KR20240039167A - 인덱스 스플린트 올리고를 사용하는 결찰에 의한 긴 핵산의 조립 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 인덱스 스플린트(indexed splint) 올리고뉴클레오타이드 분자에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 분자를 효소적으로 결찰시킴으로써 긴 핵산을 조립하는 방법에 관한 것이다. 또한 상기 개시된 방법을 수행하는데 유용한 인덱스 스플린트 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 구조물을 개시한다. 본 발명의 키트는 개시된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 라이브러리를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오타이드를 고도로 특이적인 순서로 결합시켜 선택된 원하는 결찰 생성물을 구성한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2021년 8월 2일에 출원된 미국 가출원 제63/228,448호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 분자생물학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 긴 핵산, 특히 긴 DNA 라이브러리를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
DNA 라이브러리는 생물학 연구는 물론 신약 발견 등 광범위한 응용 분야에 사용된다. 현재 DNA 라이브러리는 가장 흔히, 고체 표면에서 대규모 병렬 방식에 의해 또는 개별적으로 화학적으로 합성된 올리고를 모으는, 올리고뉴클레오타이드("올리고")의 화학적 합성에 의해 생성된다. 이러한 접근법의 주요 한계 중 하나는 단쇄 화학 합성에 의해 만들 수 있는 DNA 분자의 길이이다. 현재 시판되는 가장 긴 올리고 라이브러리의 최대 길이는 350개 뉴클레오타이드이다. 그러나 유전자 합성, 단백질 공학, 게놈 공학, 돌연변이 포화 스캐닝과 같은 많은 연구 응용 분야에서는 더 긴 DNA 라이브러리가 도움이 될 것이다.
더 긴 길이의 라이브러리를 생성시키는 한 가지 접근 방식은 2개 이상의 화학적으로 합성된 올리고를 더 긴 작제물로 연결하는 DNA 리가제의 작용을 통해 라이브러리 구성원을 효소적으로 조립하는 것이다. 당해 분야에 공지된 방법은 미리 결정된 순서로 서열을 연결하기 위해 서열의 특정 어닐링을 달성하기 위해서, 특정 이중-가닥 서열에 대한 단일-가닥의 양립성 오버행에 의존한다. 예를 들어, 미국특허 제6,495,318호를 참조하시오. '318 특허는 또한 각 조각에 상보적인 영역을 갖는 단일 스플린트 올리고에 하이브리드화되는 말단 단일-가닥 부분을 갖는 2개의 특정 서열을 개시하고 있다. 이상적인 조건 하에서, 올리고는 스플린트에 적절하게 하이브리드화하고 리가제는 두 조각을 결합시켜 보다 긴 작제물을 형성시킨다. 이와 유사한 방법은 현재 다양한 연구 그룹에서 혼합된 성공을 거두고 있다. 이 방법의 주요 단점은 하이브리드화 특이성으로 인해 라이브러리 품질이 저하될 수 있다는 것이다.
긴 올리고의 효소적 조립을 위한 대체 방법은 결찰 전에 작제물을 공간적으로 분리하기 위해 라이브러리 조각을 고체 표면 DNA 어레이에 하이브리드화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 미국특허 제10,538,796호를 참조하시오.
일부 양태에서, 본 발명은 관심 서열에 대해 높은 특이성으로 용액 중에서 실행될 수 있는 방법에 대한 필요성을 다룬다.
도 1은 올리고뉴클레오타이드를 다성분 DNA 작제물로 조립하기 위한 올리고뉴클레오타이드 구조의 한 유형을 묘사한다. 올리고 뉴클레오타이드 구조는 각 올리고뉴클레오타이드 조각에 상보적인 인접한 서열 영역을 갖는 단일 스플린트 올리고뉴클레오타이드(스플린트)에 하이브리드화된 2개의 올리고뉴클레오타이드 조각((1)은 상류 조립 성분인 조립 성분(1)이고, (2)는 하류 조립 성분인 조립 성분(2)이다)으로 이루어진다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분(1)과 (2)의 접합점이다.
도 2는 올리고뉴클레오타이드를 다성분 DNA 작제물로 조립하기 위한 또 다른 유형의 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 올리고뉴클레오타이드 구조는 인덱스 스플린트 구조에 하이브리드화된 2개의 올리고뉴클레오타이드 조각(조립 성분(1) 및 조립 성분(2))으로 이루어진다. 인덱스 스플린트 구조에는 한 쌍의 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원이 있다. 상기 쌍의 각 구성원은 다른 구성원의 다른 인덱스 서열과 하이브리드화되어 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스)를 형성하는 인덱스 서열을 가지며, 따라서 이는 두 조립 성분을 서로 근접하게 만드는 역할을 한다. 하나의 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 스플린트 서열 영역(L-스플린트)을 갖는다. 다른 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은 조립 성분(1)의 3' 말단 부분 및 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 부분에 상보적인 스플린트 서열 영역(R-스플린트)을 갖는다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다.
도 3은 올리고뉴클레오타이드를 다성분 DNA 작제물로 조립하기 위한 또 다른 유형의 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 올리고뉴클레오타이드 구조는 도 2의 구조와 유사하게, 인덱스 스플린트 구조에 하이브리드화된 2개의 올리고뉴클레오타이드 조각(조립 성분(1) 및 조립 성분(2))으로 이루어진다. 인덱스 스플린트 구조에는 한 쌍의 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원이 있다. 상기 쌍의 각 구성원은 다른 구성원의 다른 인덱스 서열에 하이브리드화하여 이중-가닥 인덱스 요소를 형성하는 인덱스 서열을 갖는다. 이 구조에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은, 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 근접하지 않아 조립 성분(1)의 루핑된(looped) 부분을 초래하는, 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 스플린트 서열 영역(L-스플린트)을 갖는다. 다른 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은 조립 성분(1)의 3' 말단 부분 및 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 부분에 상보적인 스플린트 서열 영역(R-스플린트)을 갖는다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다.
도 4는 올리고뉴클레오타이드를 다성분 DNA 작제물로 조립하기 위한 또 다른 유형의 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 올리고 뉴클레오타이드 구조는 단일 인덱스 스플린트 분자에 하이브리드화된 2개의 올리고뉴클레오타이드 조각(조립 성분(1) 및 조립 성분(2))으로 이루어진다. 이 구조에서, 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드는 조립 서열의 5'에 5' 인덱스 서열을 갖는다. 상기 인덱스 서열은 인덱스 스플린트 분자의 인덱스 서열에 하이브리드화하여 이중-가닥 인덱스 요소를 형성한다. 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에서 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 서열에, 및 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부 부분에 상보적인 서열 영역(R-스플린트)을 가지며, 그 결과 조립 성분(1)의 루핑을 생성시킨다(도 3과 다소 유사). 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다.
도 5a 내지 5c는 올리고뉴클레오타이드를 다성분 DNA 작제물로 조립하기 위한 또 다른 유형의 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 올리고뉴클레오타이드 구조는 2개의 올리고뉴클레오타이드 조각(조립 성분(1) 및 조립 성분(2))에 하이브리드화된 인덱스 스플린트 분자(도 5a 묘사됨)를 포함한다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 점선은 선택적 스페이서 서열을 나타낸다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 이러한 유형의 올리고뉴클레오타이드 구조에서, 인덱스 스플린트 분자는 스플린트 서열(스플린트) 및 2개의 인덱스 서열(A) 및 (B)(인덱스 서열(B) 및 인덱스 서열(A))를 포함한다. 인덱스 스플린트 분자의 2개의 인덱스 서열은 스플린트 서열 측면에 위치하며, 이때 스페이서 서열 스페이서(1) 및 스페이서(2)(점선)가 사이에 있다. 스플린트 서열에는 스플린트 확대도에 묘사된 대로 5' 요소 및 3' 요소가 있다. 스플린트 서열의 5' 요소는 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화한다. 스플린트 서열의 3' 요소는 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화한다. 인덱스 스플린트 분자의 하나의 인덱스 서열은 하나의 조립 성분 올리고뉴클레오타이드의 말단에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화한다. 인덱스 스플린트 분자의 다른 인덱스 서열은 다른 조립 성분 올리고뉴클레오타이드의 말단에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화한다. 도 5a 및 5b는 인덱스 스플린트 분자가 올리고뉴클레오타이드 구조의 2개의 조립 성분과 결합하는 두 가지 예시적인 배향을 예시한다. 도 5b는 인덱스 요소(인덱스(2))가, 인덱스 서열(A)(인덱스 스플린트 분자의 5' 단부에 있는 인덱스 서열)의 조립 성분(2)의 3' 단부에 있는 인덱스 서열에의 하이브리드화에 의해 형성되는 배향을 묘사한다. 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스(1))는 조립 성분(1)의 5' 단부에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화된 인덱스 서열(B)(인덱스 스플린트 분자의 3' 단부에 있는 인덱스 서열)에 의해 형성된다. 스플린트 서열의 5' 요소는 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화한다. 스플린트 서열의 3' 요소는 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화한다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다. 도 5c는 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스(1))가, 인덱스 서열(A)(인덱스 스플린트 분자의 5' 단부에 있는 인덱스 서열)의 조립 성분(1)의 5' 단부에 있는 인덱스 서열(분절(C))에의 하이브리드화에 의해 형성되는 두 번째 배향을 묘사한다. 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스(2))는 조립 성분(1)의 3' 단부에 있는 인덱스 서열(분절(F))에 하이브리드화된 인덱스 서열(B)(인덱스 스플린트 분자의 3' 단부에 있는 인덱스 서열)에 의해 형성된다. 스플린트 서열의 5' 요소는 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화한다. 스플린트 서열의 3' 요소는 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화한다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다.
도 6은 올리고뉴클레오타이드 구조가, 스플린트에 하이브리드화되지 않는 조립 서열의 영역에 하이브리드화될 수 있는 적어도 하나의 차단 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 차단제(1))를 포함하는 도 2의 변형을 예시한다. 2개의 차단 올리고뉴클레오타이드(차단제(1) 및 차단제(2))가 도 6에 묘사되어 있다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다. 하나 이상의 차단 뉴클레오타이드가 도 5b 및 5c의 올리고뉴클레오타이드 구조에 활용될 수 있다.
도 7은 4-부분 조립 과정의 첫 번째 결찰 단계에서 결찰될 2개의 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. (또한 도 8 및 9를 참조하시오). 첫 번째 결찰 단계는 2-부분 조립과 유사한 기전으로 조립 성분(1+2)(상부 구조)와 조립 성분(3+4)(하단 구조)를 별도의 반응으로 조립한다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 각 올리고뉴클레오타이드 구조의 의도된 결찰 지점이 표시되어 있다. 제1 스플린트 구조(스플린트(1)) 외에도, 상부 올리고뉴클레오타이드 구조의 인덱스 스플린트는 스페이서 섹션의 제2 스플린트 서열(스플린트(2)), 및 5' 인덱스 서열(인덱스(2))과 제1 스플린트 구조(스플린트(1)) 사이의 또 다른 인덱스 서열(인덱스(3))을 포함한다. 하부 올리고뉴클레오타이드 구조의 인덱스 스플린트는 제1 스플린트 구조(스플린트(3))와 5' 인덱스 서열(인덱스(4)) 사이에 인덱스(3)의 상보적 서열(인덱스(3) 보체)을 포함한다.
도 8은 4-부분 조립 과정의 다음 단계를 묘사한다. 도 7에 묘사된 조립 단계의 결찰 생성물이 도 8에 예시된다. 결찰은 2개의 다성분 결찰 생성물인 조립 생성물(1-2)((a)에 묘사됨) 및 조립 생성물(3-4)((c)에 묘사됨)을 생성시킨다. 인덱스 서열과, 조립된 생성물(1-2) 및 조립된 생성물(3-4)에 대한 조립 성분 사이에 위치한 IIS형 제한 효소 절단 부위(RE 절단 부위)가 또한 묘사되어 있다. 도 7에 묘사된 조립 단계의 결찰 생성물에 각각 IIS형 제한 효소에 의한 절단이 가해져, RE 절단 부위에서 절단된다(도 7에 도시되지 않음). (a)의 결찰 생성물에서, 절단은 인덱스(2)를 제거하여 (b)에 예시된 바와 같이, 조립된 생성물(1-2)의 3' 단부에 오직 조립 성분 서열만을 남긴다. (c)의 결찰 생성물에서, 절단은 인덱스(4)를 제거하여 (d)에 예시된 바와 같이, 조립된 생성물(3-4)의 5' 단부에 조립 성분 서열만을 남긴다. 생성된 생성물은 예를 들어 SPRI 정제에 의해 정제된다.
도 9는 4-부분 조립 과정의 두 번째 결찰 단계를 묘사한다. 이어서 제한 절단의 정제된 생성물(도 8의 (b) 및 (d)를 참조하시오)은 도식 이미지에 묘사된 바와 같이 함께 하이브리드화되고(인덱스(3)을 참조하시오) 결찰되어 조립된 생성물(1-2-3-4)을 생성시킨다. 이 생성물은 예를 들어 SPRI를 통해 정제될 수 있으며, 추가 결찰이 가해지거나 PCR을 통해 증폭될 수 있다. 예를 들어, 프라이머 서열이 인덱스(1)과 조립 성분(1)의 조립 서열 사이(순방향 프라이머), 및 인덱스(5)와 조립 성분(4)의 조립 서열 사이(역방향 프라이머)에 존재할 수 있다.
도 10 내지 13은 개시된 방법의 변형 양태를 함께 개략적으로 예시한다. 도 10은 2개의 조립 성분의 인덱스 서열이 이중-가닥 인덱스(1) 및 인덱스(2)를 형성하는 2개의 인덱스 서열에 하이브리드화하는 단일 스플린트("인덱스 스플린트")에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오타이드 구조를 예시한다.
도 11은 도 10의 올리고뉴클레오타이드 구조의 결찰 생성물을 묘사한다. 도 11은 또한 인덱스 스플린트가 고체 지지체 또는 인덱스 어레이에의 부착을 위해 비오틴화되는 선택적 양태를 예시한다.
도 12a 및 12b는 제2 스플린트 분자("작제물 스플린트)가 조립 성분의 3' 및 5' 단부에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 도 12a는 인덱스 스플린트가 스페이서("선택적 테더")를 통해 작제물 스플린트에 연결된 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 이는 5'에서 3'으로, 제1 인덱스 서열(올리고(1)의 5' 단부에서 인덱스와 결합하여 인덱스(1)을 형성한다); 제2 인덱스 서열(올리고(2)의 3' 단부에서 인덱스와 결합하여 인덱스(2)를 형성한다); 스페이서(선택적 테더); 5' 요소가 5' 단부 올리고(2)에 하이브리드화하고 3' 요소가 올리고 가닥(1)의 3' 단부에 하이브리드화하는 스플린트를 포함하는 청구된 인덱스 스플린트 분자의 또 다른 실시양태를 나타낸다. 도 12b는 인덱스 스프린트에 연결되지 않은 제2 스플린트 분자("작제물 스플린트")가 조립 성분의 3' 및 5' 단부에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 인덱스 스플린트가 고체 지지체 또는 인덱스 어레이에의 부착을 위해 비오틴화되는 선택적 양태도 또한 묘사되어 있다.
도 13은 도 12b의 결찰 생성물을 도시한다. 도 13은 또한 결찰 생성물의 조립 성분에 대한 선택적인 추가의 구조적 특징을 도시한다. 선택적 제한 효소 부위가 인덱스 스플린트의 5' 단부에 표시되어 있다. PBS(1) 및 BPS(1)은 조립 생성물 증폭에 유용한 (선택적) 프라이머 결합 부위를 나타낸다.
도 14는 도 1, 2 및 3에 예시된 올리고뉴클레오타이드 구조(각각 추가로 조립 성분(1) 및 조립 성분(2)를 포함한다)에 묘사된 바와 같은 세 가지 유형의 시험 스플린트 분자를 사용하여 저-상동성 라이브러리의 용액 조립을 평가하는 실험에 대한 데이터 그래프를 묘사한다. 각 유형의 시험 스플린트 분자에 대해 스플린트 대 작제물의 3개의 비(1:1, 2:1 및 4:1)가 시험되었다. 도 2 및 3의 시험 스플린트 분자가 3개의 뉴클레오타이드(nt) 기둥(stilt)과 함께(+) 및 상기 기둥 없이(-) 제조되었다. 조립된 작제물은 PCR-증폭된 조립 작제물의 차세대 서열분석(NGS)에 의해 특성화되었다. 그래프의 Y-축은 15개 세트 각각에서 올바르게 조립된 작제물에 대한 평균 판독 수이다. 보다 상세한 내용은 실시예 1을 참조하시오.
도 15는 도 5b의 시험 스플린트 분자(상부 패널)의 개략도 및 개념 증명 실험으로부터의 데이터(하부 패널)를 묘사한다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 프라이머(F) - PCR에 대한 순방향 프라이머의 위치. 프라이머(R) - PCR에 대한 역방향 프라이머의 위치. Tm은 왼쪽 및 오른쪽 작제물 올리고뉴클레오타이드(각각 조립 성분(1) 및 조립 성분(2))에 하이브리드화된 스플린트의 각 섹션의 용융 온도(즉, 5' 요소 및 3' 요소의 용융 온도)이다. BC(1) 및 BC(2)는 쌍을 이루는 바코드 서열의 위치를 나타낸다. 인덱스(1) 및 인덱스(2)는 올리고뉴클레오타이드 구조의 인덱스 요소를 나타낸다. 인덱스 스플린트 분자의 인덱스 서열과 스플린트 서열 사이의 점선은 스페이서 서열(이는 이 시험에서 20-염기 폴리T 뉴클레오타이드 서열이다)을 나타낸다. 보다 상세한 내용은 실시예 2를 참조하시오.
도 16은 세 가지 유형의 전형적인 올리고 라이브러리를 개략적으로 예시한다. 실선 상자는 조립된 작제물의 측면에 위치한 고유 바코드를 나타낸다.
도 17은 세 가지 유형의 전형적인 올리고 라이브러리(도 16을 참조하시오)에서 세 가지 유형의 시험 스플린트 분자(도 1, 2 및 5B의 올리고뉴클레오타이드 구조를 참조하시오)를 활용하는 조립 시험을 위한 전형적인 데이터를 묘사한다. 보다 상세한 내용은 실시예 3을 참조하시오.
도 18은 시험 스플린트 분자(도 5b의 올리고뉴클레오타이드 구조)의 개략도 및 다양한 스플린트 길이 및 결찰 온도와 함께 이를 사용한 조립에 대한 전형적인 데이터를 묘사한다. 실험에서, 스플린트-작제물 하이브리드화된 요소(5' 요소 및 3' 요소) 각각에 대한 용융 온도(Tm) 범위를 설계하고 8개의 상이한 온도에서 결찰을 시험하였다. 65.9℃ 결찰 데이터에 대한 중앙 판독 수에 대한 데이터가 그래프에 묘사되어 있다. 각 스플린트 온도에 대해서, 올바른 판독 및 잘못된 판독의 분율이 중앙 판독 수로 표시된다. 보다 상세한 내용은 실시예 4를 참조하시오.
