CN114058680A - 通过酶介导的链置换反应检测分析物 - Google Patents

通过酶介导的链置换反应检测分析物 Download PDF

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艾伦·费尔南多·罗德里格斯·塞诺拉
邢怡铭
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Abstract

本申请涉及利用酶辅助的核酸反应的、生物和/或环境样品中的小分子的体外传感器的组合物和方法。该方法和组合物可以用于响应和/或转导信号，所述信号由别构蛋白、核酸内切酶和核酸反应介导的信号传感产生。本申请能够几分钟内快速实现对目标物的一锅法分析。该方法和组合物可用于产生电化学信号、荧光信号、比色信号和/或发光信号，并且该方法兼容如溶液和纸基的检测形式。

Description

通过酶介导的链置换反应检测分析物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月6日提交的美国临时申请No.63/103,492的优先权，该美国临时申请的全文包括任何表、图形或图像在内，均通过引用并入本文。
技术领域
本申请主要涉及小分子的体外检测。特别地，本申请涉及别构蛋白、核酸内切酶和核酸组合物以及用于检测小分子或代谢物的方法。
背景技术
识别和信号转导元件的组合是构成小分子生物传感器的要素。适体、抗体和别构转录因子(aTF)等小分子敏感型识别生物分子在生物传感器中被广泛使用(参见Lee,K.H.等人，In Vitro Use of Cellular Synthetic Machinery for BiosensingApplications.Frontiers in Pharmacology.Frontiers Media S.A.2019.https://doi.org/10.3389/fphar.2019.01166)。其中，转录因子即aTF这类蛋白质可通过不同的结构域与DNA和效应物分子相结合，aTF与效应物分子的结合显著地影响其对DNA的亲和力。目前已有较多研究利用天然或经改造的转录因子的这类别构效应开发了在体内或体外检测相应的同源配体的生物传感器(参见Vanarsdale,E.等人，Redox-Based SyntheticBiology Enables Electrochemical Detection of the Herbicides Dicamba andRoundup via Rewired Escherichia Coli.ACS Sensors 2019,4,1180-1184.https://doi.org/10.1021/acssensors.9b00085；Wen,K.Y.等人，Freemont,P.S.A Cell-FreeBiosensor for Detecting Quorum Sensing Molecules in P.Aeruginosa-InfectedRespiratory Samples.ACS Synth.Biol.2017,6,2293-2301.https://doi.org/10.1021/acssynbio.7b00219；Dietrich,J.等人，Transcription Factor-Based Biosensors forDetecting Dicarboxylic Acids.US8652804B2,20140218；Mandell,D.J.等人，SmallMolecule Biosensors,WO/2017/048316A1,20180913)。
体外生物传感器中的别构转录因子通常可见分为两种：1)在无细胞体系，利用别构转录因子调节RNA聚合酶在其启动子上的酶活性建立检测平台(参见Silverman,A.D等人，Design and Optimization of a Cell-Free Atrazine Biosensor.ACSSynth.Biol.2020,9,671-677.https://doi.org/10.1021/acssynbio.9b00388；Jewett,M.C.等人，On Demand,Portable,Cell-Free Molecular Sensing Platform.WO/2020/072127,April 9,2020)；2)利用响应蛋白与分子信号转导相结合建立检测平台。目前，aTF与DNA相互作用生物分子(通常为酶)对于同一双链DNA片段的竞争这一原理被广泛的应用于生物传感器中。而这些方法可以归纳为：当存在同源配体且aTF-配体复合物从DNA解离时，竞争酶可以作用于DNA并产生随后可扩增的产物。例如，T4连接酶可以用于与aTF竞争带切口的双链DNA底物，该DNA底物的切口在aTF的结合序列中。当aTF响应于效应物后，T4连接酶可修复DNA，并且可以通过聚合酶链反应(PCR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或滚环扩增(RCA)进行扩增(参见Cao,J等人，Harnessing a Previously Unidentified Capabilityof Bacterial Allosteric Transcription Factors for Sensing Diverse SmallMolecules in Vitro.Sci.Adv.2018,4,eaau4602.https://doi.org/10.1126/sciadv.aau4602)。aTF HosA与克列诺片段(Klenow Fragment，KF)的竞争已用于检测对羟基苯甲酸(PHBA)。当PHBA存在时，KF与Nb.BbvCI(一种切口核酸内切酶)同时启动链置换扩增(SDA)循环，其中SDA的产物折叠成G-四链体可产生荧光信号或比色信号(参见Yao,Y.等人，Development of Small Molecule Biosensors by Coupling the Recognition ofthe Bacterial Allosteric Transcription Factor with Isothermal StrandDisplacement Amplification.Chem.Commun.2018,54,4774–4777.https://doi.org/10.1039/c8cc01764f)。限制性核酸内切酶HindIII在尿酸的存在可下用于切割HucR与DNA结合的序列，其中尿酸浓度和qPCR的Ct值之间的负相关(Yao,Y.等人，Novel SignalTransduction System for Development of Uric Acid Biosensors.Appl.Microbiol.Biotechnol.2018,102,7489–7497.https://doi.org/10.1007/s00253-018-9056-8)。最近，研究人员开发了用于检测尿酸的Cas12a平台(参见Liang,M.等人，A CRISPR-Cas12a-Derived Biosensing Platform for the Highly Sensitive Detection of DiverseSmall Molecules.Nat.Commun.2019,10.https://doi.org/10.1038/s41467-019-11648-1)。aTF-配体复合物的形成使核糖核蛋白(RNP)能够结合并切割靶DNA，从而激活Cas12a的反式切割活性以产生荧光信号。
目前，已开发的方法存在许多缺点。目前大多数方法均需要包括培养、平衡、洗涤和离心等多个制备的步骤，这些步骤不但延长了反应制备到获得检测结果的总时间，还使得实验体系更为复杂。同时，信号响应和扩增需分步进行，导致其无法在同一容器或载体上实现检测。一些基于固定化的aTF检测平台往往受限于分子固定和修饰的方法和效率。因此，许多生物传感器仍存在周转时间较长(＞100min)，需要复杂的配方和化学修饰，或低灵敏度或不稳定的问题。此外，目前大多数技术仍依赖于核酸扩增，这无形中增加了试验的成本，并使得反应更为复杂。
因此，目前仍然需要开发一种可以摒弃上述缺陷的，可快速并准确地检测小分子的平台。
发明内容
本申请涉及利用酶辅助的核酸反应对生物和/或环境样品中的小分子的进行检测的体外传感器的组合物和方法。该组合物和方法可以用于响应和/或转导由别构蛋白或适体、核酸内切酶和核酸反应介导的传感信号。该组合物和方法可用于产生电化学信号、荧光信号、比色信号和/或发光信号，并且该方法可以以不同的模式进行，例如如溶液的、纸基的、以及利用微流体装置的模式。可以对该方法、组分和组合物进行改进以适用于不同的保存技术，例如冻干和纸上干燥。
该方法包括分子机制、实验装置、反应组分和组合物、以及信号的产生和测量方法。通常，可以在检测之前制备和处理试验样品。制备可包括过滤、离心、改变温度、溶解、稀释或浓缩试验样品中的靶分子。分子机制和实验设置能够感应试验样品中由别构蛋白或适体介导的特定靶小分子/代谢物。若试验样品中存在靶小分子/代谢物，则靶小分子/代谢物可以与别构蛋白或适体结合，并触发由核酸内切酶启动的Toehold介导的链置换反应的循环。反应中积累的最终置换产物可以通过电化学、荧光、比色和/或发光方法进行检测。本方法采用Toehold介导的链置换扩增，由于在信号放大过程仅仅采用竞争酶或DNA模板结构的改变来触发，避免了现有方法中的核酸扩增过程，因此能够实现在快速、简单而准确地一步法分析。该方法可以应用于几乎任何别构蛋白/配体复合物或适体，其中别构蛋白或适体可以作为阻遏物或激活物。
实验装置和反应的方式可兼容于各种生物传感策略的不同形式和变化，同时，反应的组分和组合物也可适用于基于固定化的检测平台。
附图说明
图1为小分子/代谢物的体外生物传感器的图示。天然或经改造的别构蛋白(aTF)与包括其同源DNA结合序列的双链DNA片段结合。该蛋白的结合阻碍了IIS型限制性核酸内切酶(在本例中为HgaI)切割DNA结合序列，该IIS型限制性核酸内切酶的识别位点位于DNA结合序列的上游或下游。该IIS型限制性核酸内切酶的切割位点位于别构蛋白结合序列中。别构蛋白的同源效应物或配体(例如小分子或代谢物)的存在导致别构蛋白从结合DNA序列解离，这使得HgaI结合至其识别位点并切割别构蛋白结合DNA序列。这种切割产生长度为五个核苷酸的5′突出端(单链DNA的短部分)。对于侵入探针(IP)而言，该突出端作为Toehold区域和成核位点，启动了Toehold介导的链置换反应。在5′端和3′端处分别用荧光基团和猝灭基团对IP进行标记。该反应的结果为中间物(S-IP)，该中间物可以被HgaI切割，但缺少对于别构蛋白的完整结合序列。该切割产生了Toehold区域，可启动另一个Toehold介导的链置换反应，并引起IP(P)片段的置换，从而产生荧光信号。新的S-IP参与包括IIS型限制性内切酶进行的切割和Toehold介导的链置换的循环反应。在整个循环中，IP的总量减少而P增加。各循环使得置换的荧光产物(P)不断积累，并且可以采用实时或终点测定荧光信号。
图2示出独立的信号放大回路的图示。该回路具有三个主要部分：IIS型限制性内切酶HgaI、DNA中间物(S-IP)和侵入探针(IP)。
图3示出信号放大回路依赖于DNA模板(S)浓度的证明。反应的最终体积为10μL，并且由下列物质组成：1.25μM的IP、100U/mL的HgaI和不同浓度的DNA模板(S)(50nM、75nM和100nM)。
图4示出信号放大回路依赖于侵入探针(IP)浓度的证明。反应的最终体积为10μL，并且由下列物质组成：50nM的DNA模板(S)、100U/mL的HgaI和不同浓度的侵入探针(IP)(50nM、125nM、250nM、500nM和1250nM)。
图5A至图5C示出别构效应介导HgaI切割。图5A示出用于证实TetR与包含HgaI识别位点和tetO序列的DNA模板(S)结合的电泳迁移率变动分析(EMSA)；以及在四环素(Tc)的存在下未结合的情况。图5B示出2-bp间隔序列(N＝0-12)对TetR保护的DNA的HgaI切割的影响的PAGE。将50nM的DNA与250nM的TetR和1U的HgaI在37℃培养30分钟。之后立即用0.4U的蛋白酶K在37℃对蛋白质进行消化15分钟。矩形表示S的切割产物。箭头表示TetR/S复合物，这是由于TetR被蛋白酶K不完全消化。图5C示出Tc对HgaI切割进行调节的EMSA。提高的Tc浓度得到了更大量的切割产物。
