CN116411056A - 适用于以二硫键作为可断连接单元修饰dNTP的测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高通量测序方法。包括1)提供包含两端含测序接头的基因组DNA片段的测序文库;2)基因组DNA片段的单链DNA与固相基质表面的引物互补配对;3)DNA聚合酶和带有阻断基团和荧光标记的dNTP加入到固相基质上;4)以基因组DNA片段为模板合成碱基,读取荧光值;5)去除新合成碱基3’端阻断基团和荧光标记,重复4)直到合成双链DNA;6)利用DNA聚合酶扩增生成二链测序的模板;7)DNA聚合酶和带有阻断基团与荧光标记的dNTP加入到固相基质上合成碱基;8)去除新合成碱基3’端阻断基团和荧光标记,重复7)。该方法可有效避免测序过程中的酶与修饰dNTP上的二硫键发生反应,保证测序正常进行。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序领域,具体涉及一种适用于以二硫键作为可断连接单元修饰dNTP的测序方法。
背景技术
随着测序技术的发展,越来越多的测序手段和测序公司涌现出来。利用带有可逆阻断基团和荧光染料修饰的dNTP实现边合成边测序(Sequencing By Synthesis,SBS)是一种经济高效、应用广泛的方法。在此过程中,可断连接单元作为连接核苷酸与荧光染料以及连接核苷酸与阻断基团的中介,其特点和性质对于测序的准确度、读长等都有重要影响。能够用在SBS技术中的可断连接单元既要不影响DNA聚合酶的活性,又要能在相对温和的条件下快速断裂,同时不能破坏DNA的结构和生物芯片表面的官能团。二硫键能够被多种温和的还原剂(如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇三(2-羧乙基)膦(TCEP)等)高效快速地断裂,同时其合成相对简单,因此得到了广泛应用。
然而,二硫键非常活跃,当体系中存在有巯基或者其他二硫键等基团时,二硫键在特定条件下会与之发生反应,从而导致以二硫键作为可断连接单元修饰dNTP失去阻断基团或荧光染料,无法再正常进行测序。
测序过程中用到的DNA聚合酶等蛋白上都含有巯基和二硫键等官能团,有些生物芯片表面也会有巯基等官能团的修饰,当这些官能团与修饰dNTP的二硫键发生反应时,会影响测序的正常进行。因此,要想使用以二硫键作为可断连接单元修饰dNTP,需要想办法阻止这种有害反应的进行。在DNA测序开始之前,需要先将模板DNA固定在芯片上,在固定模板DNA的过程中如果使用了可以跟二硫键发生反应的物质(如酶、蛋白、芯片表面的修饰等),那么在测序过程中,以二硫键作为可断连接单元修饰dNTP就会与之发生反应,dNTP失去原有的功能,测序过程受到影响。双末端测序在测序中应用广泛,其中,生成用于从另外一端开始测序的模板DNA(二链模板DNA)至关重要。在二链模板DNA生成的过程中,往往需要用到量比较多、活性较强的DNA聚合酶,这些DNA聚合酶在完成二链模板的生成之后较难被清洗掉。残留的DNA聚合酶可能会与修饰dNTP的二硫键发生反应,影响二链测序的进行。
而在现有的技术中,为了解决这个问题,用到二硫键作为可断连接单元修饰dNTP的DNA测序技术都会避免使用能够与之发生反应的酶等蛋白,这局限了可选择的酶种类以及酶的用量。而当测序过程中需要用到会与二硫键发生反应的酶(或其他成分)时,现有技术无法阻止这种有害反应的进行,导致修饰dNTP被破坏,测序无法正常进行。
由此,以二硫键作为可断连接单元修饰dNTP的测序方法还需要进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本发明提供了一种测序方法,可以有效避免测序过程中的酶(或其他成分)与修饰dNTP上的二硫键发生反应,保证测序的正常进行。
具体而言,本发明提供了如下技术方案:
本发明提供了一种高通量双末端测序方法,包括:(1)提供测序文库,所述测序文库包含基因组DNA片段,所述基因组DNA片段的两端含有测序接头;(2)获取所述测序文库的基因组DNA片段的单链DNA,与固相基质表面上的引物互补配对,以便将所述基因组DNA片段固定在所述固相基质上;(3)将DNA聚合酶、带有阻断基团与不同荧光标记的dNTP加入到所述固相基质上,(4)以基因组DNA片段为模板,合成互补链上一个碱基,读取碱基上的荧光信号;(5)去除所述互补链上新合成碱基3’端的阻断基团和荧光标记,重复步骤(4)直到完成单末端测序;(6)单末端测序完成之后,利用DNA聚合酶扩增生成二链测序的模板;(7)将DNA聚合酶和带有阻断基团与不同荧光标记的dNTP加入到固相基质上,使之以生成的二链为模板合成一个碱基;(8)去除所述新合成碱基3’端的阻断基团和荧光标记,重复步骤(7)直到测序完成。
