CN103597094A - 利用电活性水解探针(e-tag探针)监测实时聚合酶链式反应(pcr)的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用标记有电活性指示剂的水解探针来实时电化学监测PCR扩增子的方法以及用于实施所述方法的微芯片。与现有技术相比,本发明提供的方法更简单以及具有更高的特异性。可以利用在PCR过程中测得的电化学信号来确定目标DNA的初始量。这种技术可应用于核酸的检测和定量,特别是用于现场应用,例如基于核酸的现场生物分析。
Description
技术领域
本发明涉及通过实时监测PCR扩增过程来对核酸(DNA或RNA)进行定量的方法以及用于实施所述方法的微芯片装置。
背景技术
全球都迫切需要一种适用于便携式应用,特别是现场测试的、基于DNA的高效生物分析技术(参见文献“Yager,P.;Domingo,G.J.;Gerdes,J.;Annu.Rev.Biomed.Eng.2008,10,107-144”)。同时扩增和测量目标DNA的实时聚合酶链式反应(PCR)被认为是用于DNA定量的标准技术。传统的基于荧光的实时PCR已非常成熟并广泛应用于基于DNA的生物分析中。但是,由于需要庞大、昂贵且复杂的光学仪器,因此限制了其在便携情况下的应用。为了将实时PCR转变成适用于便携应用的技术,近期的研究致力于用基于电化学的检测取代实时PCR系统中的荧光测量部件,这是因为前者的仪器简单且易于小型化,而这对于发展便携式生物分析技术和装置是至关重要的。
已发展并用于基于荧光的实时PCR技术中的机制主要有4种(参见文献“Klein,D.Trend.Mol.Med.2002,8,257-260”)。最简单的一种基于插入染料,该插入染料在与双链PCR扩增子结合时产生增强的荧光。基于分子信标和基于杂交探针的实时PCR都利用了当探针与PCR扩增子杂交时的荧光增强,而基于水解探针的实时PCR则只在探针被切断后才产生可检测的荧光。为了发展基于电化学的实时PCR技术,已经研究和提出了这些检测机制的电化学变型。
自从Hsing等人首次报道了电化学实时PCR(ERT-PCR)(参见文献“Yeung,S.W.;Lee,T.M.H.;Hsing,I.M.J.Am.Chem.Soc.2006,128,13374-13375”;“Yeung,S.W.;Lee,T.M.H.;Hsing,I.M.Anal.Chem.2008,80,363-368”)以来,已报道了数种ERT-PCR策略,有趣的是,这些策略都是基于与基于荧光插入子的实时PCR类似的检测机制。
例如,Gong等人(参见文献“Gong et al.,Biosens.Bioelectron.,24(2009),2131-2136”)报道了一种基于插入子的用于实时监测PCR扩增子的方法。在他们的方法中,利用当亚甲基蓝(MB)插入到双链PCR产物中时其扩散系数发生降低来监测所产生的PCR扩增子的量。随着PCR的进行,越来越多的MB插入到PCR扩增子中,这导致MB的电化学信号减小。基于类似的机制,Marchal等人(参见文献“Marchalet al.,J.Am.Chem.Soc.,131(2009),11433-11441”)开发了一种利用dNTP内在的电活性并由氧化还原催化剂Ru(bpy)3 3+(其中bpy=2,2’-双吡啶)或Os(bpy)3 3+辅助的ERT-PCR。随着PCR循环数的增加,越来越多的dNTP被消耗,这导致电化学信号降低。这两种方法都不需要固定探针,并且表明其灵敏度与基于荧光的系统相当。但是,这两种方法都是信号关闭式(signal-off)的,较容易产生假阳性结果(参见文献“Xiao,Y.;Piorek,B.D.;Plaxco,K.W.;Heeger,A.J.J.Am.Chem.Soc.2005,127,17990-17991”;“Luo,X.;Hsing,I.M.Electroanalysis,2010,22,2769-2775”)。此外,这些方法均不可能实现多任务。
基于固定在电极表面且标记有电活性指示剂(例如二茂铁、亚甲基蓝)的DNA探针的构型变化,Plaxco等人开发了一种用于检测DNA的电化学固定的“分子信标”方法。当固定的探针与目标DNA杂交时,固定的探针上的电活性标记的距离显著地改变,这导致电化学信号显著上升(信号开启式(signal-on)设计)(参见文献“Xiao,Y.;Piorek,B.D.;Plaxco,K.W.;Heeger,A.J.J.Am.Chem.Soc.2005,127,17990-17991”)或下降(信号关闭式(signal-off)设计)(参见文献“Fan,C.;Plaxco,K.W.;Heeger,A.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2003,100,9134-9137”)。