图6A至图6C示出使用环境基质的生物传感器的试验。图6A示出在香港池塘采集的环境样品。采集后，在样品中掺入不同的抗生素(在适用的情况下)并立即使用注射器式过滤器进行过滤。图6B示出从样品过滤到获得结果的整个工作流程可以在25分钟内完成。图6C示出传感器成功检测到在水样品中存在掺入的抗生素，且未出现干扰。将500nM的各配体用于基于TetR的生物传感器(最终浓度250nM)。将2.5μM的各配体用于基于MphR的生物传感器(最终浓度1.25μM)。(ns：使用双尾t检验的非同源配体与WS之间的p值＞0.05)。Tc＝四环素，Ery＝红霉素，Amp＝氨苄青霉素，Kan＝卡那霉素，WS＝水样品(无分析物)。条形表示平均值，并且误差条表示s.d.n＝2(图6C)。
图7A至图7B示出核酸内切酶介导的Toehold介导的链置换(TMSD)反应可以通过TetR进行负调节(阻遏)并且通过四环素(Tc)去抑制的证明。图7A示出生物传感器的各部分，表明DNA模板(S)和侵入探针(IP)序列和修饰。图7B示出使用不同浓度的TetR(0nM、50nM、100nM、150nM和200nM)对反应的抑制。
图8示出基于TetR的生物传感器响应于不同浓度的四环素(0nM、25nM、50nM、100nM、250nM和500nM)的证明。
图9A至图9B示出核酸内切酶介导的Toehold介导的链置换(TMSD)反应可以通过MphR进行负调节(阻遏)并通过红霉素(Ery)去抑制的证明。图9A示出生物传感器的各部分，表明DNA模板(S)和侵入探针(IP)序列和修饰。图9B示出使用不同浓度的MphR(0nM、750nM、1.5μM、2.25μM和3μM)对反应的抑制。
图10示出基于MphR的生物传感器响应不同浓度的红霉素(0nM、100nM、200nM、350nM、500nM、750nM、1μM和2.5μM)。
图11A至图11B为示出核酸内切酶介导的Toehold介导的链置换(TMSD)反应可以用于在适体传感器中转导和扩增信号的图示。图11A示出在靶标诱导的适体解离后，DNA模板S与侵入探针(IP)杂交时的结构改变。类似地，图11B示出由适体区和S区组成的适体开关的结构改变。在结构改变后，两种机制都可以参与信号放大回路。
图12A至图12B示出可以由DNA模板S上的构象改变而触发信号放大回路。图12A示出了来自S的两种不同的发夹(SH和LH)的结构和最小自由能(MFE)。图12B示出发夹茎的长度对信号放大回路的速度和泄漏(rate and leakage)、以及切割的荧光产物的最终浓度有影响。SH和LH是没有适体的体系，而SH抑制和LH抑制是适体与S等摩尔浓度的体系。在所有情况中：反应体积为10μL，其中HgaI的浓度为100U/mL，S的浓度为50nM，并且IP的浓度为1.25μM。
图13示出侧流层析分析(Lateral Flow Assay)形式的图示。左侧的图示出试纸条的组分和侵入探针的修饰。中间的图示出阴性试验的简化示意图。右手侧示出阳性试验的简化示意图。
图14示出检测电化学信号放大回路的图示。
图15示出纯化的TetR和MphR在还原状态下的SDS-PAGE。
序列的简要描述
SEQ ID NO:1：编码TetR的大肠杆菌(E.coli)的核苷酸序列
SEQ ID NO:2：与TetR传感器分子一同使用的示例性DNA模板序列
SEQ ID NO:3：SEQ ID NO:2的互补序列
SEQ ID NO:4：示例性侵入探针
SEQ ID NO:5：与TetR传感器分子一同使用的示例性DNA模板序列
SEQ ID NO:6：SEQ ID NO:5的互补序列
SEQ ID NO:7：与TetR传感器分子一同使用的示例性DNA模板序列
SEQ ID NO:8：SEQ ID NO:7的互补序列
SEQ ID NO:9：与TetR传感器分子一同使用的示例性DNA模板序列
SEQ ID NO:10：SEQ ID NO:9的互补序列
SEQ ID NO:11：与TetR传感器分子一同使用的示例性DNA模板序列
SEQ ID NO:12：SEQ ID NO:11的互补序列
SEQ ID NO:13：与TetR传感器分子一同使用的示例性DNA模板序列
SEQ ID NO:14：SEQ ID NO:13的互补序列
SEQ ID NO:15：与TetR传感器分子一同使用的示例性DNA模板序列
SEQ ID NO:16：SEQ ID NO:15的互补序列
SEQ ID NO:17：与MphR传感器分子一起使用的示例性DNA模板序列
SEQ ID NO:18：SEQ ID NO:17的互补序列
SEQ ID NO:19：示例性侵入探针
SEQ ID NO:20：示例性侵入探针
SEQ ID NO:21：TetR的大肠杆菌的氨基酸序列
SEQ ID NO:22：MphR的大肠杆菌的氨基酸序列
具体实施方式
所选的定义
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该”旨在也包括复数形式。此外，在详细描述和/或权利要求中使用术语“包括(including、includes)”、“具有(having、has)”、“带有(with)”或他们的变型时，此类术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式而为包含性的。过渡术语/短语(及其任何语法变体)“包含(comprising、comprises、comprise)”包括短语“基本上由……组成(consistingessentially of、consists essentially of)”和“由……组成(consisting、consists)”。
短语“基本上由……组成(consisting essentially of、consists essentiallyof)”表示权利要求包括含有指定材料或步骤的实施方案以及那些实质上不影响权利要求的基本特征和新颖特征的实施方案。
术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。在本申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”表示在特定值的可接受误差范围内。
在本公开中，范围以简写形式陈述，以避免必须详细陈述和描述范围内的每个值。在适当的情况下，可以选择该范围内的任何合适的值作为该范围的上限值、下限值或端值。例如，1至10的范围表示端值为1和10，而且中间值为2、3、4、5、6、7、8、9、以及包括在1至10内的所有中间范围，例如2至5、2至8和7至10。同样地，当在本文中使用范围时，旨在明确包括范围的组合和子组合(例如，在所公开的范围内的子范围)以及其中的具体实施方案。
如本文和权利要求书中所用，“样品”是指细胞、组织、固体或流体的样品，包括但不限于(例如)皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官、肿瘤、环境来源(包括水道、土壤或空气)、体外细胞培养成分(包括但不限于细胞在细胞培养基中生长所产生的条件培养基、重组细胞和细胞组分)、或源自生物体或含有生物体的任何其他来源的样品。
如本文所用的术语“生物体”包括病毒、细菌、真菌、植物和动物。生物体的其他实例为本领域普通技术人员已知的，并且此类实施方案在本文公开的材料和方法的范围内。本文所述的分析可用于分析从任何生物体获得的任何遗传物质。
如本文所用的“模板”或“模板序列”是包括“靶位点”的多核苷酸(例如，如本文所定义的，包括DNA、RNA或DNA/RNA杂合体、以及它们的修饰形式)。术语“靶位点”用于指模板序列中存在的一种核酸序列，该核酸序列可与探针(例如，本文的任何探针)、蛋白质或其他核苷酸序列结合，只要存在充分的结合条件(例如，充分的互补性)即可。合适的DNA/RNA结合条件包括细胞中正常存在的生理条件。其他合适的结合条件(例如，无细胞系统中的条件)是本领域已知的。
当术语“杂交”用于两个序列时，表示这两个序列彼此足够互补以使这两个序列之间的核苷酸碱基能够配对。彼此杂交的序列可以是完全互补的，但也可以具有一定程度的错配。因此，探针序列或其他杂交序列可以与相应的靶序列具有一些错配，但是仍然如预期的那样起作用，只要探针或其他杂交序列可以与靶序列杂交即可。根据杂交的严格性，两个互补序列之间至多约5％至20％的错配可使这两个序列之间能够杂交。通常，高严格条件具有较高的温度和较低的盐浓度，而低严格条件具有较低的温度和较高的盐浓度。高严格条件对于杂交是优选的。关于两个序列表明这两个序列彼此充分互补以使这两个序列之间的核苷酸碱基能够配对。
“杂交条件”是指使至少一部分互补序列能够彼此重组的温度、pH和反应物浓度的条件。完成杂交所需的条件取决于待杂交的寡核苷酸的大小、寡核苷酸之间的互补程度和杂交反应混合物中其他物质的存在。各杂交步骤所需的实际条件是本领域熟知的，或者可以由本领域普通技术人员容易地确定。典型的杂交条件包括使用pH约7至约8.5的缓冲液以及约30℃至约80℃的温度；优选的条件包括使用pH 7.5的Tris-EDTA缓冲液以及约5mM至约15mM的MgCl2。将混合的寡聚物加热至95℃并在180分钟内缓慢冷却至20℃。在某些实施方案中，杂交的温度必须低于DNA双链体的解链温度。杂交条件也可包括缓冲液，该缓冲液对于寡核苷酸和其他组分是相容的，即化学惰性的，但仍允许互补碱基对之间的杂交。
如本文所用，可互换使用的短语“能够连接(operably linked、operativelylinked)”或“能够关联(operatively associated with)”是指这样一种并列关系，其中所述组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。可以通过任何有用的键(例如，共价键、非共价键、和/或通过范德华力、氢键、和/或诸如包括π-π相互作用、盐桥、或阳离子-π相互作用在内的其他分子间力连接的键)或任何有用的接头(例如，核苷酸序列或本文中的任何序列)使第一组分能够连接至第二组分。
贯穿本公开全文，通过特定命名法描述不同序列，例如靶序列和探针序列。当使用这种命名法时，应当理解，所鉴定的序列与相应序列的至少一部分基本上相同或基本上反向互补。例如，“侵入探针序列”描述了与侵入探针序列的至少一部分基本上相同或与侵入探针序列的至少一部分基本上反向互补的序列。因此，本文使用该命名法来简化本文公开的方法中使用的不同的多核苷酸和多核苷酸的部分的描述；然而，本领域普通技术人员应当认识到，与相应序列的至少一部分基本上相同或基本上反向互补的适当序列可用于实施本文公开的方法。
此外，彼此对应的两个序列，例如探针结合序列、DNA模板序列或适体序列，在至少70％、优选至少80％、甚至更优选至少90％、并且最优选至少95％的序列上具有至少90％的序列同一性、优选至少95％的序列同一性、甚至更优选至少97％的序列同一性、并且最优选至少99％的序列同一性。可供选择地，彼此对应的两个序列彼此反向互补，并且在反向互补序列中，在至少70％、优选至少80％、甚至更优选至少90％、并且最优选至少95％的序列上具有至少90％的完全匹配、优选至少95％的完全匹配、甚至更优选至少97％的完全匹配、并且最优选至少99％的完全匹配。因此，彼此对应的两个序列可以在至少70％、优选至少80％、甚至更优选至少90％、并且最优选至少95％的序列上彼此杂交或与公共参考序列杂交。优选地，彼此对应的两个序列在这两个序列的整个长度上是100％相同的，或在这两个序列的整个长度上是100％反向互补的。
如本文所用，短语“别构蛋白”是指将对目的分子的识别与响应直接结合的蛋白质。别构效应是蛋白质的共同特征，其中通过效应物与第二或“别构”位点(通常与第一位点相距相当远)的结合来改变“活性”位点的行为。改变的行为可以直接或间接地引起蛋白质活性的改变，从而引起可检测的响应。
