，可通过荧光扫描仪定量分析。

本发明提供的基于脱氧核酸酶的Pb²⁺检测芯片的制作方法，包括如下步骤：

(1)化学修饰的酶链17E固定在化学修饰的玻片上

2-40μM化学修饰的17E按1∶1(V/V)的比例加入2×点样缓冲液。通过以接触式Cartesian mocroarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片。点样完毕，将玻片置于一定湿度，比如70％湿度、室温条件下48～72h进行固定。分别用0.2％SDS、去离子水洗2次，每次2min，然后用醛基封闭液(0.1g硼氢化钠，30mL PBS，10mL 99％乙醇)封闭15min。再依次用0.2％SDS、去离子水各洗2次，每次2min，吹干，备用。

(2)17DS底物链与17E酶链的杂交

标记了荧光集团的底物链17DS用杂交液稀释成1-10μM。将稀释好的底物链溶液加在芯片的斑点处，盖上盖玻片。芯片置于湿盒中，25℃，经12-16h后将芯片置于4℃，30min，再25℃，15min。然后依次用0.2％SDS，2×SSC，0.2×SSC洗3min，吹干，备用。

本发明提供的Pb²⁺检测芯片的使用方法，包括如下步骤：

用杂交液稀释制备好不同浓度的Pb²⁺，加不同浓度的Pb²⁺溶液于芯片斑点处，4℃，反应1h。去离子水洗3次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描并分析结果。

总之，本发明利用了在Pb²⁺存在的情况下，对Pb²⁺具有特异性强响应的脱氧核酸酶8-17的17E酶链催化切断17DS底物链，造成切断后17DS底物链的部分或全部脱落的特征反应。如果17DS底物链预先进行荧光标记，切断使荧光信号减弱。铅离子荧光检测芯片的制备包括三个步骤：首先根据已知的脱氧核酸酶8-17的结构，设计相应的化学修饰的17E酶链和荧光修饰的17DS底物链，然后将末端修饰的17E酶链固定在经修饰的玻片上，最后将荧光标记的底物链17DS与玻片上的酶链杂交，形成脱氧核酸酶8-17双链结构。使用上述芯片进行铅离子的检测只需要将待测样品添加到芯片上，并保持一段时间，然后利用芯片信号分析系统扫描芯片，并对荧光信号进行分析。通过荧光信号的变化，实现对的Pb²⁺检测。样品中Pb²⁺浓度越高，荧光信号减弱的越多。该方法可以检测的Pb²⁺的浓度范围是1nM-10μM。该铅离子检测芯片也可以不使用荧光标记的17DS底物链，而采用纳米金标记探针杂交和银染技术，对Pb²⁺浓度进行灰度检测；或者使用其它各种各样的信号标记，比如放射性标记、量子点、酶或纳米金等。：

1、本发明基于脱氧核酸酶的Pb²⁺检测芯片的制作方法简单、易行。

2、本发明基于脱氧核酸酶的Pb²⁺检测芯片具有检测灵敏度和专一性高。

3、应用本发明基于脱氧核酸酶的Pb²⁺检测芯片检测Pb²⁺时，样品、试剂消耗量少，成本低。

4、使用本发明的检测的结果用普通的扫描仪扫描观察及分析即可，不需要复杂的昂贵设备，使现场检测更方便、易行。

附图说明

图1.是芯片上基于脱氧核酸酶荧光检测铅离子的原理图。

图2(A)-图2(B)，是本发明实施例3中利用Pb-1和Pb-2杂交制备的检测芯片检测Pb²⁺的荧光扫描照片及荧光信号减弱(％)标准曲线。荧光扫描照片中荧光强度(平均)依次是：缓冲液组64064，10nM Pb²⁺组38358，100nM Pb²⁺组18180，1μM Pb²⁺组5913，10μM Pb²⁺组2870。

图3(A)-图3(B)，是本发明实施例4中利用Pb-3和Pb-4杂交制备的检测芯片检测Pb²⁺的荧光扫描照片及荧光信号减弱(％)标准曲线。荧光扫描照片中荧光强度(平均)依次是：缓冲液组63966，3nM Pb²⁺组54169，10nM Pb²⁺组35323，100nM Pb²⁺组16658，1μM Pb²⁺组7056，10μM Pb²⁺组4233。

