CN115032254A - 一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法,主要包括两个部分:磁珠体系:S‑DNA与E‑DNA通过恒温振荡的方式将两条链以部分碱基互补配对的方式结合,固定在MBs上。检测体系:当上述溶液中含有铅离子时,DNAzyme被激活,S‑DNA在中间修饰的rA裂解位点裂解,并释放从S‑DNA上裂解下来的E‑DNA。释放的E‑DNA可以与新的S‑DNA结合,在Pb2+的帮助下释放更让多的E‑DNA直到S‑DNA用尽。磁分离后将上清液和沉淀物分别应用在电化学和荧光检测模式中,由此,得到了一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法。同其它用于铅离子检测的传感器相比,该传感器具有准确性高,可靠性强的优点。

Description

一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的 方法
技术领域
本发明涉及一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法,尤其涉及双模生物传感器的制备方法。
背景技术
铅作为人体非必需元素,主要通过吸入含铅烟雾和粉尘、饮水、进食等方式进入人体后不能代谢和生物降解。铅的毒性剧烈,对人体的危害是全身性的,急性中毒会引发头痛,幻觉,腹痛,骨关节炎,高血压,长时间接触低水平铅引发的慢性中毒则导致肌肉无力,先天畸形,精神失常,肾脏功能损伤,瘫痪甚至死亡。一些国家对环境和食品中的Pb2+含量有严格的要求,GB 5749-2006规定居民饮用水中的铅最大允许量为0.01 mg/L (48.26 nM),GB 2762-2017中详细列出了各类食品的铅限量值,其中茶叶的限量标准为5.0 mg/kg。因此,对于Pb2+的检测对生命、食品、环境和医学科学等都具有重要的意义。目前铅离子的检测方法主要有电感耦合等离子体-质谱法、电感耦合等离子体-原子发射光谱法、高效液相色谱法,这些方法虽然灵敏度,但需要昂贵的仪器,检测成本高,同时对操作人员的技术水平要求较高,不适合现场检测。因此,建立一种方便、经济、适用于现场检测的方法对于检测食品中的铅离子含量问题非常重要。
发明内容
一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法。
一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)磁珠体系的构建:通过S-DNA上的生物素(bio)与磁珠(MBs)包被的链霉亲和素(SA)之间的强结合将S-DNA固定在MBs上,然后吸取等体积的E-DNA通过恒温振荡的方式将两条链以部分碱基互补配对的方式结合。
(2)双模生物传感器的构建包括两个部分:电化学体系和荧光体系,当样本中含有铅离子时,DNAzyme被激活,S-DNA在中间修饰的rA裂解位点裂解,并释放从S-DNA上裂解下来的E-DNA,Pb2+以及链b;释放的E-DNA可以与新的S-DNA结合,在Pb2+的帮助下释放更让多的E-DNA和链b,直到S-DNA用尽;电化学体系:首先,链d通过Au-S键的方式结合至电极表面,上述样本磁分离后,将上清液中链b滴加在电极表面,与链d经碱基互补配对形成双链结构;此时,由于电极上双链DNA结构中的负磷酸骨架对亚甲基蓝具有镶嵌作用,亚甲基蓝进入电极表面产生较大电流,从而造成差分脉冲信号的变化;荧光体系:磁分离后留取沉淀物MBs与链a,此时,加入标记有荧光染料的DNA链c与沉淀物置于37℃恒温振荡仪中振荡1 h,孵育完成后,将上清液用缓冲液补充体积至200 μL,此时,由于链a与链c碱基互补配对,上清液中链c含量减少,从而造成荧光信号的变化,由此,得到了一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法。
所述的一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的E-DNA的序列为CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GAAGCAC;所述的S-DNA的序列为GGG GGG GTG AGT GCT TCC ACT AT rA GGA AGA GAT GAAAAAA;所述的S-DNA与E-DNA浓度比1:0.5~1:1.2;所述的MBs的体积为1~10 μL;所述的恒温振荡温度为20~50℃,时间为1~2 h;
所述的一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的Pb2+的孵育时间为0.5 h~1.5 h;所述的缓冲液为Tris-HCl,PBS,HEPES中的一种或两种,pH范围在6.0~8.0;
所述的一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的DNA链c的荧光基团为Cy3,Cy5,FAM,ROX,Alexa Fluor 488,AlexaFluor 594中的一种。
本发明所涉及的传感器中,采用荧光和电化学结合检测,与传统的用于检测铅离子的电化学传感器相比具有准确性高,可靠性强的优点。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下为本发明的较佳实施例详细说明。
附图说明
图1为基于磁分离技术用于铅离子超灵敏检测的新型双模生物传感器的制备示意图。
图2为所制备传感器在加入Pb2+前(虚线)、后(实线)的差分脉冲结果。