如本文所用，术语“Toehold”是指包括核酸序列的起始位点的区域，所述核酸序列被设计为启动所述区域与互补核酸序列的杂交。核酸序列的二级结构可以为Toehold暴露或钝化的形式。例如，在一些实施方案中，Toehold的二级结构使得Toehold可用于与互补核酸杂交(Toehold为“暴露的”或“可接近的”)，在其他实施方案中，Toehold的二级结构使得Toehold不可用于与互补核酸杂交(Toehold为“钝化的”或“不可接近的”)。若Toehold为钝化的或以其他方式不可用，则可以通过一些信号使Toehold可用，例如发夹的打开，该发夹为通过限制性内切酶切割的序列或其一部分。当暴露时，Toehold被配置为互补核酸序列可以在该Toehold处成核。
如本文所用，“适体”是除了通过碱基对杂交之外能够特异性结合目标分析物的寡核苷酸。适体通常包括DNA或RNA或DNA和RNA的混合物，但除了核苷酸之外也可以含有蛋白质，或含有蛋白质而不含核苷酸。适体可为天然存在的或通过合成或重组方法制备。适体通常是单链的，但也可以是双链或三链的。适体可以包含天然存在的核苷酸、以某种方式例如通过化学修饰而修饰的核苷酸和非天然碱基。适体可含有一定的化学修饰，例如通过添加诸如荧光基团一类的标记物，或通过添加一种分子，该分子能够使适体交联至与其结合的分子。若适体具有相同的序列或能够与相同的分子特异性结合，则这些适体为相同的“类型”。适体的长度会有所不同，但通常小于约100个核苷酸。
如本文所用，术语“切割”是指核酸分子的共价骨架的断裂。切割可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的，并且双链切割可以作为两个不同的单链切割的结果而发生。DNA切割可以产生平末端或交错末端。
如本文所用，术语“核酸酶”和“核酸内切酶”和短语“限制性内切酶”在本文中可互换使用，是指具有DNA切割催化活性的酶。
若一种物质组分以比另一种组分更高的摩尔浓度存在，则通常称该物质相对于另一种组分以“过量”或“摩尔过量”存在。通常，当以过量存在时，该组分将以至少约2倍、至少约5倍、或至少约10倍的摩尔过量存在，并且通常以100至1,000,000倍摩尔过量存在。本领域技术人员将领会并理解对于任何特定反应或反应条件优选的过量的特定程度或量。这种过量通常是根据经验确定的和/或对于特定反应或反应条件是最佳的。
本公开提供了解决用于检测小分子的常规方法相关的问题、同时加快该过程的材料和方法。
本申请的某些实施方案涉及测定样品中分析物的存在的方法，该方法包括a)使核酸内切酶、DNA模板、传感器分子和侵入探针与样品混合接触，其中传感器分子可以抑制限制性内切酶对DNA模板中限制性酶切位点的识别；b)使传感器分子与DNA模板结合或杂交，其中当不存在分析物时，传感器分子阻止限制性内切酶识别DNA模板中特异于所述限制性内切酶的限制性酶切位点，或者当分析物与传感器分子结合时，从DNA模板中置换传感器分子；c)任选地，用限制性内切酶消化DNA模板；d)任选地，使侵入探针与DNA模板杂交；e)任选地，用限制性内切酶对杂交侵入探针和DNA模板进行切割；以及f)通过检测从侵入探针释放的信号确定至少一种分析物的存在或不存在，其中检测到所述信号表示存在分析物。某些实施方案还提供了用于分析物检测的组合物，该组合物包含限制性内切酶、DNA模板、传感器分子和侵入探针，其中分析物与传感器分子结合并允许由限制性内切酶识别DNA模板中的限制性酶切位点。在某些实施方案中，使用Toehold介导的链置换，侵入探针与报告分子联合产生可检测信号。在某些实施方案中，在与反应混合物接触之前，可以通过加热、离心、化学或物理溶解、稀释、浓缩或过滤对样品进行处理。
DNA模板和Toehold介导的链置换
本申请的方法能够检测多种靶分子。一方面，本申请涉及使用诸如别构蛋白、转录因子、适体或适体传感器之类的传感器分子的组合物和方法，这些传感器分子与靶分子结合并能够检测靶分子，其中传感器抑制核酸内切酶对DNA模板的结合和切割。
在某些实施方案中，DNA模板可以是单链或双链的。在某些实施方案中，DNA模板可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个有利于处理或检测分析物的序列。此类序列包括限制性酶切位点或核酸内切酶位点，特别是IIS型核酸内切酶位点，约1个至约20个碱基对的间隔序列、和/或至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个与适体互补的位点。在某些实施方案中，DNA模板可以具有操纵子序列，其优选为传感器分子的DNA结合序列。在某些实施方案中，包括操纵子序列、限制性酶切位点以及与适体互补的序列的该序列是能够连接的。在存在两个或更多个促有利于分析物的处理或检测的位点(例如，限制性酶切位点、操纵子序列或适体注释区)的某些实施方案中，这些位点可以由零个碱基对或至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、75个、100个或更多个碱基对隔开。在存在两个或更多个有利于处理或检测分析物的位点(例如，限制性酶切位点、操纵子序列或适体注释区)的优选实施方案中，这些位点可以由约4个至约15个碱基对隔开。
在某些实施方案中，限制性内切酶与DNA模板的结合和切割可以允许探针与经切割的DNA模板杂交并引发Toehold介导的链置换，如美国专利No.9,284,602和Simmel FC,Yurke B,Singh HR.Principles and Applications of Nucleic Acid StrandDisplacement Reactions(核酸链置换反应的原理和应用).Chem Rev.2019年5月22日；119(10):6326-6369；doi:10.1021/acs.chemrev.8b00580.电子出版于2019年2月4日；PMID:30714375中所描述的，Toehold介导的链置换是本领域熟知的方法，将上述各参考文献通过引用并入本文。在优选的实施方案中，通过从探针上切割的标记物间接确定分析物的存在。在某些实施方案中，当存在分析物时，传感器分子不再抑制限制性内切酶识别DNA模板中的限制性酶切位点，因而DNA模板被切割。然后，经切割的DNA模板可以与探针杂交，所述探针可以具有能够连接的荧光标记物和猝灭基团、或电化学标记物。在某些实施方案中，与探针杂交的DNA模板可以被一种或多种限制性内切酶切割。该切割可以从探针除去猝灭基团或电活性标记物，从而使得能够检测到分析物并打开Toehold DNA链，并在未修饰的DNA模板链上产生长度为至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个核苷酸的突出端，其作为另一个侵入探针的Toehold区域和成核位点，以启动Toehold介导的链置换反应(TMSD)。该反应的结果为标记物的置换和积累，优选地为侵入探针的含有荧光基团或电活性标记物的片段的置换和积累。新形成的杂交侵入探针和DNA模板参与包括一种或多种限制性内切酶切割及随后的TMSD的循环反应。
在某些实施方案中，探针(特别是侵入探针)与核苷酸序列(特别是DNA模板)的杂交可通过使探针与DNA模板重组的任何方法来实现。在一个实施方案中，杂交可通过Toehold介导的链置换来实现。杂交可通过探针与部分双链多核苷酸链上的Toehold序列重组来触发。部分双链多核苷酸链上的Toehold序列与探针的重组可引起部分双链多核苷酸链的链分离、以及探针与包含Toehold的多核苷酸序列杂交。对不包含Toehold序列的链进行置换。通常应当理解，探针与多核苷酸序列的杂交反应的特异性可在热力学上受探针序列和/或Toehold区域长度的控制。
杂交的探针和多核苷酸序列的切割会引起从探针释放信号。检测到释放的信号的存在可表明样品中分析物的存在。信号的强度可以相对于参考信号进行测量。参考信号可为从具有已知分析物的样的信号。参考信号也可为在添加酶之前(即，可以在DNA模板、传感器分子和适当的反应组分之后将限制性内切酶添加到样品中)或在除去或置换一种或多种探针之前采集的信号。参考信号也可为在探针与多核苷酸序列杂交不存在的情况下从样品采集的信号。
在某些实施方案中，DNA模板序列可以在传感器分子的识别位点与限制性酶切位点之间具有核苷酸间隔序列，这意味着本申请可以与几乎任何aTF或适体一起使用，而不需要核酸内切酶的识别位点与操纵子序列之间的重叠序列，例如aTF的DNA结合序列。在某些实施方案中，可以用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个碱基将传感器分子的识别位点与限制性酶切位点隔开。
探针设计和检测
在某些实施方案中，可以将探针设计成与模板DNA序列或其部分杂交。在某些实施方案中，探针的互补核苷酸区段的长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、40个、50个或100个碱基对或更长。在优选的实施方案中，探针的互补核苷酸区段的长度为约10个至约50个碱基对。此外，探针(例如，本文的任何探针，如侵入探针)可以用荧光标记物(例如，与猝灭基团标记物一起使用)、电活性标记来标记，或可以是未标记的。探针可以具有核酸内切酶结合位点。可以优化探针的浓度以促进扩增反应。
在某些实施方案中，本文的探针可以包括任何有用的标记物，包括在核酸序列中任何有用位置处的荧光标记物和猝灭基团标记物，例如在探针的3′末端和/或5′末端处或在环结构内。示例性荧光标记物包括量子点或荧光基团。用于该方法的荧光标记物的实例包括荧光素、6-FAMTM(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Applied Biosystems)、TETTM(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Applied Biosystems)、VICTM(加利福尼亚州卡尔斯巴德的AppliedBiosystems)、MAX、HEXTM(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Applied Biosystems)、TYETM(马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific)、TYE665、TYE705、TEX、JOE、CyTM(新泽西州皮斯卡塔韦的Amersham Biosciences)染料(Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Texas
Figure BDA0003200304480000161
(俄勒冈州尤金的Molecular Probes,Inc.)、Texas Red-X、
Figure BDA0003200304480000162
(俄勒冈州尤金的Molecular Probes,Inc.)染料(AlexaFluor 350、AlexaFluor 405、AlexaFluor430、AlexaFluor 488、AlexaFluor 500、AlexaFluor 532、AlexaFluor 546、AlexaFluor568、AlexaFluor 594、AlexaFluor 610、AlexaFluor 633、AlexaFluor 647、AlexaFluor660、AlexaFluor 680、AlexaFluor 700、AlexaFluor 750)、DyLightTM(马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific)染料(DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 755)、ATTOTM(德国锡根的ATTO-TECGmbH)染料(ATTO 390、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 520、ATTO 532、ATTO550、ATTO 565、ATTO Rhol01、ATTO 590、ATTO 594、ATTO 610、ATTO 620、ATTO 633、ATTO635、ATTO 637、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740)、