根据本发明的实施例,以上所述的高通量测序方法还可以进一步包括如下技术特征:
根据本发明的实施例,所述高通量测序方法进一步包括:在步骤(6)之后,步骤(7)之前,加入二硫键断裂试剂进行处理,所述二硫键断裂试剂能够切开酶、蛋白质或芯片表面上的二硫键。在测序开始之前,先用能够切开二硫键的二硫键断裂试剂对固相基质上的DNA模板进行切除,以断开酶或者其他蛋白质上的二硫键,使之变成巯基。这些二硫键很可能会在后续的测序过程中与修饰dNTP上的二硫键发生交联反应。可用的二硫键断裂试剂选自二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(3-羟基丙基)膦中的至少一种。然后,加入巯基封闭试剂进行处理,所述巯基封闭试剂与巯基反应,封闭巯基基团。可用的巯基封闭试剂选自碘乙酰胺、氯乙酰氨(ClAM,chloroacetamide)、碘乙酸中的至少一种。用碘乙酰胺、氯乙酰氨(ClAM,chloroacetamide)、碘乙酸等巯基封闭试剂与巯基反应,巯基包括上一步由二硫键断开变成的巯基、蛋白上原来就含有的巯基或者芯片表面修饰的巯基等。发生反应后的巯基被封闭掉,不会再与修饰dNTP上的二硫键发生反应。
根据本发明的实施例,所述高通量测序方法进一步包括:在步骤(7)之前(二链测序的每一轮聚合反应之前),在固相基质中加入缓冲液孵育,所述缓冲液中含有二硫化物。在每一循环的合成反应进行之前用含有二硫化物(如HED、cystamine等)的缓冲液对DNA模板进行孵育,以消耗掉潜在的能够与修饰dNTP上的二硫键发生反应的物质。
根据本发明的实施例,所述高通量测序方法进一步包括:在步骤(6)之后,步骤(7)之前,采用表面活性剂去除所述固相基质表面的DNA聚合酶,所述表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、月桂酸中的至少一种。用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或者其他表面活性剂清洗多余的蛋白质(酶),减少残余的酶量,从而减少与修饰dNTP发生反应的量。
根据本发明的实施例,步骤(3)中所述阻断基团选自叠氮基团、氨基基团、乙基、甲基或者其他可以用于可逆阻断修饰的基团。
根据本发明的实施例,步骤(1)中通过下述方法获得测序文库:获取片段化的核酸序列,对所述核酸序列进行末端修复,并进行5’端磷酸化和3’端加尾;连接测序接头,进行PCR扩增,以便获得所述测序文库。
根据本发明的实施例,所述基因组DNA片段大小为80~800bp。
根据本发明的实施例,所述测序文库为DNA纳米球,步骤(1)进一步包括:将基因组DNA片段进行单链变性,环化,以便获得单链环状DAN;通过滚环扩增技术对所述单链环状DNA进行扩增,以便获得DNA纳米球。
根据本发明的实施例,所述高通量测序方法适用于MGI平台、illumina平台、SOLID平台。
根据本发明的实施例,所述基因组DNA片段来自于组织、FFPE、cfDNA、gDNA、多重PCR产物、杂交产物、不同突变频率的肿瘤标准品、血浆游离DNA捕获文库、ctDNA捕获文库。
本发明所取得的有益效果为:本发明所提供的高通量方法,有效避免了修饰dNTP上的二硫键发生不利于测序的反应,可以显著减少测序过程中因为修饰dNTP二硫键发生反应而导致的荧光染料被吸附在芯片内或者丢失以及3’端阻断基团丢失等问题,从而降低背景和runon,提升测序质量。
附图说明
图1是根据本发明的实施例1提供的测试组与对照组二链Q30的比较结果图。
图2是根据本发明的实施例1提供的测试组与对照组每个循环Q30的比较结果。
图3是根据本发明的实施例1提供的测试组与对照组每个循环背景的比较结果图。
图4是根据本发明的实施例1提供的测试组与对照组每个循环平均lag值的比较结果。
图5为根据本发明的实施例1提供的测试组与对照组每个循环平均runon值的比较结果。图6为根据本发明的实施例1提供的测试组与对照组二链第一循环A通道的图片对比结果。
图7为根据本发明的实施例2提供的测试组与对照组二链二链Q30的比较结果图。
图8为根据本发明的实施例2提供的测试组与对照组信号的比较结果图。