图4(A)-图4(B)，是本发明实施例5中利用Pb-1和Pb-2杂交制备的检测芯片检测Pb²⁺和其他二价离子的荧光扫描照片及荧光信号减弱结果(％)。荧光扫描照片中荧光强度(平均)依次是：缓冲液组64263，Pb^{2 +}组2879，Hg²⁺组60909，Zn²⁺组61584，Mg²⁺组60073，Cu²⁺组61963.Ca^{2 +}组62355。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明的实质性特点和显著的进步，为阐述方便，先将所涉及的核酸序列列于表1中。

表1：本发明中使用的核酸探针序列。

实施例1：利用探针Pb-1和Pb-2制备Pb²⁺检测芯片。

将40μM的Pb-2溶于水，然后与相同体积的Spotting Solution混合，用Cartesian公司的微阵列芯片制作系统点阵在醛基修饰的载玻片表面，置于室温下，在70％相对湿度下保存48-72h进行固定，然后，室温下将玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入纯水中振荡数分钟，再浸入0.2％SDS两次，每次2min，再浸入纯水中两次，每次2min，晾干。用杂交液(10mM Tris-HCl，pH 7.2，1M NaCl)将Pb-1稀释，终浓度为5μM，滴于芯片上，盖上盖玻片，室温杂交12-16h后。然后将芯片置于4℃，30min，再25℃，15min。然后依次用0.2％SDS，2×SSC，0.2×SSC洗3min，吹干备用。

实施例2：利用探针Pb-3和Pb-4制备Pb²⁺检测芯片。

将40μM的Pb-4溶于水，然后与相同体积的Spotting Solution混合，用Cartesian公司的微阵列芯片制作系统点阵在醛基修饰的载玻片表面，置于室温下，70％相对湿度保存48-72h进行固定，然后，室温下将玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入纯水中振荡数分钟，再浸入0.2％SDS两次，每次2min，再浸入纯水中两次，每次2min，晾干。用杂交液(10mMTris-HCl，pH 7.2，100mM NaCl)将Pb-3稀释，终浓度为5μM，滴于芯片上，盖上盖玻片，室温杂交12-16h后，将芯片置于4℃，30min，再25℃，15min。然后依次用0.2％SDS，2×SSC，0.2×SSC洗3min，吹干备用。

实施例3：使用探针Pb-1和Pb-2制备的芯片检测不同浓度的Pb²⁺。

用10mM Tris-HCl，pH 7.2，50mM NaCl稀释制备好不同浓度的Pb²⁺，加不同浓度的Pb²⁺溶液于制备好的芯片斑点处，4℃，反应1h，再室温放置15min。且用缓冲液洗3次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片(图2A)并分析结果(图2B)。

结果表明，在Pb²⁺离子存在的情况下，芯片斑点处荧光强度减弱，当Pb²⁺浓度为10nM时，与缓冲液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度减弱40％，随着Pb²⁺浓度增加，荧光信号逐渐减弱。该芯片检测Pb²⁺的检测限为1nM。

实施例4：使用探针Pb-3和Pb-4制备的芯片检测不同浓度的Pb²⁺。

用10mM Tris-HCl，pH 7.2，100mM NaCl杂交液稀释制备好不同浓度的Pb²⁺，加不同浓度的Pb²⁺溶液于制备好的芯片斑点处，4℃，反应1h，再室温放置15min。用10mM Tris-HCl，pH 7.2，100mM NaCl缓冲液洗2次，再用缓冲液洗一次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片(图3A)并分析结果(图3B)。

结果表明，在Pb²⁺离子存在的情况下，芯片斑点处荧光强度减弱，当Pb²⁺浓度为3nM时，与缓冲液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度减弱15％，随着Pb²⁺浓度增加，荧光信号逐渐减弱。该芯片检测Pb²⁺的检测限为1nM。

实施例5：考察探针Pb-1和Pb-2制备的芯片对Pb²⁺检测的特异性。

用10mM Tris-HCl，pH 7.2，50mM NaCl稀释制备10μM的不同的二价金属离子，加不同二价金属离子溶液于制备好的芯片斑点处，4℃，反应1h，再室温放置15min，再用缓冲液洗3次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片(图4A)并分析结果(图4B)。

结果表明，只有在Pb²⁺存在的情况下，芯片斑点处荧光强度大大减弱，Pb²⁺为10μM时，与缓冲液组的荧光强度相比，荧光强度减弱了95％。而当加入10μM其他二价金属离子，荧光强度只有微小的减弱，在1％～5％左右。说明该芯片对Pb²⁺检测具有很好的特异性。