Figure BDA0003200304480000171
(俄勒冈州尤金的Molecular Probes,Inc.)染料(BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BOPDIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、HiLyte FluorTM(加利福尼亚州菲蒙的AnaSpec)染料(HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor594、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750)、AMCA、AMCA-S、
Figure BDA0003200304480000172
Blue(俄勒冈州尤金的Molecular Probes,Inc.)、Cascade Yellow、香豆素、羟基香豆素、Rhodamine GreenTM-X(俄勒冈州尤金的Molecular Probes,Inc.)、RhodamineRedTM-X(俄勒冈州尤金的Molecular Probes,Inc.)、Rhodamine 6G、TMR、TAMRATM(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Applied Biosystems)、5-TAMRA、ROXTM(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Applied Biosystems)、Oregon
Figure BDA0003200304480000173
(纽约州格兰德岛的Life Technologies)、OregonGreen 500、
Figure BDA0003200304480000174
700(内布拉斯加州林肯的Li-Cor Biosciences)、IRDye 800、WeIIREDD2、WeIIRED D3、WeIIRED D4和
Figure BDA0003200304480000175
640(德国曼海姆的Roche DiagnosticsGmbH)。在一些实施方案中，可以使用消光系数＞50,000M-1cm-1且与荧光检测通道适当光谱匹配的明亮的荧光基团。
在某些实施方案中，荧光标记的探针包含在反应混合物中，并且产生荧光标记的反应产物。本申请的方法和组合物的实施方案中包括的用作标记物以产生荧光标记的探针的荧光基团可以是许多荧光基团中的任一者，包括但不限于4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸茋-2,2'-二磺酸；吖啶和衍生物，例如吖啶和异硫氰酸吖啶；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸盐，荧光黄(Lucifer Yellow)VS；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺，亮黄(Brilliant Yellow)；BIODIPY荧光基团(4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省)；香豆素和衍生物，例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆冉151)；酸性红(cyanosine)；DAPDXYL磺酰氯；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5"-二溴连苯三酚-磺酞(Bromopyrolol Red)；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸酯基苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰酸二氢-茋-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸茋-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-4'-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；EDANS(5-[(2-氨基乙基)氨基]萘-1-磺酸)、曙红和衍生物，例如曙红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物，例如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；乙锭，例如溴化乙锭；荧光素和衍生物，例如5-羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)和荧光素异硫氰酸酯(FITC)；荧光胺；绿色荧光蛋白和衍生物，例如EBFP、EBFP2、ECFP和YFP；IAEDANS(5-({2-[(碘乙酰基)氨基]乙基}氨基)萘-1-磺酸)、孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副玫瑰苯胺；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二醛；芘和衍生物，例如芘丁酸酯、1-芘磺酰氯和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；QSY7；QSY9；反应性红4(
Figure BDA0003200304480000182
Figure BDA0003200304480000181
Brilliant Red3B-A)；罗丹明和衍生物，例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(Rhodamine 6G)、罗丹明异硫氰酸酯，丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明B、罗丹明123、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(Texas Red)；N,N,N',N-四甲基-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物。在某些实施方案中，组合物和使用方法中荧光探针的浓度为约0.01μM至约100μM、约0.1μM至约100μM、约0.1μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、或约1μM至约10μM。在某些实施方案中，荧光探针的浓度为约0.01μM、约0.1μM、约1μM、1.1μM、1.2μM、约1.25μM、约1.3μM、约1.4μM、约1.5μM、约1.6μM、约1.7μM、约1.8μM、约1.9μM、约2μM、约2.5μM或约5μM。
示例性猝灭基团标记物包括荧光基团、量子点、金属纳米颗粒和其他相关的标记物。合适的猝灭基团包括Black Hole
Figure BDA0003200304480000183
-1(加利福尼亚州诺瓦托的BiosearchTechnologies)BHQ-2、Dabcyl、Iowa
Figure BDA0003200304480000191
FQ(爱荷华州克拉尔维尔的Integrated DNATechnologies)、IowaBlack RQ、QXLTM(加利福尼亚州菲蒙的AnaSpec)、QSY7、QSY9、QSY21、QSY35、IRDye QC、BBQ-650、Atto540Q、Atto575Q、Atto575Q、MGB 3'CDPI3和MGB-5'CDPI3。在一个实例中，术语“猝灭基团”是指当接近供体时，降低来自荧光供体的发射的物质。在优选的实施方案中，猝灭基团在荧光标记物的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个或30个核苷酸碱基内。当从荧光基团发射的荧光可检测地降低时，例如降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多时，荧光被猝灭。许多荧光猝灭基团是本领域已知的，包括Dabcyl；磺酰氯如丹磺酰氯；以及Black Hole Quencher BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。
在某些实施方案中，电活性标记的探针包含在反应混合物中，并且产生电活性标记的反应产物。本申请的方法和组合物的实施方案中包括的可以用作产生电活性标记的探针或寡核苷酸的标记物的电活性标记物可以是许多电活性标记物中的任一者，包括但不限于亚甲基蓝、蒽醌、Ru(bpy)2dppz2+、Ru(phen)2dppz2+、二茂铁及其衍生物、苏木精、磁珠、量子点、生物素-adviinHRP、纳米复合物等。在某些实施方案中，组合物和使用方法中电活性探针的浓度为约0.01μM至约100μM、约0.1μM至约100μM、约0.1μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约1μM、约1.25μM、约1.5μM至约10μM。在某些实施方案中，电活性探针的浓度为约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约1.1μM、约1.2μM、约1.3μM、约1.4μM，、约1.5μM，、约1.6μM、约1.7μM、约1.8μM、约1.9μM、约2μM、约2.5μM或约5μM。
可以将其他标记物用于本申请，包括允许比色检测和化学发光检测或荧光检测的标记物。例如，生物素或地高辛在本领域中是熟知的，并且可以与抗地高辛抗体和链霉亲和素结合使用，抗地高辛抗体和链霉亲和素与碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或荧光素或罗丹明偶联，以允许比色检测和化学发光检测或荧光检测。
任何能够检测标记的核苷酸的检测方法或系统均可以用于根据本申请的实施方案的方法中，并且此类合适的检测方法和系统是本领域熟知的。在某些实施方案中，可以通过经切割的探针间接检测分析物，其中探针的标记端被释放作为切割产物。可通过凝胶电泳、质谱、荧光共振能量转移(FRET)、侧流层析分析、比色分析、发光分析和电化学检测方法如微分脉冲伏安法组成的组中的方法进行切割产物的检测。例如使用光电二极管检测来自荧光标记的反应产物的信号。
在优选的实施方案中，通过从探针切割的标记物间接测定分析物的存在。在某些实施方案中，当存在分析物时，传感器分子不再抑制限制性内切酶识别DNA模板中的限制性酶切位点，并且DNA模板被切割。然后，经切割的DNA模板可以与探针杂交，该探针可具有能够连接的荧光标记物和猝灭基团或电化学标记物。在某些实施方案中，与探针杂交的DNA模板可以被一种或多种限制性内切酶切割。该切割可以从探针上除去猝灭基团或电活性标记物，打开Toehold DNA链并在未修饰的DNA模板链上暴露长度为至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个核苷酸的突出端，其作为Toehold区域和另一个侵入探针的成核位点以启动Toehold介导的链置换反应(TMSD)。
该反应的结果为标记物的置换和积累，标记物优选为侵入探针的包含荧光基团或电活性标记物的片段。新形成的杂交侵入探针和DNA模板参与由一种或多种限制性内切酶切割然后是TMSD的循环反应。在整个循环中，侵入探针的总量可以减少，而标记的、经切割的侵入探针的量可以增加。各循环引起置换的标记产物在经切割的侵入探针上的积累。可以实时或终点对标记的信号进行测定。反应速率受DNA模板浓度的影响。反应速率和标记物信号最终强度可以取决于侵入探针的浓度。
可以使用多种熟知的方法进行该经切割的标记物的检测。检测方法的实例包括电活性分析、荧光分析或侧流层析分析。在限制性内切酶切割时，可以释放荧光基团或电活性标记物。使用电活性标记探针的实例和所述探针的检测方法在本领域中有所描述，例如描述于美国专利No.8,975,025中，该美国专利通过引用整体并入本文。
