CN113862337B - 一种基于冻融循环提高dna链置换反应速率的调控方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于冻融循环提高DNA链置换反应速率的调控方法，通过液氮冷冻，为DNA链置换反应运行提供区室化结构；解冻使得DNA和溶质含量的急剧下降，破坏了活性和非生产性复合物之间的平衡；冻融循环允许DNA链置换反应反复重启，加速驱动DNA链置换反应的运行。在底物链上修饰荧光基团，通过荧光强度监测反应的动力学以及产率。本发明具有普遍适用性，操作简便性的优点，在DNA编程复杂生物系统的分子行为、实现快速响应领域具有极大的应用潜力。

Description

一种基于冻融循环提高DNA链置换反应速率的调控方法

技术领域

本发明属于核酸分子纳米技术领域，涉及核酸分子链置换反应速率调控，特别涉及到一种基于冻融循环加快DNA链置换的方法及应用。

背景技术

核酸分子(或DNA)纳米技术使用核酸分子构筑了各种分子工具以及分子装置，在分子载药、吸纳后传递、信息加密等领域都具有广泛的应用。核酸分子具有精确的碱基配对特性，允许合理的碱基链设计，使其成为高度可编程的生物分子，这使得构建复杂的核酸分子电路并且应用于复杂体系成为可能。加速核酸分子相互作用有望实现可编程多功能性核酸分子纳米装置的实际应用，极大推进核酸分子纳米技术的发展。

DNA链置换是核酸纳米技术的重要部分，其利用核酸分子单链间严格的碱基互补配对得到预杂交链，然后与进攻链反应，进而释放核酸单链产物。因其反应进程的可编程性以及动力学特征的可预测性等优点使得核酸分子链置换技术在构建一系列纳米功能装置方面展现出巨大的优势。迄今为止，基于DNA链置换已经开发出用于多种目的的核酸分子电路。特别地，基于扩散的核酸分子电路已经取得了可观的进步。但是核酸分子电路执行速度是阻碍其在生物应用中的可扩展性和可用性的主要障碍。而DNA链置换的加速对于功能性核酸分子纳米器件的实际应用的构建至关重要。因此，丰富加速策略以实现DNA链置换加速对于全面发展核酸分子纳米技术的潜力至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于冻融循环加快DNA链置换的方法，即一种基于冻融循环提高DNA链置换反应速率的调控方法，先通过液氮冷冻，为DNA链置换反应提供区室化结构；再解冻使得DNA和溶质含量的急剧下降，以破坏了活性和非生产性复合物之间的平衡；经多次冷冻--解冻的冻融循环，允许DNA链置换反应反复重启，加速驱动反应的运行，实现DNA链置换反应速率的提高。与现有调控方法不同的是，本发明无须使用生物酶或者构建另外的反应支架，仅通过对体系进行冻融循环，调控核酸分子的局部浓度，进而反复推动核酸分子链置换反应重启，进而实现DNA链置换的加速。

本发明实现基于冻融循环加快DNA链置换机理如图1所示：

液氮冷冻触发冰晶增长，为核酸分子链置换反应运行提供区室化结构，将溶质局域在间质液中，DNA和溶质浓度急剧增加；继而解冻使得DNA和溶质含量的急剧下降，破坏了活性和非生产性复合物之间的平衡。冻融循环允许DNA链置换反复重启，加速驱动反应的运行。

本发明提出的基于冻融循环提高DNA链置换反应效率的调控方法，包括以下步骤：

(1)根据沃森-克里克碱基互补配对原则，设计对应核酸分子链(A,I,C)的序列，完成核酸分子链的合成；

本发明中，可以利用Nupack软件设计核酸分子链的序列，也可以用其他常用软件。

本发明适用于所有DNA链置换反应，不限于以下表1中的核酸分子链序列。

在一具体实施方案中，核酸分子链(A,I,C)序列分别如下表1所示的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，均从5’端开始：

表1：

I	TGATGGAGTAGGAAGAGAAGAGAAGA	SEQ ID NO.1
			C	GGAGTAGGAAGAGAAGAGAAGA-FAM	SEQ ID NO.2
A	BHQ1-TCTTCTCTTCTCTTCCTACTCCATCA	SEQ ID NO.3

(2)将合成的核酸分子链溶解于三羟甲基氨基甲烷(tris)-盐酸(HCl)缓冲溶液中，该缓冲液的pH为8。置于4℃冰箱储存备用。DNA链置换需要配置的缓冲溶液pH＝8，保持DNA本身结构的稳定性。

(3)将经步骤(2)分别得到的含核酸分子链A的溶液和含核酸分子链C链的溶液进行混合，所用缓冲溶液为pH＝8的tris-HCl缓冲溶液，经过PCR仪进行退火(从95℃梯度降温至25℃)形成含底物链D的溶液；