임의의 도면 또는 명세서에서 "절반"의 사용, 예를 들어 "왼쪽 절반 작제물"은 제한하려는 의도가 아니다. 예를 들어, "왼쪽 절반 작제물" 및 "오른쪽 절반 작제물"은 조립 성분(1)과 조립 성분(2)의 길이가 동일함을 나타내기 위한 것이 아니다. 작제물 성분의 크기는 다를 수 있다. 이러한 맥락에서 "절반"은 "부분", "일부" 또는 "올리고뉴클레오타이드 분자"에 필적한다.
도 2는 올리고뉴클레오타이드를 다성분 DNA 작제물로 조립하기 위한 또 다른 유형의 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 올리고뉴클레오타이드 구조는 인덱스 스플린트 구조에 하이브리드화된 2개의 올리고뉴클레오타이드 조각(조립 성분(1) 및 조립 성분(2))으로 이루어진다. 인덱스 스플린트 구조에는 한 쌍의 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원이 있다. 상기 쌍의 각 구성원은 다른 구성원의 다른 인덱스 서열과 하이브리드화되어 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스)를 형성하는 인덱스 서열을 가지며, 따라서 이는 두 조립 성분을 서로 근접하게 만드는 역할을 한다. 하나의 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 스플린트 서열 영역(L-스플린트)을 갖는다. 다른 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은 조립 성분(1)의 3' 말단 부분 및 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 부분에 상보적인 스플린트 서열 영역(R-스플린트)을 갖는다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다.
도 3은 올리고뉴클레오타이드를 다성분 DNA 작제물로 조립하기 위한 또 다른 유형의 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 올리고뉴클레오타이드 구조는 도 2의 구조와 유사하게, 인덱스 스플린트 구조에 하이브리드화된 2개의 올리고뉴클레오타이드 조각(조립 성분(1) 및 조립 성분(2))으로 이루어진다. 인덱스 스플린트 구조에는 한 쌍의 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원이 있다. 상기 쌍의 각 구성원은 다른 구성원의 다른 인덱스 서열에 하이브리드화하여 이중-가닥 인덱스 요소를 형성하는 인덱스 서열을 갖는다. 이 구조에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은, 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 근접하지 않아 조립 성분(1)의 루핑된(looped) 부분을 초래하는, 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 스플린트 서열 영역(L-스플린트)을 갖는다. 다른 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은 조립 성분(1)의 3' 말단 부분 및 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 부분에 상보적인 스플린트 서열 영역(R-스플린트)을 갖는다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다.
도 4는 올리고뉴클레오타이드를 다성분 DNA 작제물로 조립하기 위한 또 다른 유형의 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 올리고 뉴클레오타이드 구조는 단일 인덱스 스플린트 분자에 하이브리드화된 2개의 올리고뉴클레오타이드 조각(조립 성분(1) 및 조립 성분(2))으로 이루어진다. 이 구조에서, 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드는 조립 서열의 5'에 5' 인덱스 서열을 갖는다. 상기 인덱스 서열은 인덱스 스플린트 분자의 인덱스 서열에 하이브리드화하여 이중-가닥 인덱스 요소를 형성한다. 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에서 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 서열에, 및 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부 부분에 상보적인 서열 영역(R-스플린트)을 가지며, 그 결과 조립 성분(1)의 루핑을 생성시킨다(도 3과 다소 유사). 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다.
도 5a 내지 5c는 올리고뉴클레오타이드를 다성분 DNA 작제물로 조립하기 위한 또 다른 유형의 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 올리고뉴클레오타이드 구조는 2개의 올리고뉴클레오타이드 조각(조립 성분(1) 및 조립 성분(2))에 하이브리드화된 인덱스 스플린트 분자(도 5a 묘사됨)를 포함한다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 점선은 선택적 스페이서 서열을 나타낸다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 이러한 유형의 올리고뉴클레오타이드 구조에서, 인덱스 스플린트 분자는 스플린트 서열(스플린트) 및 2개의 인덱스 서열(A) 및 (B)(인덱스 서열(B) 및 인덱스 서열(A))를 포함한다. 인덱스 스플린트 분자의 2개의 인덱스 서열은 스플린트 서열 측면에 위치하며, 이때 스페이서 서열 스페이서(1) 및 스페이서(2)(점선)가 사이에 있다. 스플린트 서열에는 스플린트 확대도에 묘사된 대로 5' 요소 및 3' 요소가 있다. 스플린트 서열의 5' 요소는 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화한다. 스플린트 서열의 3' 요소는 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화한다. 인덱스 스플린트 분자의 하나의 인덱스 서열은 하나의 조립 성분 올리고뉴클레오타이드의 말단에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화한다. 인덱스 스플린트 분자의 다른 인덱스 서열은 다른 조립 성분 올리고뉴클레오타이드의 말단에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화한다. 도 5a 및 5b는 인덱스 스플린트 분자가 올리고뉴클레오타이드 구조의 2개의 조립 성분과 결합하는 두 가지 예시적인 배향을 예시한다. 도 5b는 인덱스 요소(인덱스(2))가, 인덱스 서열(A)(인덱스 스플린트 분자의 5' 단부에 있는 인덱스 서열)의 조립 성분(2)의 3' 단부에 있는 인덱스 서열에의 하이브리드화에 의해 형성되는 배향을 묘사한다. 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스(1))는 조립 성분(1)의 5' 단부에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화된 인덱스 서열(B)(인덱스 스플린트 분자의 3' 단부에 있는 인덱스 서열)에 의해 형성된다. 스플린트 서열의 5' 요소는 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화한다. 스플린트 서열의 3' 요소는 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화한다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다. 도 5c는 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스(1))가, 인덱스 서열(A)(인덱스 스플린트 분자의 5' 단부에 있는 인덱스 서열)의 조립 성분(1)의 5' 단부에 있는 인덱스 서열(분절(C))에의 하이브리드화에 의해 형성되는 두 번째 배향을 묘사한다. 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스(2))는 조립 성분(1)의 3' 단부에 있는 인덱스 서열(분절(F))에 하이브리드화된 인덱스 서열(B)(인덱스 스플린트 분자의 3' 단부에 있는 인덱스 서열)에 의해 형성된다. 스플린트 서열의 5' 요소는 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화한다. 스플린트 서열의 3' 요소는 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화한다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다.
도 6은 올리고뉴클레오타이드 구조가, 스플린트에 하이브리드화되지 않는 조립 서열의 영역에 하이브리드화될 수 있는 적어도 하나의 차단 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 차단제(1))를 포함하는 도 2의 변형을 예시한다. 2개의 차단 올리고뉴클레오타이드(차단제(1) 및 차단제(2))가 도 6에 묘사되어 있다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 의도된 결찰 지점은 조립 성분들의 접합점이다. 하나 이상의 차단 뉴클레오타이드가 도 5b 및 5c의 올리고뉴클레오타이드 구조에 활용될 수 있다.
도 7은 4-부분 조립 과정의 첫 번째 결찰 단계에서 결찰될 2개의 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. (또한 도 8 및 9를 참조하시오). 첫 번째 결찰 단계는 2-부분 조립과 유사한 기전으로 조립 성분(1+2)(상부 구조)와 조립 성분(3+4)(하단 구조)를 별도의 반응으로 조립한다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 각 올리고뉴클레오타이드 구조의 의도된 결찰 지점이 표시되어 있다. 제1 스플린트 구조(스플린트(1)) 외에도, 상부 올리고뉴클레오타이드 구조의 인덱스 스플린트는 스페이서 섹션의 제2 스플린트 서열(스플린트(2)), 및 5' 인덱스 서열(인덱스(2))과 제1 스플린트 구조(스플린트(1)) 사이의 또 다른 인덱스 서열(인덱스(3))을 포함한다. 하부 올리고뉴클레오타이드 구조의 인덱스 스플린트는 제1 스플린트 구조(스플린트(3))와 5' 인덱스 서열(인덱스(4)) 사이에 인덱스(3)의 상보적 서열(인덱스(3) 보체)을 포함한다.
도 8은 4-부분 조립 과정의 다음 단계를 묘사한다. 도 7에 묘사된 조립 단계의 결찰 생성물이 도 8에 예시된다. 결찰은 2개의 다성분 결찰 생성물인 조립 생성물(1-2)((a)에 묘사됨) 및 조립 생성물(3-4)((c)에 묘사됨)을 생성시킨다. 인덱스 서열과, 조립된 생성물(1-2) 및 조립된 생성물(3-4)에 대한 조립 성분 사이에 위치한 IIS형 제한 효소 절단 부위(RE 절단 부위)가 또한 묘사되어 있다. 도 7에 묘사된 조립 단계의 결찰 생성물에 각각 IIS형 제한 효소에 의한 절단이 가해져, RE 절단 부위에서 절단된다(도 7에 도시되지 않음). (a)의 결찰 생성물에서, 절단은 인덱스(2)를 제거하여 (b)에 예시된 바와 같이, 조립된 생성물(1-2)의 3' 단부에 오직 조립 성분 서열만을 남긴다. (c)의 결찰 생성물에서, 절단은 인덱스(4)를 제거하여 (d)에 예시된 바와 같이, 조립된 생성물(3-4)의 5' 단부에 조립 성분 서열만을 남긴다. 생성된 생성물은 예를 들어 SPRI 정제에 의해 정제된다.
도 9는 4-부분 조립 과정의 두 번째 결찰 단계를 묘사한다. 이어서 제한 절단의 정제된 생성물(도 8의 (b) 및 (d)를 참조하시오)은 도식 이미지에 묘사된 바와 같이 함께 하이브리드화되고(인덱스(3)을 참조하시오) 결찰되어 조립된 생성물(1-2-3-4)을 생성시킨다. 이 생성물은 예를 들어 SPRI를 통해 정제될 수 있으며, 추가 결찰이 가해지거나 PCR을 통해 증폭될 수 있다. 예를 들어, 프라이머 서열이 인덱스(1)과 조립 성분(1)의 조립 서열 사이(순방향 프라이머), 및 인덱스(5)와 조립 성분(4)의 조립 서열 사이(역방향 프라이머)에 존재할 수 있다.
도 10 내지 13은 개시된 방법의 변형 양태를 함께 개략적으로 예시한다. 도 10은 2개의 조립 성분의 인덱스 서열이 이중-가닥 인덱스(1) 및 인덱스(2)를 형성하는 2개의 인덱스 서열에 하이브리드화하는 단일 스플린트("인덱스 스플린트")에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오타이드 구조를 예시한다.
도 11은 도 10의 올리고뉴클레오타이드 구조의 결찰 생성물을 묘사한다. 도 11은 또한 인덱스 스플린트가 고체 지지체 또는 인덱스 어레이에의 부착을 위해 비오틴화되는 선택적 양태를 예시한다.
도 12a 및 12b는 제2 스플린트 분자("작제물 스플린트)가 조립 성분의 3' 및 5' 단부에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 도 12a는 인덱스 스플린트가 스페이서("선택적 테더")를 통해 작제물 스플린트에 연결된 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 이는 5'에서 3'으로, 제1 인덱스 서열(올리고(1)의 5' 단부에서 인덱스와 결합하여 인덱스(1)을 형성한다); 제2 인덱스 서열(올리고(2)의 3' 단부에서 인덱스와 결합하여 인덱스(2)를 형성한다); 스페이서(선택적 테더); 5' 요소가 5' 단부 올리고(2)에 하이브리드화하고 3' 요소가 올리고 가닥(1)의 3' 단부에 하이브리드화하는 스플린트를 포함하는 청구된 인덱스 스플린트 분자의 또 다른 실시양태를 나타낸다. 도 12b는 인덱스 스프린트에 연결되지 않은 제2 스플린트 분자("작제물 스플린트")가 조립 성분의 3' 및 5' 단부에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오타이드 구조를 묘사한다. 인덱스 스플린트가 고체 지지체 또는 인덱스 어레이에의 부착을 위해 비오틴화되는 선택적 양태도 또한 묘사되어 있다.
도 13은 도 12b의 결찰 생성물을 도시한다. 도 13은 또한 결찰 생성물의 조립 성분에 대한 선택적인 추가의 구조적 특징을 도시한다. 선택적 제한 효소 부위가 인덱스 스플린트의 5' 단부에 표시되어 있다. PBS(1) 및 BPS(1)은 조립 생성물 증폭에 유용한 (선택적) 프라이머 결합 부위를 나타낸다.
도 14는 도 1, 2 및 3에 예시된 올리고뉴클레오타이드 구조(각각 추가로 조립 성분(1) 및 조립 성분(2)를 포함한다)에 묘사된 바와 같은 세 가지 유형의 시험 스플린트 분자를 사용하여 저-상동성 라이브러리의 용액 조립을 평가하는 실험에 대한 데이터 그래프를 묘사한다. 각 유형의 시험 스플린트 분자에 대해 스플린트 대 작제물의 3개의 비(1:1, 2:1 및 4:1)가 시험되었다. 도 2 및 3의 시험 스플린트 분자가 3개의 뉴클레오타이드(nt) 기둥(stilt)과 함께(+) 및 상기 기둥 없이(-) 제조되었다. 조립된 작제물은 PCR-증폭된 조립 작제물의 차세대 서열분석(NGS)에 의해 특성화되었다. 그래프의 Y-축은 15개 세트 각각에서 올바르게 조립된 작제물에 대한 평균 판독 수이다. 보다 상세한 내용은 실시예 1을 참조하시오.
도 15는 도 5b의 시험 스플린트 분자(상부 패널)의 개략도 및 개념 증명 실험으로부터의 데이터(하부 패널)를 묘사한다. 화살촉은 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 나타내고; 평평한 단부는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부이다. 프라이머(F) - PCR에 대한 순방향 프라이머의 위치. 프라이머(R) - PCR에 대한 역방향 프라이머의 위치. Tm은 왼쪽 및 오른쪽 작제물 올리고뉴클레오타이드(각각 조립 성분(1) 및 조립 성분(2))에 하이브리드화된 스플린트의 각 섹션의 용융 온도(즉, 5' 요소 및 3' 요소의 용융 온도)이다. BC(1) 및 BC(2)는 쌍을 이루는 바코드 서열의 위치를 나타낸다. 인덱스(1) 및 인덱스(2)는 올리고뉴클레오타이드 구조의 인덱스 요소를 나타낸다. 인덱스 스플린트 분자의 인덱스 서열과 스플린트 서열 사이의 점선은 스페이서 서열(이는 이 시험에서 20-염기 폴리T 뉴클레오타이드 서열이다)을 나타낸다. 보다 상세한 내용은 실시예 2를 참조하시오.
도 16은 세 가지 유형의 전형적인 올리고 라이브러리를 개략적으로 예시한다. 실선 상자는 조립된 작제물의 측면에 위치한 고유 바코드를 나타낸다.
도 17은 세 가지 유형의 전형적인 올리고 라이브러리(도 16을 참조하시오)에서 세 가지 유형의 시험 스플린트 분자(도 1, 2 및 5B의 올리고뉴클레오타이드 구조를 참조하시오)를 활용하는 조립 시험을 위한 전형적인 데이터를 묘사한다. 보다 상세한 내용은 실시예 3을 참조하시오.
도 18은 시험 스플린트 분자(도 5b의 올리고뉴클레오타이드 구조)의 개략도 및 다양한 스플린트 길이 및 결찰 온도와 함께 이를 사용한 조립에 대한 전형적인 데이터를 묘사한다. 실험에서, 스플린트-작제물 하이브리드화된 요소(5' 요소 및 3' 요소) 각각에 대한 용융 온도(Tm) 범위를 설계하고 8개의 상이한 온도에서 결찰을 시험하였다. 65.9℃ 결찰 데이터에 대한 중앙 판독 수에 대한 데이터가 그래프에 묘사되어 있다. 각 스플린트 온도에 대해서, 올바른 판독 및 잘못된 판독의 분율이 중앙 판독 수로 표시된다. 보다 상세한 내용은 실시예 4를 참조하시오.
임의의 도면 또는 명세서에서 "절반"의 사용, 예를 들어 "왼쪽 절반 작제물"은 제한하려는 의도가 아니다. 예를 들어, "왼쪽 절반 작제물" 및 "오른쪽 절반 작제물"은 조립 성분(1)과 조립 성분(2)의 길이가 동일함을 나타내기 위한 것이 아니다. 작제물 성분의 크기는 다를 수 있다. 이러한 맥락에서 "절반"은 "부분", "일부" 또는 "올리고뉴클레오타이드 분자"에 필적한다.
본 개시내용은, 특히 인덱스 스플린트 올리고뉴클레오타이드 분자에 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드를 효소적으로 결찰시킴으로써 용액 내 긴 DNA 라이브러리를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 합성된다. 이 방법은 일반적으로 더 짧은 성분들을 결찰시킴으로써 DNA 또는 RNA를 포함한 긴 핵산을 생성시키는 데 유용하다.
A. 정의
본원에 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "핵산 조립"이라는 용어는 원하는 핵산 서열(다성분 작제물) 또는 이 과정의 생성 핵산을 생성시키기 위해 적어도 2개의 핵산 단편 또는 올리고뉴클레오타이드를 특정 순서로 함께 물리적으로 결합시키는 방법을 지칭한다. 각각의 단편 또는 올리고뉴클레오타이드는 "조립 성분"(때때로 본원에서 구어체로 "절반 작제물"이라고도 한다)이다. 2개의 조립 성분이 결합되는 경우, 상류 성분은 "상류 조립 성분"(또는 조립 성분(1) 또는 왼쪽 절반 작제물 또는 왼쪽 작제물 절반)이고 하류 성분은 "하류 조립 성분"(또는 조립 성분(2) 또는 오른쪽 절반 작제물 또는 오른쪽 작제물 절반)이다. 상류 조립 성분(조립 성분(1))의 3' 단부는 하류 조립 성분(조립 성분(2))의 5' 단부와 결합된다. 조립 성분은 조립 서열 및 적어도 하나의 비-조립 서열을 포함한다. "조립 서열"은 최종 다성분 작제물에 포함된 관심 서열이다. 비-조립 서열은 인덱스 서열, 프라이머 서열, 제한 효소 서열, 바코드 서열 등과 같이 조립 방법과 관련된 서열을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "5' 말단 서열"이라는 용어는 핵산의 5' 말단을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "3' 말단 서열"이라는 용어는 핵산의 3' 말단을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 말단 서열은 2개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드, 3개 이상, 5개 이상 또는 10개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드, 30개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드, 50개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드, 또는 100개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 3' 또는 5' "실질적 말단 서열"은 3' 또는 5' 말단에 근접하지만 이를 포함하지 않는 서열을 지칭한다. 예를 들어, 3' 또는 5' 실질적 말단 서열의 3' 또는 5' 단부는 각각 3' 또는 5' 말단 뉴클레오타이드의 약 100개 뉴클레오타이드 이내, 약 50개 뉴클레오타이드 이내, 약 30개 뉴클레오타이드 이내, 약 25개 뉴클레오타이드 이내, 약 20개 뉴클레오타이드 이내, 약 15개 뉴클레오타이드 이내, 약 10개 뉴클레오타이드 이내, 약 5개 뉴클레오타이드 이내, 약 4개 뉴클레오타이드 이내, 약 3개 뉴클레오타이드 이내, 약 2개 뉴클레오타이드 이내 또는 1개 뉴클레오타이드 이내에 있을 수 있다.