最近,Fang等人报道了一种使用非固定的双重标记的DNA探针的电化学DNA检测策略(参见文献“Wu,J.;Huang,C.;Cheng,G.;Zhang,F.;He,P.;Fang,Y.Electrochem.Commun.2009,11,177-180”)。所述探针具有茎环结构并在两端均连接有电活性的胭脂红酸基团,所述胭脂红酸基团相互靠近以致形成二聚体,从而抑制其电活性。当与互补的目标DNA杂交时,所述胭脂红酸分离,从而重新获得产生电化学信号的能力。在同一个研究组报道的另外一种策略中,茎环DNA探针的一端连接有4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸(dabcyl),另一端连接有金纳米颗粒(参见文献“Fan,H.;Xu,Y.;Chang,Z.;Xing,R.;Wang,Q.;He,P.;Fang,Y.Biosens.Bioelectron.2010,26,2655-2659”)。所述探针与目标DNA的杂交使dabcyl与金纳米颗粒分离,从而使dabcyl与α-CD改性的电极结合,结果使金纳米颗粒产生电化学信号。这些简单的策略设计巧妙,灵敏度高,但还未应用于实时PCR。
已报道了基于水解探针的DNA检测的电化学变型。Jenkins等人报道了这样一种方法,该方法使用二茂铁标记的DNA探针和T7核酸外切酶(参见文献“Hillier,S.C.;Flower,S.E.;Frost,C.G.;Jenkins,A.T.A.;Keay,R.;Braven,H.;Clarkson,J.Electrochem.Commun.2004,6,1227–1232”)。当DNA探针与目标DNA杂交时,所述DNA探针5’端上的二茂铁标记被双链特异性T7核酸外切酶切除。由于所产生的二茂铁标记的核苷酸比二茂铁标记的DNA探针小得多,并且其所带的负电荷比二茂铁标记的DNA探针少得多,因此其可以更快地扩散至电极,从而产生更高的二茂铁电化学信号。
在过去的十年中,基于电化学的DNA分析技术的开发聚焦于现场应用。Hsing等人开发了一种用于病原体多任务检测的基于微芯片的完整DNA生物分析平台,其能够处理基于DNA的生物分析的全过程,包括从样品制备及DNA扩增到序列特异性扩增子检测(参见文献“Yeung,S.W.;Lee,T.M.H.;Cai,H.;Hsing,I.M.Nucl.Acids Res.2006,34,e118”)。首次报道了基于电化学的实时PCR(ERT-PCR)(参见文献“Yeung,S.W.;Lee,T.M.H.;Hsing,I.M.J.Am.Chem.Soc.2006,128,13374-13375;Yeung,S.W.;Lee,T.M.H.;Hsing,I.M.Anal.Chem.2008,80,363-368”)。通过使用二茂铁标记的脱氧尿苷三磷酸(Fc-dUTP)对所产生的PCR扩增子的量进行电化学监测,在PCR过程中所述Fc-dUTP被整合到固定的探针上,导致二茂铁的电化学信号增强。在DNA模板的浓度较高时,这种ERT-PCR的灵敏度高于基于荧光的SYBR Green实时PCR平台。
但是,当检测低浓度的目标DNA时,ERT-PCR的性能不够令人满意。与基于荧光的实时PCR相比,需要更多的循环数才能获得可检测的信号。ERT-PCR在目标DNA浓度低的情况下性能不佳的原因可归结为:(1)Fc-dUTP被整合到PCR扩增子中、以及被引入固定在电极上的所延伸的探针上的效率低;(2)电子从整合的Fc-dUTP经过DNA骨架传递到电极上的效率低;以及(3)检测电极也作为在PCR过程中DNA探针在其上固定并延伸的基底,这可能导致对电化学测量产生干扰。2008年,开发了一种用于检测序列特异性DNA和PCR扩增子的免固定电化学方法,该方法基于在均匀液相中目标DNA与二茂铁标记的PNA探针之间的杂交,并且免去了将DNA探针固定在电极上的需要(参见文献“Luo,X.;Lee,T.M.H.;Hsing,I.M.Anal.Chem.2008,80,7341-7346”)。该方法简单、快速,并易于实现多任务(参见文献“Luo,X.;Hsing,I.M.Biosens.Bioelectron.2009,25,803-808”)。
此外,T.H.Fang等人(参见文献“T.H.Fang et al.,Biosens.Bioelectron.24,2009,2131–2136”)报道了采用同步电化学检测的实时PCR微流装置。T.Defever等人(参见文献“T.Defever et al.,J.Am.Chem.Soc.131,2009,11433–11441”)报道了通过调节氧化还原催化来对聚合酶链式反应进行实时电化学监测。T.Defever等人(参见文献“T.Defever et al.,Anal.Chem.83,2011,1815-1821”)报道了使用可插入DNA的氧化还原探针的实时电化学PCR。此外,B.Y.Won等人(参见文献“B.Y.Won et al.,Analyst,2011,136,1573–1579”)报道了对基于亚甲基蓝与DNA之间的相互作用的电化学实时PCR系统的信号发生机制的研究以及对其性能的验证。
