CN110004213A

CN110004213A - 基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法

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Publication number: CN110004213A
Application number: CN201910160872.7A
Authority: CN
Inventors: 唐波; 刘炬; 王慧; 李平; 梁凯丽
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2039-03-04
Also published as: CN110004213B

Abstract

本公开提供了基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法，该方法利用toehold介导的链置换反应引发待测miRNA进行滚环扩增反应，利用滚环扩增反应的DNA单链、含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针实现荧光共振能量转移的检测。本公开由于采用将TMSD与滚环扩增结合产生的DNA单链能够使使荧光团大量聚集，使得供体荧光基团的荧光强度不仅不会产生衰弱，而且产生了逐渐增强的趋势，从而提高了对于分析待测靶标miRNA的含量的效果。

Description

基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA 的方法

技术领域

本公开属于分子检测领域，涉及基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法。

背景技术

这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

MicroRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，具有在翻译水平或转录后水平调控基因表达的功能。miRNAs的表达异常与多种疾病相关，如癌症、代谢性疾病等。因此miRNAs已经成为重要的早期临床诊断标志物。据本公开发明人所知，目前，定性检测RNA含量的方法主要是聚合酶链反应法(PCR)，检测方法较为单一。

Toehold介导的链置换反应(TMSD)是一种不依赖于酶的由DNA的生物物理学特性驱动的化学反应。随着研究者对TMSD的不断深入，发现它不仅可以作为DNA纳米材料的组装基元，还可以作为生物分子识别元件。与简单的Watson-Crick碱基配对相比，TMSD 可以提高核酸识别的特异性。利用TMSD可以实现对miRNA等核酸及小分子物质进行特异性和灵敏检测。然而，本公开发明人发现，TMSD具有信号输出较低的缺陷，该缺陷不利于将TMSD应用于检测miRNA。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本公开先将TMSD与滚环扩增(RCA)结合，然后再采用荧光共振能量转移(FRET)进行检测，不仅可以提高识别miRNA的特异性，还可以放大信号来克服单纯TMSD的缺点。在滚环扩增的产物上连接能够产生FRET的两条荧光探针，可以实现对miRNA的定性检测。可应用于定性检测细胞中的目标miRNA，并分析该目标miRNA 的生理功能。

为了实现上述目的，本公开的技术方案为：

一方面，一种miRNA的检测方法，利用toehold介导的链置换(TMSD)反应引发待测miRNA进行滚环扩增反应，利用滚环扩增反应的DNA单链、含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针实现荧光共振能量转移的检测。

荧光共振能量转移的过程为：当一个荧光分子(又称为供体荧光分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体荧光分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。本公开将先将TMSD与滚环扩增(RCA)结合，然后再与荧光共振能量转移(FRET)结合，发现本公开由于采用将TMSD 与滚环扩增(RCA)结合产生的DNA单链能够使使荧光团大量聚集，使得供体荧光基团的荧光强度不仅不会产生衰弱，而且产生了逐渐增强的趋势，从而提高了对于分析待测靶标 miRNA的含量的效果。

为了便于上述检测方法的实现，另一方面，一种基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的引物组，包括哑铃型DNA探针、含有供体荧光基团的DNA单链探针、含有受体荧光基团的DNA单链探针；

所述哑铃型DNA探针为5'端和3'端连接的封闭的单链DNA形成的茎环结构，且所述茎环结构中茎的两端均有一个环，其中一个环含有toehold序列，toehold序列与茎的一条单链直接连接，所述茎的一条单链的序列与toehold序列构成的整体序列能够和待测miRNA配位；

含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针均能够与引发待测miRNA滚环扩增反应形成的DNA单链进行配位，使配位后的供体荧光基团和受体荧光基团产生荧光共振能量转移。

本公开中，由于toehold序列能够与一部分待测miRNA配位，促进哑铃型探针的茎双链序列打开，并使茎的一条单链与另一部分待测miRNA配位，从而使得哑铃型探针形成环状结构，进而能够实现滚环扩增，滚环扩增后的DNA单链能够与含有供体荧光基团的DNA单链、含有受体荧光基团的DNA单链进行配位，导致荧光基团大量聚集，使得供体荧光团的荧光强度既受荧光聚集效应的影响又受FRET效果的影响，因此产生逐渐增强的趋势。