Claims (9)

1.一种基于脱氧核酸酶的铅离子检测芯片，其特征在于对具有特异性强响应的脱氧核酸酶8-17的17E酶链催化切断17DS底物链，切断后17DS底物链的部分或全部脱落。

2.按权利要求1所述的铅离子检测芯片，其特征在于所述的17DS底物链预先进行荧光标记，切断使荧光信号减弱。

3.制作如权利要求1或2所述的铅离子检测芯片的方法，其特征在于首先根据已知的脱氧核酸酶8-17的结构，设计相应的化学修饰的17E酶链和荧光修饰的17DS底物链，然后将末端修饰的17E酶链固定在经修饰的玻片上，最后将荧光标记底物链17DS与玻片上酶链杂交，形成脱氧核酸酶8-17双链结构。

4.按权利要求3所述的制作方法，其特征在于包括：

(1)化学修饰的酶链17E固定在化学修饰的玻片上

2-40μM化学修饰的17E按1∶1体积比加入2×点样缓冲液。通过以接触式Cartesian mocroarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片。点样完毕，将玻片置于70％湿度、室温的条件下48～72h进行固定；并分别用0.2％SDS、去离子水洗2次，每次2min，然后用醛基封闭液封闭15min；再依次用0.2％SDS、去离子水各洗2次，每次2min，吹干；

(2)17DS底物链与17E酶链的杂交

标记了荧光的底物链17DS用杂交液稀释成1-10μM。将稀释好的底物链溶液加在芯片的斑点处，盖上盖玻片；芯片置于25℃湿盒中，12-16h后，将芯片置于4℃，30min，再25℃，15min；然后依次用0.2％SDS，2×SSC，0.2×SSC洗3min，吹干。

5.按权利要求4所述的制作方法，其特征在于所述的封闭液由0.1g硼氢化钠、30ml PBS和10ml质量百分含量为99％乙醇组成。

6.使用如权利要求1所述的铅离子检测芯片的方法，其特征在于使用所述的铅离子检测芯片进行铅离子的检测只需要将待测样品添加到芯片上，并保持一段时间，然后利用芯片信号分析系统扫描芯片，并对荧光信号进行分析；通过荧光信号的变化，实现对的Pb²⁺检测；样品中Pb²⁺浓度越高，荧光信号减弱越多。

7.按权利要求6所述的使用方法，其特征在于检测铅离子的浓度范围是1nM～10μM。

8.按权利要求6所述的使用方法，其特征在于用10mM Tris-HCl，pH7.2，50mM NaCl杂交液稀释制备好不同浓度的Pb²⁺，加不同浓度的Pb²⁺溶液于制备好的芯片斑点处，4℃，反应1h，再室温放置15min；再用缓冲液洗3次，吹干后用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray3000扫描照片并分析结果。

9.按权利要求8所述的使用方法，其特征在于：

a)使用探针Pb-1和Pb-2制备的芯片，检测不同浓度的Pb²⁺表明在Pb^{2 +}离子存在的情况下，芯片斑点处荧光强度减弱，当Pb²⁺浓度为10nM时，与缓冲液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度减弱40％，随着Pb²⁺浓度增加，荧光信号逐渐减弱；

b)使用探针Pb-3和Pb-4制备的芯片，检测不同浓度的Pb²⁺表明在Pb^{2 +}离子存在的情况下，芯片斑点处荧光强度减弱，当Pb²⁺浓度为3nM时，与缓冲液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度减弱15％，随着Pb²⁺浓度增加，荧光信号逐渐减弱；

c)使用探针Pb-1和Pb-2制备的芯片对Pb²⁺检测特异性表明，只有在Pb²⁺存在的情况下，芯片斑点处荧光强度大大减弱，Pb²⁺为10μM时，与缓冲液组的荧光强度相比，荧光强度减弱了95％；而当加入10μM其他二价金属离子，荧光强度只有1％～5％的微小的减弱，所以制备的芯片对Pb^{2 +}检测具有特异性；

所述的Pb-1的序列为5’-Cy5-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3’；

所述的Pb-2的序列为5’-NH₂-T12-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGA

                  AATAGTGAGT-3’；

所述的Pb-3的序列为5’-TATGTCTGACTCACTATrAGGAAGAGA

                  TG-Cy5-3’；

所述的Pb-4的序列为5’CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATA

                  GTGAGTCAGACATA-T12-NH₂-3’。

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