至于专利/申请文献,J.Lee等人(美国专利No.7,135,294B2)开发了一种用电信号实时检测PCR产物的方法。在PCR过程中,核苷酸被整合到扩增子中,导致PCR混合物的电迁移率降低。因此,随着PCR的进行,PCR混合物的阻抗升高。因此,通过测量溶液的阻抗就能够实时地监测PCR扩增过程。A.Heller等人(美国专利申请公开No.2002/0001799A1)描述了在PCR产物的小样品中对DNA的PCR扩增进行快速的安培法验证。Jung-im Han(美国专利申请公开No.2005/0191686A1)描述了一种微PCR装置、一种使用所述微PCR装置扩增核酸的方法以及一种使用所述微PCR装置测量PCR产物的浓度的方法。此外,I.M.Hsing等人(美国专利申请公开No.2010/0184028A1)描述了一种使用具有导电性或电化学活性的标记对核酸进行实时定量和监测的方法和系统。
但是,本领域仍然需要一种更简单的、免固定的以及具有更高特异性的用于对核酸进行定量的实时ERT-PCR方法。
发明内容
本发明描述了一种利用标记有一个或多个电活性指示剂的DNA探针(称为eTaq探针)以及具有带负电荷的表面的电极对PCR扩增子的量进行实时电化学测量的方法。所述eTaq探针与所述PCR扩增子的一部分互补,并在PCR引物延伸的过程中被具有核酸外切酶活性的DNA聚合酶水解。所得的电活性核苷酸具有较高的扩散系数和较少的负电荷,从而导致电化学信号增强。随着PCR循环而增加的电化学信号可用于确定目标DNA模板的初始量。
与现有技术相比,本发明的方法较简单、不需要固定探针、且具有更高的特异性。因此,本发明的方法可应用于核酸的检测和定量,特别是在现场应用中,例如基于核酸的现场生物分析。特别地,与Hsing等人首次开发的ERT-PCR相比,由于利用了eTaq探针的水解以及所释放的标记有二茂铁的dUTP的扩散控制的电化学反应,本发明的基于eTaq的ERT-PCR方法不存在Fc-dUTP整合效率低以及电子传递效率低的问题。在本发明的基于eTaq的ERT-PCR中,eTaq探针的水解发生在液相中或第二基底上,而不是在检测电极上,因此避免了对电化学测量的干扰。
相应地,本发明的一个方面涉及一种实时地或在每个聚合酶链式反应(PCR)热循环之后对PCR的核酸扩增产物(或PCR扩增子)进行电化学监测和/或定量的方法,包括:使含有目标核酸的样品与标记有至少一个电活性指示剂的单链水解DNA探针接触;在PCR扩增可有效进行的条件下加入PCR酶,例如具有5’-3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶;施加电势;以及实时地或在每个PCR热循环之后检测或测量由所述电活性指示剂产生的电信号和/或确定所述样品中所含有的核酸的量。
所述单链水解DNA探针与PCR扩增子中的区域互补并具有不能被延伸的3’端。在一个实施方案中,所述水解DNA探针的3’端是被磷酸化的。在另一个实施方案中,所述水解DNA探针的3’端具有至少一个不与所述PCR扩增子互补的碱基。所述探针可用于多任务。所述探针可标记有一个或多个电活性指示剂。优选地,所述电活性指示剂是二茂铁或亚甲基蓝。可用具有包含例如氧化铟锡、金、铂、碳和/或磁性颗粒的带负电荷的表面的导电性电极来检测或测量电信号。在一个实施方案中,所述电极可以是叉指阵列(IDA)电极。所述电活性探针能够被DNA聚合酶水解,并且在PCR热循环过程中,被水解的量与PCR热循环过程中所产生的扩增子的量成比例地增加。
本发明的另一方面涉及用于实施本发明的方法的微芯片,包括电化学导电性电极和用于容纳含有核酸的溶液的支持物。PCR反应可在所述微芯片的微腔中进行,所述微芯片优选由硅制成。所述微腔优选形成在阳极键合的硅和玻璃基底之间。优选地,所述微芯片可包括整合在其上的基于金属的温度传感器以及微加热器,以控制PCR反应过程中的温度。可在所述微芯片上图案化形成并整合检测电极,并且所述电极的表面可优选包含氧化铟锡、金、铂、碳和/或磁性颗粒。所述电极可用于检测或测量由所述方法产生的电化学信号,该电化学信号与所产生的PCR扩增子的量成比例。
附图说明
以下结合附图详细描述各个实施方案。
图1示出本发明的一个实施方案的示意图。
图2示出本发明的一个实施方案,该实施方案使用人类基因组DNA(男性)作为模板,并且扩增了人类性别决定区Y(SRY)的一个137-bp(碱基对)的片段。图2(a)的曲线图示出在采用电活性水解探针的实时PCR中,在0、5、10、20、30或40个循环之后的差示脉冲伏安法(DPV)扫描结果,图2(b)的曲线图为示出所述DPV扫描的峰电流强度对PCR循环数的图。