在侧流层析分析中，例如，样品可以流经具有识别元件的表面，识别元件包括核酸或优选地包括抗体。侧流层析分析可以是夹心分析或竞争性分析。在某些实施方案中，由于靶核苷酸的存在所引起的经切割的标记物可与抗体修饰的纳米颗粒结合，流过对照带(control band)，并终止于检测带(test band)。因此，当存在靶标时将出现检测带。当不存在分析物时，探针未经切割，并且探针会与抗体缀合的纳米颗粒结合并且被对照带捕获。
传感器分子
在某些实施方案中，传感器分子为别构蛋白或适体。传感器分子可以是具有别构行为并且包括至少一个效应物结合域和至少一个核酸结合域的任何天然或经改造的蛋白质。在某些实施方案中，传感器分子可以是单体或多聚体。效应物结合域可以与靶分析物结合并抑制核酸结合域与DNA模板结合。适体可以是具有至少一个分析物结合域并且与DNA模板中的至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个碱基对互补的任何核酸序列。可以存在缺口、置换、缺失或其他核酸修饰，只要适体可以与DNA模板杂交即可。至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个核酸可以为被置换的、缺失的，或可以在互补区域的缺口区域中。在某些实施方案中，传感器分子可以由诸如质粒载体、粘粒载体、细菌载体或噬菌体载体之类的载体编码；所有这些载体都包含表达多肽的重组多核苷酸。表达的蛋白质可以包含标签以有利于下游纯化。标签包括但不限于聚组氨酸标签、FLAG标签、GST标签和Myc标签。可能需要其他步骤以从蛋白质中除去标签，并且这些步骤是本领域熟知的。
在某些实施方案中，传感器分子可以是别构转录因子(aTF)，例如真核aTF或原核aTF。在各实施方案中，传感器分子可以是(例如)AraC/XlyS家族、ArgR家族、ArsR/SmtB家族、AsnC/Lrp家族、Crp/Fnr家族、DeoR家族、DtxR家族、Fur家族、GntR家族、IclR家族、LacI家族、LuxR家族、LysR家族、MarR家族、MerR家族、MetJ家族、ModE家族、PadR家族、TetR家族、Xre家族的成员。TetR家族的实例包括但不限于TetR、MphR、NemR、PaaR、SaaR、RutR、SczA、RolR、QdoR、PsbI、PmeR、CymR、ComR、BetI和TtgR。传感器分子可以是天然存在的(野生型)或经改造的aTF。
另外的或可供选择的示例性aTF见于Ramos等人的Microbiology and MolecularBiology Reviews，2005年6月，326-356页以及Tropell等人的Microbiol Mol BiolRev.2004年9月；68(3)：474-500，这些内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，可以将一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个适体用作传感器分子。在某些实施方案中，本文提供了用于检测靶分析物的存在的传感器，其包括具有可以与分析物结合的区域的适体探针。本申请的适体优选地对特定分析物具有特异性。适体可以具有诊断、靶标确认和治疗应用。根据适体对其配体的解离常数Kd定义结合的特异性。适体可以具有与抗体相似的Kd范围(pM至nM)的高亲和性以及与抗体相似/优于抗体的特异性。适体的长度通常在约10个和约100个核苷酸之间。例如，通过合成初始异质寡核苷酸群，然后在该群内选择与特定靶分析物紧密结合的寡核苷酸，可以选择配置为与特定靶分析物结合的适体。此类适体可为目前本领域现存的或目前商业上使用的，或者可通过免疫学领域目前常用的技术进行开发。适体序列为本领域熟知的。可以由商业供应商化学合成适体。同样地，可以从开发适体的公司购买适体。此外，可以使用通过指数富集(SELEX)系统进化的配体产生它们自己的适体，这是本领域熟知的体外选择方法。与特定靶分析物结合的适体一经鉴定，则可以使用生物学和其他领域已知的多种技术对适体进行复制，例如通过克隆或化学合成和聚合酶链式反应(PCR)扩增、随后进行转录或体外转录。
在某些实施方案中，适体在组合物或方法中存在的浓度可以为约1nM至约1,000nM、约10nM至约500nM、约100nM至约500nM、约200nM至约300nM、约100nM、约200nM、约225nM、约250nM、约275nM、约300nM或约400nM。
试剂盒
在某些实施方案中，本申请的组合物和使用方法可以进一步以试剂盒的形式提供。试剂盒可以包括以下一者或多者：一种或多种限制性内切酶、一种或多种DNA模板、一种或多种传感器分子、一种或多种侵入探针和其他试剂(例如，本文所述的任何试剂，如酶、缓冲液或增强剂)，特别是本领域技术人员认为对于Toehold介导的链置换反应是必需或有益的试剂、以及使用说明书(例如，包括本文所述的任何方法的使用说明书)。试剂盒的各组分可以单独包装或一起包装。在一个实例中，将组分包装在一起以允许单个腔室或单个试管反应。
酶
在某些实施方案中，可以使用一种或多种酶，包括多种核酸内切酶。限制性内切酶可以在DNA模板的3'端或5'端产生突出端，该突出端的长度为至少三个、四个、五个、六个、七个或八个核苷酸。在某些实施方案中，限制性内切酶可以是单体或多聚体。在优选的实施方案中，可以使用一种或多种IIS型核酸内切酶。示例性IIS型核酸内切酶包括AarI、Acc36I、AclWI、AcuI、AjuI、AloI、Alw26I、AlwI、ArsI、AsuHPI、BaeI、BarI、BbsI、
Figure BDA0003200304480000231
BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BfuI、BmrI、BmsI、BmuI、BpiI、BpmI、BpuEI、
Figure BDA0003200304480000232
BsaXI、Bse1I、Bse3DI、BseGI、BseMI、BseMII、BseNI、BseRI、BseXI、BsgI、BslFI、BsmAI、BsmBI-v2、BsmFI、BsmI、Bso31I、BspCNI、BspMI、BspPI、BspQI、BspTNI、BsrDI、BsrI、Bst6I、BstF5I、BstMAI、BstV1I、BstV2I、BsuI、BtgZI、BtsCI、BtsI-v2、BtsIMutI、BveI、CseI、CspCI、Eam1104I、EarI、EciI、Eco31I、Eco57I、Esp3I、FaqI、FauI、FokI、GsuI、HgaI、HphI、HpyAV、LguI、LmnI、Lsp1109I、LweI、MboII、MlyI、MmeI、MnlI、Mva1269I、NmeAIII、PaqCI、PciSI、PctI、PleI、PpsI、PsrI、SapI、SchI、SfaNI、TaqII、TspDTI和TspGWI；或其限制性内切酶的同工异源酶中的任一者。
在某些实施方案中，一种或多种酶的浓度可以为约1U/mL至约1000U/mL、约20U/mL至约500U/mL、约50U/mL至约250U/mL或约100U/mL。
缓冲剂、辅酶因子、金属、蛋白质和盐
可用于本申请的缓冲剂和盐为核苷酸杂交、Toehold-链介导的置换、限制性内切酶切割和/或别构转录因子折叠以及与DNA模板结合提供了合适的稳定pH和离子条件。本领域已知有多种缓冲液和盐溶液以及改性缓冲液可以用于本申请，包括本文未具体公开的试剂。优选的缓冲剂包括但不限于Tris-HCl、NaCl、MgCl2和BSA。优选的盐溶液包括但不限于乙酸钾、硫酸钾、氯化钾、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、氯化镁、乙酸镁、硫酸镁、氯化锰、乙酸锰、硫酸锰、氯化钠、乙酸钠、氯化锂和乙酸锂的溶液。
缓冲剂可以以任何浓度存在。在一些实施方案中，缓冲剂以约0.01nM至约400mM、约0.05nM至约200mM、或约0.1nM至约100mM或约50nM的量存在。本领域技术人员将理解，其他浓度的缓冲液可用于本申请。
在某些实施方案中，组合物和方法可以进一步包含允许限制性内切酶和/或别构蛋白的功能、稳定性和折叠的辅酶因子、金属和蛋白质。
使用方法
在某些实施方案中，核酸内切酶(限制性内切酶)、DNA模板、传感器分子和侵入探针可以用于检测样品中任何目标分析物。分析物可以是小分子、代谢物或其前体，例如抗生素、芳香族化合物、群体感应分子或金属。在优选的实施方案中，分析物可以是金属或其阳离子，例如Hg、Cu、Ag、Au、Zn、As、Ni、Co、Cd、Pb、Fe、Ni、Mn、Cd、基于上述金属的Hg2+、Cu+、Ag+、Au+、Zn2+、As3+、Ni2+、Co2+、Cd2+、Pb2+、Fe2+、Ni2+、Mn2+和Cd2+；芳香族分子，例如苯甲酸酯、n-甲苯甲酸酯、甲苯、二甲苯、氯化苯酚、对甲苯磺酸酯、五氯苯酚、三氯苯酚、水杨酸酯、2-氯-顺式和顺式-粘康酸酯；抗生素，例如四环素、大环内酯、氯霉素、放线菌紫素、乙硫异烟胺(Ethionamide)加强剂、辛环素(simocyclinone)、卡那霉素、链霉素和萘啶酸；以及其他小分子，例如代谢物、毒素、衍生自酯的分子、激素和杀虫剂。
特别地，组合物和方法使传感器分子能够控制核酸序列的切割。传感器分子的识别能力能够使一种物质(特别是aTF或适体)触发更简单、更实惠、快速、模块化且可编程的基于核酸的回路反应。在某些实施方案中，提供了信号转换和放大回路，其为独立运行的、依赖于核酸内切酶对DNA模板的循环切割。这种切割在模板上产生Toehold区域，随后将Toehold用作侵入探针杂交的成核位点。然后，侵入探针引发链置换反应，该反应以原始模板链之一的置换为终点。重要的是，这种新形成的双链片段包含核酸内切酶的DNA识别位点。因此，该片段可以被切割，并再次形成Toehold区域。在恒定浓度的核酸内切酶的条件下，循环反应的动力学取决于DNA模板的浓度以及侵入探针的浓度和序列。侵入探针可以用化学标记物进行化学修饰，以通过比色法、荧光法或电化学法直接检测切割产物。
循环反应的驱动可以取决于核酸内切酶对其DNA识别位点的可达性。在某些实施方案中，组合物和方法可以用于在不存在传感器生物分子的同源配体的情况下，阻止核酸内切酶接近其识别位点。
在优选的实施方案中，可以使用aTF或适体作为传感器分子来设计组合物和方法。aTF可以与核酸内切酶竞争相同的、重叠的或相邻的DNA序列。适体可以使限制性酶切位点不被限制性内切酶识别。在不存在配体的情况下，aTF或适体抑制DNA核酸内切酶切割。当配体存在并与aTF结合时，aTF发生构象变化并从DNA解离，从而使核酸内切酶能够切割并启动信号放大循环。当配体存在并与适体结合时，适体可以从DNA模板释放，并且DNA模板可以与侵入探针杂交。该产物的形成允许限制性内切酶识别DNA模板中的限制性酶切位点，从而使核酸内切酶能够切割并启动信号放大循环。
在某些实施方案中，可以将组合物和方法设计为用于转换适体中DNA模板的二级结构。适体与其配体结合时的解离能够发生链置换反应，该反应产生核酸内切酶的双链识别位点，否则该识别位点将“隐蔽”在环结构中。在某些实施方案中，限制性内切酶，例如HgaI，结合至双链DNA分子中的限制性内切酶识别位点。DNA模板是包含与发夹(即茎-环)相邻的适体互补序列的结构。限制性内切酶识别位点可以隐蔽在模板的环区中，该环区是单链的，因此限制性内切酶难以接近。当同源配体与适体结合时，适体可以从DNA模板序列解离。然后DNA模板序列可以在模板的适体互补序列处与侵入探针杂交(即侵入探针和适体可以具有互补碱基对)。模板和侵入探针之间的完全互补性使得能够打开模板的茎、并形成双链中间物(S-IP)，该中间物包含限制性内切酶识别位点，此时限制性内切酶可接近。从这一点开始，如前所述，发生循环的TMSD和切割反应。