"핵산", "폴리뉴클레오타이드" 또는 "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 DNA 분자, RNA 분자 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA와 같은 DNA 분자 및 가이드 RNA, 메신저 RNA 또는 합성 RNA와 같은 RNA 분자를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 단일-가닥 및 이중-가닥 형태를 포함한다.
"하이브리드화" 또는 "하이브리드화하는"이라는 용어는 완전히 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드 가닥이 적합한 하이브리드화 조건 하에서 함께 모여, 2개의 구성성분 가닥이 수소 결합에 의해 결합되는 이중-가닥 구조 또는 영역을 형성하는 과정을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "부분 하이브리드화"라는 용어는 이중-가닥 구조 또는 영역이 하나 이상의 돌출 또는 불일치를 포함하는 경우를 포함한다. 전형적으로 아데닌과 티민, 또는 아데닌과 우라실(각각 A와 T 또는 A와 U) 또는 시토신과 구아닌(C와 G) 사이에 수소 결합이 형성되지만, 다른 비-정규 염기쌍도 형성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Adams et al., "The Biochemistry of the Nucleic Acids," 11th ed., 1992]을 참조하시오). 변형된 뉴클레오타이드는 비-정규 방식으로 하이브리드화를 허용하거나 촉진하는 수소 결합을 형성할 수 있음이 고려된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 서열의 "부분", "분절", "요소" 또는 "단편"이라는 용어는 전체 서열보다 작은 서열의 임의의 부분(예를 들어, 뉴클레오타이드 하위 서열 또는 아미노산 하위 서열)을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 부분, 분절, 요소 또는 단편은 1보다 큰 임의의 길이, 예를 들어 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300개 또는 500개 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "인덱스 스플린트(indexed splint)"라는 용어는 (1) 적어도 하나의 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 스플린트 서열, 및 (2) 표적 분자 내의 인덱스 서열에 하이브리드화할 수 있는 인덱스 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, 도 5a를 참조하시요. "표적"은 조립 성분이다. 전형적으로, 인덱스 스플린트는 2개의 표적을 다성분 작제물로 결찰시키는 것을 용이하게 하기 위해 상기 두 표적에 하이브리드화하도록 설계된다. 예를 들어 도 5b를 참조하시오. 이를 위해, 스플린트 서열은 전형적으로 두 표적 모두에 하이브리드화하여 한 표적의 3' 단부와 다른 표적의 5' 단부를 근접하게 만든다. 표적의 인덱스 서열은 인덱스 스플린트의 인덱스 서열에 하이브리드화할 목적으로 표적에 추가된 추가 서열이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "인덱스 스플린트-특이적 정렬 결찰"이라는 용어는 리가제를 사용하여 실질적으로 단일-가닥 단편을 서로 결찰시켜 다성분 핵산 결찰 생성물을 생성시키는 프로토콜을 지칭하며, 이때 결찰 생성물에서 단편의 순서는, 결찰될 2개 단편의 3' 말단 서열 및 5' 말단 서열에 하이브리드화하는 스플린트를 포함하는 인덱스 스플린트 분자에 의해 지시된다. "실질적으로 단일-가닥 단편"은 부분적인 이중-가닥 부분, 예를 들어 인덱스 스플린트 분자의 스플린트 서열에 하이브리드화된 3' 또는 5' 말단 서열, 및/또는 인덱스 스플린트 분자의 인덱스 서열에 하이브리드화된 3' 또는 5' 말단 인덱스 서열(또는 3' 또는 5' 실질적으로 말단 인덱스 서열)을 포함하는 단편을 지칭한다.
"인덱스 요소"는 서로의 역 보체인 서열을 갖는 2개의 가닥에 의해 형성된(이들로 이루어진) 이중-가닥 DNA 분절을 지칭한다. "인덱스 서열"은, 서로의 역 보체이고 서로에 대한 하이브리드화에 의해 인덱스 요소를 형성하는 서열의 두 가닥 중 하나인 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 인덱스 서열은 회문형이 아니다(예를 들어, 스템 루프 또는 다른 2차 구조가 없다). 단일 인덱스 스플린트상의 두 인덱스 서열은 서로 하이브리드화하지 않는다.
본 개시내용의 방법 및 생성물은, 도 5, 패널 A에 도식적으로 묘사된 바와 같이 인덱스 스플린트 분자를 활용하면 올리고뉴클레오타이드 라이브러리에서 다성분 작제물의 개선된 조립을 초래한다는 예상치 못한 발견에 적어도 부분적으로 기초하고 있다. 결찰될 조립 성분의 각 쌍이 스플린트 서열 및 조립 성분 쌍에 특이적인 인덱스 서열을 갖는 상응하는 인덱스 스플린트 분자를 갖는 인덱스 스플린트-특이적 정렬 결찰을 사용함으로써, 올리고뉴클레오타이드 라이브러리에서 다수의 올바른 작제물의 조립이, 상동성 올리고 라이브러리(올리고가 상당한 정도의 서열 상동성을 공유하는 올리고 라이브러리)에서조차 가능하다. 인덱스 스플린트 분자의 인덱스 서열은 작제물 서열의 일부가 아니며, 따라서 라이브러리 구성원 간의 상동성에 영향을 받지 않는다. 이는 멀티플렉스 조립의 이전의 고처리량 방법에 비해 예상치 못한 이점이자 개선이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 혼합물"은 내부에 용해된 다수의 상이한 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 수용액을 지칭한다. 혼합물은 50 내지 예를 들어 50,000 사이의 임의의 값을 포함하여, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 500개, 적어도 1,000개, 적어도 5,000개, 적어도 10,000개, 또는 적어도 50,000개 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 혼합물은 올리고뉴클레오타이드를 동일 반응계에서 합성함으로써, 즉 어레이 내의 제자리에서 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 이어서 합성 후 어레이의 표면으로부터 상기 올리고뉴클레오타이드를 절단함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Geary et al. (Nature Methods 2004 1: 241-248)] 및 문헌[LeProust et al. (Nucleic Acids Research 2010 38: 2522-2540)]을 참조하시오.
본원에 사용되는 바와 같은 "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 뉴클레오타이드의 다량체를 나타낸다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 약 2 내지 약 200개 뉴클레오타이드, 최대 약 50개 뉴클레오타이드, 최대 약 100개 뉴클레오타이드, 최대 약 500개 뉴클레오타이드의 길이를 갖거나, 또는 2 내지 500개 사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오타이드 수를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 30 내지 300개 뉴클레오타이드 길이 또는 30 내지 400개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 단량체(즉, 올리고리보뉴클레오타이드일 수 있다) 및/또는 데옥시리보뉴클레오타이드 단량체를 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 길이는 예를 들어 10 내지 20, 21 내지 30, 31 내지 40, 41 내지 50, 51 내지 60, 61 내지 70, 71 내지 80, 80 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 250 내지 300, 300 내지 350, 또는 350 내지 400개 뉴클레오타이드, 및 이들 범위 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "다성분 결찰 생성물을 생성시키기 위해 조립될 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 세트"라는 용어 및 이의 문법적 동등어는 효소적으로 더 긴 서열로 조립될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 세트를 지칭하며, 본원에서 정의된 순서로 각 올리고뉴클레오타이드로부터의 서열을 함유하는 "다성분 작제물" 또는 "다성분 결찰 생성물"로서 지칭된다. 본 개시내용으로부터 이해되는 바와 같이, 한 세트의 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드는 (i) 인덱스 스플린트 분자의 상보적 서열에 하이브리드화하여 이중-가닥 인덱스 요소를 형성하는 인덱스 서열인 3' 또는 5' 말단(또는 실질적으로 말단) 서열, 및 (ii) 인덱스 스플린트 분자의 스플린트 서열에 하이브리드화하는 5' 또는 3' 말단 서열을 포함하는 조립 서열을 함유할 수 있다. "조립 서열"은 최종 작제물에 포함되는 관심 서열이며, 조립 방법과 관련된 서열, 예를 들어 인덱스 서열, 프라이머 서열, 제한 효소 서열, 바코드 서열 등은 포함하지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 다수의 값 범위가 제공된다. 해당 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 중간 값도 구체적으로 고려되는 것으로 이해된다. 명시된 범위에 포함되는 각각의 더 작은 범위 또는 중간 값도 구체적으로 고려된다. "약"이라는 용어는 일반적으로 표시된 수치의 ±10%를 지칭한다. 예를 들어, "약 10%"는 9% 내지 11%의 범위를 나타낼 수 있고, "약 20"은 18-22를 의미할 수 있다. "약"의 다른 의미는 반올림과 같이 문맥에서 명백할 수 있으므로, 예를 들어 "약 1"은 0.5 내지 1.4를 의미할 수도 있다.
명세서 전반에 걸쳐 용어의 다른 정의가 나타날 수도 있다.
B. 방법 및 생성물에 대한 설명
원하는 작제물을 형성하기 위한 효소적 결찰을 위해 특정 올리고뉴클레오타이드를 조립하는 한 가지 방법을 도 1에 묘사한다. 도 1은 결찰될 2개의 올리고뉴클레오타이드를 묘사하며, 하나는 상류 올리고뉴클레오타이드("조립 성분(1)")이고 다른 하나는 하류 올리고뉴클레오타이드("조립 성분(2)")이다. 상류 작제물 올리고뉴클레오타이드는 결찰 지점의 상류(5'에서 3' 기준으로)이고, 하류 작제물 올리고뉴클레오타이드는 결찰 지점의 하류이다. 상류 및 하류 작제물 올리고뉴클레오타이드는 단일 스플린트 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화된다. 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 상보적 서열의 두 영역을 가지며, 하나는 상류 작제물 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하고 다른 하나는 하류 작제물 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하며, 따라서 왼쪽 작제물의 3' 단부가 오른쪽 작제물의 5' 단부에 바로 인접하여 의도한 결찰 부위를 형성한다. 하이브리드화 조건 하에서, 두 조립 성분은 단일 스플린트 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하고, 리가제가 두 조각을 결합시켜 더 긴 다성분 작제물을 형성시킨다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법은 결찰을 위한 조립 성분을 조립하기 위해 스플린트 영역 및 2개의 인덱스 서열(A) 및 (B)(예를 들어, 도 5a를 참조하시오)를 포함하는 인덱스 스플린트 분자를 사용한다. 인덱스 스플린트 분자의 두 인덱스 서열은 스플린트 서열의 측면에 위치하며, 이때 사이에 스페이서 서열(점선)이 있다. 상기 스플린트의 확대도에 묘사된 바와 같이, 스플린트 영역에는 5' 요소 및 3' 요소가 있다. 스플린트 서열의 5' 요소는 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화한다(예를 들어, 도 5b를 참조하시오). 스플린트 서열의 3' 요소는 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화한다. 일부 양태에서, 인덱스 서열(A) 및 (B)는 회문형이 아니고(예를 들어, 스템 루프 또는 다른 2차 구조가 없다) 서로 하이브리드화하지도 않는다. 인덱스 스플린트 분자의 한 인덱스 서열은 하나의 절반 작제물의 말단에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화한다. 인덱스 스플린트 분자의 다른 인덱스 서열은 다른 절반 작제물의 말단에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화한다. 따라서, 스플린트 서열 및 인덱스 서열 둘 다 2개의 절반 작제물에 하이브리드화함으로써, 인덱스 스플린트는 2개의 절반 작제물을 근접하게 데려오고 이들을 결찰을 위한 위치에 정렬시킨다.
인덱스 서열은 관심 서열의 일부가 아니다. 이는 두 조립 성분의 단부에 추가되는 추가 서열이다. 따라서, 이들은 가능한 한 반응 혼합물의 다른 서열과 다르게 설계될 수 있으며, 따라서 특히 다수의 서로 다른 조립 성분이 동일한 반응에서 결찰될 때(즉, 멀티플렉스)의도하지 않은 조립 성분 쌍의 가능성을 줄일 수 있다.
스플린트의 3' 요소 및 5' 요소는 각각 길이가 약 5 내지 20개의 뉴클레오타이드이고 선택적으로 인덱스 요소의 용융 온도보다 낮은 용융 온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 스플린트 요소는 반응 조건 하에서 단독으로(즉, 인덱스 요소의 부재 하에) 하이브리드화를 구동하기에 충분하지 않아야 하지만, 조립 성분이 인덱스 스플린트의 인덱스 서열의 하이브리드화를 통해 제자리에 유지될 때 두 조립 성분의 의도하지 않은 짝짓기를 실질적으로 감소시키거나 제거하기 위해서 두 조립 성분에 일시적으로만 하이브리드화할 것이다. 이는 반응의 조립 성분이 상당한 정도의 상동성을 공유하는 경우(예를 들어, 상동성 올리고 라이브러리) 특히 중요하다.
도 5b 및 5c에 예시된 바와 같이, 인덱스 스플린트 분자가 올리고뉴클레오타이드 구조의 두 조립 성분을 결합시키는 데에는 두 가지 예시적인 배향이 존재한다.
도 5b는 인덱스 서열 A(인덱스 스플린트 분자의 5' 단부에 있는 인덱스 서열)가 조립 성분(2)의 3' 단부에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화하여 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스(2))를 형성하는 배향을 묘사한다. 인덱스 서열 B(인덱스 스플린트 분자의 3' 단부에 있는 인덱스 서열)는 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스(1))를 형성하는 조립 성분(1)의 5' 단부에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화된다.
도 5c는 인덱스 서열 A(인덱스 스플린트 분자의 5' 단부에 있는 인덱스 서열)가 조립 성분 1의 5'에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화하여 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스(2))를 형성하는 두 번째 배향을 묘사한다. 인덱스 서열 B(인덱스 스플린트 분자의 3' 단부에 있는 인덱스 서열)는 조립 성분(2)의 3'에 있는 인덱스 서열에 하이브리드화하여 이중-가닥 인덱스 요소(인덱스(1))를 형성한다. 인덱스 스플린트 분자는 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화하는 스플린트의 5' 요소와 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화하는 스플린트 서열 결합의 3' 요소를 수용하기 위해 180° 비틀려 예시되어 있음에 유의한다. 상기 비틀림은 단지 설명을 위한 것이며 제한하려는 의도는 없다.
폴리뉴클레오타이드를 다성분 작제물로 조립하는데 있어 본 발명의 예시적인 이점 및 구별되는 특징은 하기를 포함한다. 본 발명은 조립 방법을 위한 어레이 또는 고체 지지체를 필요로 하지 않는다. 이 방법은 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 조립하는 데 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 이 방법은 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행된다. 하나의 양태에서, 이 방법은 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 라이브러리를 사용하여 수행된다. 혼합물은 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 500개, 적어도 1,000개, 적어도 5,000개, 적어도 10,000개 또는 적어도 50,000개 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 추가로, 양태에서, 이 방법은 II형 제한(즉, 단편 결합 부위에 "흉터가 없다")과 같이, 비-조립 서열이 다음 주기 전에 깨끗하게 제거될 수 있는 반복 과정으로서 수행될 수 있다. 이 방법은 작은 변이를 제외하고 실질적으로 동일한 서열을 갖는 라이브러리와 같은, 복합 라이브러리, 낮은 상동성 라이브러리 및 높은 상동성 라이브러리를 조립하는 데 활용될 수 있다.
인덱스 스플린트는 다른 방식으로 사용될 수 있다. 도 2에 도시된 한 변형 에서, 의도된 작제물의 왼쪽과 오른쪽 절반을 나타내는 2개의 올리고뉴클레오타이드가 한 쌍의 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원에 하이브리드화된다. 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원 쌍의 각 구성원은 상기 쌍의 다른 구성원에 있는 인덱스 서열의 역 보체인 인덱스 서열을 추가로 함유하므로, 서로 하이브리드화하여, 본원에서 인덱스 요소(도 2에서 "인덱스"로 표지된다)로서 언급된 이중-가닥 DNA 부분을 형성할 수 있다. 2개의 인덱스 서열은 간접적으로 2개의 조립 성분을 하나로 모으는 역할을 한다. 인덱스 서열은 조립 서열 자체의 일부가 아니다. 도 2에서, 오른쪽 인덱스 스플린트는 왼쪽 작제물 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 상동성인 스플린트 서열(R-스플린트)과 오른쪽 작제물 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부에 상동성인 섹션을 함유한다. 도 2에서 R-스플린트는 약 10개의 뉴클레오타이드(nt)를 포함하지만 그 범위는 예를 들어 약 5 nt 내지 약 20 nt일 수 있다.
모든 스플린트 서열이 표적의 말단 서열에 하이브리드화할 필요는 없다. 인덱스 스플린트의 또 다른 변형이 도 3에 예시되어 있다. 이 올리고뉴클레오타이드 구조는 도 2 올리고뉴클레오타이드 구조의 변형이다. 발명자는 이 구조가, 설계된 조립 성분의 5' 단부가 결여된 절두된 합성 생성물로 인해 발생하는 간섭을 감소시키거나 제거할 수 있다고 생각하였다. 이 구조에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 근접하지 않은 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 스플린트 서열 영역(L-스플린트)을 가지며, 그 결과 조립 성분(1)의 루핑된 부분을 생성시킨다. 다른 스플린트 올리고뉴클레오타이드 구성원은 조립 성분(1)의 3' 말단 부분 및 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 부분에 상보적인 스플린트 서열 영역(R-스플린트)을 갖는다.
도 4에서, 조립 성분(1) 올리고뉴클레오타이드는 5' 단부 조립 성분(1)에 5' 인덱스 서열을 갖는다. 인덱스 서열은 인덱스 스플린트 분자의 인덱스 서열에 하이브리드화하여 이중-가닥 인덱스 요소를 형성한다. 스플린트 분자는 조립 성분(1) 조립 성분(1)의 3' 말단 부분 및 조립 성분(2) 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 부분에 상보적인 서열을 가지며, 그 결과 조립 성분(1)의 루핑을 초래한다(도 3과 유사하나, 단지 하나의 인덱스 스플린트만이 사용된다).