图3为示出采用标记有多个电活性指示剂的水解探针的电化学实时PCR的示意图。
图4为示出叉指阵列电极的信号扩增机制的示意图。
图5为示出采用多个电活性水解探针的多任务电化学实时PCR的示意图。
具体实施方式
在本申请的全文中,使用术语“包括”或“包含”描述了多个实施方案;但是,本领域技术人员将会理解,在某些特定的情况下,也可用词语“主要由...组成”或“由...组成”来描述实施方案。
为了使读者更好的理解本发明,并且在任何情况下都不构成对本发明范围的限制,除非另有说明,否则本申请中使用的所有表示数量、百分比或比例的数字以及其他数值都应理解为在任何情况下都由术语“大约”修饰。相应地,除非有相反的说明,否则本申请的说明书及权利要求书中记载的数值参数均为近似值,其可根据想要得到的性质而改变。至少,每个数值参数都应至少根据已报道的有效数字及采用普通舍入方法来理解。
除非另有特别说明,否则本申请中使用的术语“一个”包括单数及复数。因此,本申请中的术语“一个”或“至少一个”可互换使用。
本申请中的其他术语的涵义由其在本领域中公知的涵义定义。
以下对本发明的实施方案作详细说明。图1示出本发明的一个实施方案的示意图,其中使用了标记有电活性指示剂2(例如,二茂铁、亚甲基蓝)的DNA寡核苷酸1(又称为eTaq探针)、以及具有带负电荷的表面的电极3(例如,氧化铟锡电极)。在PCR之前,由于带负电荷的DNA骨架和带负电荷的电极表面之间的静电排斥4,eTaq探针1被阻止接近电极,这导致电活性指示剂2的电化学信号5可忽略不计。当产生了PCR扩增子6时,eTaq探针1和PCR引物7都退火结合到PCR扩增子6的互补区上。随着PCR引物7在由具有核酸外切酶活性的DNA聚合酶9催化的延伸8中被延长,eTaq探针1被DNA聚合酶9水解,释放出标记有电活性指示剂2的核苷酸10。由于电活性核苷酸10所带的负电荷比eTaq探针1的少得多,因此电活性核苷酸10可以扩散到电极表面,从而产生可检测的电化学信号11。
更详细而言,仍参见示出本发明的一个实施方案的示意图图1,正如Luo等人在文献“Luo,et al.,Anal.Chem.,80,7341-7346(2008)”中以及Luo等人在文献“Luo,et al.,Electroanalysis,22,2769-2775(2010)”中报道的那样,由于带负电荷的DNA骨架与带负电荷的电极表面之间的静电排斥,与eTaq探针1结合的电活性指示剂2不能扩散到电极3上,这导致电活性指示剂2的电化学信号可忽略不计。在PCR循环的退火步骤中,eTaq探针1和PCR引物7都退火结合到PCR扩增子中的互补区上,其中PCR引物7位于上游。然后,DNA聚合酶9使PCR引物7沿着PCR扩增子6延伸。由于DNA聚合酶9具有5’-3’核酸外切酶活性,当DNA聚合酶9遇到eTaq探针1时,eTaq探针1被水解。也就是说,所述PCR酶是具有5’-3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
探针由于PCR引物的延伸而被水解的机制与Mayrand开发的基于探针的荧光实时PCR(美国专利No.6,395,518B1)中所用的相同。在Mayrand的方法中,水解探针的一端标记有荧光分子,另一端标记有淬灭分子。探针的水解使得荧光分子与淬灭分子分离,从而导致荧光信号的产生。在本发明中,水解反应将eTaq探针1切断成为电活性核苷酸10。电活性核苷酸10上所带的负电荷比eTaq探针1上的少得多,因此电活性核苷酸10可以扩散到电极3上,从而产生可检测的电化学信号11。据观察,正如Jenkins等人在文献“Jenkins et al.,Bioelectrochem.,63(2004),307-310”中以及Jenkins等人在文献“Jenkinset al.,Electrochem.Commun.,6(2004),1227–1232”中所报道的那样,当电活性DNA探针被水解时,可检测到较高的电化学信号,但在上述报道中,DNA探针被核酸酶的水解被用于检测DNA和核酸酶,而不是用于实时PCR。
更详细而言,仍参见示出本发明的一个实施方案的示意图图1,eTaq探针1的3’端被磷酸化以防止eTaq探针1在PCR过程中延伸,这是因为eTaq探针1的延伸可能会造成对PCR的干扰以及降低扩增效率。