图9为根据本发明的实施例2提供的测试组与对照组背景的比较结果图。
图10为根据本发明的实施例2提供的测试组与对照组每个循环Q30的比较结果图。
图11为根据本发明的实施例2提供的测试组与对照组每个循环lag值的比较结果图。
图12为根据本发明的实施例2提供的测试组与对照组每个循环runon值的比较结果图。
图13为根据本发明的实施例3提供的测试组与对照组二链二链Q30的比较结果图。
图14为根据本发明的实施例3提供的测试组与对照组信号的比较结果图。
图15为根据本发明的实施例3提供的测试组与对照组背景的比较结果图。
图16为根据本发明的实施例3提供的测试组与对照组每个循环Q30的比较结果图。
图17为根据本发明的实施例3提供的测试组与对照组每个循环lag值的比较结果图。
图18为根据本发明的实施例3提供的测试组与对照组每个循环runon值的比较结果图。
图19为根据本发明的实施例4提供的测试组与对照组二链二链Q30的比较结果图。
图20为根据本发明的实施例4提供的测试组与对照组信号的比较结果图。
图21为根据本发明的实施例4提供的测试组与对照组背景的比较结果图。
图22为根据本发明的实施例4提供的测试组与对照组每个循环Q30的比较结果图。
图23为根据本发明的实施例4提供的测试组与对照组每个循环lag值的比较结果图。
图24为根据本发明的实施例4提供的测试组与对照组每个循环runon值的比较结果图。
具体实施方式
下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
本发明提供了一种高通量测序方法来避免修饰dNTP上的二硫键发生有害反应。所提供的方法广泛应用于WGS、WES、RNA、WGBS及Panel等各种文库类型。
本发明提供了一种高通量测序方法,包括:(1)提供测序文库,所述测序文库包含基因组DNA片段,所述基因组DNA片段的两端含有测序接头;(2)获取所述测序文库的基因组DNA片段的单链,与固相基质表面上的引物互补配对,以便将所述基因组DNA片段固定在所述固相基质上;(3)将DNA聚合酶和带有阻断基团和不同荧光标记的dNTP加入到所述固相基质上;(4)以基因组DNA片段为模板,合成互补链上一个碱基,读取碱基上的荧光信号;(5)去除所述互补链上新合成碱基3’端的阻断基团和荧光标记,重复步骤(4)直到完成单末端测序;(6)单末端测序完成之后,利用DNA聚合酶扩增生成二链测序的模板;(7)将DNA聚合酶和带有阻断基团与不同荧光标记的dNTP加入到固相基质上,使之以生成的二链为模板合成一个碱基;(8)去除所述新合成碱基3’端的阻断基团和荧光标记,重复步骤(7)直到测序完成。
根据本发明的实施方式,所述高通量测序方法进一步包括:在步骤(6)之后,步骤(7)之前,加入二硫键断裂试剂进行处理,所述二硫键断裂试剂能够切除酶或蛋白质上的二硫键。在测序开始之前,先用能够切开二硫键的二硫键断裂试剂对固相基质上的DNA模板进行切除,以断开酶或者其他蛋白质上的二硫键,使之变成巯基。这些二链键很可能会在后续的测序过程中与修饰dNTP上的二硫键发生交联反应。可用的二硫键断裂试剂包括但不限于二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(3-羟基丙基)膦。二硫键断裂试剂的用量为0.001-1000mM。
根据本发明的实施方式,所述高通量测序方法进一步包括:加入巯基封闭试剂进行处理,所述巯基封闭试剂与巯基反应,以便封闭巯基基团。可用的巯基封闭试剂选自碘乙酰胺、氯乙酰氨(ClAM,chloroacetamide)、碘乙酸等。用碘乙酰胺、氯乙酰氨(ClAM,chloroacetamide)、碘乙酸等巯基封闭试剂与巯基反应,巯基包括上一步由二硫键断开变成的巯基、蛋白上原来就含有的巯基或者芯片表面修饰的巯基等。发生反应后的巯基被封闭掉,不会再与修饰dNTP上的二硫键发生反应。巯基封闭试剂的用量为0.001-1000mM。
根据本发明的实施方式,所述高通量测序方法进一步包括:在步骤(7)之前,在固相基质中加入缓冲液孵育,所述缓冲液中含有二硫化物。在每一循环的合成反应进行之前用含有二硫化物(如HED、cystamine等)的缓冲液对DNA模板进行孵育,以消耗掉潜在的能够与修饰dNTP上的二硫键发生反应的物质。缓冲液中二硫化物的用量为0.001-1000mM