본원에 도시된 바와 같이, 도 5a 내지 5c에 예시된 것과 같은 실시양태는 주목할만한 이점을 제공하였다. 도 5의 인덱스 스플린트 분자를 사용하는 낮은 상동성 라이브러리 또는 복잡한 라이브러리의 조립으로 높은 정확도(즉, 전체 판독 수에 대한 전체 올바른 판독 수)가 산출되었다. 도 17을 참조하시오. "복합 라이브러리"는 주변 프라이머 결합 부위를 제외하고 서열 유사성이 거의 없는 라이브러리 서열을 지칭한다. 또한, 탈락(dropout) 작제물도 존재하지 않았다. 따라서 데이터는 도 5의 인덱스 스플린트 분자를 사용하여 조립 성분을 조립하면 훨씬 더 높은 식별이 가능함을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 도 1의 경우와 같은 스플린트 분자의 잡다한 하이브리드화로 인해, 불가능했던 작제물의 올바른 조립을 가능하게 한다.
따라서, 본 개시내용은 효소 결찰을 위해 인덱스 스플린트를 사용하는 특정 올리고뉴클레오타이드를 활용하는 다성분 작제물의 조립 방법을 제공한다. 본 개시내용은 무엇보다도 미리 정의된 순서를 갖는 다성분 결찰 생성물을 형성하기 위해 인덱스 스플린트-특이적 정렬 결찰에 의해 2개 이상의 특정 성분을 조립하는 방법을 제공한다. 이 방법은 고체 지지체 없이 용액 중에서 수행될 수 있다. 이 방법은 정의된 순서로 2개, 3개 또는 4개 이상의 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 서열을 결찰하여 합성 다성분 작제물을 생성시키는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 다수의 상이한 합성 다성분 작제물(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 10개, 적어도 100개, 적어도 1,000개 또는 적어도 10,000개, 또는 적어도 100,000개의 다성분 작제물)을 동일한 용액 중에서 생성시킬 수 있다는 점에서 멀티플렉스화될 수 있다. 이 과정을 또한 여러 번 반복하여 보다 긴 핵산을 생성시킬 수도 있다.
특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드 분자는 합성 유기 화학 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적 합성에 의해 생성된다. 본원에 기재된 일부 올리고뉴클레오타이드 분자는 대안적으로 시험관내 전사 및 세포 기반 발현을 포함하는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
본 개시내용의 방법뿐만 아니라 이 방법에 사용되는 다양한 올리고뉴클레오타이드 분자를 하기 개시내용에서 더 상세히 기재한다.
인덱스 스플린트
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 도 5a에 예시된 바와 같이 인덱스 스플린트를 사용한다. 인덱스 스플린트는 스플린트 영역, 제1 인덱스 서열, 및 제2 인덱스 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 인덱스 서열 및 제2 인덱스 서열은 스플린트 영역의 측면에 위치한다. 제1 인덱스 서열 및 제2 인덱스 서열은 인덱스 스플린트의 5' 및 3' 단부에 위치할 수 있다. 하나의 양태에서, 제1 인덱스 서열 및 제2 인덱스 서열 중 하나 또는 둘 모두는 인덱스 스플린트의 말단 서열(예를 들어, 5' 말단 서열 및/또는 3' 말단 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 인덱스 서열 및 제2 인덱스 서열 중 하나 또는 둘 다는 인덱스 스플린트의 실질적인 말단(예를 들어, 5' 실질적인 말단 서열 및/또는 3' 실질적인 말단 서열)을 포함하지만 말단 뉴클레오타이드는 포함하지 않는다. 스플린트 영역에는 5' 서열 요소 및 3' 서열 요소가 있는데, 이들은 각각 2개의 조립 성분 각각에 하이브리드화하여 조립 성분의 단부를 근접하게 만든다. 도 5a 내지 5c에 예시된 바와 같이, 스플린트 서열의 5' 요소는 하류 조립 성분(조립 성분(2))의 5' 단부에 하이브리드화하는 반면, 스플린트 서열의 3' 요소는 상류 조립 성분(조립 성분(1))의 3' 단부에 하이브리드화한다. 결과적으로, 하류 조립 성분의 5' 단부와 상류 조립 성분의 3' 단부가 합쳐지고 리가제에 의해 결찰될 수 있다.
인덱스 스플린트 분자가 결찰을 위한 올리고뉴클레오타이드 구조의 두 조립 성분에 결합하는 두 가지 예시적인 배향이 존재하며, 각각 도 5b 및 5c에 도시된다.
인덱스 서열은 관심 서열의 일부가 아니며 최종 조립에 존재하지 않을 것이다. 이 서열은 두 조립 성분의 단부에 추가되는 추가 서열이다. 따라서, 이 서열은 가능한 한 반응 혼합물 중의 다른 서열과 상이하게 설계될 수 있으며, 따라서 특히 다수의 상이한 조립 성분이 동일한 반응(즉, 멀티플렉스)에서 결찰될 때 의도하지 않은 조립 성분 쌍의 가능성을 줄일 수 있다.
인덱스 요소의 특징은 하기를 포함한다. 인덱스 서열은 그의 보체에만 하이브리드화하도록 설계된다. 따라서 임의의 주어진 인덱스 요소에 대해, 최종 작제물 분자에는 상기 서열 중 어느 서열(보체 또는 역 보체)도 존재하지 않는다. 유사하게, 하나 이상의 스페이서 서열을 포함하는 인덱스 스플린트 분자의 경우, 인덱스 서열(보체 또는 역보체) 중 어느 것도 스페이서에 존재하지 않는다. 인덱스 서열은 스템-루프 구조와 같이 그 자체로 안정적인 2차 구조를 갖지 않도록 설계하는 것이 바람직하며, 따라서 회문형이 아니다. 더욱이, 인덱스 요소의 뉴클레오타이드 조성은 조립 방법에 사용하기에 적합한 용융 온도(Tm)를 갖도록 설계하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 인덱스 요소는 스플린트 요소가 조립 성분에 대해 100% 일치성을 갖는 스플린트 요소를 제외하고는 조립 성분에 일시적으로만 하이브리드화할 수 있는 온도 범위에서 하이브리드화된 상태를 유지하도록 설계된다. 작제물 요소에 대한 스플린트 요소 서열의 불일치는 하이브리드화를 불안정하게 만든다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 동적 하이브리드화는 100% 일치성의 스플린트 요소-조립 성분 하이브리드화의 형성을 선호하는 샘플링을 허용한다고 여겨진다. 이는 본 개시내용의 방법에서 형성된 다성분 작제물의 높은 정확성에 기여하는 것으로 여겨진다. 일부 양태에서, 조립 정확도(즉, 전체 판독 수에 대한 전체 올바른 판독 수)는 적어도 80%, 85%, 또는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 적어도 96%이다. 또한, 이는, 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 의도된 작제물의 탈락을 최소화하는 데 기여하고 따라서 나타낸 의도된 작제물의 높은 백분율을 제공하는 것으로 여겨진다. 일부 양태에서, 의도된 작제물의 백분율은 의도된 전체 작제물 수의 적어도 80%, 85% 또는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 적어도 98%이다.
선택적으로, 인덱스 서열은 용융 온도를 예측하는 데 도움이 되도록 기본 균형(A=T=G=C)이 적용된 무작위의 복잡도가 높은 서열이다. 단독중합체 반복이 포함될 수 있다. 다른 실시양태에서, 인덱스 서열은 단독중합체 및/또는 다이뉴클레오타이드 반복, 예를 들어 GTGTGTGT와 같은 반복 요소를 포함하지 않는다. 높은 용융 온도는 개시된 방법의 실시에 유용하다. 각 인덱스 서열의 Tm은 약 50℃ 내지 약 80℃, 약 65℃ 내지 약 72℃, 약 55℃ 내지 약 75℃, 약 50℃ 내지 약 70℃, 또는 60℃ 내지 약 80℃일 수 있다. 하나의 양태에서, 각 인덱스 서열의 Tm은 약 65℃ 내지 약 69℃이다. 하나의 양태에서, 인덱스 서열은 20 nt 내지 60 nt일 수 있다. 인덱스 서열은 20개 뉴클레오타이드(nt) 내지 50 nt, 25 nt 내지 45 nt, 25 내지 35 nt, 또는 28 nt 내지 32 nt일 수 있다. 하나의 양태에서, 인덱스 서열은 약 30개 뉴클레오타이드이다. 인덱스 서열을 더 짧게 유지하는 이유는 조립 성분의 작제물 서열 길이를 최대화하기 위한 것이다. 매우 짧은 인덱스 서열을 만드는 데 있어 주요 장애물은 특이성과 이중 안정성이 저하된다는 것이다. 인덱스 서열은 서열 라이브러리로서 제조될 수 있다. 잠재적인 인덱스 서열을 적절한 게놈에 대해 스크리닝하여, 하이브리드화할 수도 있는 서열을 제외시킨다. 하나의 양태에서, 잠재적인 인덱스 서열을 인간 게놈에 대해 스크리닝한다. 서열 라이브러리의 인덱스 서열은 길이, 염기 균형 또는 용융 온도와 같은 일부 특징을 공유하도록 설계되는 반면, 상이한 인덱스 서열 간의 하이브리드화를 방해하도록 설계될 수 있다. 하나의 양태에서, 서열 라이브러리는, 다른 세트와는 상이하지만 세트 내의 특징을 공유하는 인덱스 서열 또는 이들의 다중 세트를 함유할 수 있다. 예를 들어, 서열 라이브러리는 하나의 예측된 용융 온도로 설계된 인덱스 서열의 한 세트를 포함할 수 있는 반면, 라이브러리 내의 인덱스 서열의 두 번째 세트는 상이한 용융 온도로 설계될 수 있다.
스플린트
인덱스 스플린트는 스플린트 서열을 포함한다. 스플린트 서열은 2개의 조립 성분 쌍의 특이성을 안내하기 위한 것이다. 도 5a에 예시된 바와 같이, 스플린트 서열(스플린트)에는 5' 요소(5'-요소) 및 3' 요소(3' 요소)라는 2개의 서열 요소가 있다. 스플린트 서열의 5' 요소는 하류 조립 성분의 5' 단부에 하이브리드화한다. 보다 구체적으로, 5' 요소는 하류 조립 성분(조립 성분(2))의 5' 말단 또는 5' 실질적 말단 서열에 하이브리드화한다(예를 들어, 도 5b를 참조하시오). 스플린트 서열의 3' 요소는 상류 조립 성분(조립 성분(1))의 3' 단부에 하이브리드화한다. 보다 구체적으로, 3' 요소는 상류 조립 성분(조립 성분(1))의 분절 D의 3' 말단 또는 3' 실질적 말단 서열에 하이브리드화한다(예를 들어, 도 5b를 참조하시오).
스플린트는 전형적으로 짧은 서열 또는 인덱스 영역의 용융 온도보다 낮은 용융 온도를 갖는 서열이다. 일부 실시양태에서, 각 스플린트 요소는 반응 조건 하에서 하이브리드화를 구동하기에는 그 자체로는 불충분하도록 설계된다. 대신에, 스플린트 서열은 인덱스 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 인덱스 서열에 대한 하이브리드화를 통해 조립 성분이 제 위치에 유지될 때 조립 성분 올리고뉴클레오타이드에 일시적으로만 하이브리드화하도록 설계된다. 하나의 양태에서, 스플린트 서열의 5' 요소 및 3' 요소는 개입하는 뉴클레오타이드 없이 연속적이다. 하나의 양태에서, 스플린트 서열의 5' 요소 및 3' 요소는 실질적으로 연속적이다, 예를 들어 개입하는 소수(1, 2 또는 3개)의 뉴클레오타이드가 5' 요소와 3' 요소 사이에 존재하고, 상기 개입하는 소수의 뉴클레오타이드는 조립 성분의 어느 한 조립 서열에 결합하도록 의도되지 않는다. 스플린트 서열의 5' 요소 및 3' 요소는 독립적으로 길이가 약 5개 뉴클레오타이드 내지 약 25개 뉴클레오타이드, 또는 약 5개 뉴클레오타이드 내지 약 20개 뉴클레오타이드, 또는 약 8개 뉴클레오타이드 내지 약 15개 뉴클레오타이드, 또는 약 10개 뉴클레오타이드 내지 13개 뉴클레오타이드일 수 있다. 스플린트의 5' 요소 및 3' 요소는 일반적으로 유사한 용융 온도를 갖는다. 스플린트 요소의 용융 온도는 인덱스 요소의 용융 온도보다 낮다. 스플린트 요소의 용융 온도의 선택은 조립 단계에서 사용되는 리가제의 영향을 받는다. 일부 양태에서, 스플린트 요소의 용융 온도(Tm)는, Tm = (2*(A개수 + T개수))+(4*(C개수 + G개수))-7)에 의해 계산될 때, 10℃ 내지 80℃, 14℃ 내지 44℃, 20℃ 내지 42℃, 또는 22℃ 내지 40℃의 범위일 수 있다. 당업자는 다양한 스플린트 용융 온도가 다양한 리가제, 예를 들어 더 높은 온도에서 사용될 수 있는 리가제에 대해 선택될 수 있음을 인식할 것이다, 예를 들어 열안정성 리가제, 예를 들어 9°N™ DNA 리가제(New England Biolabs, Ipswich, MA)는 용융 온도가 더 높은 스플린트와 함께 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 인덱스 스플린트는 인덱스 스플린트의 특정한 구조적 특징(예를 들어, 인덱스 서열 및 스플린트 서열) 사이에 링커인 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서 스페이서의 길이는 1 내지 30개 뉴클레오타이드일 수 있다. 스페이서는 조립 서열이나 인덱스 서열에 하이브리드화하지 않도록 설계된 임의의 서열 또는 비-핵산 성분이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 단독중합체 서열과 같은 단순한 서열이거나 다이뉴클레오타이드 또는 트라이뉴클레오타이드 반복과 같은 짧은 반복 서열일 수 있다. 일부 양태에서, 인덱스 스플린트는 도 5a에 예시된 바와 같이 2개의 스페이서 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 인덱스 스플린트는 하나 이상의 추가적인 구조적 특징을 연결하기 위해 2개 이상의 스페이서 서열을 갖는다. 예를 들어, 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 반복적인 조립 적용을 위한 인덱스 스플린트는 제2 스플린트 요소 및 제3 인덱스 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 스페이서 서열은 선택적으로 특정한 구조적 특징들을 분리할 수 있다.
조립 성분
일부 실시양태에서, 조립 성분은 최종 작제물 조립에 존재하기를 원하는 서열 및 인덱스 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 분자이다. 조립 성분에서 인덱스 서열의 위치는 성분이 의도된 결찰 반응에서 왼쪽(상류) 성분인지 오른쪽(하류) 성분인지에 따라 달라진다.
전형적으로, 상류 조립 성분에서, 인덱스 스플린트 서열은 조립 성분 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 또는 실질적으로 5' 말단에 위치한다. 조립 서열은 조립 성분 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 영역에 위치한다. 하나의 양태에서, 인덱스 서열은 조립 서열와 연속적이다. 다른 양태에서, 추가 서열(구조적 특징)이 인덱스 서열와 조립 서열 사이에 위치할 수 있다. 이러한 구조적 특징은 하기 중 하나 이상일 수 있다: 적어도 하나의 프라이머 서열, 적어도 하나의 바코드 서열 및/또는 적어도 하나의 제한 효소 절단 부위. 양태에서, IIS형 제한 효소 부위가 조립 서열의 바로 상류에 있다. 예를 들어, 도 8, 분자(c)를 참조하시오. 이러한 양태에서, IIS형 제한 효소 부위는 절단 부위에서의 효소적 절단이 조립 서열로부터 비-조립 서열을 모두 분리하도록 위치한다. 이러한 양태는 첫 번째 조립 단계의 생성물이 후속 조립 단계에서 성분으로서 사용되는 방법의 반복적인 버전에 유용하다.
전형적으로, 하류 조립 성분에서, 인덱스 스플린트 서열은 조립 성분 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 실질적으로 3' 말단에 위치한다. 조립 서열은 조립 성분 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열에 위치한다. 하나의 양태에서, 인덱스 서열은 조립 서열(분절 E)과 연속적이다. 다른 양태에서, 조립 서열(분절 E)과 인덱스 서열(분절 F) 사이에 추가 서열이 위치할 수 있다. 이러한 서열은 하기 중 하나 이상일 수 있다: 적어도 하나의 프라이머 서열, 적어도 하나의 바코드 서열, 및 적어도 하나의 제한 효소 절단 부위. 양태에서, IIS형 제한 효소 부위가 조립 서열의 바로 하류에 있다. 예를 들어, 도 8, 분자(a)를 참조하시오. IIS형 제한 효소 부위는 절단 부위에서의 효소적 절단이 조립 서열로부터 비-조립 서열을 모두 제거하도록 위치한다. 이러한 양태는 첫 번째 조립 단계의 생성물이 후속 조립 단계에서 성분으로서 사용되는 방법의 반복적인 버전에 유용하다.
방법
본 개시내용은 결찰 생성물(다성분 조립체)을 생성시키기 위해 2개의 핵산 조립 성분을 조립하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 상류 조립 성분, 및 하류 조립 성분을 반응 혼합물에 존재하는 인덱스 스플린트에 하이브리드화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하이브리드화된 구조에서, 상류 조립 성분의 5' 단부 및 3' 단부 둘 다는 인덱스 스플린트에 하이브리드화되고, 하류 조립 성분의 5' 단부 및 3' 단부 둘 다는 인덱스 스플린트에 하이브리드화된다. 하이브리드화 단계 다음에는 결찰 단계가 이어진다. 결찰 단계에서, 상류 조립 성분의 3' 단부가 하류 조립 성분의 5' 단부에 결찰되어, 제1 결찰 생성물을 생성시킨다. 하나의 양태에서, 반응 혼합물은 다중화되고, 다수의 상류 조립 성분 종, 다수의 하류 조립 성분 종, 및 다수의 인덱스 스플린트 분자 종을 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다. 다수의 인덱스 스플린트 분자 종 각각은 혼합물 내의 미리 결정된 상류 조립 성분, 및 미리 결정된 하류 조립 성분에 하이브리드화할 수 있다.
이 방법은 수용액 중에서 수행된다. 수용액은 하이브리드화 단계 및 결찰 단계 모두에서 동일할 수 있다. 결찰 단계를 위한 수용액은 방법에 사용되는 리가제에 적합한 적절한 pH 및 염 농도를 갖는 임의의 수용액일 수 있다. 반응 용액은 전형적으로는 완충되고 하나 이상의 염을 포함하며, 선택적으로 리가제에 적합한 PEG(폴리에틸렌 글리콜)와 같은 분자 크라우딩제(crowding agent)를 포함할 수 있다. 동일한 수용액이 하이브리드화 단계 및 결찰 단계 모두에 사용되는 일부 실시 양태에서, 완충액의 성분은 최고의 결과를 달성하기 위해, 리가제 효소에 다소 유리하거나 하이브리드화 반응에 다소 유리하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 용액 내 마그네슘 농도가 보다 엄격한 하이브리드화 단계를 지원하는 경우, 상기 마그네슘 농도는 리가제 반응에 이상적인 농도보다 약간 낮거나 상당히 높도록 선택될 수 있다.