图3为所制备传感器在加入Pb2+前(虚线)、后(实线)的荧光信号结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1
具体步骤如下:
(1)磁珠体系的构建:准确吸取1 μmol/L 生物素标记的S-DNA与5 μL磁珠(MBs)包被的链霉亲和素(SA),恒温振荡1h后除去上清液,将S-DNA固定在MBs上。然后吸取等体积的E-DNA(0.5 μmol/L)通过恒温振荡的方式将两条链以部分碱基互补配对的方式结合。
(2)在上述体系中加入10 μL不同浓度的Pb2+置于37℃恒温振荡仪中振荡0.5 h。待充分振荡后,吸取上清液滴加在含有链d(Au-S键)的电极上。孵育1 h后,将电极浸泡在亚甲基蓝溶液中孵育30 min,待亚甲基蓝嵌入DNA链磷酸骨架后冲洗电极,将其放入PBS缓冲溶液中进行DPV测量(扫描区间为-0.4 V~0.2 V,扫描速率为50 mV/s,振幅为0.05 V,脉冲宽度为0.05 s)。而沉淀物中加入荧光基团FAM标记的链c,置于37℃恒温振荡仪中振荡1 h。孵育完成后,吸取上清液,用pH=7.4的PBS缓冲液补充溶液体积至200 μL。设置激发波长为490nm,发射波长测量范围510~600 nm,在荧光分光光度计下记录520 nm发射波长时的荧光强度。
实施例2
具体步骤如下:
(1)磁珠体系的构建:准确吸取2 μmol/L 生物素标记的S-DNA与5 μL磁珠(MBs)包被的链霉亲和素(SA),恒温振荡1.5 h后除去上清液,将S-DNA固定在MBs上。然后吸取等体积的E-DNA(1.5 μmol/L)通过恒温振荡的方式将两条链以部分碱基互补配对的方式结合。
(2)在上述体系中加入10 μL不同浓度的Pb2+置于37℃恒温振荡仪中振荡1 h。待充分振荡后,吸取上清液滴加在含有链d(Au-S键)的电极上。孵育1 h后,将电极浸泡在亚甲基蓝溶液中孵育45 min,待亚甲基蓝嵌入DNA链磷酸骨架后冲洗电极,将其放入Tris缓冲溶液中进行DPV测量(扫描区间为-0.4 V~0.2 V,扫描速率为50 mV/s,振幅为0.05 V,脉冲宽度为0.05 s)。而沉淀物中加入荧光基团Cy3标记的链c,置于37℃恒温振荡仪中振荡1 h。孵育完成后,吸取上清液,用pH=8的Tris-HCl缓冲液补充溶液体积至200 μL。设置激发波长为535 nm,发射波长测量范围540~630 nm,在荧光分光光度计下记录565 nm发射波长时的荧光强度。
所制备的电化学传感器对铅离子的检测具有准确性高,可靠性强的特点。同时,所制备的传感器对实际样品具有非常好的实际应用价值。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)磁珠体系的构建:通过S-DNA上的生物素(bio)与磁珠(MBs)包被的链霉亲和素(SA)之间的强结合将S-DNA固定在MBs上,然后吸取等体积的E-DNA通过恒温振荡的方式将两条链以部分碱基互补配对的方式结合;
(2)双模生物传感器的构建包括两个部分:电化学体系和荧光体系,当样本中含有铅离子时,DNAzyme被激活,S-DNA在中间修饰的rA裂解位点裂解,并释放从S-DNA上裂解下来的E-DNA,Pb2+以及链b;释放的E-DNA可以与新的S-DNA结合,在Pb2+的帮助下释放更让多的E-DNA和链b,直到S-DNA用尽;电化学体系:首先,链d通过Au-S键的方式结合至电极表面,上述样本磁分离后,将上清液中链b滴加在电极表面,与链d经碱基互补配对形成双链结构;此时,由于电极上双链DNA结构中的负磷酸骨架对亚甲基蓝具有镶嵌作用,亚甲基蓝进入电极表面产生较大电流,从而造成差分脉冲信号的变化;荧光体系:磁分离后留取沉淀物MBs与链a,此时,加入标记有荧光染料的DNA链c与沉淀物置于37℃恒温振荡仪中振荡1 h,孵育完成后,将上清液用缓冲液补充体积至200 μL,此时,由于链a与链c碱基互补配对,上清液中链c含量减少,从而造成荧光信号的变化,由此,得到了一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法。
2.根据权利要求1所述的一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的E-DNA的序列为CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAAATA GTG GAA GCAC;所述的S-DNA的序列为GGG GGG GTG AGT GCT TCC ACT AT rA GGA AGAGAT GAA AAAA;所述的S-DNA与E-DNA浓度比1:0.5~1:1.2;所述的MBs的体积为1~10 μL;所述的恒温振荡温度为20~50℃,时间为1~2 h。
3.根据权利要求1所述的一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的Pb2+的孵育时间为0.5 h~1.5 h;所述的缓冲液为Tris-HCl,PBS,HEPES中的一种或两种,pH范围在6.0~8.0。
4.根据权利要求1所述的一种基于磁分离技术介导的双模生物传感器检测铅离子的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的DNA链c的荧光基团为Cy3,Cy5,FAM,ROX,Alexa Fluor488,Alexa Fluor 594中的一种。
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