根据本发明的实施方式,所述高通量测序方法进一步包括:采用表面活性剂去除所述固相基质表面的DNA聚合酶,所述表面活性剂包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、月桂酸等。用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或者其他表面活性剂清洗多余的蛋白质(酶),减少残余的酶量,从而减少与修饰dNTP发生反应的量。表面活性剂的用量为0.001-1000mM。
根据本发明的实施方式,步骤(3)中所述阻断基团包括但不限于叠氮基团、氨基基团、乙基基团、甲基基团或者其他可以用于可逆阻断修饰的基团。
根据本发明的实施例,所述基因组DNA片段大小为20~800bp。根据本发明的实施例,所述高通量测序方法适用于MGI平台、illumina平台、SOLID平台等多个测序平台。
根据本发明的实施例,所述基因组DNA片段来自于组织、FFPE、cfDNA、gDNA、多重PCR产物、杂交产物、不同突变频率的肿瘤标准品、血浆游离DNA捕获文库、ctDNA捕获文库。基因组DNA片段可以直接来自于DNA样本,也可以来自于RNA样本。
对于DNA样本,可以通过超声或者酶切的方式对DNA进行片段化。而且根据文库大小可以选择不同片段化条件获得预期长度的小片段DNA。打断后的DNA片段两端会有缺口,需要对DNA缺口进行修复,并同时完成5’端磷酸化和3‘端添加A尾。然后连接上测序接头(例如可以为BGISEQ/MGISEQ测序接头),进行PCR扩增得到DNA文库。当然,如果为了获得DNA纳米球,还需要将DNA文库中的双链产物进行单链变性、环化、消化得到可用于制备DNA纳米球的单链环状DNA,即单链环化步骤。有些样本,例如血浆游离DNA样本,在提取获得其核酸时已经是片段化的DNA,因此不再需要进行片段化处理。而针对RNA样本,需要去除rRNA或者进行mRNA富集,并进行反转录形成DNA文库。实施例中所用到的dNTP记载在申请号为202110355785.4的中国专利申请中。
本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
其中实施例中所用到的仪器如下:
MGISEQ-2000测序仪,MGISEQ-2000测序试剂载片(715nm),迷你装载仪,PCR仪,PCR八连管,eppendorf移液器一套,effendorf高速离心机
所用到的试剂如下:
实施例1
1.制备和装载DNB
参考《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》对大肠杆菌文库进行DNA纳米球的制备和定量,准备两张一样的测序芯片,按照说明书,将制备好的DNA纳米球装都载到这两张MGISEQ-2000测序试剂载片(715nm)上。
2.准备测序试剂
准备两套DNBSEQ-G400高通量测序试剂套装(FCL PE50)。一套作为对照组,一套作为实验组。
2.1将MGISEQ-2000RS高通量测序试剂盒中的MDA试剂和MDA聚合酶取出,按照下表配制两套MDA混合液:
将两套混合液分别加入到两个试剂槽的15号孔中。
2.2取CPAS AD153测序引物2工作液V2.0 100ml,称取适量的CTAB加入其中,使其终浓度为1mM。将两套试剂盒中实验组的8号孔试剂取出,用移液器量取3ml新配制的这种含有十六烷基三甲基溴化铵的测序引物加入到8号孔中。对照组的8号孔试剂不做处理。
2.3配制50mM的碳酸氢铵溶液,称取适量的碘乙酰胺粉末加入其中,使其终浓度为50mM。将两套试剂盒中实验组的13号孔试剂取出,用移液器量取3ml新配制的封闭试剂混合液加入到13号孔中。对照组的13号孔试剂不做处理。
2.4称取适量的2-羟乙基二硫化物加入到洗脱试剂2中,使其终浓度为5mM。将两套试剂盒中实验组的18号孔试剂取出,将新配制的含有2-羟乙基二硫化物的洗脱试剂2加入到18号孔中。对照组的18号孔试剂不做处理。
2.5准备测序用的以二硫键作为可断连接单元修饰dNTP和可以聚合这种dNTP的测序酶以及对应的测序缓冲液。按照下表配制测序用的测序试剂混合液和补平试剂混合液,每种混合液配制两份:
将两套试剂槽中的1号孔试剂取出,加入配好的测序试剂混合液。两套试剂槽的2号孔试剂取出,加入配好的补平试剂混合液。
3.设置脚本
对照组的脚本无需更改,实验组的脚本在对照组脚本的基础上做以下更改:
1)脚本里设置二链模板生成之后,先将二硫键断裂试剂(切除试剂)泵入芯片中60℃孵育5分钟,然后泵入13号孔的封闭试剂,30℃孵育30分钟;
2)实验组的引物试剂中添加了CTAB,在二链测序引物杂交时CTAB会清洗掉多余的DNA聚合酶。实验组和对照组的引物杂交条件都是用都是55℃10分钟;