하이브리드화 단계는, 인덱스 스플린트 및 2개의 조립 성분을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 구조를 형성하기에 충분한 시간 동안 상기 반응을 상승된 온도에서 더 낮은 온도로 냉각시키는 수욕에서 배양함으로써 수행될 수 있다. 하이브리드화 단계의 온도 프로파일은 인덱스 서열의 Tm 및 스플린트 영역의 Tm에 의해 결정된다. 예를 들어, 하이브리드화 단계는 더 높은 온도에서 시작된 후 냉각 기간이 이어질 수 있다. 시작 온도는 인덱스 서열의 Tm을 초과하여 임의의 2차 구조를 용융시킨다. 예시적인 온도 프로파일은 약 95℃에서 약 40℃까지, 예를 들어 93℃에서 40℃까지이다. 하이브리드화 냉각 기간은 약 15분 내지 수 시간의 범위일 수 있다. 예시적인 기간은 1.75시간이다. 하나의 양태에서, 하이브리드화 단계는 1.75시간에 걸쳐 93℃에서 44℃까지의 냉각을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하이브리드화 단계의 온도는 시간에 따라 변할 수 있거나 여러 주기에 걸쳐 더 높은 온도에서 더 낮은 온도로 순환될 수 있다.
결찰 단계는 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드 구조를 리가제와 접촉시킴으로써 수행된다. 반응 혼합물의 온도를 사용되는 리가제에 적합한 온도로 변경시킬 수 있으며, 일부 실시양태에서 온도는 인덱스 요소의 용융 온도보다 낮고 스플린트 요소의 용융 온도보다 높다. 예를 들어, 하이브리드화 후, 반응 혼합물의 온도를 약 45 내지 약 70℃, 약 45 내지 65℃, 약 50 내지 65℃, 또는 약 61℃ 내지 65℃ 등의 범위로 증가시키고, 이어서 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드 구조를 열안정성 리가제와 접촉시킨다. 비-열안정성 리가제의 경우 더 낮은 온도가 사용될 수 있다. 결찰 단계는 수 분에서 수 시간까지 적절한 시간 동안 수행된다. 선택적으로, 결찰 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 종료된다. 예를 들어, 리가제를 고온에 의해, 화학적 변성제에 의해 변성시키거나, 또는 (결찰 반응에 필요한 마그네슘을 결합시키기 위해) EDTA를 첨가할 수 있다.
이 방법은 어떤 리가제로도 수행될 수 있다. DNA 및 RNA 리가제를 상업적으로 입수할 수 있다. 대안적으로, 리가제를 화학적으로 합성할 수 있거나(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, 2nd Edition, W.H. Freeman & Co., NY, 1992]을 참조하시오) 세포에서의 발현과 같은 분자 생물학 방법을 통해 재조합적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 재조합 리가제를 정제를 돕기 위해 융합 단백질로서 제조할 수 있다. 특정 양태에서, 리가제는 정제된 형태 또는 분리된 형태로 제공된다. 특정 실시양태에서, 리가제는 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99% 순도로 제공된다. 특정 실시양태에서, 리가제는 조성물의 일부로서 제공된다. 특정 실시양태에서, 리가제는 다성분 구조의 조립을 위한 조성물로서 사용되거나 이에 포함되기에 적합한 수성 조성물로서 제공된다. 당업자는 이러한 리가제 반응 조성물에 포함될 수 있는 다양한 물질을 잘 알고 있다.
리가제의 선택은 결찰 단계의 온도에 영향을 미친다. 다양한 리가제는 다양한 효율성, 다양한 온도에서의 다양한 활성, 결찰 부위의 불일치에 대한 민감도가 다를 수 있다. 더 낮은 온도 범위에서 기능하는 중온성(mesophilic) DNA 리가제의 다수의 예가 존재한다. 열안정성 리가제도 또한 이용 가능하다. 열안정성 리가제는 더 높은 온도(예를 들어, 최대 65℃)에서 리가제 반응 조건을 허용한다. 더 높은 온도 반응 조건은 보다 정확한 조립 작제물에 기여할 수 있다. 하나의 양태에서, 열안정성 리가제는 결찰 부위에서 결찰이 발생하기 전에 더 큰 공간(footprint) 요구사항(예를 들어, 약 25개의 뉴클레오타이드 하이브리드화된 서열)을 갖는다. 이러한 특징은 더 큰 특이성에 기여하여 결찰된 생성물의 순도를 향상시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 다중 리가제가 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 동일한 하이브리드화 반응에 상이한 리가제를 순차적으로 첨가할 수 있다. 하나의 양태에서, 동일한 반응에 다양한 리가제가 포함될 수 있다. 예를 들어, 중온성 리가제 및 열안정성 리가제가 반응에 포함될 수 있으며, 호열성 리가제의 온도를 올리기 전에 중온성 리가제를 더 낮은 온도에서 사용할 수 있다. 이러한 실시양태는 하나의 예측된 용융 온도로 설계된 인덱스 서열의 한 세트를 포함하는 서열 라이브러리로 방법을 실행하는데 적용될 수 있는 반면, 라이브러리 내의 인덱스 서열의 제2 세트는 다른 용융 온도로 설계될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 성분의 농도는 결찰 정확도에 영향을 미치는 반응 매개변수이다. 올리고뉴클레오타이드 성분의 농도가 높으면 잘못된 결찰 결과가 나올 가능성이 높아진다. 따라서 농도가 낮을수록 결찰 생성물의 정확도가 향상될 수 있다.
일반적으로, 하이브리드화 조건, 하이브리드화된 서열의 길이 및 결찰 조건을 정확하게 조립된 작제물의 최고 수율을 달성하기 위해 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 일련의 조건으로 인해 특정 성분 세트에 대해 잘못된 조립이 발생하는 경우, 더 높은 결찰 온도 및/또는 더 엄격한 하이브리드화 조건을 사용할 수 있다. 하이브리드화 조건 및 리가제 조건을 최적화하는 것은 본 개시내용 및 당업계의 통상적인 지식을 고려하여 당업자의 범위 내에 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)] 또는 문헌[Anderson, Nucleic Acid Hybridization, 1st Ed., BIOS Scientific Publishers Limited (1999)]을 참조하시오.
하나의 양태에서, 방법은 도 2의 인덱스 스플린트를 사용하고 적어도 하나의 차단 뉴클레오타이드를 추가로 포함하여 수행될 수 있다. 도 6은 올리고뉴클레오타이드 구조를 도시하며, 여기서 올리고뉴클레오타이드 구조는 조립 성분의 조립 서열에서 단일-가닥 영역에 하이브리드화된 적어도 하나의 차단 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 변형은 의도하지 않은 하이브리드화를 방지하기 위해 고려된다. 차단 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥 영역의 일부 또는 전부를 차단하도록 설계될 수 있다. 도 6의 묘사된 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드 구조는 2개의 추가 올리고뉴클레오타이드 가닥을 포함하며, 하나는 조립 성분(1) 서열에 하이브리드화되고 다른 하나는 조립 성분(2) 서열에 하이브리드화된다. 차단 올리고뉴클레오타이드는 도 6에 묘사된 인덱스 스플린트 분자의 2개의 올리고뉴클레오타이드 분자의 일부로서 합성될 수 있는 것으로 고려된다. 차단 올리고뉴클레오타이드는 또한 도 5의 올리고뉴클레오타이드 구조 또는 본 발명의 다른 실시양태에서 사용될 수 있다. 차단 올리고뉴클레오타이드는 도 5에 묘사된 인덱스 스플린트 분자의 일부로서 합성될 수 있는 것으로 고려된다.
상기 방법을 반복적으로 수행할 수 있다. 하나의 양태에서, 하류 조립 성분은 3' 단부에 제거 가능한(분리 가능한) 인덱스 서열을 포함한다. 조립 성분을 포함하는 결찰 생성물을 제공하기 위한 하이브리드화 및 결찰 단계 후에, 인덱스 서열을 제거하여(예를 들어 효소적 절단 또는 절단 가능한 링커의 절단을 통해), 결찰된 생성물의 3' 말단 서열이 조립 서열의 3' 서열이 되게 한다. 이 첫 번째 결찰된 생성물은 두 번째 결찰된 생성물을 생성하기 위한 방법의 또 다른 반복에서 상류 조립 성분으로 이용될 수 있다. 반응 혼합물은, 첫 번째 결찰된 생성물 및 또 다른 하류 조립 성분에 하이브리드화하는 인덱스 스플린트 분자를 포함한다.
하나의 양태에서, 제거 가능한(또는 분리 가능한) 인덱스 서열은 제한 효소 부위를 포함한다. 하나의 양태에서, 제한 효소 부위는 IIS형 제한 효소에 대한 것이다. IIS형 제한 효소는, 비대칭 DNA 서열을 인식하고 그의 인식 서열 밖의 정의된 거리(대개는 1 내지 20개 뉴클레오타이드 이내)에서 절단하는 특정 효소 그룹을 포함한다. IIS형 제한 효소의 이러한 특정 절단 작용 방식은 원하는 조립 서열이 유지되고 비-조립 서열이 제거되도록 절단을 허용한다. 이는 최종 조립 서열을 변경하지 않는 DNA 조작을 허용하며 따라서 다성분 작제물에서 흉터없는 연결부위의 생성을 가능하게 한다.
하나의 양태에서, 제거 가능한(또는 탈착 가능한) 인덱스 서열은 절단 가능한 링커에 의해 조립 서열에 연결되는 인덱스 서열일 수 있다. 광절단성 링커 화학은 당업계에 공지되어 있으며 TriLink Biotechnologies, Integrated DNA Technologies 및 Glen Research로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
하나의 양태에서, 이 방법은 도 7 내지 9에 예시된 바와 같이 4-부분 조립이며, 여기서 조립 과정은 첫 번째 조립의 결찰 생성물에 대해 반복된다. 이 양태에는 제한 효소 절단 단계에 의해 분리된 2개의 결찰 단계가 존재한다. 하이브리드화 단계는 도 7에 묘사된 바와 같이 2개의 올리고뉴클레오타이드 구조를 형성한다. 도 7에 묘사된 상부 올리고뉴클레오타이드 구조에서, 올리고뉴클레오타이드 구조는 도 5b에 예시된 배향이다(그러나 이는 도 5c에 묘사된 배향으로 설계될 수 있다). 인덱스 스플린트 분자는 5'에서 3'으로, 하류 조립 성분(2)에 하이브리드화되어 인덱스(2)를 형성하는 제1 인덱스 서열, 스플린트 서열(스플린트(1)), 및 상류 조립 성분(1)에 하이브리드화되어 인덱스(1)을 형성하는 제2 인덱스 서열을 포함한다. 스플린트(1)은 상류 조립 성분(1)의 3' 말단 서열 및 하류 조립 성분(2)의 5' 말단 서열에 하이브리드화된다. 제1 스플린트 구조(스플린트(1)) 외에도, 상부 올리고뉴클레오타이드 구조의 인덱스 스플린트는, 스페이서 섹션에 제2 스플린트 서열(스플린트(2)), 및 5' 인덱스 서열(인덱스(2))과 제1 스플린트 구조(스플린트(1)) 사이에 또 다른 인덱스 서열(인덱스(3))을 추가로 포함한다. 하류 조립 성분(2)는 조립 서열의 3'에 제한 효소 서열인 추가적인 구조적 특징을 포함한다(도 8에 묘사됨).
도 7에 묘사된 하부 올리고뉴클레오타이드 구조에서, 올리고뉴클레오타이드 구조는 도 5c에 예시된 배향이다(그러나 이는 도 5b의 배향으로 설계될 수 있다). 인덱스 스플린트 분자는 5'에서 3'으로, 상류 조립 성분(3)에 하이브리드화되어 인덱스(4)를 형성하는 제1 인덱스 서열, 스플린트 서열(스플린트(3)), 및 하류 조립 성분(4)에 하이브리드화되어 인덱스(5)를 형성하는 제2 인덱스 서열을 포함한다. 스플린트(3)은 상류 조립 성분(3)의 3' 말단 서열 및 하류 조립 성분(4)의 5' 말단 서열에 하이브리드화된다. 하부 올리고뉴클레오타이드 구조의 인덱스 스플린트는 5' 인덱스 서열(인덱스(4))과 스플린트(3) 사이에 인덱스(3)의 상보적 서열(인덱스(3) 보체)을 추가로 포함한다.
결찰 단계는 각각 도 8, 구조(a) 및 (c)에 예시된 바와 같이, 성분(1&2)의 결찰 생성물, 조립된 생성물(1-2), 및 성분(3&4)의 제2 결찰 생성물, 조립된 생성물(3-4)를 생성시킨다. 도 8에 예시된 바와 같이, 상부 구조(a)의 인덱스 스플린트는 조립 성분 2의 조립 서열의 제한 효소 부위(RE 절단부위) 3' 및 인덱스 2에 대한 5'를 포함한다. 구조(c)의 인덱스 스플린트는 조립 성분(3)의 조립 서열의 제한 효소 부위 5' 및 인덱스(3)의 3'을 포함한다. 인덱스 스플린트는 하기 2개의 추가의 구조적 특징을 포함한다: 스플린트(2)와 인덱스(4)에 대한 인덱스 서열 사이에 위치하고, 상기 인덱스 서열은 인덱스(3)을 형성하는 보체 서열 및 인덱스(4)에 대한 인덱스 서열의 제한 효소 부위 5'이다. 결찰 생성물은 IIS형 제한 효소 절단이 가해져 조립된 생성물(1-2) 및 조립된 생성물(3-4)의 제한 효소 부위를 절단하여 각각 인덱스(2) 및 인덱스(4)를 제거한다. 결과적으로, 결찰 생성물(1-2)의 절단 생성물은 상류 조립 성분일 수 있고, 결찰 생성물(3-4)의 절단 생성물은 이 방법의 또 다른 반복에서 하류 조립 성분일 수 있다. 절단 생성물은 예를 들어 SPRI 정제(예를 들어, SPRI는 고체상 가역적 고정화를 나타낸다)에 의해 정제된 후 하이브리드화 단계를 거칠 수 있다. 하이브리드화 단계는 도 9에 예시된 올리고뉴클레오타이드 구조를 생성시킨다. 예시된 바와 같이, 이중-가닥 인덱스(3)은 2개의 인덱스 스플린트 분자의 인덱스(3) 서열의 하이브리드화에 의해 형성된다. 스플린트(2)는 조립 성분에 하이브리드화하여 결찰 부위를 형성하는 역할을 하고; 5' 요소는 조립된 생성물(3-4)의 5' 단부에 결합하고 3' 요소는 조립된 생성물(1-2)의 3' 단부에 결합한다. 두 번째 결찰 단계가 수행되어 다성분 결찰 생성물(1-2-3-4)(도시되지 않음)가 생성된다. 두 번째 결찰 단계의 생성물은 선택적으로 SPRI로 정제되고 PCR을 통해 증폭될 수 있다.
본원에서, 2개의 상보적 인덱스 서열을 갖는 공통 인덱스 스플린트 분자에 대한 2개의 조립 성분의 대향 단부의 하이브리드화가 양호한 특이성을 제공하는 인덱스 기반 결찰을 나타낸다. 예를 들어, 인덱스 요소의 용융 온도(Tm)는 2개의 하이브리드화된 스플린트 요소 각각의 용융 온도(Tm)보다 높을 수 없다. 이러한 방식으로, 인덱스 결합은 하이브리드화 조건 하에서 안정적인 반면, 스플린트 결합은 준안정적이다. 따라서 특별히 설계된 인덱스 서열은 하이브리드화 반응을 구동하고 스플린트 서열과 반응 혼합물의 의도하지 않은 표적 사이의 원하지 않는 결합을 피할 수 있다.
훨씬 더 큰 생성물을 조립할 때도 동일한 과정을 반복할 수 있다.
개시된 방법의 변형에 의해 특이성을 개선할 수 있는 조건이 있을 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 하기는 인덱스 서열의 용융 온도를 높여 특이성을 증가시키는 방법을 기재한다. 이 양태는 또한 2 단계 결찰 과정에 의존한다. 간단히 말하면, 도 10-13에 예시된 바와 같이, 첫 번째 연결 단계에서 2개의 조립 성분 올리고는, 서로 인접한 2개의 인덱스 서열을 포함하지만 스플린트 영역을 포함하지 않는 분자에 하이브리드화되고(도 10의 "인덱스 스플린트"를 참조하시오) 이의 인덱스 서열에서 함께 결찰되어 첫 번째 결찰 단계에서 훨씬 더 긴 올리고를 형성시킨다(도 11을 참조하시오). 첫 번째 결찰 단계(인덱스 서열의 단부 결찰) 후에, 온도를 상보적인 스플린트 서열을 갖는 인덱스 서열의 용융 온도 이상으로 증가시킬 수 있으며, 제2 분자(2개의 조립 표적에 하이브리드화하는 "작제물 스플린트")를 더 높은 온도에서 첨가하여(도 12b를 참조하시오) 보다 큰 엄격성을 허용하여 상동성 작제물간의 교차-하이브리드화 가능성을 감소시키고, 이에 따라 이전에 기재된 실시양태보다 잠재적으로 훨씬 더 양호한 특이성을 허용한다. 각 분자에 대한 두 번째 결찰 사건은, 제1 결찰 생성물의 자유 단부가 스플린트 올리고와 하이브리드화되고 이어서 결찰되어 단일-가닥 루프를 형성하는 동안 발생한다(도 13을 참조하시오). 루프의 형성을 안정화하기 위해, 제2 스플린트의 섹션 중 하나는, 한쪽 단부에서 안정적인 듀플렉스를 형성하는 다른 섹션보다 실질적으로 길어질 수 있는 반면, 다른 쪽 단부는, 결찰되어 루프를 형성하기 위해 듀플렉스된 단부와 짧게 접촉하면 된다. 또한, 첫 번째 결찰 단계 이후 완충액을 더 첨가하여 용액을 희석함으로써 키메라 형성을 억제할 수 있다. 이는 용액의 엔트로피를 증가시켜 분자간 결찰에 대한 분자 내 결찰 및 루프 형성 가능성을 증가시킨다.
