CN110951836B - 一种基于光化学调控核酸分子链置换动力学的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于光化学调控核酸分子链置换动力学的方法，对辅助链及带缺口的模板链进行合理的设计，无紫外光照条件下，在富含质子环境中可通过Hoogsteen氢键形成三链体结构从而引入小支点区域，触发核酸分子链置换反应；在体系中加入分子光开关材料螺吡喃分子，其在紫外光照下发生异构化反应，使得溶液中质子浓度下降，导致三链体结构无法稳定存在，即小支点区域无法形成，核酸分子链置换反应在一定程度上被抑制。本发明在模板链上修饰荧光基团，通过荧光强度的监测即可反映出核酸分子链置换反应的动力学与产率。本发明方法具有可编程，动力学可调的优点，在核酸分子纳米技术方面具有巨大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于核酸分子纳米技术领域，涉及一种基于光化学调控核酸分子链置换动力学的方法。
背景技术
核酸分子纳米技术使用核酸(或DNA)作为通用材料来合理设计各种分子工具和分子装置以实现多种应用(例如体内成像，临床诊断，药物递送等)。核酸凭借其简单的碱基配对原则和纳米级尺寸，作为组装和工程化复杂分子结构的理想构筑模块，具有极高的准确性和精确性。对核酸热力学相互作用的精确预测和模拟有望实现可编程多功能性核酸分子纳米装置的构建，极大推进核酸分子纳米技术的发展。
核酸分子链置换作为一种动态核酸分子纳米技术，是在核酸分子自组装技术的基础之上发展出来的。利用核酸分子单链间严格的碱基互补配对得到预杂交链，然后与进攻链反应，进而释放核酸单链产物。因其反应进程的可编程性以及动力学特征的可预测性等优点使得核酸分子链置换技术在构建一系列纳米功能装置方面展现出巨大的优势。近年来，尽管核酸分子链置换反应已得到广泛的应用，但调控核酸分子链置换反应动力学的方式报道较少。而核酸分子链置换反应动力学的调控对于复杂纳米结构的设计及功能性核酸分子纳米器件的构建至关重要。因此，丰富调控策略以实现核酸分子链置换反应动力学的调节对于全面发展核酸分子纳米技术的潜力至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于光化学调控核酸分子链置换动力学的方法。与现有调控方法不同的是，本发明无须进行光敏基团修饰，仅通过在体系中加入分子光开关材料螺吡喃(SP)，在紫外光照条件下发生异构化反应，与体系中的质子形成复合体，引起体系中质子浓度的改变，即可实现核酸分子链置换反应动力学调控。
本发明实现基于光化学调控核酸分子链置换反应的机理如图1所示，具体内容如下所述：
对辅助链及带缺口的模板链进行合理的设计，在无紫外光照条件下，辅助链与带缺口的模板链通过Hoogsteen氢键形成三链体结构从而引入小支点区域，即小支点区域形成，进攻链与小支点区域发生碱基互补配对进而触发分支迁移过程，原本的带有荧光基团的绑定链被释放出来，核酸分子链置换反应正常进行。在体系中加入分子光开关材料螺吡喃(SP)分子，在紫外光照下，分子光开关材料螺吡喃(SP)将发生异构化反应为开环态部花菁(MC)，然后与体系中的质子相结合即被质子化为MCH+，引起体系中质子浓度减小。质子浓度的减小导致三链体结构在一定程度上无法稳定存在，即小支点区域无法形成，从而使得核酸分子链置换反应的动力学在一定程度上被抑制。本发明在模板链上修饰荧光基团，通过荧光强度的监测即可反映出核酸分子链置换反应的动力学与产率。
利用分子光开关材料螺吡喃来实现核酸分子链置换反应的前提在于质子响应的核酸分子链置换反应的设计，需要具有合适的质子响应范围及一定的质子响应灵敏度。本发明通过设计具有比较好质子响应范围的三链体复合物(图1c中所标复合物结构)来响应分子光开关材料螺吡喃在紫外光照下所带来的质子浓度改变。
根据上述原理，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种基于光化学调控核酸分子链置换动力学的方法，包括以下步骤：
(1)根据沃森-克里克碱基互补配对原则及Hoogsteen配对原则，利用用于DNA链的设计与分析的Nupack软件设计对应核酸分子链(As，A，S，C，I)的序列，特别注意的是三链体结构的设计，使得三链体区域的TAT％＝50-60％(优选TAT％＝60％)，以确保其具有合适的质子响应窗口及质子响应灵敏度，并完成核酸分子链(As，A，S，C，I)的合成；
步骤(1)中设计的核酸分子链分别对应于图1C中的分子链，其中，辅助链As即核酸分子链As与模板链是通过Hoogsteen氢键形成三链体复合物，从而引入小支点区域，才能引发后续的链置换反应。