3)脚本中设置二链的每个循环合成开始之前,芯片在添加了二硫化物的新洗脱试剂2中63℃孵育30秒。
4.上机测序
按照《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》将测序试剂槽、芯片放在MGI2000-RS测序仪上,选择对应的脚本,设置读长为PE50,进行测序。
测序结果如下:
图1是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组二链Q30的比较结果图。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者背景相同。在二链的50个循环的测试中,使用了减少MDA酶用量、CTAB清洗、封闭试剂封闭以及合成反应进行前用二硫化物孵育的测试组Q值明显比对照组高。
图2是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环Q30的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者背景相同。在二链的50个循环的测试中,使用了减少MDA酶用量、CTAB清洗、封闭试剂封闭以及合成反应进行前用二硫化物孵育的测试组每个cycle的Q30明显比对照组高。
图3是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环背景的比较结果图。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者Q30相同。在二链的50个循环的测试中,使用了CTAB清洗、封闭试剂封闭以及合成反应进行前用二硫化物孵育的测试组背景明显比对照组低。
图4是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环平均lag值的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者lag值相同。在二链的50个循环的测试中,使用、CTAB清洗、封闭试剂封闭以及合成反应进行前用二硫化物孵育的测试组lag值明显比对照组低。
图5为根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环平均runon值的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者runon值相同。在二链的50个循环的测试中,使用了、CTAB清洗、封闭试剂封闭以及合成反应进行前用二硫化物孵育的测试组runon值明显比对照组低。
图6为根据本发明的实施例提供的测试组与对照组二链第一循环A通道的图片对比结果。测试组二链第一循环A通道图片(左)清晰,背景低。对照组二链第一循环A通道图片(右)模糊,背景高。
实施例2
1.制备和装载DNB
参考《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》对大肠杆菌文库进行DNA纳米球的制备和定量,准备两张一样的测序芯片,按照说明书,将制备好的DNA纳米球装都载到这两张MGISEQ-2000测序试剂载片(715nm)上;
2.准备测序试剂
准备两套DNBSEQ-G400高通量测序试剂套装(FCL PE50)。一套作为对照组,一套作为实验组。
2.1将MGISEQ-2000RS高通量测序试剂盒中的MDA试剂和MDA聚合酶取出,按照下表配制两套MDA混合液:
将两套混合液分别加入到两个试剂槽的15号孔中。
2.2取CPAS AD153测序引物2工作液V2.0 100ml,称取适量的CTAB加入其中,使其终浓度为1mM。将两套试剂盒中实验组的8号孔试剂取出,用移液器量取3ml新配制的这种含有十六烷基三甲基溴化铵的测序引物加入到8号孔中。对照组的8号孔试剂不做处理。
2.3准备测序用的以二硫键作为可断连接单元修饰dNTP和可以聚合这种dNTP的测序酶以及对应的测序缓冲液。按照下表配制测序用的测序试剂混合液和补平试剂混合液,每种混合液配制两份:
将两套试剂槽中的1号孔试剂取出,加入配好的测序试剂混合液。两套试剂槽的2号孔试剂取出,加入配好的补平试剂混合液。
3.上机测序
按照《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》将测序试剂槽、芯片放在MGI2000-RS测序仪上,选择对应的脚本,设置读长为PE50,进行测序。