第三方面，一种miRNA的检测试剂盒，包括上述引物组、DNA聚合酶、DNA聚合酶反应缓冲液、BSA、dNTPs。

第四方面，基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法，采用上述引物组或试剂盒，其过程包括：

先向待测中添加哑铃型DNA探针、DNA聚合酶、DNA聚合酶反应缓冲液、dNTPs和水加热至体温下进行反应，反应终止；再添加含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针进行反应；然后进行荧光检测。

本公开的有益效果为：

1)本公开通过利用TMSD的精准序列识别，实现了不依赖于酶的对miRNA的特异性识别，具有很好的选择性。

2)本公开利用TMSD反应引发待测miRNA进行RCA反应可以将检测信号放大，使在检测低浓度的miRNA时可以很容易的收集检测信号。

3)通常情况下，收集FRET荧光信号时，供体荧光团的荧光强度会随着反应物浓度的升高而衰减，受体荧光团的荧光强度随反应物浓度的升高而逐渐增强。而本公开中，由于TMSD反应引发RCA的产物使荧光团大量聚集，使得供体荧光团的荧光强度既受荧光聚集效应的影响又受FRET效果的影响，因此产生逐渐增强的趋势；本公开综合荧光聚集效应与FRET的效果，可以更好的分析待测靶标miRNA的含量。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例的原理图；

图2为实施例中哑铃型DNA探针的选择表征图，A为520nm处荧光强度输出图，激发波长为494nm，B为TIRCA产物荧光增强倍数柱状图，ΔFa、ΔFb分别是当miR494和M1存在时与背景F0相比的荧光强度变化柱状图，C为ΔFa/ΔFa、ΔFb/ΔFa的柱状图；

图3为实施例中在120分钟内实时荧光监测mir494、M1、M2分别与T8哑铃型DNA探针进行TIRCA反应的过程中激发波长为494nm、以1分钟的间隔记录521nm处的荧光强度曲线；

图4为实施例中T8哑铃型DNA探针灵敏度分析图，分别在mir494为0、400pM、600pM、800pM、1nM、1.2nM的浓度下进行TIRCA的荧光发射光谱，其中，激发波长为494nm；

图5为利用TIRCA与FRET结合的方法体外定性分析miRNA的表征图，A为miR494的浓度分别为0、400pM、1.2nM、2nM时的荧光光谱，激发波长为495nm时，从505nm记录到 620nm的荧光曲线，激发波长为560nm时，收集从505nm到620nm的荧光曲线，B为在miR494 的浓度为400pM、1.2nM、2nM时，在520nm处FAM的荧光增强倍数(△F)输出图，C为在miR494的浓度为400pM、1.2nM、2nM时，FRET的效率(△Fb/△Fc)趋势图，△Fb表示494nm激发波长下，在580nm处TAMRA的荧光增强倍数，△Fc表示560nm激发波长下，在 580nm处TAMRA的荧光增强倍数；

图6为实施例中分析检测细胞破碎液中的靶标miRNA的荧光光谱图，A为脐静脉细胞组的荧光光谱图，激发波长为495nm，从505nm到620nm记录荧光曲线；激发波长为560nm时收集的505nm到620nm的荧光曲线，B为巨噬细胞组的荧光光谱图，激发波长为495nm，记录从505nm到620nm荧光曲线，激发波长为560nm时，收集的505nm到620nm的荧光曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于TMSD具有信号输出较低的缺陷，为了解决如上的技术问题，本公开提出了基于 Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法。

本公开的一种典型实施方式，提供了一种miRNA的检测方法，利用toehold介导的链置换反应引发待测miRNA进行滚环扩增反应，利用滚环扩增反应的DNA单链、含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针实现荧光共振能量转移的检测。