(2)将步骤(1)合成的核酸分子链(As，A，S，C，I)分别溶解于缓冲溶液中，分别得到五种核酸分子链缓冲溶液，备用；
(3)将步骤(2)溶解于缓冲溶液的核酸分子链A，S，C及As进行混合，然后进行退火，形成模板链及辅助链As(核酸分子链As)的混合溶液；
其中，所述退火的具体步骤包括：先升温至95℃并维持5min，然后以每8s降温0.1℃的速率梯度降温至20℃。
其中，所述模板链为由核酸分子链S，C，A这三条链经退火形成的复合物(如图1所示)。
其中，所述模板链为带缺口模板链，所述模板链作为反应底物。
(4)在缓冲溶液中混入无水乙醇，然后加入螺吡喃形成混合溶液；
其中，加入螺吡喃于溶液中用于在紫外光照下引起体系质子浓度变化，因为螺吡喃这种物质在水中的溶解度较低，所以加入体积百分比25％-30％无水乙醇(优选25％)以增加螺吡喃的溶解度。所述体积百分比25％-30％无水乙醇是相对于整体的缓冲溶液来说，例如1000μL缓冲溶液中含有25％无水乙醇，即应该加入250μL无水乙醇与750μLTris缓冲溶液混合得1000μL溶液。
(5)将步骤(3)得到的模板链及辅助链As的混合溶液稀释至步骤(4)所述的混合溶液中，用紫外线灯进行照射，然后将进攻链I与模板链及辅助链As的混合溶液混合(由于链置换反应需要在同一溶液中进行，所以需要将进攻链与模板链混合在一个试管中)，用荧光光谱仪收集荧光信号，完成核酸分子链置换反应的动力学监测。
如图1c中所示，进攻链I会与三链体复合物的toehold部分结合，toehold部分为三链体复合物中裸露出的那一段单链部分，也可被称为小支点区域，进攻链I与toehold互补配对后会引发后续的分支迁移区域，将原绑定链C置换下来，即完成链置换的过程。
步骤(1)中，所述核酸分子链As(辅助链As)的序列为SEQ ID No.1：
CCCTGATCTTGTTCCTTTCTCCTTCT。
步骤(1)中，所述核酸分子链A的序列为SEQ ID No.2：
TTCCTTTCTCCTTCTCCCTAACCTCCCATG-Cy5。
步骤(1)中，所述核酸分子链S的序列为SEQ ID No.3：AAGGAAAGAGGAAGA。
步骤(1)中，所述核酸分子链C的序列为SEQ ID No.4：Cy3-GGTGGGAGGTTAGGG。
步骤(1)中，所述核酸分子链I(进攻链I)的序列为SEQ ID No.5：
GGTGGGAGGTTAGGGTTTTTTCAAGATCAGGG。
步骤(1)中，利用辅助链As(核酸分子链As)与模板链之间的Hoogsteen键形成三链体结构，从而引入小支点区域。
步骤(2)中，所述缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(Tris-HCl)、PBS缓冲溶液，TAE缓冲溶液中的一种；优选地，为三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(Tris-HCl)。
步骤(2)中，所述缓冲溶液的pH为8；优选地，所述三羟甲基氨基甲烷(tris)-盐酸缓冲溶液的pH为8。
步骤(2)中，所述核酸分子链(As，A，S，C，I)在缓冲溶液中的终浓度均为100μM(因为DNA链购买自生物工程有限公司，会对每条链进行标示，需要加入多少体积的缓冲溶液可以配成终浓度均为100μM的储存溶液，此为统一处理方式)。
步骤(2)中，优选置于4℃冰箱储存备用。
步骤(3)中，所述核酸分子链A，S，C及As的摩尔比为优选为1：1：1.25：5。
步骤(3)中，优选在PCR仪中进行退火，从95℃梯度降温至25℃。
步骤(4)中，所述缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(Tris-HCl)、PBS缓冲溶液，TAE缓冲溶液中的一种；优选地，为三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(Tris-HCl)。
步骤(4)中，所述缓冲溶液与无水乙醇的体积比为5：1；螺吡喃的摩尔浓度优选为25μM。
步骤(4)中，所述缓冲溶液的pH优选为5.54。进一步优选，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为5.54。
步骤(4)中，所述螺吡喃为分子光开关材料，用于调控体系中的质子浓度。
步骤(5)中，所述紫外线灯优选为手持式紫外线灯。
步骤(5)中，所述紫外线灯的照射波长为254nm。(注：对功率不做要求)
步骤(5)中，所述紫外线灯的照射时间优选为60min。