测序结果如下:
图7是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组二链Q30的比较结果图。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者Q30相同。在二链的50个循环的测试中,使用了CTAB清洗的测试组Q值明显比对照组高。
图8是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环信号的比较结果图。对照组和测试组每个循环的信号在一链和二链中都一致。
图9是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环背景的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者背景值相同。在二链的50个循环的测试中,使用了CTAB清洗的测试组背景值明显比对照组低。
图10是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环Q30的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者背景相同。在二链的50个循环的测试中,使用了CTAB清洗的测试组Q值明显比对照组高。
图11是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环平均lag值的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者lag值相同。在二链的50个循环的测试中,使用了CTAB清洗的测试组lag值明显比对照组低。
图12为根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环平均runon值的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者runon值相同。在二链的50个循环的测试中,使用了CTAB清洗的测试组runon值明显比对照组低。
实施例3
1.制备和装载DNB
参考《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》对大肠杆菌文库进行DNA纳米球的制备和定量,准备两张一样的测序芯片,按照说明书,将制备好的DNA纳米球装都载到这两张MGISEQ-2000测序试剂载片(715nm)上。
2.准备测序试剂
准备两套DNBSEQ-G400高通量测序试剂套装(FCL PE50)。一套作为对照组,一套作为实验组。
2.1将MGISEQ-2000RS高通量测序试剂盒中的MDA试剂和MDA聚合酶取出,按照下表配制两套MDA混合液:
将两套混合液分别加入到两个试剂槽的15号孔中。
2.2配制50mM的碳酸氢铵溶液,称取适量的碘乙酰胺粉末加入其中,使其终浓度为50mM。将两套试剂盒中实验组的13号孔试剂取出,用移液器量取3ml新配制的封闭试剂混合液加入到13号孔中。对照组的13号孔试剂不做处理。
2.3准备测序用的以二硫键作为可断连接单元修饰dNTP和可以聚合这种dNTP的测序酶以及对应的测序缓冲液。按照下表配制测序用的测序试剂混合液和补平试剂混合液,每种混合液配制两份:
将两套试剂槽中的1号孔试剂取出,加入配好的测序试剂混合液。两套试剂槽的2号孔试剂取出,加入配好的补平试剂混合液。
3.设置脚本
对照组的脚本无需更改,实验组的脚本在对照组脚本的基础上做以下更改:
脚本里设置二链模板生成之后,先将二硫键断裂试剂(切除试剂)泵入芯片中60℃孵育5分钟,然后泵入13号孔的封闭试剂,30℃孵育30分钟。
4.上机测序
按照《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》将测序试剂槽、芯片放在MGI2000-RS测序仪上,选择对应的脚本,设置读长为PE50,进行测序。
图13是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组二链Q30的比较结果图。在二链的50个循环的测试中,使用了封闭试剂的测试组Q值明显比对照组高。
图14是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环信号的比较结果图。对照组和测试组每个循环的信号在一链和二链中都一致。