现参见图2所示的本发明的一个实施方案的示意图,从人类基因组DNA(男性)中扩增人类性别决定区Y(SRY)中的一个137-bp的片段。使用标记有亚甲基蓝的DNA作为eTaq探针(MB-eTaq)。MB-eTaq探针的3’端被磷酸化以防止其在PCR过程中延伸。在PCR热循环的退火步骤中,MB-eTaq探针和PCR正向引物都杂交到变性的PCR扩增子的互补区上。随着引物的延伸,MB-eTaq探针被水解成电活性核苷酸(MB-dATP),这导致电化学信号增强。随着PCR的进行,产生了更多的PCR扩增子,从而产生了更多的电活性核苷酸,因此测得的电化学信号也相应地增强,由此可以实现对PCR扩增子的扩增的实时监测。如图2所示,测得的亚甲基蓝的信号随着循环数的增加而增强。在不含有模板DNA的阴性对照中,即使在40个循环后测得的信号也可忽略不计,这证明了本发明的方法具有很高的特异性。
参见图3,图3为示出使用标记有多个电活性指示剂的水解探针的电化学实时PCR的示意图,水解探针1可标记有多个电活性指示剂2,例如亚甲基蓝和二茂铁。因此,产生每个PCR扩增子3时,释放多个电活性核苷酸4,这导致电化学信号5增强,从而提高检测的灵敏度。
参见图4,图4为示出叉指阵列(IDA)电极的信号扩增机制的示意图。IDA电极是近年来所开发的一种能够通过使电活性物质经历多个氧化还原循环来产生增强的电化学信号的电极。由于叉指电极之间的间隙很小,因此当在叉指电极上施加不同的电势时,在一个电极上被氧化(或还原)的电活性物质能够在相邻电极上被还原(或氧化),由此形成氧化还原循环。同一个分子在扩散离开电极前会经历多个氧化还原循环,这导致电化学信号显著增强。IDA电极只适用于扩散控制的电化学氧化还原反应,即,电活性物质应当能够在氧化电极和还原电极之间自由扩散。由于本发明的基于eTaq的ERT-PCR方法测量的是从溶液中扩散到电极表面上的Fc-dUTP所产生的电化学信号,因此完全适用IDA电极。因此,可将IDA电极应用于本发明的基于eTaq的ERT-PCR方法,以获得更高的检测灵敏度。
参见图5,通过使用多个标记有具有不同氧化还原电势的电活性指示剂的水解探针,可以实现多任务电化学实时PCR。二茂铁(Fc)和亚甲基蓝(MB)是两种具有不同氧化还原峰的电活性指示剂。如图5所示,在基于eTaq的多任务ERT-PCR中,序列分别与不同PCR扩增子互补的标记有Fc2的水解探针1和标记有MB4的水解探针3被加入到同一个PCR混合物中。当产生了PCR扩增子时,相应的水解探针被水解,释放Fc标记的dNTP5和MB标记的dNTP6,从而产生Fc的电化学信号7和MB的电化学信号8。因此,Fc和MB的信号的强度反映了相应的目标DNA模板的初始量,从而使用一个检测电极实现了多任务电化学实时PCR。
本发明还提供了一种用于实施本发明的方法的微芯片,其包括电化学导电性电极和适于容纳含有核酸的溶液的支持物。所述用于实施本发明的基于eTaq的ERT-PCR的微芯片与Hsing等人在文献“Hsing etal.,Anal.Chem.80,2008,7341”中所报道的芯片电极相似但有所不同,上述报道的全部内容以引用方式并入本文。
具体来说,PCR反应可在微芯片的微腔中进行,所述微芯片优选由硅制成。所述微腔可优选地形成在阳极键合的硅和玻璃基底之间。优选地,所述微芯片可包括整合在其上的基于金属的温度传感器、以及微加热器,以控制PCR反应期间的温度。在所述微芯片上可排列并整合有检测电极,所述电极的表面可优选包含氧化铟锡、金、铂、碳和/或磁性颗粒。所述电极可用于检测或测量由本发明所述的方法产生的电化学信号,该电化学信号与所产生的PCR扩增子的量成比例。在这一点上,电化学信号的电流可与核酸扩增产物的量相关。
预期可以使用与现有方法中所用的试剂盒类似的试剂盒来实施本发明的方法,所述试剂盒可包括用于实施本发明的方法的所有必要成分,例如引物、微芯片、电极、PCR试剂等。如果用于即时使用,所述试剂盒还可包括标记的标记物,以及其他定制试剂。
本发明的优点包括但不限于:提高实时PCR的特异性、不需要固定探针、以及可以容易地实现多任务。本发明的方法操作简便,不需要复杂的仪器和繁琐的步骤,并且通常只需几个小时就可完成。在一个宽泛的实施方案中,本发明为一种用于确定目标核酸(DNA或RNA)的存在和量的方法。由于电化学方法具有易于小型化、操作简便、仪器简单、和成本低廉的优点,本发明特别适合用于基于核酸的便携式生物分析。
实施例
以下描述的制备方法和实施例用于使本领域技术人员更清楚地理解和实施本发明。它们不应被理解为限制权利要求的范围,而只是用于说明和描述本发明。
除非另有说明,否则本文所用的所有试剂均为分析级,实验中所用的水均为去离子水。用于电化学测量的微芯片与Hsing等人在文献“Hsing et al.,Anal.Chem.80,2008,7341”中所报道的芯片电极相似,上述报道的全部内容以应用方式并入本文,所述微芯片在香港科技大学的纳米电子制造所(NFF)中制造。电化学测量使用AutolabPGSTAT30恒电势器/恒电流器(Eco Chemie)进行。PCR使用C1000TM热循环机(Bio-Rad)进行。
实施例1
使用电活性水解探针对137-bp的目标DNA的PCR扩增进行电化学实时监测。