步骤(5)中，所述进攻链I与模板链的摩尔比为优选为5：1。对于进攻链与模板链，直接根据摩尔浓度进行换算，因为核酸分子缓冲溶液的备用均处理为100μM，所以后续实验均采用摩尔浓度进行换算。在此处模板链的摩尔浓度为10nm，进攻链的摩尔浓度为50nm，体积均相同，所以其摩尔比为5：1。
本发明为防止荧光基团淬灭，实验过程中注意避光操作。
在一个具体实施方式中，所述基于光化学调控核酸分子链置换动力学的方法，具体包括以下步骤：
(1)根据沃森-克里克碱基互补配对原则及Hoogsteen配对原则，利用Nupack软件设计对应核酸分子链(As，A，S，C，I)的序列，完成核酸分子链的合成；
(2)将合成的核酸分子链溶解于三羟甲基氨基甲烷(tris)-盐酸缓冲溶液中，该缓冲液的pH为8。置于4℃冰箱储存备用；
(3)将核酸分子链A,S,C及核酸分子链As以1：1：1.25：5的摩尔比例进行混合，所用缓冲溶液为pH＝8tris-HCl缓冲溶液，经过PCR仪进行退火(从95℃梯度降温至20℃)形成模板链及辅助链As的混合溶液；
(4)在pH＝5.54tris-HCl缓冲溶液中混入体积百分比25％无水乙醇，然后加入25μM螺吡喃(螺吡喃的摩尔浓度为25μM”)形成混合溶液；
(5)将模板链及辅助链As稀释至上述步骤(4)所述的混合溶液中，用手持式紫外线灯进行照射，然后按照进攻链与模板链的摩尔比5:1进行混合，用荧光光谱仪收集荧光信号，完成核酸分子链置换反应的动力学监测。
本发明还提供了核酸分子链As，A，S，C，I；其中，所述核酸分子链As的序列如SEQID No.1所示；所述核酸分子链A的序列如SEQ ID No.2所示：所述核酸分子链S的序列如SEQID No.3所示：所述核酸分子链C的序列如SEQ ID No.4所示：所述核酸分子链I的序列如SEQID No.5所示。
本发明还提供了所述核酸分子链As，A，S，C，I在光化学调控核酸分子链置换动力学中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明所提出的基于光化学调控核酸分子链置换动力学方法，无须进行复杂昂贵的光敏基团修饰，丰富了核酸分子链置换动力学的调控方式，可应用于光化学调控的核酸分子纳米折纸结构的设计及核酸分子纳米装置的构建。本方法具有可编程，动力学可调的优点，在核酸分子纳米技术方面具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1是本发明实现基于光化学调控核酸分子链置换反应的反应机理图，其中，图1a为光化学调控核酸分子链置换反应的示意图；图1b为螺吡喃在紫外光照下的变构示意图；图1c为核酸分子链置换反应示意图。
图2是体系中没有加入分子开关材料，及加入分子开关材料有无紫外光照情况下，核酸分子链置换反应的荧光动力学曲线图。
图3是体系中加入不同浓度分子开关材料，核酸分子链置换反应的荧光动力学曲线图。
图4是体系在不同紫外光照时间下，核酸分子链置换反应的荧光动力学曲线图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：体系中没有加入分子开关材料，及加入分子开关材料有无紫外光照情况下，核酸分子链置换反应的荧光动力学研究
(1)用Tris-HCl缓冲溶液分别配置核酸分子链(As(SEQ ID No.1)，A(SEQ IDNo.2)，S(SEQ ID No.3)，C(SEQ ID No.4)，I(SEQ ID No.5))储备液100μM，此处所用缓冲溶液均为pH＝8.00，将其放入冰箱中备用。
(2)从100μM储备液中取出核酸分子链A(5μL)、S(5μL)、C(6.25μL)、As(25μL)，加入Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.00)58.75μL混匀得100μL溶液，放入PCR仪中进行退火(从95℃梯度降温至20℃。得浓度为5μM的模板链及辅助链As的混合物，并将退火所得产物放于冰箱中备用。且为防止荧光基团淬灭，实验过程中注意避光操作。
(3)配置738μLpH＝5.54Tris-HCl缓冲溶液，然后向其中混入250μL无水乙醇(体积百分比25％)，并加入25μM螺吡喃，形成988μL混合溶液1；
(4)向988μL缓冲溶液(含25％乙醇)中(该混合溶液中不含有分子光开关材料螺吡喃)加入模板链及辅助链的混合溶液(2μL)，混合均匀后加入比色皿中，并测定其荧光强度，待其荧光强度值基本趋于稳定，向其中加入10μL进攻链(5μM)，快速加入并充分混合均匀，继续监测其荧光强度，结果如图2中曲线a所示，加入进攻链I之后，荧光信号出现大幅增加，说明带有荧光基团的原绑定链C从模板链中被置换下来，核酸分子链置换反应能够进行且反应较为迅速。