图15是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环背景的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者背景值相同。在二链的50个循环的测试中,使用了封闭试剂的测试组背景值明显比对照组低。
图16是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环Q30的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者Q30相同。在二链的50个循环的测试中,使用了封闭试剂的测试组Q值明显比对照组高。
图17是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环平均lag值的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者lag值相同。在二链的50个循环的测试中,使用了封闭试剂的测试组lag值明显比对照组低。
图18为根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环平均runon值的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者runon值相同。在二链的50个循环的测试中,使用了封闭试剂的测试组runon值明显比对照组低。
实施例4
1.制备和装载DNB
参考《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》对大肠杆菌文库进行DNA纳米球的制备和定量,准备两张一样的测序芯片,按照说明书,将制备好的DNA纳米球装都载到这两张MGISEQ-2000测序试剂载片(715nm)上。
2.准备测序试剂
准备两套DNBSEQ-G400高通量测序试剂套装(FCL PE50)。一套作为对照组,一套作为实验组。
2.1将MGISEQ-2000RS高通量测序试剂盒中的MDA试剂和MDA聚合酶取出,按照下表配制两套MDA混合液:
将两套混合液分别加入到两个试剂槽的15号孔中。
2.2称取适量的2-羟乙基二硫化物加入到洗脱试剂2中,使其终浓度为5mM。将两套试剂盒中实验组的18号孔试剂取出,将新配制的含有2-羟乙基二硫化物的洗脱试剂2加入到18号孔中。对照组的18号孔试剂不做处理。
2.3准备测序用的以二硫键作为可断连接单元修饰dNTP和可以聚合这种dNTP的测序酶以及对应的测序缓冲液。按照下表配制测序用的测序试剂混合液和补平试剂混合液,每种混合液配制两份:
将两套试剂槽中的1号孔试剂取出,加入配好的测序试剂混合液。两套试剂槽的2号孔试剂取出,加入配好的补平试剂混合液。
3.设置脚本
对照组的脚本无需更改,实验组的脚本在对照组脚本的基础上做以下更改:
脚本中设置二链的每个循环合成开始之前,芯片在添加了二硫化物的新洗脱试剂2中63℃孵育30秒。
4.上机测序
按照《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》将测序试剂槽、芯片放在MGI2000-RS测序仪上,选择对应的脚本,设置读长为PE50,进行测序。
实验结果如下:
图19是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组二链Q30的比较结果图。在二链的50个循环的测试中,测试组Q值明显比对照组高。
图20是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环信号的比较结果图。对照组和测试组每个循环的信号在一链和二链中都一致。
图21是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环背景的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者背景值相同。在二链的50个循环的测试中,测试组背景值明显比对照组低。
图22是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环Q30的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者Q30相同。在二链的50个循环的测试中,测试组Q值明显比对照组高。