荧光共振能量转移的过程为：当一个供体荧光分子的荧光光谱与受体荧光分子的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。本公开将先将TMSD与RCA结合，然后再与FRET结合，发现该实施方式由于采用将TMSD与RCA结合产生的DNA单链能够使使荧光团大量聚集，使得供体荧光基团的荧光强度不仅不会产生衰弱，而且产生了逐渐增强的趋势，从而提高了对于分析待测靶标miRNA的含量的效果。

为了便于上述检测方法的实现，本公开的另一种实施方式，提供了一种基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的引物组，包括哑铃型DNA探针、含有供体荧光基团的DNA单链探针、含有受体荧光基团的DNA单链探针；

toehold序列长度越长的密封探针在TMSD介导的链置换过程更容易发生，然而，本公开通过实验发现，toehold序列长度越长会导致哑铃型DNA探针不稳定，不能抵抗单个碱基错配的miRNA的链迁移，从而使该引物组具有较低的选择性，为了使该引物组具有较高的选择性，该实施方式的一种或多种实施例中，toehold序列长度为具有8个碱基的序列。通过长度为具有6～10个碱基的序列的实验对比，发现toehold序列为具有8个碱基的序列的引物组的检测效果更好。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述供体荧光基团为羧基四甲基罗丹明(TAMRA)，所述受体荧光基团为6-羧基荧光素(FAM)。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述哑铃型DNA探针从5'端到3'端的DNA序列为： GACAACCTACAAATACTGATGACAATCTATAAGGTTGTCCGTGTTGCAACAGAGAAGA CAACACG；

含有受体荧光基团的DNA单链探针的DNA序列为：ATGACAATCTA；

含有供体荧光基团的DNA单链探针的DNA序列为：

AGAGAAGACAACACGGACAACCT。

本公开的第三种实施方式，提供了一种miRNA的检测试剂盒，包括上述引物组、DNA聚合酶、DNA聚合酶反应缓冲液、BSA、dNTPs。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶。

本公开的第四种实施方式，提供了基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET 检测miRNA的方法，采用上述引物组或试剂盒，其过程包括：

本公开所述体温是指人体正常的温度，为36.2～37.2℃。

该实施方式的一种或多种实施例中，反应终止的步骤为：加热至60～70℃反应。

为了获得哑铃型DNA探针，该实施方式的一种或多种实施例中，向链状DNA单链中添加DNA连接酶及DNA连接酶反应缓冲液，在20～25℃进行反应，终止反应后获得哑铃型DNA探针。

经过实验能够证实采用本公开检测方法能够对miRNA同时进行定性和定量的检测，尤其是对Mir-494miRNA的检测效果更好。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例

本实施例的原理如图1所示，实验过程如下。

哑铃型DNA探针的制备

将T6、T7、T8、T9、T10每种DNA探针分别制备20μL的反应体系，其中包括1μL的DNA探针(100μM)、2μL 10×T4DNA连接酶反应缓冲液(500mM Tris-HCl，100mM MgCl₂，100mMDTT，10mM ATP，pH 7.5，25℃)、1μL T4DNA连接酶(400U/μL)、16μL DEPC 水。体系在23℃下反应2小时，再在65℃加热10分钟终止反应。向体系中加入3μL NEB buffer Ⅰ(100mM BisTris Propane-HCl,100mM MgCl₂,10mM DTT,pH 7.5,25℃)、1μL核酸外切酶Ⅰ(20U/μL)、1μL核酸外切酶Ⅲ(100U/μL)，在37℃温浴30分钟，然后在80℃加热20分钟使酶失去活性。制备好的哑铃型DNA探针放在-20℃储存。

哑铃型DNA探针的利用TMSD反应引发RCA反应(以下简称TIRCA反应)的实时荧光检测

将哑铃型DNA探针分别与mir494、错配单个碱基的miRNA(M1)、错配两个碱基的miRNA(M2)反应。每组制备25μL的反应体系，包括1μL哑铃型DNA探针、2.5μL 10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、0.5μL BSA，2.5μL miRNA(1nM),3μL dNTPs，0.5μL phi29DNA 聚合酶，13μLDEPC水，1μL 25×SYBR GreenⅠ。37℃条件下实时收集荧光2小时。