本申请的有利性质是可以利用IIS型核酸内切酶，该IIS型核酸内切酶起到转导传感器/配体结合和维持信号放大的链置换反应的作用。此外，本申请中使用的IIS型核酸内切酶能够切割其识别位点下游的双链DNA碱基对。重要的是，识别位点与切割位点之间的序列可以是任何序列，这意味着本申请实际上可以与任何aTF或适体一起使用，而不需要核酸内切酶的识别位点与操纵子序列之间的重叠序列，例如aTF或适体的DNA结合序列。此外，由于切割在DNA中产生了Toehold区域，我们利用了实施链置换反应的标记探针，因此它连续地被核酸内切酶切割并被系统中已有的探针置换。这能够实现简单、一锅、实时的小分子检测。
本申请的基于Toehold介导的链置换反应可以由传感器分子的同源配体(分析物)、特别是aTF和适体驱动。传感器分子在不同的动态范围内对配体具有定量响应，并且可以整合在一锅法分析中，从而使得方法简单且快速。此外，该方法为高度模块化且可编程的，因为人们可以在相同的原理下设计用于不同小分子的生物传感器。最后，通过调节传感器分子的浓度、模板DNA和侵入探针的浓度和序列，可以对灵敏度和动力学进行微调。
在某些实施方案中，使用连续的限制性内切酶消化和侵入探针与模板的杂交的核酸循环可以(例如)通过使限制性内切酶失活(例如通过温度变化、添加盐或其他酶、改变pH直到限制性内切酶失活)、通过阻断限制性内切酶识别位点(例如通过添加与侵入探针或模板杂交的竞争性DNA链)、或当没有剩余的未经切割的侵入探针时进行终止。
本文所参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物均通过引用整体并入本文，包括所有附图和表格，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾。
以下是说明实施本申请的方法的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。除非另有说明，否则所有的百分率都是重量百分率，并且所有的溶剂混合比都是体积比。
实施例1-水中的四环素的终点检测
在实施例中，将图1提供的方案用于通过荧光信号来检测掺入水样品中的抗生素四环素(Tc)。
实施该方法的第一步是测定配体响应性别构蛋白的结合序列。在本实施例中，四环素的检测是通过TetR实现的，TetR是一种与四环素结合并与DNA序列TetO1和TetO2结合的天然aTF。因此，DNA片段S将由HgaI结合序列后紧接TetO1构成。双链S可以通过使两个互补的寡核苷酸重组而形成。其次，探针IP的序列应该由包含突出端的经切割的链的互补序列构成。在这种情况下，IP用荧光基团FAM在5'端进行标记，并且用猝灭基团BHQ-1在3'端进行标记。
在本实施例中使用的DNA序列示于表1：
表1
Figure BDA0003200304480000271
Figure BDA0003200304480000281
*将TetR序列插入质粒pET-28a，并在大肠杆菌BL21 DE3中表达。分别通过His标签亲和层析和离心过滤进行纯化和浓缩。
^下划线为HgaI的识别序列，并且TetR DNA结合序列(TetO1)以粗体表示。
在本实施例中，通过在大肠杆菌中重组表达并使用亲和层析进行纯化，从而获得TetR。此后，有必要测定抑制HgaI对TetO1的切割和随后的Toehold介导的链置换反应所需的aTF浓度。可以根据aTF对DNA的亲和力和结合常数改变aTF的浓度。在本实施例中，TetR对S的滴定示出了2倍过量足以抑制＞98％的总反应(图7B)。如以下配方中所示进行该滴定，其中样品用超纯水代替，并且TetR的最终浓度在50nm至500nM的范围内变化。
反应配方如表2所示：
表2
组分 原液浓度 体积(μL) 最终浓度
S 1μM 0.5 50nM
TetR二聚体(aTF) 2.5μM 1 250nM
IP 10μM 1.25 1.25μM
水 - 至10 -
NEBuffer 1.1 10× 1 1×
样品 - 0-5.75 -
HgaI 2000U/mL 0.5 100U/mL
最终 - 10 -
根据上表中所示的配方，在37℃用25nM至500nM范围内的不同浓度的四环素诱导反应，产生了不同的荧光强度(图8)。
应当注意，因为HgaI的识别位点与aTF结合序列隔开，并且3'和5'链上分别在5个和10个核苷酸下游处的切割位点不受任何特定序列的限制，所以该方法可以与几乎任何别构蛋白或aTF/配体一起使用。在这种情况下，只需要改变别构蛋白/aTF及其对S和IP中所述蛋白质具有特异性的同源结合DNA序列。
使用本文提供的方法、部分和组合物的小分子典型分析可包括根据上表中的配方制备反应物，然后在限制性内切酶的工作温度下孵育并测量信号。
实施例2-信号转导和放大回路
本实施例示出了独立回路的机制(图2)。在本实施例中，所用的IIS型限制性内切酶为HgaI，HgaI识别不对称DNA序列，在HgaI识别位点外侧进行切割，并且在双链片段的5'端从HgaI识别位点下游的5个碱基对处开始产生5个核苷酸长的Toehold。所用的侵入探针(IP)是与DNA模板中产生Toehold区域的链完全互补的寡核苷酸。IP包括在其5'端附近的HgaI识别位点。用荧光基团6-羧基荧光素(6-FAM)和猝灭基团Black Hole Quencher 1(BHQ-1)分别在5'端和3'端对IP进行化学修饰。本实施例中的DNA模板(S-IP)是由与IP杂交的未修饰链构成的双链DNA片段。它也可以是包含HgaI识别位点的未修饰的双链DNA片段。
在具有HgaI、DNA模板和IP的系统中(在适当的反应条件下)；HgaI与其识别位点结合并切割DNA模板。这种切割从IP释放出BHQ-1标记物，并在未修饰的DNA链上产生长度为五个核苷酸的5'突出端，其作为Toehold区域和成核位点，以用于侵入探针(IP)启动Toehold介导的链置换反应(TMSD)。该反应的结果为P的置换和积累，P是IP中包含荧光基团的片段。新形成的S-IP通过HgaI和TMSD参与切割的循环反应。在整个循环中，IP的总量减少而P增加。各循环引起置换的荧光产物P的积累，荧光产物P的荧光信号可以跨越时间或终点进行测量。反应速率受DNA模板浓度的影响(图3)。同样地，反应速率和最终荧光强度取决于IP的浓度(图4)。
实施例3-基于aTF的生物传感器
本实施例示出了使用别构转录因子及其同源配体对回路的调节(抑制和去抑制)(图1)。在本实施例中，所用的IIS型限制性内切酶为HgaI，HgaI识别不对称DNA序列，在HgaI识别位点外侧进行切割，并且在双链片段的5'端从HgaI识别位点下游的5个碱基对处开始产生5个核苷酸长的Toehold。DNA模板(S)为双链的未修饰的DNA片段，其包含紧邻操纵子序列上游的HgaI识别位点。所用的侵入探针(IP)是与DNA模板中产生Toehold区域的链完全互补的寡核苷酸。IP包括在其5'端附近的HgaI识别位点。用荧光基团6-羧基荧光素(6-FAM)和猝灭基团Black Hole Quencher 1(BHQ-1)分别在5'端和3'端对IP进行化学修饰。
本实施例考虑由S、IP、HgaI、aTF和aTF的配体组成的系统。在不存在aTF的同源配体的情况下，aTF与S中的操纵子序列结合，并抑制HgaI切割DNA模板。如果存在配体，则配体与aTF结合，并且aTF发生构象变化，这降低了aTF对操纵子的亲和力，从而引起aTF从模板S解离。这使得HgaI与S中的HgaI识别位点结合，切割操纵子序列，并产生缺少完整操纵子序列并包含Toehold区域的产物。IP与Toehold区域结合并启动TMSD反应，TMSD反应的产物为S-IP。然后，如实施例2中所述，可以发生信号放大循环。
本文中，我们提出了两种用上述机制构建的生物传感器。如图7A至图7B所示，aTFTetR(SEQ ID NO:21)可以用于构建四环素生物传感器，其中在DNA模板中以及部分地在IP(SEQ ID NO:19)中使用其相应的操纵子序列。提高TetR的浓度会降低反应速率，因为HgaI可接近的DNA模板较少。当系统被给定浓度的TetR抑制时，可以由配体四环素对系统去抑制。反应速率与一定浓度范围内的四环素浓度成比例(图8)。类似地，在DNA模板中以及部分地在IP(SEQ ID NO:20)中使用aTF MphR(SEQ ID NO:22)及其对应的操纵子序列(SEQ IDNO:17和18)的回路可以用于感应大环内酯。当不存在红霉素(一种大环内酯分子)时，提高MphR的浓度引起反应速率的降低(图9A至图9B)。在固定的MphR浓度下，添加红霉素会在一定的动态范围内引起反应速率成比例地提高(图10)。
实施例4-基于结构开关的适体传感器
我们的回路可以通过使用不同形式的结构开关机制整合到适体传感器中。图11A示出利用具有发夹结构的DNA模板(S)的方案，该DNA模板包含：1)环区中的HgaI识别序列和2)与配体响应性适体互补的单链结构域。生物传感器由与适体杂交的模板S、标记探针(分别用荧光基团/猝灭基团对修饰5'端和3'端)和IIS型限制性内切酶组成，IIS型限制性内切酶可以是但不限于HgaI。适体的功能是双重的：1)抑制DNA模板与IP杂交、以及2)以高特异性与其配体结合。在配体的存在下，适体将从S上解离，并且IP可以与S杂交，从而破坏发夹并形成双链产物(S-IP)。然后，HgaI可以进行结合和切割，并且可以如前所述进行TMSD反应。类似地，图11B示出使用适体开关构建的生物传感器，其中包含HgaI识别位点的发夹结构位于适体序列的下游。S的单链区域与适体的区域互补。类似地，系统中配体的存在引起S区与适体区之间双链区域的解离，因此IP可以与S结合。一旦形成双链HgaI识别位点，则HgaI切除适体/配体复合物，从而产生Toehold区域。然后，可以实现如前所述的回路。
DNA模板S中的发夹茎和适体开关中S区的稳定性对反应泄漏、反应速度和切割产物的最终浓度具有直接影响。可以通过改变茎的长度改变稳定性，这对DNA模板的最小自由能具有直接影响(图12A)。在具有模板S、适体、IP和HgaI的系统中(在适当的反应条件下)，当通过12个碱基对与适体链杂交时，具有短发夹(SH)的模板S比具有长发夹(LH)的模板S存在更高的泄漏。而且，当不存在适体时，反应因此不被抑制，具有LH的系统比具有SH的系统慢(图12B)。
实施例5-使用侧流层析分析形式的信号放大
除了基于荧光的检测之外，可以使用其他形式进行信号读出。在本实施例中，与基于荧光的检测不同，在5'端和3'端用化学标记物修饰IP。这些修饰可以是但不限于6-FAM、生物素、地高辛等。生物传感器机制可以是上述任一种。不同之处在于，不能通过实时荧光测量来检测切割和置换的DNA产物。作为替代，在一定的反应时间后，将溶液添加到侧流层析试纸条试验的样品垫上。图13示出了用6-FAM和生物素分别在5'端和3'端对探针进行修饰的实例。侧流层析试纸条包括：样品垫(S)上的用抗FAM抗体功能化的金纳米颗粒(AuNP)、对照区(C)上的固定化的链霉亲和素以及检测区(T)上的固定化的捕获抗体。反应后，将溶液添加到试纸条的样品垫上，并使溶液流过样品垫的不同部分。在阴性试验中，未经切割的探针的6-FAM标记物与抗FAM功能化的AuNP结合，并且生物素分子被C区的固定化的链霉亲和素捕获，这引起AuNP的聚集并显示出C带。这抑制了探针的进一步流动。与之相对，在阳性试验中，只有包含6-FAM标记物的探针片段可以通过抗FAM抗体与AuNP结合，而仅包含生物素标记物的探针片段不能与AuNP结合。仅包含生物素标记物的探针片段将在C区中被固定化的链霉亲和素捕获，并且由于AuNP聚集，条带将变得明显。然而，包含6-FAM标记物的探针片段将继续流动直到其被T区中的捕获抗体捕获。因此，由于AuNP的聚集，T区中的条带将变得明显。应当注意，这种形式可以设计成当存在或不存在靶分析物时显示出检测带，这取决于试纸条的配置。同样地，根据试纸条，可以在可见光谱或特定波长范围(例如UV)下观察到检测带和对照带。
实施例6-使用电化学读出器的信号放大
本实施例示出生物传感器的回路信号可以通过电化学方法进行检测(图14)。保持生物传感器机制与上述相同的同时，用电活性标记物(例如亚甲基蓝)而不是荧光基团/猝灭基团对来标记IP。在配体反应的诱导后，释放的切割产物为具有电活性标记物的5个核苷酸长的单链DNA片段。与全IP相比，该短片段具有较少的负电荷和分子量，因而可以更容易地扩散到丝网印刷用碳电极的表面，并且产生可以使用电位计测量的电流变化。
材料和方法