从人类基因组DNA(男性)(Promega)中扩增人类性别决定区Y(SRY)中的137-bp的片段。PCR引物的序列为5’-TGG CGA TTA AGTCAA ATT CGC-3’(SEQ ID NO:1)(正向)and5’-CCC CCT AGT ACCCTG ACA ATG TAT T-3’(SEQ ID NO:2)(反向)(Invitrogen)。使用标记有亚甲基蓝并且序列为MB-5’-AGC AGT AGA GCA GTC AGGGAG GCA GA-3’-phos(SEQ ID NO:3)的26-mer的DNA(BioSearch)作为eTaq探针(MB-eTaq)。所述MB-eTaq探针的3’端是被磷酸化的,以防止其在PCR过程中延伸。配制含有和不含有人类基因组DNA(男性)的PCR混合物。在AmpliTaq Gold360缓冲液(Applied Biosystems)中配制含有1×AmpliTaq Gold360、2mM MgCl2、0.2mM dNTP、1μM正向引物、1μM反向引物、1.6×106拷贝/μL人类基因组DNA(男性)、1μM MB-eTaq、和0.1U/μL AmpliTaq Gold360DNA聚合酶的阳性PCR混合物。配制不含人类基因组DNA(男性)的PCR混合物作为阴性对照。对该PCR溶液进行如下热循环步骤:94℃初始变性10分钟;94℃持续10秒以及60℃持续60秒,循环0、5、10、20、30或40次;60℃最终延伸5分钟。在特定的循环次数之后,将2μL PCR混合物吸移至包括ITO工作电极、Pt(铂)对电极和Pt伪参比电极的芯片上,并随即进行DPV测量。随着循环次数增加,在DPV扫描中观察到与MB对应的峰升高。DPV扫描的结果如图2(a)所示,DPV扫描中的峰电流强度对循环次数的曲线图如图2(b)所示。
实施例2
使用标记有多个电活性指示剂的水解探针对PCR扩增进行电化学实时监测。
如图3所示,使用与实施例1中相同的材料和方法对PCR扩增进行电化学实时监测,不同之处在于:水解探针标记有多个电活性指示剂。图3中的水解探针1标记有多个电活性指示剂2(多任务-MB-eTaq探针)。产生每一个PCR扩增子3时,释放多个电活性核苷酸4,从而导致电化学信号5增强以及检测灵敏度提高。
实施例3
使用叉指阵列(IDA)电极对PCR扩增进行电化学实时监测。
如图4所示,使用叉指阵列(IDA)电极实施本发明的基于eTaq的ERT-PCR扩增。由于叉指电极之间的间隙很小,因此当在叉指电极上施加不同的电势时,在一个电极上被氧化(或还原)的电活性物质能够在相邻电极上被还原(或氧化),从而形成氧化还原循环。所述电活性物质在扩散离开电极前会经历多个氧化还原循环,这导致电化学信号显著增强。IDA电极只适用于扩散控制的电化学氧化还原反应,即,电活性物质应当能够在氧化电极和还原电极之间自由扩散。由于本发明的基于eTaq的ERT-PCR方法测量的是从溶液中扩散到电极表面上的Fc-dUTP所产生的电化学信号,因此,使用IDA电极可以获得提高的检测灵敏度。
实施例4
使用多个电活性水解探针的多任务电化学实时PCR。
使用多个标记有具有不同氧化还原电势的电活性指示剂(例如二茂铁(Fc)和亚甲基蓝(MB))的水解探针进行本发明的基于eTaq的ERT-PCR。如图5所示,为了进行基于eTaq的多任务ERT-PCR,水解探针1标记有Fc2,另一个水解探针3标记有MB4,所述探针均具有与各自对应的PCR扩增子互补的序列,它们被加入到同一个PCR混合物中。当产生PCR扩增子时,相应的水解探针被水解,释放Fc标记的dNTP5和MB标记的dNTP6,从而产生Fc的电化学信号7和MB的信号8。Fc和MB的信号强度分别反映相应的目标DNA模板的初始量,从而使用一个检测电极实现了多任务电化学实时PCR。
虽然以上对本发明的描述使得本领域技术人员能够获得并使用本发明的最佳实施方式,但本领域技术人员将会理解,本发明的特定实施方案、方法和例子存在多种变化、组合以及等同形式。因此,本发明不限于以上描述的实施方案、方法和例子,而是包括本发明的范围和精神内的所有实施方案和方法。
Claims (23)
1.一种实时地或在每个聚合酶链式反应(PCR)热循环之后对PCR的核酸扩增产物或PCR扩增子进行电化学监测和/或定量的方法,包括:使含有目标核酸的样品与标记有至少一个电活性指示剂的单链水解DNA探针接触;在PCR扩增可有效进行的条件下加入PCR酶;施加电势;以及实时地或在每个PCR热循环之后检测或测量由所述电活性指示剂产生的电信号和/或确定所述样品中所含有的核酸的量。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述单链水解DNA探针具有不能被延伸的3’端。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述单链水解DNA探针的3’端是被磷酸化的。