哑铃型DNA探针的灵敏度检测

将T8哑铃型DNA探针分别与不同浓度的miRNA反应，检测时终浓度分别为0、400pM、600pM、800pM、1nM、1.2nM。每组制备25μL反应体系，包括1μL哑铃型DNA探针、2.5 μL 10×phi29DNA聚合酶反应缓冲液、0.5μL BSA，2.5μL miRNA(1nM),3μL dNTPs，0.5 μL phi29DNA聚合酶，15μL DEPC水，在37℃下反应两小时后，在65℃加热10分钟以终止反应。接下来将每个反应体系中加入8μL 25×SYBR GreenⅠ，并加水稀释到200μL。使用荧光仪检测荧光，激发波长为495nm，从505nm到600nm记录荧光发射光谱。

miRNA的定性分析和定量分析

将T8哑铃型DNA探针分别与不同浓度的miRNA反应，反应产物与分别连有FAM的DNA短链和连有TAMRA的DNA短链结合。每组制备25μL反应体系，包括1μL哑铃型密封探针、 2.5μL 10×phi29DNA聚合酶反应缓冲液、0.5μL BSA，2.5μL miRNA(1nM),3μL dNTPs， 0.5μLphi29DNA聚合酶，15μL DEPC水，在37℃下反应两小时后，在65℃加热10分钟以终止反应。反应产物中每组各加入0.5μL FAM标记的探针1(Probe1)和0.5μL TAMRA标记的探针2(Probe2)。反应30分钟后在荧光仪检测荧光。设置激发波长为495nm，从505nm 到620nm记录荧光光谱。

分析细胞中的miRNA

使用24孔板转染细胞，每孔操作如下：转染前24小时，在400μL无抗培养基中接种细胞，使转染时细胞融合度为50％。用50μL Opti-MEM稀释miRNA(转染细胞的终浓度为100nM)，用50μL Opti-MEM稀释1.0μL Lipofectamine^TM2000，并将这两种溶液混合。转染复合物加入到24孔细胞板中，100μL每孔，前后轻摇细胞板混合均匀。细胞板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时。

配制RIPA:RAPM为9:1的细胞裂解液，并向其中加入4μL的RNA酶抑制剂，混合均匀。向每孔细胞中加入200μL胰酶消化后，加入300μL培养液使细胞重悬。转移至离心管离心后弃培养液，每种细胞加入100μL含RNA酶抑制剂的细胞裂解液。4℃静置30分钟后，开始TIRCA过程。每组体系包括25μL细胞裂解物、1μL哑铃型密封探针、5μL 10×phi29DNA聚合酶反应缓冲液(500mM Tris-HCl，100mM MgCl₂，100mM(NH₄)₂SO₄，40mM DTT，pH 7.5，25℃)、0.5μL BSA(10mg/mL)，3μL dNTPs(每种dATP，dGTP，dCTP和dTTP为 10mM)，1μL phi29DNA聚合酶(10U/μL)，13μLDEPC水，在37℃下反应两小时后，在 65℃加热10分钟以终止反应。反应产物中每组各加入0.5μL FAM标记的探针1和0.5μL TAMRA标记的探针2。反应30分钟后在荧光仪检测荧光。设置激发波长为495nm，从505nm 到620nm记录荧光光谱。

实验过程中采用的序列如表1所示。

表1本实施例中采用的寡核苷酸序列

注：小写字母表示密封探针的前端序列。具有粗体和下划线的字母表示密封探针和miRNA 之间的错配碱基。小写字母“p”表示磷酸基团，“FAM”表示6-羧基荧光素，“TAMRA”表示羧基四甲基罗丹明。寡核苷酸以5'-3'的顺序给出。

结果与表征

本实施例的原理如图1所示，首先，设计可以识别待测靶标miRNA的哑铃型的密封探针作为TMSD的探针和后续RCA的模板。最初，闭合的密封探针保持稳定的哑铃型结构，当目标miRNA结合到toehold区域时，自发的分支迁移导致哑铃型密封探针转换为活化的环形，从而引发RCA，通过RCA过程扩增出数百个串联的重复的探针序列。该反应产物通过与分别用FAM(6-羧基荧光素)和TAMRA(羧基四甲基罗丹明)修饰的两条DNA探针结合，靠近的FAM与TAMRA会产生FRET。在体外实现了对目标miRNA的高灵敏检测。在细胞水平上，实现了对内皮细胞和巨噬细胞中转染靶标miRNA的检测。