在进行步骤(4)的同时，进行步骤(4’)：向988μL混合溶液1中加入模板链及辅助链的混合溶液(2μL)，混合均匀后放置在黑暗中1h，加入比色皿中，并测定其荧光强度，待其荧光强度值基本趋于稳定，向其中加入10μL进攻链(5μM)，快速加入并充分混合均匀，继续监测其荧光强度，结果如图2中曲线b所示，加入进攻链I之后，荧光信号出现大幅增加，说明带有荧光基团的原绑定链C从模板链中被置换下来，核酸分子链置换反应能够进行且反应动力学与图2a相比基本无区别。或，
进行步骤(4”)向988μL混合溶液1中加入模板链及辅助链的混合溶液(2μL)，混合均匀后用手持式紫外线灯照射60min，加入比色皿中，并测定其荧光强度，待其荧光强度值基本趋于稳定，向其中加入10μL进攻链(5μM)，快速加入并充分混合均匀，继续监测其荧光强度，结果如图2中曲线c所示，加入进攻链I之后，荧光信号较之图2中曲线a，b增幅显著减小，说明只有少数带有荧光基团的原绑定链C从模板链中被置换下来，核酸分子链置换反应被抑制。
实施例2：体系中加入不同浓度分子开关材料，核酸分子链置换反应的荧光动力学研究
(1)用Tris-HCl缓冲溶液分别配置核酸分子链(As(SEQ ID No.1)，A(SEQ IDNo.2)，S(SEQ ID No.3)，C(SEQ ID No.4)，I(SEQ ID No.5))储备液100μM，此处所用缓冲溶液均为pH＝8.00，将其放入冰箱中备用。
(2)从100μM储备液中取出核酸分子链A(5μL)、S(5μL)、C(6.25μL)、As(25μL)，加入Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.00)58.75μL混匀得100μL溶液，放入PCR仪中进行退火(从95℃梯度降温至20℃)。得浓度为5μM的模板链及辅助链As的混合物，并将退火所得产物放于冰箱中备用。且为防止荧光基团淬灭，实验过程中注意避光操作。
(3)配置738μLpH＝5.54Tris-HCl缓冲溶液，然后向其中混入250μL无水乙醇(体积百分比25％)，分别加入0μM，1μM，2μM，5μM，10μM，25μM螺吡喃形成988μL混合溶液；
(4)向上述988μL混合溶液中分别加入模板链及辅助链的混合溶液(2μL)，混合均匀后用手持式紫外线灯照射60min，加入比色皿中，并测定其荧光强度，待其荧光强度值基本趋于稳定，然后向其中加入10μL进攻链(5μM)，快速加入并充分混合均匀，继续监测其荧光强度，结果如图3所示，随着分子光开关材料浓度的增加，核酸分子链置换反应被抑制的程度逐渐加大。
实施例3：体系在不同紫外光照时间下，核酸分子链置换反应的荧光动力学研究
(1)用Tris-HCl缓冲溶液分别配置核酸分子链(As(SEQ ID No.1)，A(SEQ IDNo.2)，S(SEQ ID No.3)，C(SEQ ID No.4)，I(SEQ ID No.5))储备液100μM，此处所用缓冲溶液均为pH＝8.00，将其放入冰箱中备用。
(2)从100μM储备液中取出核酸分子链A(5μL)、S(5μL)、C(6.25μL)、As(25μL)，加入Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.00)58.75μL混匀得100μL溶液，放入PCR仪中进行退火(从95℃梯度降温至20℃)。得浓度为5μM的模板链及辅助链As的混合物，并将退火所得产物放于冰箱中备用。且为防止荧光基团淬灭，实验过程中注意避光操作。
(3)配置738μLpH＝5.54Tris-HCl缓冲溶液，然后向其中混入250μL无水乙醇(体积百分比25％)，加入25μM螺吡喃形成混合溶液1；
(4)向988μL混合溶液1中加入模板链及辅助链的混合溶液(2μL)，混合均匀后用手持式紫外线灯分别照射0min，5min，15min，30min，60min，加入比色皿中，并测定其荧光强度，待其荧光强度值基本趋于稳定，向其中加入10μL进攻链(5μM)，快速加入并充分混合均匀，继续监测其荧光强度，结果如图4所示，随着光照时间的增加，荧光信号的增加逐渐减弱，说明核酸分子链置换反应被逐渐抑制。