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述单链水解DNA探针的3’端具有至少一个不与所述PCR扩增子互补的碱基。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述单链水解DNA探针与所述PCR扩增子中的区域互补。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述PCR酶是具有5’-3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的方法,其中使用具有带负电荷的表面的导电性电极检测或测量所述电信号。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述电极的所述表面包含氧化铟锡、金、铂、碳或磁性颗粒。
9.根据权利要求7所述的方法,其中所述电极是叉指阵列(IDA)电极。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述标记有电活性指示剂的单链水解DNA探针被DNA聚合酶水解,并且水解的量在所述PCR热循环过程中增加。
11.根据权利要求10所述的方法,其中电活性核苷酸与在所述PCR热循环过程中产生的扩增子的量成比例地累积。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述电信号的电流与核酸扩增产物的量相关。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述电活性指示剂是二茂铁或亚甲基蓝。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述探针上标记有多个电活性指示剂。
15.根据权利要求1所述的方法,其中使用多个标记有不同电活性指示剂的水解DNA探针。
16.一种用于实施权利要求1所述的方法的微芯片,包括电化学导电性电极和适于容纳含有核酸的溶液的支持物。
17.根据权利要求16所述的微芯片,其中所述PCR反应在微腔中进行。
18.根据权利要求17所述的微芯片,其中所述微腔形成在阳极键合的硅和玻璃基底之间。
19.根据权利要求16所述的微芯片,其中所述微芯片上整合有基于金属的温度传感器以及微加热器。
20.根据权利要求19所述的微芯片,其中所述整合的加热器和传感器用于控制所述PCR反应过程中的温度。
21.根据权利要求16所述的微芯片,其中所述微芯片上图案化形成和整合有检测电极。
22.根据权利要求21所述的微芯片,其中所述电极的表面包含氧化铟锡、金、铂、碳或磁性颗粒。
23.根据权利要求22所述的微芯片,其中所述电极用于检测或测量电化学信号,该电化学信号反映了所产生的PCR扩增子的量。
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Cited By (1)
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Families Citing this family (13)
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---|---|---|---|---|
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US11624725B2 (en) | 2016-01-28 | 2023-04-11 | Roswell Blotechnologies, Inc. | Methods and apparatus for measuring analytes using polymerase in large scale molecular electronics sensor arrays |
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KR102622275B1 (ko) | 2017-01-10 | 2024-01-05 | 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 | Dna 데이터 저장을 위한 방법들 및 시스템들 |
CN110520517A (zh) | 2017-01-19 | 2019-11-29 | 罗斯威尔生命技术公司 | 包括二维层材料的固态测序装置 |
US10508296B2 (en) | 2017-04-25 | 2019-12-17 | Roswell Biotechnologies, Inc. | Enzymatic circuits for molecular sensors |