本实施例中以mir494为例设计了Toehold的长度为6-10个碱基的哑铃型密封探针并进行筛选。最初，这些自互补的密封探针都呈哑铃型，不能引发RCA。仅具有比密封探针的打开过程更大的热力学能量变化的靶杂交可以将密封探针切换到活化的圆形形式从而引发 RCA。TIRCA反应的产物会形成大量的ssDNA和dsDNA，可以通过使用Sybr Green I染料嵌入dsDNA使荧光增强来检测TIRCA产物的多少，从而反应不同toehold长度密封探针的TIRCA速率。荧光增强倍数越大说明反应越容易进行，TIRCA速率越快。根据每种探针与错配单个碱基的miRNA(M1)反应后荧光增强倍数与每种探针与目标miRNA(miR494) 反应后荧光增强倍数的比值来选择合适的探针。比值越小，说明选择性越好；比值越大，说明荧光增强倍数越接近，选择性越差。

toehold长度为6～10个碱基的探针(T6～T10)分别与mir494反应后荧光强度与空白对照的增强倍数分别为15.85倍、23.47倍、28.11倍、28.69倍、31.37倍。检测结果如图2A所示， toehold的长度越长的密封探针在与mir494结合进行TIRCA过程后，产生的TIRCA产物越多， TIRCA过程更容易发生。而toehold的长度太短的哑铃型密封探针太稳定，即使目标miRNA 也不能高效的打开探针来引发RCA。这是由于toehold的长度越长的密封探针在TMSD介导的链置换过程更容易发生。实验结果中，T6～T10探针分别与错配单个碱基的miRNA反应后荧光强度与空白对照的增强倍数分别为1.34倍、2.80倍、1.81倍、16.23倍、23.03倍。图2B表明，toehold长度为6～8个碱基的探针与错配单个碱基的miRNA反应后的荧光强度显示较弱，而toehold长度为9个碱基和10个碱基的探针与错配单个碱基的miRNA反应后的荧光强度仍然较高。这说明toehold的长度过长的密封探针不够稳定，不能抵抗单个碱基错配的miRNA 的链迁移，TIRCA测定显示较低的选择性。每种探针与错配单个碱基的miRNA反应后的荧光增强倍数和每种探针与mir494反应后的荧光增强倍数的比值结果分别为8.45％、11.94％、 6.44％、56.57％、73.41％。图2C表明，toehold的长度为8个碱基的探针分别与错配单个碱基的miRNA和mir494反应后荧光增强倍数分别为1.91倍和28.11倍，比值仅为6.44％，比值最低，选择性最好。因此，toehold的长度为8个碱基(T8)的哑铃型密封探针可以高效的被mi494 打开来完成TIRCA，并且不能被错配单个碱基的miRNA打开。该探针显示出良好的选择性。

对选择出的T8哑铃型密封探针的选择性利用实时收集SYBR GreenⅠ的荧光的方法进行了验证。结果如图3所示，随时间的延长，探针与mir494反应的体系中荧光强度逐渐增强，后又趋于稳定；而探针与错配单个碱基和错配两个碱基的miRNA反应的这两组体系中，荧光强度无明显变化。这说明，在为时两小时的实时监测中，mi494可以与该密封探针发生良好的TIRCA过程产生大量的dsDNA，而错配单个碱基和错配两个碱基的miRNA不能使该密封探针打开不能完成TIRCA过程。因此，选择出的T8哑铃型密封探针有很好的选择性。

为了测定T8探针检测mir494的灵敏度，采用不同浓度的mir494与该密封探针进行TIRCA反应。图4显示了在0～1.2nM(0、400pM、600pM、800pM、1nM、1.2nM)的mir494 存在下收集的来自SYBR GreenⅠ的发射光谱。荧光强度随着mir494浓度从0到1.2nM的增加而增加。在mir494浓度为0、400pM、600pM、800pM、1nM、1.2nM时荧光强度分别增加了 16.44倍、101.70倍、146.61倍、176.72倍、215.48倍。此结果表明该探针具有很高的灵敏度。经计算，该探针的检测限为0.11pM。