菌株和生长培养基.使用大肠杆菌(E.coli)BL21 DE3(中国Sangon)进行重组蛋白的表达。所用的生长培养基为溶原性(LB)琼脂或补充有卡那霉素的肉汤(马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific#J17924)(50μg/mL)。
质粒和DNA部分.编码aTF的pET-28a质粒直接购自Sangon Biotech(中国上海)。该质粒被设计为表达C末端具有His标签的蛋白(表3)。表3中，HgaI识别位点用下划线标出；HgaI结合位点与操纵子序列之间的间隔序列小写；操纵子序列以粗体突出显示；FAM为6-羧基荧光素；并且BHQ为Black Hole Quencher。形成dsDNA传感器和DNA荧光探针(5'6-FAM-3'BHQ1)的DNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies(爱荷华州克拉尔维尔)(表3)。使用热循环仪(95℃5min、-0.5℃/min、20℃10min)，在TrisEDTA(TE)缓冲液中使互补寡核苷酸重组，其中缓冲液为pH 7.5、12.5mM MgCl2，最终浓度为10μM dsDNA。相应地，用pH 7.5的TE缓冲液稀释至最终工作浓度。
表3
Figure BDA0003200304480000331
Figure BDA0003200304480000341
Figure BDA0003200304480000351
aTF表达和纯化.在补充有卡那霉素的LB琼脂上划线接种，以用于挑取包含pET-28a的大肠杆菌BL21 DE3的单菌落。使用单菌落在200rpm和37℃条件下生长为10mL的过夜培养物，随后生长为500mL培养物。在OD600为0.5时，用250μM IPTG(密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich#I6758)诱导培养物，并在200rpm和37℃条件下生长5小时。以3,300×g离心20分钟后，回收细胞团，并重悬于裂解缓冲液(PBS pH 7.4(Thermo Fisher Scientific#28372)、1×Halt蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific#1861278)、10mM咪唑)中，或在PBS pH 7.4中于-20℃保存最多7天。将悬浮液在冰上超声处理(1min超声处理1min静止，进行5个循环，占空比为50％)，并以13,000×g离心30分钟。然后使用Ni-NTA琼脂糖(德国希尔登的Qiagen#30210)在重力柱(10mM、25mM和250mM咪唑的PBS溶液分别用于平衡、洗涤和洗脱)中，将上清液用于纯化具有His标签的蛋白。使用离心过滤器(Amicon Ultra4，马萨诸塞州伯灵顿的Millipore)进行脱盐(最终缓冲液为PBS)并将经纯化的蛋白浓缩。通过还原型SDS-PAGE 12％(图15)进行纯化的确认，并且通过考马斯亮蓝法(Bradford Assay)进行浓度测定。将蛋白于-20℃保持在50％甘油中，并用PBS相应地进行稀释。
凝胶电泳和电泳迁移率变动分析.使用PAGE 12％(室温、90V、TBE 1X缓冲液)观察HgaI对具有不同长度的间隔序列的DNA模板(SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:16)的活性(图5B)。将包含DNA模板、TetR和HgaI的反应物在37℃培养，并在30分钟后通过添加蛋白酶K(马萨诸塞州伊普斯威奇的New England Biolabs#P8107S)再培养10分钟后终止。该步骤是为了终止HgaI并从TetR释放任何未经切割的DNA。
为了评价TetR的别构效应(图5A和图5C)，将dsDNA与不同比例的aTF混合，并于室温在NEBuffer1.1(New England Biolabs#B7201S)中平衡。在室温、90V、TBE 1X缓冲液中的10％PAGE上进行EMSA。用SYBRGold(Thermo Fisher Scientific#S11494)1X在TBE 1X缓冲液中进行后染色。
反应组成如相应的附图所示，除非另有说明，否则均使用最终浓度为1X NEBuffer1.1(New England Biolabs#B7201S)进行所有反应。
HgaI/Toehold介导的链置换反应.通过添加缓冲液1.1(New England Biolabs)、dsDNA模板、侵入探针、aTF、无核酸酶的水(Integrated DNA Technologies)或样品和Hgal(New England Biolabs)至最终体积为10μL，从而构建反应。在添加HgaI后，立即在CFX96Touch Real Time PCR检测系统(加利福尼亚州赫拉克勒斯的Bio-Rad Laboratories,Inc.)的通道1上监测6-FAM荧光强度30分钟至120分钟。Hgal限制性反应的详细配方可与见于表4。
表4
组分 原液浓度 体积(μL) 最终浓度
dsDNA模板 1μM 0.5 50nM
aTF 多种 1.75 多种
探针 10μM 1.25 1.25μM
水或样品 - 5 -
Buffer 1.1NEB 10X 1 1X
Hga1 2000U/mL 0.5 100U/mL
**最终** - 10 -
水采样和处理.从香港东部的池塘(22.332022，114.245774)中采集水样。将样品收集在无菌50mL Falcon管中，并于室温运输到实验室(1h)。在实验室中使用0.45μm注射器式过滤器对水样进行过滤并立即用于反应。在过滤前，向相应的样品中掺入已知浓度的四环素(参见SigmaACS Synthetic Biology pubs.acs.org/synthbio Research Articlehttps://dx.doi.org/10.1021/acssynbio.0c00545 ACS Synth.Biol.2021,10,371-378376Sigma-Aldrich#87128)、红霉素(Sangon Biotech CAS#114-07-8)、卡那霉素(ThermoFisher Scientific#J17924)或氨苄青霉素(Sigma-Aldrich#A9518)。所有使用水样(掺料或未掺料)的反应均在收集的当天进行，收集与反应之间最长为2h。对于图6C所示的数据，使用500nM(最终浓度250nM)抗生素检测基于TetR的生物传感器，并且将2.5μM(最终浓度1.25nM)用于基于MphR的生物传感器。在所有反应中，使用50nM的DNA模板和1.25μM的侵入探针(图6A至图6C)。
数据处理和可视化.所有原始数据均用Microsoft Excel和GraphPad Prism 8进行处理和分析。所有的图均用GraphPad Prism 8(加利福尼亚州圣地亚哥的Prism)和Matlab(加利福尼亚州波特拉谷的Mathworks)绘制。方案图示由Biorender.com绘制。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且本领域技术人员可以想到根据这些实施例和实施方案进行各种修改或改变，因而这些修改或改变将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限定可以与本文公开的任何和/或所有其他要素或限定(单独地或以任意组合形式)或任何其他发明或其实施方案进行组合，并且所有此类组合均包括在本发明的范围内，但不限于此。
SEQUENCE LISTING
<110> 香港科技大学
<120> 通过酶介导的链置换反应检测分析物
<130> HKUS.160X
<150> 63/103,492
<151> 2020-08-06
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 1
atgagtcggt tagacaagag taaagtgatt aattcggctc tcgaactgct gaatgaagtt 60
gggattgagg ggttgactac ccgcaaatta gcacagaaac ttggcgtaga acagccaact 120
ctttactggc acgttaagaa taagcgggcc cttcttgatg cgcttgccat cgagatgctg 180
gaccgccatc acacacactt ttgcccatta gaaggggagt cgtggcagga tttcttacgg 240
aataatgcca agtctttccg gtgcgctctt cttagccatc gtgacggtgc aaaggtacat 300
ttaggcacgc gcccgaccga aaaacagtac gaaaccttag aaaaccagct tgcctttctg 360
tgtcaacagg gtttcagcct cgaaaatgcg ttatacgctc tgtcggccgt aggccacttt 420
acgctcgggt gcgtcctcga ggaccaagag caccaggtcg ctaaggagga gcgggagacc 480
ccaaccacag atagtatgcc accattgtta cgtcaagcaa tcgagttgtt tgatcaccaa 540
ggtgcggagc ctgcatttct ttttggttta gaactgatta tctgtggcct tgaaaagcag 600
ttgaaatgcg aaagcgggtc ctgacatcat catcatcatc at 642
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 2
ataaagacgc tccctatcag tgatagaga 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 3
tctctatcac tgatagggag cgtctttat 29
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性侵入探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> BHQ
<400> 4
ataaagacgc tccctatcag tga 23
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 5
ataaagacgc agtccctatc agtgatagag a 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 6
tctctatcac tgatagggac tgcgtcttta t 31
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 7
ataaagacgc agtctcccta tcagtgatag aga 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 8
tctctatcac tgatagggag actgcgtctt tat 33
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 9
ataaagacgc agtcagtccc tatcagtgat agaga 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 10
tctctatcac tgatagggac tgactgcgtc tttat 35
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 11
ataaagacgc agtcagtctc cctatcagtg atagaga 37
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 12
tctctatcac tgatagggag actgactgcg tctttat 37