如上所述仅为本发明的几个具体实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，采用与其相同或相似方法所得到的调控核酸纳米结构自组装，均在本发明保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 一种基于光化学调控核酸分子链置换动力学的方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccctgatctt gttcctttct ccttct 26
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcctttctc cttctcccta acctcccatg 30
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaggaaagag gaaga 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtgggaggt taggg 15
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggtgggaggt tagggttttt tcaagatcag gg 32
Claims (6)
1.一种基于光化学调控核酸分子链置换反应的方法，其特征在于，通过调控紫外光照对核酸分子链置换反应进行调控；该方法的具体步骤为：
（1）根据沃森-克里克碱基互补配对原则及Hoogsteen配对原则，设计对应核酸分子链As，A，S，C，I的序列，完成核酸分子链的合成；所述核酸分子链As的序列为SEQ ID No.1：CCCTGATCTTGTTCCTTTCTCCTTCT；所述核酸分子链A的序列如SEQ ID No.2所示：TTCCTTTCTCCTTCTCCCTAACCTCCCATG-Cy5；所述核酸分子链S的序列如SEQ ID No.3所示：AAGGAAAGAGGAAGA；所述核酸分子链C的序列如SEQ ID No.4所示：Cy3-GGTGGGAGGTTAGGG；所述核酸分子链I的序列如SEQ ID No.5所示：GGTGGGAGGTTAGGGTTTTTTCAAGATCAGGG；
（2）将步骤（1）合成的核酸分子链As，A，S，C，I分别溶解于缓冲溶液中，备用；所述核酸分子链As，A，S，C，I在缓冲溶液中的终浓度均为100μM；
（3）将步骤（2）分别溶解于缓冲溶液的核酸分子链A，S，C及核酸分子链As进行混合，然后进行退火，形成模板链及核酸分子链As的混合溶液；
其中，所述模板链为由核酸分子链S，C，A这三条链经退火形成的复合物；所述核酸分子链A，S，C及核酸分子链As的摩尔比是1：1：1.25：5；
（4）在pH为5.54的缓冲溶液中混入无水乙醇，然后加入分子光开关材料螺吡喃形成混合溶液；所述缓冲溶液与无水乙醇的体积比为5：1；所述螺吡喃的摩尔浓度为25μM；
（5）将步骤（3）得到的模板链及核酸分子链As的混合溶液稀释至步骤（4）所述的混合溶液中，用紫外线灯进行照射，然后将核酸分子链I与模板链及核酸分子链As的混合溶液混合，收集荧光信号，完成基于光化学调控核酸分子链置换反应；核酸分子链I与模板链的摩尔比是5：1；
步骤(2)和（4）中，所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液、PBS缓冲溶液、TAE缓冲溶液中的一种。
2.如权利要求1所述的一种基于光化学调控核酸分子链置换反应的方法，其特征在于，使用带缺口的模板链作为反应底物。
3.如权利要求1所述的一种基于光化学调控核酸分子链置换反应的方法，其特征在于，利用核酸分子链As与模板链之间的Hoogsteen键形成三链体结构，从而引入小支点区域。
4.如权利要求1所述的一种基于光化学调控核酸分子链置换反应的方法，其特征在于，步骤（4）中，利用分子光开关材料螺吡喃调控体系中的质子浓度。
5.核酸分子链As，A，S，C，I，其特征在于，所述核酸分子链As的序列为SEQ ID No.1：CCCTGATCTTGTTCCTTTCTCCTTCT；所述核酸分子链A的序列如SEQ ID No.2所示：TTCCTTTCTCCTTCTCCCTAACCTCCCATG-Cy5；所述核酸分子链S的序列如SEQ ID No.3所示：AAGGAAAGAGGAAGA；所述核酸分子链C的序列如SEQ ID No.4所示：Cy3-GGTGGGAGGTTAGGG；所述核酸分子链I的序列如SEQ ID No.5所示：GGTGGGAGGTTAGGGTTTTTTCAAGATCAGGG。
6.如权利要求5所述的核酸分子链As，A，S，C，I在光化学调控核酸分子链置换反应中的应用。
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