优选地，含核酸分子链A的溶液和含核酸分子链C链的溶液按1:1的摩尔比例进行混合。

(4)将经步骤(3)得到的含底物链D的溶液与对应的进攻链I即含核酸分子链I的溶液进行混合，在pH＝8tris-HCl缓冲溶液中；

优选地，含底物链D的溶液与对应的进攻链I即含核酸分子链I的溶液按1:1的摩尔比例进行混合；

(5)将经步骤(4)得到的混合溶液置于液氮冷冻1min之后，37℃水浴5min解冻；

液氮冷冻1min的目的是为了让溶液完全成固态，而没有过冷液这种状态则影响浓缩效果。37℃解冻5min，既保证解冻成完全的液态，破坏了活性和非生产性复合物之间的平衡；且37℃对DNA链的稳定性没有影响。

(6)重复步骤(5)；即，将所述混合溶液置于冷冻-解冻的反复循环下。

所述步骤(6)中冻融循环中，可多次重复步骤(5)，利用反复冻融循环加快DNA链置换反应速度。冻融循环多次，如1-9次。在具体实施方案中，用3次冻融循环可以提高DNA链置换反应的速率。通过1次冻融循环也可以加速。对冻融循环次数的增加反应逐步趋向热力学平衡的状态。本发明实验中进行了1-9次冻融循环，通过1-9次反复冻融循环的实例，体现DNA链置换反应速率的提高是和冻融循环次数呈现正相关的关系。

本发明调控方法进一步包括步骤(7)以验证实验结果的实现：(7)用荧光光谱仪收集荧光信号，实现DNA链置换运行的监测。

本发明还提出了所述调控方法在用于核酸分子逻辑电路、神经网络的加速中的应用。现有技术中目前的核酸分子逻辑电路以及神经网络大多都是以DNA链置换反应为基础进行构建，但是，核酸分子电路运行速度是阻碍其在生物领域可用性和可扩展性的主要障碍。本发明提出的实现以冻融循环策略加速DNA链置换反应，并且该策略是具有普适性的。进一步可以通过冻融循环加速核酸分子逻辑电路、神经网络。

本发明通过液氮冷冻DNA链置换反应底物为DNA电路运行提供区室化结构；解冻使得DNA和溶质含量的急剧下降，破坏了活性和非生产性复合物之间的平衡；冻融循环允许DNA电路反复重启，加速驱动DNA电路的运行。在底物链上修饰荧光基团，通过荧光强度监测反应的动力学以及产率。本发明所提出的基于冻融循环加快DNA链置换的方法，无须使用复杂昂贵的生物酶，极大加快了核酸分子链置换速率，可应用于核酸分子逻辑电路以及更为复杂的神经网络的加速。本发明具有普遍适用性，操作简便性的优点，在DNA编程复杂生物系统的分子行为、实现快速响应领域具有极大的应用潜力。

附图说明

图1是本发明实现基于冻融循环加快DNA链置换的机理图。

图2是本发明实施例1中，体系中没有冻融循环，以及3次冻融循环条件下，DNA链置换反应速率的荧光动力学曲线图。

图3是本发明实施例2中，体系中循环不同次数冻融反应，DNA链置换反应速率的荧光输出柱状图。

具体实施方式

结合以下附图对实施例进行阐述。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：体系中常温反应及重复3次冻融循环情况下，DNA链置换反应速率的荧光动力学研究

(1)用Tris-HCl缓冲溶液分别配置核酸分子链(A,C,I)储备液100μM，此处所用缓冲溶液均为pH＝8.00，将其放入冰箱中备用，其中A链3’端修饰了荧光基团，C链5’端修饰了对应的猝灭基团。

(2)从100μM储备液中取出核酸分子链A(20μL)、C(20μL)加入Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.00)60μL混匀得100μL溶液，放入PCR仪中进行退火(从95℃梯度降温至25℃)。得浓度为20μM的底物链D链，并将退火所得产物放于冰箱中备用。且为防止荧光基团淬灭，实验过程中注意避光操作。

(3)取I储备液中取2μL，并加入8μL Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.00)，得到浓度为20μM的进攻链；

(4)25℃常温条件下的链置换反应：取两个离心管，向其中加入995μL pH为8的Tris-HCl缓冲溶液以及2.5μL底物链D，混合均匀后加入比色皿中，并测定其荧光强度，待其荧光强度值基本趋于稳定，向其中一个离心管中加入2.5μL进攻链I(20μM)，快速加入并充分混合均匀，继续监测其荧光强度。