为了实现对miRNA的定性检测和定量，将不同浓度的mir494与T8密封探针发生TIRCA 反应，反应产物与分别被FAM和TAMRA修饰的两种DNA探针结合，使两种荧光染料大量被连接到反应产物上并靠近。使用FAM的激发波长(494nm)，从505nm到620nm收集荧光。荧光检测结果，如图5A所示，在mir494浓度分别为400pM、1.2nM、2nM时，来自FAM 的在520nm处的荧光强度分别是空白对照组的3.90倍、5.68倍、6.76倍。图5B表明，荧光增强倍数随待测mir494浓度的增加荧光逐渐增加。这是因为在一定浓度范围内荧光聚集增强的效应，miRNA浓度越高，TIRCA产物越多，FAM的荧光聚集效果越强。在580nm处收集 TAMRA受到FRET后的荧光，经计算，在mir494浓度分别为400pM、1.2nM、2nM时荧光强度分别是空白对照组的3.53倍、4.96倍、6.20倍。使用TAMRA的激发波长(560nm)，收集570nm到620nm的荧光。来自TAMRA的在580nm处的荧光强度分别是空白对照组的2.78 倍、3.57倍、3.38倍。经计算，在mir494浓度分别为400pM、1.2nM、2nM时，TAMRA 受到FRET的效率(受到FRET后荧光增强倍数与560nm波长激发后荧光增强倍数的比值) 分别为1.27、1.39、1.83。图5C表明，随着mir494浓度的增加，TAMRA受到FRET的效率逐渐增加。FRET的产生不仅能够说明TIRCA过程顺利进行，还可以实现对miRNA的定性分析及定量分析。通常情况下，收集FRET荧光信号时，供体荧光团的荧光强度会随着反应物浓度的升高而逐渐减弱，受体荧光团的荧光强度随反应物浓度的升高而逐渐增强。而本实施例中，由于TIRCA产物使荧光团大量聚集，使得供体荧光团的荧光强度既受荧光聚集效应的影响又受FRET效果的影响，因此产生逐渐增强的趋势。因此，综合荧光聚集效应与FRET 的效果，可以更好的分析待测靶标miRNA的含量。

为了验证此方法是否能够实现对细胞裂解液中靶标miRNA的检测。本实施例将has-miR-494-5p mimics转染到内皮细胞和巨噬细胞中，使mir494在这两种细胞中过量表达。将细胞裂解液与T8哑铃型密封探针进行TIRCA反应3小时后，将反应产物与分别被FAM和TAMRA修饰的两种DNA探针结合。分别用494nm和560nm波长激发，并收集荧光。对于脐静脉内皮细胞，如图6A所示，FAM的荧光强度增强了6.98倍，TAMRA受到FRET后荧光增强倍数与560nm波长激发后荧光增强倍数分别为5.95倍、3.78倍，受到FRET的效率为1.57。对于巨噬细胞，如图6B所示，FAM的荧光强度增强了8.30倍，TAMRA受到FRET后荧光增强倍数与56 0nm波长激发后荧光增强倍数分别为5.10倍、3.34倍，受到FRET的效率为1.53。

该实施例实验过程设计的T8探针用于对细胞中目标miRNA的检测时，因整个反应过程无需复杂的程序，因此可直接检测细胞裂解液中的miRNA，减少了繁琐步骤对待测miRNA 的影响，使结果更准确。相比热循环扩增方法通常涉及使用热循环仪并受到外部驱动的熔化和再杂交的影响，该方法可以在简单的条件下实施。因TMSD过程的存在，相对于简单的 RCA或基于挂锁探针的RCA，该方法具有更高的特异性。并且扩增过程使信号放大，可以更容易的收集荧光信号。特别是在TIRCA产物上连接上分别被FAM和TAMRA荧光团修饰的两种DNA探针，使这两种荧光团靠近产生FRET，既可以验证TIRCA过程的成功进行和两种探针的成功连接到TIRCA产物上，又可以实现对目标miRNA的定性及定量分析。