도 10에 예시된 바와 같이, 두 조립 성분은 한 조립 성분의 5' 단부에 있는 인덱스 서열 및 다른 조립 성분의 3' 단부에 있는 인덱스 서열에 의해 스플린트 분자에 하이브리드화된다. 결찰 후, 결찰 생성물은 2개의 조립 성분을 포함하며, 여기서 2개의 인덱스 서열은 결찰된 생성물의 중간에서 인접하고 서로 결찰된다. 도 11을 참조하시오. 결찰 후 결찰 생성물은 현재 결찰된 2개의 인덱스 서열(인덱스(1)-인덱스(2))에 의해 인덱스 스플린트에 하이브리드화된 상태로 유지되며 용융 온도가 상당히 증가한다. 예를 들어, 각각의 인덱스 서열이 30개 뉴클레오타이드 길이이고 각각의 인덱스 요소가 약 69℃의 용융 온도를 갖는 양태에서, 듀플렉스 내 두 인덱스 서열의 결합된 용융 온도는 약 86℃인 평균 온도보다 약 17℃ 더 높다. 이는 듀플렉스의 변성 없이 반응 용액의 온도를 80도 이하의 온도까지 올릴 수 있음을 의미한다.
선택적으로, 이 방법의 단계 사이에서, 예를 들어 하이브리드화 용액을 세척하여 반응 용액을 세척함으로써 반응 용액으로부터 결합되지 않은 단편 또는 결찰되지 않은 생성물을 제거할 수 있다. 선택적으로, 이러한 제거는 인덱스 스플린트 올리고를 고체 지지체에 결합시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 인덱스 스플린트 올리고는 그의 3' 단부(도 11을 참조하시오) 또는 5' 단부에 부착된 비오틴을 가질 수 있다. 이어서 올리고 듀플렉스를, 통상적으로 표적 강화에 사용되는 자성 스트렙트아비딘 비드에 결합시킬 수 있다. 이들을 통상적으로 SPRI 비드를 사용하여 수행되는 것처럼, 튜브 내에서 혼합하고 수 분 동안 배양한 다음, 강한 구배 자기장을 통해 튜브의 측면이나 바닥으로 당길 필요가 있다. 이어서, 하이브리드화 용액을 회수하고, 용기를 다시 충전하고 결찰된 생성물을 튜브의 세척 완충액으로 1회 또는 수회 세정함으로써 세척 단계를 수행할 수 있다. 이렇게 하면 결찰되지 않은 올리고뉴클레오타이드의 농도가 감소하고 두 번째 결찰 단계에서 잘못된 결찰이 발생할 가능성이 줄어든다.
결찰된 생성물을, 물 또는 보다 엄격한 결찰 완충액을 첨가하거나 또는 완충액에 적합한 용융 온도 이상으로 가열함으로써 듀플렉스로부터(따라서 비드로부터) 방출시킬 수 있다. 9°N™ 리가제(NEB, Ipswich, MA)와 같은 열안정성 리가제를 리가제 완충액에 첨가하고 온도를 80℃ 이상으로 증가시키거나 다른 열안정성 리가제가 활성 상태를 유지하는 최고 온도까지 증가시킬 수 있으며, 이 시점에서 결찰 생성물의 자유 단부에 대한 스플린트 분자를 튜브에 첨가할 수 있다. 대안적으로, 가열하기 전에 스플린트를 혼합물에 첨가하고 가열 후에 리가제를 첨가할 수 있다. 이 단계는 용액 중의 올리고를 사용하거나 자기 비드에 결합된 상태로 수행될 수 있다. 이 두 번째 결찰 사건은 도 12 및 13에 묘사되어 있다. 결찰 반응 기간 후, EDTA를 첨가하거나 단순히 실온으로 또는 실온에서 빠르게 냉각시킴으로써 결찰 반응을 중단시킬 수 있다.
도 13은 예를 들어 프라이머 결합 부위(PBS(1) 및 BPS(1)) 및 선택적 제한 효소 부위를 포함하여, 올리고상의 선택적인 추가의 구조적 특징을 도시한다. 증폭을 PCR 또는 회전 환 증폭(rolling circle amplification)을 통해 수행할 수 있다. 회전 환 증폭은 루핑된 올리고의 프라이머 결합 부위에 상보적인 단일 프라이머, 및 박테리오파지 phi29 DNA 폴리머라제와 같은 진행성(processivity)이 높은 DNA 폴리머라제를 튜브에 첨가함으로써 수행된다. 대안적으로, PCR은 폴리머라제, 한 쌍의 프라이머 및 dNTP에 의해 수행되고 이어서 열 순환기에서 열 순환시킴으로써 수행될 수 있다.
때때로 조립된 생성물의 PCR 증폭 중에 결찰되지 않은 올리고뉴클레오타이드가 폴리머라제에 의해 확장되어 원치 않는 키메라를 생성할 수 있다. 원형화된 DNA를 생성시키는 도 12 및 13에 예시된 실시양태는 엑소뉴클레아제 단계를 추가함으로써 이러한 키메라 생성을 감소시킬 수 있다. 이 추가 단계에서, 엑소뉴클레아제를 사용하여 5' 단부로부터 단일-가닥 DNA 및 이중-가닥 DNA를 절단하면서 원형 DNA 조립체를 남길 수 있다. 엑소뉴클레아제 단계는 PCT 증폭 전에 수행되어야 한다. 절단 과정은 EDTA를 첨가하거나 반응 혼합물을 75℃로 가열하여 효소를 사멸시키거나, 또는 두 가지 모두를 통해 중단될 수 있다. 이러한 원형 작제물은 후속적으로 PCR에 의해 증폭되거나, 또는 phi29와 같은 진행성 폴리머라제를 사용하는 회전 환 증폭에 의해 증폭된다.
하나의 양태에서, 도 10의 두 조립 성분을 결찰하는 첫 번째 결찰 단계가 생략된다. 제2 스플린트("작제물 스플린트")는 두 조립 성분의 5' 및 3' 자유 단부에서 작제물 서열에 하이브리드화하고, 이어서 결찰된다.
도 10-13과 관련된 또 다른 실시양태에서, 인덱스 스플린트 및 작제물 스플린트는 링커 분자 또는 서열(도 12a에서 "선택적 테더")에 의해 연결된다. 이 분자는 도 5a의 인덱스 스플린트의 성분을 가지지만 5'에서 3' 순서가 상이하다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 다성분 작제물은 먼저 본 개시내용에 따라 용액 중에서 조립될 수 있으며, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 조립 후 고체 기질에 부착될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은, 다성분 작제물이 조립 후 어레이 기질에 부착되는 다성분 구조물의 어레이를 제조하는 데 사용될 수 있다. 후속적으로, 다성분 작제물 또는 다성분 작제물의 풀 또는 다수의 풀은 임의로 및 선택적으로 어레이 기질로부터 절단되어 라이브러리 또는 라이브러리들로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 다성분 작제물을 비드에 부착시킬 수 있다. 작제물을 화학적 수단이나 특정 하이브리드화를 통해 비드에 부착시킬 수 있다. 부착 방법에 따라, 상이한 비드를 사용하여 특정 작제물을 캡처하거나, 또는 하나의 비드가 여러 작제물을 캡처할 수 있다. 라이브러리를 비드에 부착시키면, 라이브러리를 보관, 세척, 농축 또는 효소적으로 조작하는 데 이점을 제공할 수 있다.
키트
본 개시내용은 또한 개시된 방법을 수행하는데 유용한 키트를 제공한다. 하나의 양태에서, 적어도 한 가지 유형의 상류 조립 성분, 한 가지 유형의 하류 조립 성분을 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 라이브러리, 및 상기 조립 성분의 결찰을 지시하기 위한 인덱스 스플린트, 및 DNA 리가제를 포함하는, 상술한 방법을 수행하기 위한 시약을 함유하는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 다른 반응 성분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적절한 양의 하나 이상의 반응 성분이 하나 이상의 용기에 제공되거나 기질 상에 유지된다. 키트의 추가 성분의 예에는 반응 완충액, 결찰 생성물을 검출하기 위한 하나 이상의 시약(예를 들어, 탐침 또는 PCR 프라이머) 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 사용되는 반응 성분은 다양한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분(예를 들어, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 탐침 및/또는 프라이머)은 수용액에 현탁되거나 비드에 결합되거나 동결 건조되거나 동결건조된 분말 또는 펠릿으로 존재할 수 있다. 본 개시내용의 키트는 임의의 적합한 온도에서 제공될 수 있다. 예를 들어, 단백질 성분 또는 그 복합체를 액체에 함유한 키트를 보관하려면 0℃ 미만, 바람직하게는 약 -20℃에서, 가능하면 글리세롤 또는 다른 적합한 부동액을 함유하는 동결 방지 용액에 제공하고 유지시키는 것이 바람직하다.
키트 또는 시스템은 적어도 하나의 분석에 충분한 양으로, 본원에 기재된 성분의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 일부 적용에서, 하나 이상의 반응 성분은 개별적인, 전형적으로 일회용인 튜브 또는 동등한 용기에 미리-측정된 단일 사용 양으로 제공될 수 있다. 키트에 공급되는 성분의 양은 적절한 양일 수 있으며 생성물이 대상이 되는 시장에 따라 달라질 수 있다. 성분이 공급되는 용기(들)는 공급된 형태를 유지할 수 있는 임의의 통상적인 용기, 예를 들어 미세원심분리기, 미세적정 플레이트, 앰플, 병, 또는 일체형 시험 장치, 예를 들어 유동 장치, 카트리지, 측류, 또는 기타 유사한 장치일 수 있다.
키트는 또한 용기 또는 용기들의 조합을 유지하기 위한 패키징 물질을 포함할 수 있다. 이러한 키트 및 시스템의 전형적인 패키징 물질은 반응 성분 또는 검출 탐침을 다양한 배열 중 어느 하나에서(예를 들어, 바이알, 미세적정 플레이트 웰, 마이크로어레이 등에서) 유지하는 고체 매트릭스(예를 들어, 유리, 플라스틱, 종이, 호일, 미세-입자 등)를 포함한다. 키트는 상기 성분의 사용을 위해 유형의 형태로 기록된 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
개시된 조립 방법은 인덱스 스플린트 분자의 인덱스 서열과 조립 성분 분자 간의 안정적이고 특정한 하이브리드화에 의존한다. 대조적으로, 직접 조립을 위해 스플린트를 활용하는 선행 기술 방법은 스플린트 분자와 2개의 조립 성분 사이의 안정하고 특정한 하이브리드화에 의존한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 개시내용의 접근법(도 5a 내지 5c)과 종래 기술의 접근법 사이의 근본적인 차이점은, 상기 개시된 방법에서는 원하는 조립 서열이 조립될 조각을 결찰 위치로 가져오는 데 사용되지 않는다는 점이라고 여겨진다. 개시된 조립 방법의 스플린트 서열은 너무 짧아서 안정한 하이브리드화를 이루지 못하며, 따라서 인덱스 하이브리드화가 없는 조립을 허용하기에 충분하지 않다. 인덱스 스플린트 분자의 인덱스 서열은 작제물 서열의 일부가 아니므로 라이브러리 구성원 간의 상동성에 영향을 받지 않는다. 이는 멀티플렉스 조립의 이전의 고처리량 방법에 비해 예상치 못한 이점이자 개선점이다.
실시예
본 교시의 양태는 하기 실시예에 비추어 더욱 잘 이해될 수 있으며, 이들 실시예는 어떤 방식으로든 본 교시의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
하기 실험은 도 1, 2 및 3에 묘사된 올리고뉴클레오타이드 스플린트 구조를 사용하여 용액 내 상동성이 낮은 라이브러리를 제조하는 것을 평가하기 위해 설계되고 수행되었다. 따라서 세 가지 유형의 시험 스플린트 분자를 평가하였다. "시험 스플린트 분자"라는 용어는 도 1의 단일 스플린트 분자를 지칭한다. 도 2 및 3에서, "시험 스플린트 분자"는 인덱스 요소를 형성하기 위한 상보적 인덱스 서열의 하이브리드화에 의해 형성된 2개의 올리고뉴클레오타이드 구조를 지칭한다. 도 2 및 3의 인덱스 요소는 동일하며, Tm은 60℃ 내지 75℃의 범위에 있다. 하이브리드화된 인덱스의 높은 Tm은 상기 Tm 미만의 온도에서 2개의 뉴클레오타이드 구조를 유효하게 단일 분자로 만든다.
작제물 서열을 상동성이 낮은 게놈 서열 세트인 UTR(번역되지 않은 영역)로부터 취하였다. 140개의 UTR이 조립되었다. 시험된 스플린트 분자의 설계에 따라, 올바른 작제물은 동일한 UTR 서열에 결찰된 UTR 서열이었다. 따라서 140개의 상이한 UTR에 대해 140개의 상이한 시험 스플린트 분자 및 조립이 가능한 총 140개의 올바른 작제물이 존재하였으며, 총 19,460개의 잘못된 작제물이 가능하였다. 전형적으로, 140개의 UTR 각각은 원래 올리고 라이브러리에 두 가지 버전을 가지고 있다: 하나의 버전은 5' 단부에 프라이머 부위를 갖고 다른 버전은 3' 단부에 PCR 증폭을 위한 프라이머 부위를 가지며 MiSeq(Illumina)에 필요한 어댑터가 도입된다.
시험 스플린트 분자 대 작제물의 3개의 비(1:1, 2:1 및 4:1)를 각 유형의 시험 스플린트 분자에 대해 시험하였다. 도 2 및 3의 시험 스플린트 분자(둘 다 인덱스를 가짐)에 대해 +/- 3 뉴클레오타이드 스페이서(기둥(stilt)으로서 지칭됨)를 또한 시험하였다. 3개의 뉴클레오타이드 기둥을 시험 스플린트 분자의 인덱스 부분과 스플린트 부분 사이에 위치시켰다. 그 결과, 이 실험에서 15개의 세트가 조립되었다. 각 세트에는 420개의 상이한 UTR 서열로부터 조립될 수 있는 140개의 올바른 UTR 작제물이 존재하였다. 상이한 세트로부터의 생성물은 서열분석에 의해 구별이 가능하였는데, 이때 상이한 서열은 DNA 라이브러리 물질 생성 시 각 하위세트에 대해 상이한 분자 사본수로 인쇄되었다.
각 세트에 대해, UTR 및 시험 스플린트 분자로부터 올리고 라이브러리를 제조하였다. 약 80 ng의 라이브러리를 용해시키고(키나제 반응 및 리가제 반응 모두에 적합한 완충액 중에) 이어서 DNA 올리고의 5' 말단을 인산화하기 위해서 제조사의 권장 사항에 따라 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(NEB)를 사용하여 키나제 반응을 수행하였다. 키나제 처리된 생성물을 1.75시간에 걸쳐 93℃에서 44℃로 냉각되는 수욕에서 배양하여 하이브리드화시켜 도 1, 2 및 3에 묘사된 올리고뉴클레오타이드 구조를 형성시켰다. 이어서 하이브리드화된 생성물을 결찰 온도까지 가열하고 1 마이크로리터(㎕)의 9°N™ 리가제(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA)를 첨가하였다. 결찰 반응은 1시간 동안 진행되었다. 결찰된 생성물을 1.5x AMPure® XP 비드(Beckman Coulter, Brea, CA)를 사용하여 정제하고 PCR로 증폭시켰다. PCR 산물을 NGS(차세대 서열분석)에 의해 서열분석하여 각 세트의 올바른 조립 정도를 특성화하였다.
결과
NGS 판독 데이터를 도 14에 도시한다. 데이터는 세 가지 유형의 시험 스플린트 분자(도 1, 2 또는 3에 묘사된 올리고뉴클레오타이드 구조의)가 15개 세트 모두에서 작동하였음을 보여준다. 도 1의 시험 스플린트 분자가 가장 잘 작동하였다. 특히, 스플린트/작제물 분자 비가 4:1인 세트는 시험된 3개의 비 중 가장 잘 작동하였으며 올바르게 조립된 작제물에 대한 평균 판독 수는 700에 가까웠다. 도 2 및 3의 데이터는 서로 유사하며, 이때 도 2의 데이터는 올바르게 조립된 작제물에 대한 평균 판독 수가 약간 더 높다는 것을 보여준다. 도 2 시험 스플린트 분자 중의 3개 뉴클레오타이드 기둥의 존재는 도 2 시험 스플린트 분자에 거의 영향을 미치지 않았다. 도 3 시험 스플린트 분자 중의 3개 뉴클레오타이드 기둥의 존재는 기둥이 없는 시험 스플린트 분자에 대한 데이터에 비해 평균 판독 수의 약간의 감소를 초래하였다.
실시예 2
실시예 1의 경우와 상이한 시험 스플린트 분자를 조사하기 위해 하기의 실험을 설계하고 수행하였다. 이 실험은 도 5b의 올리고뉴클레오타이드 구조에 예시된 바와 같은 시험 스플린트 분자를 사용하였다. 시험 스플린트 분자는 인덱스 스플린트 분자이며, 이는 시험 스플린트 분자의 5' 및 3' 말단에 위치한 인덱스 서열을 포함하고 2개의 조립 성분에 결합하는 스플린트 영역의 측면에 위치한 단일 올리고뉴클레오타이드 서열이다. 조립 성분(조립된 작제물을 형성하기 위해 결찰되는 조립 서열을 포함한다)을, 시험 스플린트 분자의 인덱스 서열에 대한 역 보체 서열을 추가로 포함시켜 2개의 위치에서 조립 성분에 시험 스플린트 분자의 하이브리드화가 가능하도록 제조하였다. 왼쪽 조립 성분의 경우, 시험 스플린트 분자는 (1) 왼쪽 조립 성분의 3' 단부의 특정 서열에 결합하는 스플린트 요소에서, 및 (2) 왼쪽 조립 성분의 5' 단부에 있는 인덱스 서열에서 결합한다(하이브리드화하여 인덱스 요소를 형성한다). 오른쪽 조립 성분의 경우, 시험 스플린트 분자는 (1) 오른쪽 조립 성분의 5' 단부의 특정 서열에 결합하는 스플린트 요소에서, 및 (2) 오른쪽 조립 성분의 5' 단부에 있는 인덱스 서열에서 결합한다(하이브리드화하여 또 다른 인덱스 요소를 형성한다). 왼쪽 조립 성분의 3' 말단에 있는 인덱스 요소는 오른쪽 조립 성분의 3' 말단에 있는 인덱스 요소와 상이한 서열을 가지며, 따라서 2개의 별도 인덱스 요소 사이에 교차 하이브리드화가 존재하지 않는다. 왼쪽 조립 성분의 5' 말단에 있는 인덱스 요소는 30개의 뉴클레오타이드로 이루어지고 65-72℃ 범위의 Tm을 가지며, 오른쪽 조립 성분의 3' 말단에 있는 인덱스 요소는 30개의 뉴클레오타이드로 이루어지고 65 내지 72℃ 범위의 Tm을 갖는다.