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 13
ataaagacgc agtcagtcag tccctatcag tgatagaga 39
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 14
tctctatcac tgatagggac tgactgactg cgtctttat 39
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 15
ataaagacgc agtcagtcag tctccctatc agtgatagag a 41
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与TetR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 16
tctctatcac tgatagggag actgactgac tgcgtcttta t 41
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与MphR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 17
ataaagacgc gaatataacc gacgtgactg ttacatttag gtgg 44
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 与MphR传感器分子一起使用的DNA模板序列
<400> 18
ccacctaaat gtaacagtca cgtcggttat attcgcgtct ttat 44
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性侵入探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> BHQ
<400> 19
ataaagacgc tccctatcag tga 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性侵入探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> BHQ
<400> 20
ataaagacgc gaatataacc gac 23
<210> 21
<211> 207
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 21
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser
195 200 205
<210> 22
<211> 194
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 22
Met Pro Arg Pro Lys Leu Lys Ser Asp Asp Glu Val Leu Glu Ala Ala
1 5 10 15
Thr Val Val Leu Lys Arg Cys Gly Pro Ile Glu Phe Thr Leu Ser Gly
20 25 30
Val Ala Lys Glu Val Gly Leu Ser Arg Ala Ala Leu Ile Gln Arg Phe
35 40 45
Thr Asn Arg Asp Thr Leu Leu Val Arg Met Met Glu Arg Gly Val Glu
50 55 60
Gln Val Arg His Tyr Leu Asn Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly Pro Gln
65 70 75 80
Gly Leu Trp Glu Phe Leu Gln Val Leu Val Arg Ser Met Asn Thr Arg
85 90 95
Asn Asp Phe Ser Val Asn Tyr Leu Ile Ser Trp Tyr Glu Leu Gln Val
100 105 110
Pro Glu Leu Arg Thr Leu Ala Ile Gln Arg Asn Arg Ala Val Val Glu
115 120 125
Gly Ile Arg Lys Arg Leu Pro Pro Gly Ala Pro Ala Ala Ala Glu Leu
130 135 140
Leu Leu His Ser Val Ile Ala Gly Ala Thr Met Gln Trp Ala Val Asp
145 150 155 160
Pro Asp Gly Glu Leu Ala Asp His Val Leu Ala Gln Ile Ala Ala Ile
165 170 175
Leu Cys Leu Met Phe Pro Glu His Asp Asp Phe Gln Leu Leu Gln Ala
180 185 190
His Ala

Claims (32)

1.一种用于分析物检测的组合物，包含限制性内切酶、DNA模板、传感器分子和侵入探针，其中所述分析物与所述传感器分子结合并允许所述限制性内切酶识别所述DNA模板中的限制性酶切位点，并且其中所述侵入探针与报告分子联合产生可检测信号。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述传感器分子为别构转录因子或适体。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述分析物为与所述传感器分子结合的配体。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述限制性内切酶为IIS型限制性内切酶，该IIS型限制性内切酶在所述DNA模板的3′端或5′端产生突出端，并且所述突出端的长度为至少四个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述DNA模板为双链DNA序列或单链DNA序列；所述双链DNA序列包括位于至少一个操纵子序列上游或下游的至少一个限制性酶切位点，所述单链DNA序列包括位于发夹结构的环区内的限制性酶切位点和互补于适体分子的结构域。
6.根据权利要求2所述的组合物，其中DNA模板序列和适体序列能够连接在单个DNA寡核苷酸中。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述单个DNA寡核苷酸形成发夹结构，其中所述发夹的茎为所述DNA模板与所述适体之间的互补区域。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中当不存在所述分析物时，所述传感器分子与所述DNA模板结合或杂交。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中当存在所述分析物时，所述传感器分子不与所述DNA模板结合或杂交。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述分析物时，所述传感器分子不以与存在所述分析物时相同的亲和力与所述DNA模板结合或杂交。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述侵入探针为部分互补或完全互补于DNA模板的单链DNA序列。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述侵入探针在3′端或5′端处具有荧光标记物、猝灭标记物和/或电活性标记物。
13.根据权利要求2所述的组合物，其中所述别构转录因子包括至少一个效应物结合域和至少一个核酸结合域。
14.根据权利要求5所述的组合物，其中与所述双链DNA模板结合的所述别构转录因子抑制所述限制性内切酶对限制性酶切位点的识别。
15.根据权利要求5所述的组合物，其中所述单链DNA序列的所述发夹结构抑制所述限制性内切酶对所述限制性酶切位点的识别。
16.根据权利要求5所述的组合物，其中所述侵入探针与所述DNA模板的单链DNA序列互补于所述适体的区域杂交，或者与所述DNA模板的茎环区杂交。
17.根据权利要求7所述的组合物，其中所述DNA模板的所述发夹结构抑制所述限制性内切酶对所述限制性酶切位点的识别。
18.根据权利要求7所述的组合物，其中所述侵入探针与所述DNA模板互补于所述适体的区域杂交，或者与所述DNA模板的茎环区杂交。
19.根据权利要求1所述的组合物，还包含适合于限制性内切酶切割反应和Toehold介导的链置换反应的缓冲液。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中所述DNA模板包括至少一个限制性内切酶的限制性酶切位点和至少一个别构蛋白结合序列。
21.一种检测样品中分析物的方法，所述样品用于调节DNA回路，该方法包括：
a)使所述样品与权利要求1所述的组合物混合接触；以及
b)使所述传感器分子与所述DNA模板结合；其中当不存在所述分析物时，所述传感器分子阻止所述限制性内切酶识别所述DNA模板中特异于所述限制性内切酶的限制性酶切位点，或者当存在所述分析物并且所述分析物与所述传感器分子结合时，从所述DNA模板中置换所述传感器分子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中当存在所述分析物时，所述方法还包括：
c)用所述限制性内切酶消化所述DNA模板；
d)使所述侵入探针与所述DNA模板杂交；
e)用所述限制性内切酶对杂交侵入探针和DNA模板进行切割；以及
f)通过检测自经切割的杂交侵入探针和DNA模板所释放的信号确定至少一种分析物的存在或不存在，其中检测到所述信号表示存在所述分析物。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述分析物选自抗生素、芳香族化合物、群体感应分子或金属。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述信号为电化学信号、荧光信号、发光信号和/或比色信号。
25.根据权利要求21所述的方法，还包括使所述样品与适合于限制性内切酶的切割反应和Toehold介导的链置换反应的缓冲液接触。
26.根据权利要求21所述的方法，其中在与权利要求1所述的组合物混合接触之前，通过加热、离心、化学或物理溶解、稀释、浓缩或过滤对所述样品进行处理。
27.根据权利要求21所述的方法，其中a)混合接触和b)结合在约20℃至约60℃的温度进行。
28.根据权利要求22所述的方法，其中c)消化、d)杂交和e)切割在约20℃至约60℃的温度进行。
29.根据权利要求22所述的方法，其中e)切割还包括使所述侵入探针与所述经切割的杂交侵入探针和DNA模板杂交，并置换经切割的DNA片段的短链。
30.一种调节DNA回路的方法，该方法包括：
a)使限制性内切酶、具有限制性内切酶识别位点的DNA序列和侵入探针接触；
b)用所述限制性内切酶消化所述DNA序列，从而产生具有Toehold区域的经消化的DNA序列；
c)使所述侵入探针与步骤b)的所述经消化的DNA序列在所述Toehold区域处杂交，以产生杂交DNA序列；
d)用所述限制性内切酶消化步骤c)的所述杂交DNA序列，从而产生具有第二Toehold区域的经消化的DNA序列；
e)使所述侵入探针与步骤d)的所述经消化的DNA序列在所述第二Toehold区域处杂交；以及
f)任选地，重复步骤d)和e)直到所述限制性内切酶失活或没有剩余的未经切割的侵入探针或通过阻断所述限制性内切酶识别位点而终止。
31.根据权利要求30所述的方法，其中步骤d)的所述消化从所述侵入探针释放标记物或猝灭基团。
32.根据权利要求30所述的方法，其中步骤e)的所述杂交从所述侵入探针释放标记物。
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