本实施例提供的方法将TIRCA与FRET相结合，应用toehold介导的链置换(TMSD)通过设计结构可切换的密封探针来启动特定miRNA的滚环扩增，并将扩增产物结合上分别连有FAM和TAMRA两种荧光染料的DNA探针，利用两种荧光染料靠近产生FRET效果和荧光聚集效应，实现了对miRNA的定性分析。这种miRNA测定法，不仅可以验证TIRCA过程的顺利进行，还可以实现对目标miRNA的定性检测及定量检测。该方法具有许多优点：1)通过利用TMSD的精准序列识别，实现了不依赖于酶的对miRNA的特异性识别，具有很好的选择性；2)TIRCA过程可以将检测信号放大，使在检测低浓度的miRNA时可以很容易的收集检测信号；3)细胞中靶标检测时不涉及miRNA纯化或复杂的实验程序；4)可以实现对过程的验证、定性分析及定量分析。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 65

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

ggacaaccta caaatactga tgactatcta taaggttgtc cgtgttgtca cagagaagac 60

aacac 65

<210> 2

<211> 65

<212> DNA

<213> 引物

<400> 2

gacaacctac aaatactgat gacaatctat aaggttgtcc gtgttgtaac agagaagaca 60

acacg 65

<210> 3

<211> 65

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

gacaacctac aaatactgat gacaatctat aaggttgtcc gtgttgcaac agagaagaca 60

acacg 65

<210> 4

<211> 65

<212> DNA

<213> 引物

<400> 4

gacaacctac aaatactgat gacaatctat aaggttgtcc gtgttacaac agagaagaca 60

acacg 65

<210> 5

<211> 65

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

gacaacctac aaatactgat gacaatctat aaggttgtcc gtgtaacaac agagaagaca 60

acacg 65

<210> 6

<211> 11

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

atgacaatct a 11

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物

<400> 7

agagaagaca acacggacaa cct 23

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> Mir-494

<400> 8

agguuguccg uguugucuuc ucu 23

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> 引物

<400> 9

agguuguccg uguuguauuc ucu 23

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 引物

<400> 10

agguuguccg uuuuaucuuc ucu 23

Claims

1.一种miRNA的检测方法，其特征是，利用toehold介导的链置换反应引发待测miRNA进行滚环扩增反应，利用滚环扩增反应的DNA单链、含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针实现荧光共振能量转移的检测。

2.一种基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的引物组，其特征是，包括哑铃型DNA探针、含有供体荧光基团的DNA单链探针、含有受体荧光基团的DNA单链探针；

3.如权利要求2所述的引物组，其特征是，toehold序列长度为具有8个碱基的序列。

4.如权利要求2所述的引物组，其特征是，所述供体荧光基团为羧基四甲基罗丹明，所述受体荧光基团为6-羧基荧光素。

5.如权利要求2所述的引物组，其特征是，所述哑铃型DNA探针从5'端到3'端的DNA序列为：

GACAACCTACAAATACTGATGACAATCTATAAGGTTGTCCGTGTTGCAACAGAGAAGACAACACG；

含有受体荧光基团的DNA单链探针的DNA序列为：ATGACAATCTA；

含有供体荧光基团的DNA单链探针的DNA序列为：

AGAGAAGACAACACGGACAACCT。

6.一种miRNA的检测试剂盒，其特征是，包括权利要求2～5任一所述的引物组、DNA聚合酶、DNA聚合酶反应缓冲液、BSA、dNTPs。

7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征是，所述DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶。

8.基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法，其特征是，采用权利要求2～5任一所述的引物组或权利要求6～7任一所述的试剂盒，其过程包括：

9.如权利要求8所述的方法，其特征是，反应终止的步骤为：加热至60～70℃反应。

10.如权利要求8所述的方法，其特征是，向链状DNA单链中添加DNA连接酶及DNA连接酶反应缓冲液，在20～25℃进行反应，终止反应后获得哑铃型DNA探针。