작제물 서열(2250개 서열)을 상동성이 낮은 게놈 서열 세트인 UTR(번역되지 않은 영역)로부터 취하였다. 조립 서열의 길이는 200개 뉴클레오타이드였다. 조립 성분은 UTR 구성 서열, 인덱스 서열, 바코드 및 프라이머 서열을 포함하였다. 도 15에 예시된 바와 같이, 왼쪽 조립 성분(왼쪽)은 5'에서 3'으로, 인덱스 서열(인덱스 스플린트에 하이브리드화될 때 인덱스(1)을 형성한다), 프라이머 서열(프라이머F), 바코드(BC1), 및 조립 서열을 포함하였다. 오른쪽 조립 성분(오른쪽)은 5'에서 3'으로, 조립 서열, 바코드(BC2), 프라이머 서열(프라이머R) 및 인덱스 서열(인덱스 스플린트에 하이브리드화될 때 인덱스(2)를 형성한다)을 포함하였다.
시험 스플린트 분자는 5'에서 3'으로, 인덱스 서열(오른쪽 조립 성분에 하이브리드화하여 올리고뉴클레오타이드 구조 중에 인덱스(2)를 형성한다), 스페이서(점선), 스플린트 서열, 또 다른 스페이서(점선), 및 또 다른 인덱스 서열(하이브리드화하여 올리고뉴클레오타이드 구조 중에 인덱스(1)을 형성한다)을 포함하였다. 스플린트 서열은 오른쪽 조립 성분의 조립 서열의 5' 말단 서열에 하이브리드화하는 5' 서열 요소, 및 오른쪽 조립 성분의 조립 서열의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는 3' 서열을 함유한다. 스플린트의 5' 서열 요소 및 3' 서열 요소 각각은 길이가 적어도 12개 뉴클레오타이드이고 각각 28℃ 이상의 Tm을 갖는다(식 1: Tm = (2*(A개수 + T개수)) + (4*(C개수 + G개수))-7)을 사용하여 계산된 바와 같다).
실험에 사용된 스플린트 분자의 설계에 의해, 올바른 작제물은 동일한 UTR에 결찰된 UTR이었으며, 400개 뉴클레오타이드 다성분 작제물(비-작제물 서열은 포함하지 않는다)을 생성시켰다. 각 UTR 조립 성분을, 6개의 고유한 바코드 쌍을 추가로 포함하도록 설계하였다. 올바른 작제물은 조립된 작제물에서 왼쪽 및 오른쪽 바코드가 올바르게 쌍을 이루는 것에 의해 표시된다. 따라서, 각 UTR에 대해 6개의 올바른 작제물이 가능하다(및 30개의 잘못된 작제물이 가능하다). 2250개의 상이한 UTR 서열 및 6개의 고유한 바코드 쌍이 시험되었으며, 따라서 총 13,500개의 고유한 인덱스 스플린트 분자(2250 x 6) 및 13,500개의 고유한 올바른 작제물이 가능하다.
UTR 성분 구성 및 인덱스 스플린트 분자를 함유하는 올리고 라이브러리를 제조하였다. 약 80 ng의 라이브러리를 용해시키고, 이어서 DNA 올리고의 5' 말단을 인산화하기 위해, 제조사의 권장 사항에 따라 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(NEB)를 사용하여 키나제 반응을 수행하였다. 키나제 처리된 생성물을 1.75시간에 걸쳐 93℃에서 44℃로 냉각되는 수욕에서 배양하여 하이브리드화시켰다. 이어서 하이브리드화된 생성물을 결찰 온도 60.6℃까지 가열하고 1 마이크로리터(㎕)의 9°N™ 리가제(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA)를 첨가하였다. 결찰 반응은 10분 동안 진행되었다. 결찰된 생성물을 1.5x AMPure® XP 비드(Beckman Coulter, Brea, CA)를 사용하여 정제하고 PCR로 증폭시켰다. PCR 산물을 NGS(차세대 서열분석)에 의해 서열분석하여 올바른 조립 정도를 특성화하였다.
결과
데이터를 도 15의 표에 나타낸다. 13,500개의 가능한 올바른 구성 중에서 13,465개가 10,000,000개 미만의 판독으로 라이브러리를 서열분석함으로써 검출되었다. 조립체의 대향 단부에 위치한 고유한 바코드에 기반하여, 이 데이터는 가능한 올바른 구성의 99.70%가 상기 반응에서 조립되었음을 나타내지만, 바코드 사이의 각 서열의 전장 서열 정확도를 나타내지는 않는다.
따라서, 도 5b의 올리고뉴클레오타이드 구조는 현저하게 많은 수의 올바른 작제물을 가능하게 하였다. 이는 올리고뉴클레오타이드 라이브러리 제조에 있어서 매우 중요한 숫자이다.
실시예 3
하기의 실험을 도 1, 2 및 5b의 올리고뉴클레오타이드 구조를 사용하여 조립을 시험하기 위해 설계하고 수행하였다. 실험은 세 가지 유형의 올리고뉴클레오타이드 라이브러리((a) 복합 라이브러리, (b) 타일(tiled) 라이브러리, 및 (c) 상동성 라이브러리)를 비교하도록 설계되었다. 세 가지 유형의 라이브러리가 도 16에 개략적으로 묘사되어 있다.
이 실험을 위한 복합 라이브러리에서, 서열들은 주변 프라이머 부위를 제외하고 서열의 서열 유사성이 거의 없다. 복합 라이브러리((a)형)는 600개의 개별 UTR 서열(즉, 총 600개의 가능한 올바른 조립 작제물)을 가졌다. 상동성 라이브러리((c)형)는 60개의 개별 UTR 서열을 활용하였으며 각 개별 UTR 서열은 10개의 독특하게 바코딩된 작제물(총 600개의 가능한 올바른 조립 작제물)을 가졌다. 이 실험의 타일 라이브러리에서, 각 구성원은 3개의 다른 구성원과 서열 일치성으로 포개진다. 타일 라이브러리((b)형)의 경우, 150개의 개별 UTR 서열 각각에 대해 4개의 타일 작제물(82 내지 246개 염기쌍이 서열 일치성으로 포개진다)(총 600개의 가능한 올바르게 조립된 작제물)이 존재하였다. 각 라이브러리에 대해, 조립된 작제물의 길이는 400개 염기였다.
각 유형의 라이브러리를 각 유형의 시험 스플린트 분자(도 1, 2 및 5B의 올리고뉴클레오타이드 구조를 참조하시오)와 함께 시험하여, 표 1에 나타낸 대로 9개 범주를 생성시켰다.
| 범주 | 인덱스 스플린트 | 라이브러리 유형 |
| 1a | 도 1 | 복합 라이브러리((a)형) |
| 1b | 타일 라이브러리((b)형) | |
| 1c | 상동성 라이브러리((c)형) | |
| 2a | 도 2 | 복합 라이브러리((a)형) |
| 2b | 타일 라이브러리((b)형) | |
| 2c | 상동성 라이브러리((c)형) | |
| 3a | 도 5b | 복합 라이브러리((a)형) |
| 3b | 타일 라이브러리((b)형) | |
| 3c | 상동성 라이브러리((c)형) |
9개 범주는 모두 동일한 라이브러리에 있고 함께 조립되었다. PCR 산물을 올바른 조립 정도를 특성화하기 위해 NGS(차세대 서열분석)로 서열분석하였다.
결과
데이터를 도 17에 나타낸다. 총 판독 수(올바른 및 잘못된)에 대한 데이터를 왼쪽 상단 그래프에 나타낸다. 이들 데이터는 상동성 라이브러리((c)형)에 있는 도 1 및 도 2의 인덱스 스플린트로 인해 대부분의 잘못 조립된 작제물이 발생하였음을 나타낸다. 백분율 정확도 데이터(즉, 전체 판독 수에 대한 전체 올바른 판독 수)를 왼쪽 하단 그래프에 나타낸다. 세 가지 유형의 인덱스 스플린트 분자 모두 복합 라이브러리((a)형)에서 높은 정확도를 얻었고 타일 라이브러리((b)형)에서는 중간 수준의 정확도를 나타내었다. 도 5b의 스플린트 분자만이 상동성 라이브러리((c)형)에 대해 높은 정확도를 얻었다. 중앙값 올바른 판독 데이터를 오른쪽 상단 그래프에 나타낸다. 탈락 작제물 수에 대한 데이터는 오른쪽 하단 그래프에 나타낸다. "탈락 작제물"은 올바른 판독이 없는 올바른 작제물(각 라이브러리마다 600개의 가능한 올바른 작제물이 존재한다)을 지칭한다. 이들 데이터는 도 1 및 도 2 조립의 인덱스 스플린트가 각 라이브러리 유형에 대한 탈락 작제물을 가지고 있음을 보여준다. 예를 들어, 도 1의 인덱스 스플린트는 복합 라이브러리((a)형)에 대해 50개가 넘는 탈락 작제물, 타일 라이브러리((b)형)에 대해 60개가 넘는 탈락 작제물, 상동성 라이브러리((c)형)에 대해 거의 70개에 가까운 탈락 작제물을 나타내었다. 도 5b 인덱스 스플린트의 경우 어떠한 라이브러리에 대해서도 탈락 작제물이 존재하지 않았다.
도 5b 데이터의 두 가지 주목할만한 양태가 이 데이터에서 관찰된다. 첫째, 도 5b 인덱스 스플린트 분자를 사용한 조립 방법은 유용한 수준의 정확도로 (c)형(복합 라이브러리) 라이브러리 유형을 조립할 수 있는 유일한 방법이었다(왼쪽 하단 그래프를 참조하시오). 두번째, 도 5b 인덱스 스플린트 분자를 사용한 조립 방법에는 탈락이 없었다(오른쪽 하단 그래프를 참조하시오). 600개의 가능한 올바른 조립 작제물이 모두 도 5b 조립에서 조립되었다. 대조적으로, 다른 두 가지 접근법은 50-80개의 탈락, 즉 600개의 가능한 올바른 작제물로 구성되지 않은 작제물을 가졌다.
이들 데이터는 도 5b에 묘사된 인덱스 스플린트 분자를 사용하는 올바른 조립에 대한 효과를 나타내며, 스플린트 분자의 잡다한 하이브리드화로 인해 달리 불가능할 수 있는 작제물의 올바른 조립을 입증한다.
실시예 4
하기의 실험을, 도 5b에 도시된 바와 같은 인덱스 스플린트 분자를 활용하여 구조물을 조립할 때 두 가지 실험 변수의 효과를 측정하기 위해 설계하고 수행하였다.
작제물 서열을 상동성이 낮은 게놈 서열 세트인 UTR(번역되지 않은 영역)로부터 취하였다. 용융 온도(Tm = (2*(A개수 + T개수))+(4*(C개수 + G개수))-7에 의해 계산된 Tm)에 의해 구성된, 스플린트 서열의 각 절반에 대한 16개의 가변 길이를 설계하였다. 스플린트 절반에 대해 2℃씩 14℃에서 44℃까지의 온도 임계값이 준비되었다. 각 스플린트 설계에 대해 40개의 UTR 고유 서열이 조립되었다(총 16 X 40 = 640 UTR 서열). 각 UTR 서열에 대해 10개의 고유 바코드(총 6,400개의 가능한 올바른 작제물)가 사용되었다. 바코드가 상기 조립된 작제물에서 올바르게 쌍을 이룬 경우(NGS에 의해 측정됨) '올바른' 쌍으로 지칭되었다. 조립 성분은 PCT 증폭을 허용하기 위해 순방향 프라이머(상류 조립 성분) 및 역방향 프라이머(하류 조립 성분)에 대한 서열을 추가로 포함하였다. 라이브러리는 8개의 상이한 결찰 온도에서 조립되었다. 도 18은 이 실험을 위한 도 5b 시험 스플린트 분자의 개략도를 묘사한다.
UTR 조립 성분과 다양한 시험 스플린트 분자로 구성된 올리고 라이브러리를 제조하였다. 약 80 ng의 라이브러리를 키나제 반응 및 리가제 반응 모두에 적합한 완충액에 용해시키고, 이어서 DNA 올리고의 5' 말단를 인산화시키기 위해 제조사의 권장 사항에 따라 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(NEB)를 사용하여 키나제 반응을 수행하였다. 키나제 처리된 생성물을 1.75 시간에 걸쳐 93℃에서 44℃로 냉각되는 수욕에서 배양함으로써 하이브리드화시켜 도 5b에 묘사된 올리고뉴클레오타이드 구조를 형성시켰다. 이어서, 하이브리드화된 생성물을 시험된 결찰 온도 중 하나로 가열하고 1 마이크로리터(㎕)의 9°N™ 리가제(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA)를 첨가하였다. 결찰 반응이 1시간 동안 진행되었다. 결찰된 생성물을 1.5x AMPure® XP 비드(Beckman Coulter, Brea, CA)를 사용하여 정제하고 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 산물을 올바른 조립 정도를 특성화하기 위해 NGS(차세대 서열분석)로 서열분석하였다.
결과
데이터는 일반적으로 결찰 온도가 높을수록 조립의 특이성이 증가한다는 것을 입증한다. 데이터는 일반적으로 짧은 스플린트 길이(낮은 Tm)를 갖는 조립 작제물의 효율성이 높은 결찰 온도에서 감소한다는 것을 입증한다. 전형적인 데이터를 도 18의 그래프에 묘사한다. 데이터는 2개의 스플린트 분절에 대한 Tm 범위에 걸쳐 도 5b의 인덱스 스플린트 분자를 활용하여 높은 정도의 올바른 조립이 가능함을 예시한다.
예시적인 실시양태
생성물
실시양태 1. 2개의 핵산 성분을 조립하여 다성분 결찰 생성물을 생성시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 구조물로서, 상기 올리고뉴클레오타이드 구조물이 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드, 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 인덱스 스플린트를 포함하고, 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 인덱스 스플린트에 부분적으로 하이브리드화되는, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서,
(a) 인덱스 스플린트가 스플린트 서열, 및 상기 스플린트 서열 측면에 위치한 제1 인덱스 서열 및 제2 인덱스 서열을 포함하고;
(b) 상기 스플린트 서열이 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 및 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부 모두에 하이브리드화하고;
(c) 상기 제1 인덱스 서열이 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화하여 제1 이중-가닥 인덱스 요소를 형성하고, 상기 제2 인덱스 서열이 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화하여 제2 이중-가닥 인덱스 요소를 형성하는
올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 3. 실시양태 2에 있어서,
인덱스 스플린트의 스플린트 서열이
(a) 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화되는(역 보체인) 5' 요소, 및
(b) 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화되는(역 보체인) 3' 요소
를 함유하고, 상기 스플린트 서열의 5' 요소 및 3' 요소가 연속적인, 즉 개입 뉴클레오타이드가 없는, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서,
(a)의 5' 하이브리드화된 스플린트 요소 및 (b)의 3' 하이브리드화된 스플린트 요소 각각이 약 14℃ 내지 약 44℃의 용융 온도(Tm)를 가지며, 여기서
Tm =(2*(A개수 + T개수)) + (4*(C개수 + G개수))-7인
올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 5. 실시양태 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서,
(1) 제1 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 3' 단부에 위치하고;
(2) 제2 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 5' 단부에 위치하는
올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 6. 실시양태 5에 있어서,
(a) 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드(왼쪽 조립 성분)의 5' 말단 서열을 포함하는 제3 인덱스 서열, 및
(2) 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제1 DNA 서열 성분으로서, 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드(왼쪽 조립 성분)의 3' 말단 서열을 포함하는 제1 DNA 서열 성분
을 포함하고,
(b) 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제2 DNA 서열 성분, 및
(2) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열을 포함하는 제4 인덱스 서열
을 포함하고,
(c) 인덱스 스플린트가 5'에서 3'으로
(1) 제2 인덱스 서열인 5' 말단 서열,
(2) 선택적 제1 스페이서 서열,
(3) 스플린트 서열로서,
상기 스플린트 서열의 5' 요소가 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열에 하이브리드화하고(그의 역 보체이고),
상기 스플린트 서열의 3' 요소가 상기 제 1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는(그의 역 보체인) 스플린트 서열,
(4) 선택적 제2 스페이서 서열, 및
(5) 제2 인덱스 서열인 3' 말단 서열
을 포함하는
올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 7. 실시양태 6에 있어서,
각각의 스페이서 서열이 독립적으로 1 내지 30개의 뉴클레오타이드로 이루어지는, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 8. 실시양태 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서,
(1) 제1 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 5' 단부에 위치하고;
(2) 제2 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 3' 단부에 위치하는
올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 9. 실시양태 8에 있어서,
(a) 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 제3 인덱스 서열, 및
(2) 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제1 DNA 서열 성분으로서, 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드(왼쪽 조립 성분)의 3' 말단 서열을 포함하는 제1 DNA 서열 성분
을 포함하고,
(b) 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제2 DNA 서열 성분, 및
(2) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열을 포함하는 제4 인덱스 서열
을 포함하고,
(c) 인덱스 스플린트가 5'에서 3'으로
(1) 제1 인덱스 서열인 5' 말단 서열,
(2) 선택적 제1 스페이서 서열,
(3) 스플린트 서열로서,
상기 스플린트 서열의 5' 요소가 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열에 하이브리드화하고(그의 역 보체이고),
상기 스플린트 서열의 3' 요소가 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는(그의 역 보체인) 스플린트 서열,
(4) 선택적 제2 스페이서 서열, 및
(5) 제2 인덱스 서열인 3' 말단 서열
을 포함하는
올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 10. 실시양태 8 또는 9에 있어서,
각각의 스페이서 서열이 독립적으로 1 내지 30개의 뉴클레오타이드로 이루어지는, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 11. 실시양태 2 내지 10 중 어느 하나에 있어서,
각각의 이중-가닥 인덱스 요소가 10 내지 40개의 염기쌍을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 12. 실시양태 2 내지 11 중 어느 하나에 있어서,
각각의 이중-가닥 인덱스 요소가 약 10℃ 내지 약 80℃의 용융 온도(Tm)를 가지며, 여기서 Tm = (2*(A개수 + T개수)) + (4*(C개수 + G개수))-7인, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 13. 실시양태 6, 7, 9, 10 및 11 중 어느 하나에 있어서,
제4 인덱스 서열(분절F)이 제2 DNA 서열 성분에 제거 가능하게(또는 분리 가능하게) 연결되는, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서,
제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 제2 DNA 서열 성분의 3'에 II형 제한 효소 부위를 추가로 포함하고, 제한 효소 절단 부위가 상기 제2 DNA 서열 성분의 3'에 바로 인접한, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 15. 실시양태 13에 있어서,
제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 절단 가능한 링커에 의해 제2 DNA 서열 성분에 제거 가능하게(또는 분리 가능하게) 연결되고, 절단 부위가 상기 제2 DNA 서열 성분의 3'에 바로 인접한, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 16. 실시양태 2 내지 15 중 어느 하나에 있어서,
분절 D 또는 분절 E의 서열 분절에 하이브리드화되는(역 보체인) 적어도 하나의 차단 올리고뉴클레오타이드 성분을 추가로 포함하고, 상기 서열 분절이 스플린트에 하이브리드화된 서열을 제외하는, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
실시양태 17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나의 올리고뉴클레오타이드 구조물의 세트 또는 라이브러리.