EP3615685A4 (en) | 2017-04-25 | 2021-01-20 | Roswell Biotechnologies, Inc | ENZYMATIC CIRCUITS FOR MOLECULAR SENSORS |
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WO2019026517A1 (ja) * | 2017-07-31 | 2019-02-07 | 国立大学法人大阪大学 | 溶液中に存在する対象物質の検出方法および検出するためのシステム |
EP3676389A4 (en) * | 2017-08-30 | 2021-06-02 | Roswell Biotechnologies, Inc | PROCESSIVE ENZYMATIC MOLECULAR ELECTRONIC SENSORS FOR STORING DNA DATA |
EP3694990A4 (en) | 2017-10-10 | 2022-06-15 | Roswell Biotechnologies, Inc. | METHODS, APPARATUS AND SYSTEMS FOR NON-AMPLIFICATION DNA DATA STORAGE |
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---|---|---|---|---|
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US20060199187A1 (en) * | 2005-03-02 | 2006-09-07 | Meyerhoff Mark E | Enzyme amplified electrochemical DNA detection |
US8975025B2 (en) * | 2006-08-11 | 2015-03-10 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Method and system for nucleic acid detection using electroconductive or electrochemically active labels |
WO2008022538A1 (en) * | 2006-08-11 | 2008-02-28 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Method and system for real time quantification and monitoring of nucleic acid amplification using electroconductive or electrochemically active labels |
US20080153135A1 (en) * | 2006-12-20 | 2008-06-26 | Liu Timothy Z | Methods and apparatus for conducting amplification reactions on high density hydrophilic patterned microplates |
DE102007029772B4 (de) * | 2007-06-22 | 2011-12-08 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren und Schnelltest zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
STEPHEN S. W. YEUNG ET AL.: "Electrochemistry-Based Real-Time PCR on a Microchip", 《ANAL. CHEM》 * |
XIAOTENG LUO ET AL.: "Immobilization-Free Sequence-Specific Electrochemical Detection of DNA Using Ferrocene-Labeled Peptide Nucleic Acid", 《ANAL. CHEM》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114058680A (zh) * | 2020-08-06 | 2022-02-18 | 香港科技大学 | 通过酶介导的链置换反应检测分析物 |
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