(5)冻融循环条件下的链置换反应：取两个冻存管，向其中一管加入995μLpH为8的Tris-HCl缓冲溶液以及2.5μL底物链D以及2.5μL进攻链I；另一管加入995μLpH为8的Tris-HCl缓冲溶液以及2.5μL底物链D混合均匀后，在液氮环境下反应1min，然后在37℃水浴5min，重复3次冻融循环操作。

(6)第3次水浴结束之后，将溶液加入比色皿中，并测定其荧光强度。

(7)通过对比，3次冻融循环得到的链置换反应产物与常温25℃反应50min的效果相当。如图2所示。

实施例2：体系进行不同次数的冻融循环操作，DNA链置换反应速率的研究

(1)用Tris-HCl缓冲溶液分别配制核酸分子链(A,C,I)储备液100μM，此处所用缓冲溶液均为pH＝8.00，将其放入冰箱中备用。

(2)从100μM储备液中取出核酸分子链A(20μL)、C(20μL)加入Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.00)60μL混匀得100μL溶液，放入PCR仪中进行退火(从95℃梯度降温至25℃)。得浓度为20μM的底物链，并将退火所得产物放于冰箱中备用。且为防止荧光基团淬灭，实验过程中注意避光操作。

(3)取I储备液中取5μL，并加入20μL Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.00)，得到浓度为20μM的进攻链；

(4)取9个冻存管，分别向其中加入995μLpH为8的Tris-HCl缓冲溶液，2.5μL底物链D以及2.5μL进攻链I，混合均匀。在液氮环境下反应1min，然后在37℃水浴5min，对9个冻存管分别重复1～9次冻融循环操作。

(5)对应次数冻融循环结束之后，监测其荧光强度。如图3所示。

(6)荧光监测显示，随着冻融循环次数增加，反应逐步趋向热力学平衡状态。

以上本发明实施例1、2中，所用的序列如表1所示，从5’端开始。

表1：

I	TGATGGAGTAGGAAGAGAAGAGAAGA	SEQ ID NO.1
			C	GGAGTAGGAAGAGAAGAGAAGA-FAM	SEQ ID NO.2
A	BHQ1-TCTTCTCTTCTCTTCCTACTCCATCA	SEQ ID NO.3

C链3’端由荧光基团FAM修饰。

A链5’端由猝灭基团BHQ1修饰。

通过退火过程，C链的荧光被A链猝灭，形成稳定的二链体D；当输入链I通过toehold介导的链置换反应与D链发生反应之后，带有荧光基团的C链被重新释放，以荧光信号形式进行表达；因此，通过荧光信号的监测，来反映DNA链置换反应的进程。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 一种基于冻融循环提高DNA链置换反应速率的调控方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgatggagta ggaagagaag agaaga 26

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggagtaggaa gagaagagaa ga 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcttctcttc tcttcctact ccatca 26

Claims (5)

1.一种基于冻融循环提高DNA链置换反应速率的调控方法，其特征在于，所述方法中，先通过液氮冷冻，为DNA链置换反应运行提供区室化结构；再解冻使得DNA和溶质含量的急剧下降，破坏活性和非生产性复合物之间的平衡；经多次的冷冻--解冻的冻融循环，允许DNA链置换反复重启，加速驱动反应的运行，实现DNA链置换反应速率的提高；

所述方法包括以下步骤：

(1)根据沃森-克里克碱基互补配对原则分别设计对应的核酸分子链A、I、C的序列；

所述核酸分子链I、C、A的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

(2)将所述核酸分子链A、I、C分别溶解于pH＝8的tris-HCl缓冲溶液中，分别得到含核酸分子链A的溶液、含核酸分子链I的溶液、含核酸分子链C的溶液，然后在4℃下储存备用；

(3)将所述步骤(2)得到的含核酸分子链A的溶液、含核酸分子链C链的溶液混合；经过PCR仪进行退火形成含底物链D的溶液；将含核酸分子链A的溶液、含核酸分子链C链的溶液按1:1的摩尔比例进行混合；

(4)在pH＝8的tris-HCl缓冲溶液中将所述含底物链D的溶液与所述步骤(2)得到的含核酸分子链I的溶液混合；将所述含底物链D的溶液与所述含核酸分子链I的溶液按1:1的摩尔比例进行混合

(5)将所述步骤(4)得到的混合溶液置于液氮冷冻1min之后再37℃水浴5min解冻；

(6)重复1-9次所述步骤(5)，经1-9次冻融循环，实现DNA链置换反应速率的提高。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤(7)：

(7)用荧光光谱仪收集荧光信号，完成核酸分子链置换反应的监测。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中利用Nupack软件设计核酸分子链序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)反复冻融循环加快DNA链置换反应速度。

5.如权利要求1所述的调控方法在用于核酸分子逻辑电路、神经网络的加速中的应用。