실시양태 18. 실시양태 17의 세트 또는 라이브러리를 포함하는 키트.
실시양태 19. DNA 리가제를 추가로 포함하는 실시양태 18의 키트.
방법
실시양태 20. 2개의 핵산 성분을 조립하여 다성분 결찰 생성물을 생성시키는 방법으로서,
(A) 제1 DNA 서열 성분을 포함하는 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 제2 DNA 서열 성분을 포함하는 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 인덱스 스플린트에 하이브리드화하는 단계로서, 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부 및 3' 단부가 모두 상기 인덱스 스플린트에 하이브리드화되고, 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부 및 3' 단부가 모두 상기 인덱스 스플린트에 하이브리드화하는 단계; 및
(B) 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 결찰시켜, 제1 다성분 결찰 생성물을 생성시키는 단계
를 포함하는, 방법.
실시예 21. 실시양태 20에 있어서,
(a) 인덱스 스플린트가 스플린트 서열, 및 상기 스플린트 서열 측면에 위치한 제1 인덱스 서열 및 제2 인덱스 서열을 추가로 포함하고;
(b) 상기 스플린트 서열이 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 및 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부 모두에 하이브리드화하고;
(c) 상기 제1 인덱스 서열이 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화하여 제1 이중-가닥 인덱스 요소를 형성하고, 상기 제2 인덱스 서열이 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화하여 제2 이중-가닥 인덱스 요소를 형성하는
방법.
실시양태 22. 실시양태 21에 있어서,
인덱스 스플린트의 스플린트 서열이
(a) 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화하여 이중-가닥 5' 스플린트 요소를 형성하는 5' 요소, 및
(b) 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화하여 이중-가닥 3' 스플린트 요소를 형성하는 3' 요소
를 함유하고, 상기 스플린트 서열의 5' 요소 및 3' 요소가 연속적인, 즉 개입 뉴클레오타이드가 없는, 방법.
실시양태 23. 실시양태 22에 있어서,
이중-가닥 5' 스플린트 요소 및 이중-가닥 3' 스플린트 요소 각각이 약 10℃ 내지 약 80℃의 용융 온도(Tm)를 가지며, 여기서
Tm =(2*(A개수 + T개수)) + (4*(C개수 + G개수))-7인
방법.
실시양태 24. 실시양태 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서,
(1) 제1 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 3' 단부에 위치하고;
(2) 제2 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 5' 단부에 위치하는
방법.
실시양태 25. 실시양태 24에 있어서,
(a) 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 제3 인덱스 서열, 및
(2) 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제1 DNA 서열 성분으로서, 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열을 포함하는 제1 DNA 서열 성분
을 포함하고,
(b) 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제2 DNA 서열 성분, 및
(2) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열을 포함하는 제4 인덱스 서열
을 포함하고,
(c) 인덱스 스플린트가 5'에서 3'으로
(1) 제2 인덱스 서열인 5' 말단 서열,
(2) 선택적 제1 스페이서 서열,
(3) 스플린트 서열로서,
상기 스플린트 서열의 5' 요소가 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열에 하이브리드화하고,
상기 스플린트 서열의 3' 요소가 상기 제 1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는 스플린트 서열,
(4) 선택적 제2 스페이서 서열, 및
(5) 제1 인덱스 서열인 3' 말단 서열
을 포함하는
방법.
실시양태 26. 실시양태 25에 있어서,
각각의 스페이서 서열이 독립적으로 1 내지 30개의 뉴클레오타이드로 이루어지는, 방법.
실시양태 27. 실시양태 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서,
(1) 제1 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 5' 단부에 위치하고;
(2) 제2 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 3' 단부에 위치하는
방법.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서,
(a) 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 제3 인덱스 서열, 및
(2) 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제1 DNA 서열 성분으로서, 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열을 포함하는 제1 DNA 서열 성분
을 포함하고,
(b) 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제2 DNA 서열 성분, 및
(2) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열을 포함하는 제4 인덱스 서열
을 포함하고,
(c) 인덱스 스플린트가 5'에서 3'으로
(1) 제1 인덱스 서열인 5' 말단 서열,
(2) 선택적 제1 스페이서 서열,
(3) 스플린트 서열로서,
상기 스플린트 서열의 5' 요소가 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열에 하이브리드화하고,
상기 스플린트 서열의 3' 요소가 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는 스플린트 서열,
(4) 선택적 제2 스페이서 서열, 및
(5) 제2 인덱스 서열인 3' 말단 서열
을 포함하는
방법.
실시양태 29. 실시양태 27 또는 28에 있어서,
각각의 스페이서 서열이 독립적으로 1 내지 30개의 뉴클레오타이드로 이루어지는, 방법.
실시양태 30. 실시양태 21 내지 29 중 어느 하나에 있어서,
각각의 이중-가닥 인덱스 요소가 10 내지 40개의 염기쌍을 포함하는, 방법.
실시양태 31. 실시양태 21 내지 30 중 어느 하나에 있어서,
각각의 이중-가닥 인덱스 요소가 약 10℃ 내지 약 80℃의 용융 온도(Tm)를 가지며, 여기서 Tm = (2*(A개수 + T개수)) + (4*(C개수 + G개수))-7인, 방법.
실시양태 32. 실시양태 20 내지 31 중 어느 하나에 있어서,
(C) 다성분 결찰 생성물로부터 인덱스 스플린트를 변성시키고, 후속적으로 단계 (A), (B) 및 (C)를 반복적으로 수행하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
실시양태 33. 실시양태 20 내지 32 중 어느 하나에 있어서,
제4 인덱스 서열이 제2 DNA 서열 성분에 제거 가능하게 연결되는, 방법.
실시양태 34. 실시양태 33에 있어서,
제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 제2 DNA 서열 성분의 3'에 IIs형 제한 효소 부위를 추가로 포함하고, 제한 효소 절단 부위가 상기 제2 DNA 서열 성분의 3'에 바로 인접한, 방법.
실시양태 35. 실시양태 33에 있어서,
제4 인덱스 서열이 절단 가능한 링커에 의해 제2 DNA 서열 성분에 연결되고, 절단 부위가 상기 제2 DNA 서열 성분의 3'에 바로 인접한, 방법.
실시양태 36. 실시양태 33 내지 35 중 어느 하나에 있어서,
제1 결찰 생성물의 제2 DNA 성분으로부터 제4 인덱스 서열을 제거하는 단계,
제4 인덱스 서열을 갖는 추가의 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드, 및 제2 스플린트 서열을 포함하는 추가의 인덱스 스플린트를 제공하는 단계,
후속적으로 단계 (A), (B) 및 (C)를 수행하는 단계
를 추가로 포함하고,
상기 제1 결찰 생성물이 단계 (A)의 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드이고,
상기 추가의 인덱스 스플린트의 제2 스플린트 서열이 상기 추가의 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열에 하이브리드화하는 5' 요소 및 상기 제1 결찰 생성물의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는 3' 요소를 함유하는
방법.
실시양태 37. 실시양태 33 내지 35 중 어느 하나에 있어서,
인덱스 스플린트가 제5 인덱스 서열에 인접한 제2 스플린트 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 스플린트 서열의 5' 요소가 제2 DNA 서열 성분의 3' 말단 서열에 하이브리드화할 수 있는, 방법.
실시양태 38. 실시양태 20 내지 32 중 어느 하나에 있어서,
제3 인덱스 서열이 제1 DNA 서열 성분에 제거 가능하게(또는 분리 가능하게) 연결되는, 방법.
실시양태 39. 실시양태 38에 있어서,
제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 제1 DNA 서열 성분의 5'에 IIs형 제한 효소 부위를 추가로 포함하고, 제한 효소 절단 부위가 상기 제1 DNA 서열 성분의 5'에 바로 인접한, 방법.
실시양태 40. 실시양태 38에 있어서,
제3 인덱스 서열이 절단 가능한(또는 분리 가능한) 링커에 의해 제1 DNA 서열 성분에 연결되고, 절단 부위가 상기 제1 DNA 서열 성분의 5'에 바로 인접한, 방법.
실시양태 41. 실시양태 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서,
제1 결찰 생성물의 제1 DNA 서열 성분으로부터 제3 인덱스 서열을 제거하는 단계,
상기 제3 인덱스 서열을 갖는 추가의 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드, 및 추가의 인덱스 스플린트를 제공하는 단계,
후속적으로 단계 (A), (B) 및 (C)를 수행하는 단계
를 추가로 포함하고,
상기 제1 결찰 생성물이 단계 (A)의 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드이고,
상기 추가의 인덱스 스플린트의 스플린트 서열이 상기 추가의 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는 3' 요소 및 상기 제1 결찰 생성물의 5' 말단 서열에 하이브리드화하는(역 보체인) 5' 요소를 함유하는
방법.
실시양태 42. 실시양태 20 내지 41 중 어느 하나에 있어서,
하이브리드화 단계가 인덱스 요소의 용융 온도(Tm)를 기준으로 소정 온도 범위에서 수행되고,
결찰 단계가, 스플린트 서열의 5' 및 3' 요소의 용융 온도(Tm)보다 높고 인덱스 요소의 용융 온도(Tm)보다 낮은 온도에서 수행되는
방법.
실시양태 43. 실시양태 20 내지 42 중 어느 하나에 있어서,
결찰 단계의 온도가 약 45 내지 70℃이고 리가제가 열안정성인, 방법.
실시양태 44. 실시양태 20 내지 43 중 어느 하나에 있어서,
인덱스 요소의 용융 온도가 약 60 내지 90℃인, 방법.
실시양태 45. 실시양태 20 내지 44 중 어느 하나에 있어서,
5' 스플린트 요소 및 3' 스플린트 요소의 용융 온도가 약 20 내지 42℃인, 방법.
상기 예시적이거나 바람직한 실시양태에 대한 설명은, 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 개시내용을 제한하기보다는 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 쉽게 이해될 수 있듯이, 상기에 제시된 특징들의 다양한 변형 및 조합이 청구범위에 제시된 바와 같은 본 개시내용으로부터 이탈됨 없이 활용될 수 있다. 그러한 변형은 본 개시내용의 범위로부터 이탈되는 것으로 간주되지 않으며, 그러한 모든 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체 내용이 참고로 포함된다.
Claims (28)
- (A) 제1 DNA 서열 성분을 포함하는 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 제2 DNA 서열 성분을 포함하는 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 인덱스 스플린트(indexed splint)에 하이브리드화하는 단계로서, 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부 및 3' 단부가 모두 상기 인덱스 스플린트에 하이브리드화되고, 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부 및 3' 단부가 모두 상기 인덱스 스플린트에 하이브리드화하는 단계; 및
(B) 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부를 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 결찰시켜, 제1 다성분 결찰 생성물을 생성시키는 단계
를 포함하는, 2개의 핵산 성분을 조립하여 다성분 결찰 생성물을 생성시키는 방법. - 제1항에 있어서,
(a) 인덱스 스플린트가 스플린트 서열, 및 상기 스플린트 서열 측면에 위치한 제1 인덱스 서열 및 제2 인덱스 서열을 추가로 포함하고;
(b) 상기 스플린트 서열이 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 및 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부 모두에 하이브리드화하고;
(c) 상기 제1 인덱스 서열이 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화하여 제1 이중-가닥 인덱스 요소를 형성하고, 상기 제2 인덱스 서열이 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화하여 제2 이중-가닥 인덱스 요소를 형성하는,
방법. - 제2항에 있어서,
인덱스 스플린트의 스플린트 서열이
(a) 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에 하이브리드화하여 이중-가닥 5' 스플린트 요소를 형성하는 5' 요소, 및
(b) 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 하이브리드화하여 이중-가닥 3' 스플린트 요소를 형성하는 3' 요소
를 함유하고, 상기 스플린트 서열의 5' 요소 및 3' 요소가 연속적인, 즉 개입 뉴클레오타이드가 없는, 방법. - 제2항 또는 제3항에 있어서,
(1) 제1 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 3' 단부에 위치하고;
(2) 제2 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 5' 단부에 위치하는,
방법. - 제4항에 있어서,
(a) 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 제3 인덱스 서열, 및
(2) 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제1 DNA 서열 성분으로서, 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열을 포함하는 제1 DNA 서열 성분
을 포함하고,
(b) 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제2 DNA 서열 성분, 및
(2) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열을 포함하는 제4 인덱스 서열
을 포함하고,
(c) 인덱스 스플린트가 5'에서 3'으로
(1) 제2 인덱스 서열인 5' 말단 서열,
(2) 선택적 제1 스페이서 서열,
(3) 스플린트 서열로서,
상기 스플린트 서열의 5' 요소가 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열에 하이브리드화하고,
상기 스플린트 서열의 3' 요소가 상기 제 1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는, 스플린트 서열,
(4) 선택적 제2 스페이서 서열, 및
(5) 제1 인덱스 서열인 3' 말단 서열
을 포함하는,
방법. - 제5항에 있어서,
각각의 스페이서 서열이 독립적으로 1 내지 30개의 뉴클레오타이드로 이루어지는, 방법. - 제2항 또는 제3항에 있어서,
(1) 제1 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 5' 단부에 위치하고;
(2) 제2 인덱스 서열이 인덱스 스플린트의 3' 단부에 위치하는,
방법. - 제7항에 있어서,
(a) 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 제3 인덱스 서열, 및
(2) 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제1 DNA 서열 성분으로서, 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열을 포함하는 제1 DNA 서열 성분
을 포함하고,
(b) 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 5'에서 3'으로
(1) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열을 포함하는 다성분 결찰 생성물로 결찰될 제2 DNA 서열 성분, 및
(2) 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열을 포함하는 제4 인덱스 서열
을 포함하고,
(c) 인덱스 스플린트가 5'에서 3'으로
(1) 제1 인덱스 서열인 5' 말단 서열,
(2) 선택적 제1 스페이서 서열,
(3) 스플린트 서열로서,
상기 스플린트 서열의 5' 요소가 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열에 하이브리드화하고,
상기 스플린트 서열의 3' 요소가 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는, 스플린트 서열,
(4) 선택적 제2 스페이서 서열, 및
(5) 제2 인덱스 서열인 3' 말단 서열
을 포함하는,
방법. - 제7항 또는 제8항에 있어서,
각각의 스페이서 서열이 독립적으로 1 내지 30개의 뉴클레오타이드로 이루어지는, 방법. - 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 이중-가닥 인덱스 요소가 10 내지 40개의 염기쌍을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
(C) 다성분 결찰 생성물로부터 인덱스 스플린트를 변성시키고, 후속적으로 단계 (A), (B) 및 (C)를 반복적으로 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
제4 인덱스 서열이 제2 DNA 서열 성분에 제거 가능하게 연결되는, 방법. - 제12항에 있어서,
제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 제2 DNA 서열 성분에 대한 3'에 IIs형 제한 효소 부위 3'을 추가로 포함하고, 제한 효소 절단 부위가 상기 제2 DNA 서열 성분의 3'에 바로 인접한 것인, 방법. - 제12항에 있어서,
제4 인덱스 서열이 절단 가능한 링커에 의해 제2 DNA 서열 성분에 연결되고, 절단 부위가 상기 제2 DNA 서열 성분의 3'에 바로 인접한 것인, 방법. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 결찰 생성물의 제2 DNA 성분으로부터 제4 인덱스 서열을 제거하는 단계,
제4 인덱스 서열을 갖는 추가의 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드, 및 제2 스플린트 서열을 포함하는 추가의 인덱스 스플린트를 제공하는 단계,
후속적으로 단계 (A), (B) 및 (C)를 수행하는 단계
를 추가로 포함하고,
상기 제1 결찰 생성물이 단계 (A)의 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드이고,
상기 추가의 인덱스 스플린트의 제2 스플린트 서열이 상기 추가의 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 서열에 하이브리드화하는 5' 요소 및 상기 제1 결찰 생성물의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는 3' 요소를 함유하는,
방법. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
인덱스 스플린트가 제5 인덱스 서열에 인접한 제2 스플린트 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 스플린트 서열의 5' 요소가 제2 DNA 서열 성분의 3' 말단 서열에 하이브리드화할 수 있는, 방법. - 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
제3 인덱스 서열이 제1 DNA 서열 성분에 제거 가능하게 연결되는, 방법. - 제17항에 있어서,
제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 제1 DNA 서열 성분에 대한 IIs형 제한 효소 부위 5"을 추가로 포함하고, 제한 효소 절단 부위가 상기 제1 DNA 서열 성분의 5'에 바로 인접한 것인, 방법. - 제17항에 있어서,
제3 인덱스 서열이 절단 가능한 링커에 의해 제1 DNA 서열 성분에 연결되고, 절단 부위가 상기 제1 DNA 서열 성분의 5'에 바로 인접한 것인, 방법. - 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 결찰 생성물의 제1 DNA 서열 성분으로부터 제3 인덱스 서열을 제거하는 단계,
상기 제3 인덱스 서열을 갖는 추가의 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드, 및 추가의 인덱스 스플린트를 제공하는 단계,
후속적으로 단계 (A), (B) 및 (C)를 수행하는 단계
를 추가로 포함하고,
상기 제1 결찰 생성물이 단계 (A)의 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드이고,
상기 추가의 인덱스 스플린트의 스플린트 서열이 상기 추가의 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 서열에 하이브리드화하는 3' 요소 및 상기 제1 결찰 생성물의 5' 말단 서열에 하이브리드화하는 5' 요소를 함유하는,
방법. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
하이브리드화 단계가 인덱스 요소의 용융 온도(Tm)를 기준으로 소정 온도 범위에서 수행되고,
결찰 단계가, 스플린트 서열의 5' 및 3' 요소의 용융 온도(Tm)보다 높고 인덱스 요소의 용융 온도(Tm)보다 낮은 온도에서 수행되는,
방법. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
결찰 단계의 온도가 약 45 내지 70℃이고 리가제가 열안정성인, 방법. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
인덱스 요소의 용융 온도가 약 60 내지 90℃인, 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
5' 스플린트 요소 및 3' 스플린트 요소의 용융 온도가 약 20 내지 42℃인, 방법. - 2개의 핵산 성분을 조립하여 다성분 결찰 생성물을 생성시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 구조물로서, 상기 올리고뉴클레오타이드 구조물이 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드, 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 인덱스 스플린트를 포함하고, 상기 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 및 상기 제2 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드가 인덱스 스플린트에 부분적으로 하이브리드화되는, 올리고뉴클레오타이드 구조물.
- 각각 제25항에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조물을 갖는 올리고뉴클레오타이드 구조물의 세트 또는 라이브러리.
- 제25항에 따른 세트 또는 라이브러리를 포함하는 키트.
- 제27항에 있어서,
DNA 리가제를 추가로 포함하는 키트.
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