图23是根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环平均lag值的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者lag值相同。在二链的50个循环的测试中,测试组lag值明显比对照组低。
图24为根据本发明的实施例提供的测试组与对照组每个循环平均runon值的比较结果。在一链50个循环的测试中,对照组与测试组条件一致,两者runon值相同。在二链的50个循环的测试中,测试组runon值明显比对照组低。
本文中,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种高通量测序方法,其特征在于,包括:
(1)提供测序文库,所述测序文库包含基因组DNA片段,所述基因组DNA片段的两端含有测序接头;
(2)获取所述测序文库的基因组DNA片段的单链DNA,与固相基质表面上的引物互补配对,以便将所述基因组DNA片段固定在所述固相基质上;
(3)将DNA聚合酶、带有阻断基团和不同荧光标记的dNTP加入到所述固相基质上;
(4)以基因组DNA片段为模板,合成互补链上一个碱基,读取碱基上的荧光信号;
(5)去除所述互补链上新合成碱基3’端的阻断基团和荧光标记,重复步骤(4)直到合成双链DNA;
(6)单末端测序完成之后,利用DNA聚合酶扩增生成二链测序的模板;
(7)将DNA聚合酶和带有阻断基团与不同荧光标记的dNTP加入到固相基质上,使之以生成的二链为模板合成一个碱基;
(8)去除所述新合成碱基3’端的阻断基团和荧光标记,重复步骤(7)直到测序完成。
2.根据权利要求1所述的高通量测序方法,其特征在于,进一步包括:
在步骤(6)之后,步骤(7)之前,加入二硫键断裂试剂进行处理,所述二硫键断裂试剂能够切除酶或蛋白质上的二硫键;
任选地,所述二硫键断裂试剂选自硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(3-羟基丙基)膦中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的高通量测序方法,其特征在于,进一步包括:
加入巯基封闭试剂进行处理,所述巯基封闭试剂与巯基反应,以便封闭巯基基团;
任选地,所述巯基封闭试剂选自碘乙酰胺、氯乙酰氨(ClAM,chloroacetamide)、碘乙酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的高通量测序方法,其特征在于,进一步包括:
在步骤(7)之前,以及每一轮测序的聚合反应之前,在固相基质中加入缓冲液孵育,以便消耗掉所述固相基质上的会与二链键反应的物质,所述缓冲液中含有二硫化物。
5.根据权利要求1所述的高通量测序方法,其特征在于,进一步包括:
采用表面活性剂去除所述固相基质表面的DNA聚合酶,所述表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、月桂酸中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的高通量测序方法,其特征在于,步骤(3)中所述阻断基团选自叠氮基团、氨基基团、乙基、甲基或者其他可以用于可逆阻断修饰的基团。
7.根据权利要求1所述的高通量测序方法,其特征在于,步骤(1)中所述测序文库通过下述方法获得:
获取片段化的核酸序列,对所述核酸序列进行末端修复,并进行5’端磷酸化和3’端加尾;
连接测序接头,进行PCR扩增或者不进行PCR扩增,以便获得所述测序文库。
8.根据权利要求1所述的高通量测序方法,其特征在于,所述基因组DNA片段大小为20~800bp。
9.根据权利要求1所述的高通量测序方法,其特征在于,所述测序文库为DNA纳米球,步骤(1)进一步包括:
将基因组DNA片段进行单链变性,环化,以便获得单链环状DNA;
通过滚环扩增技术对所述单链环状DNA进行扩增,以便获得DNA纳米球;
任选地,所述高通量测序方法适用于MGI平台illumina平台、SOLID平台。
10.根据权利要求1所述的高通量测序方法,其特征在于,所述基因组DNA片段来自于组织、FFPE、cfDNA、gDNA、多重PCR产物、杂交产物、不同突变频率的肿瘤标准品、血浆游离DNA捕获文库、ctDNA捕获文库。
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2021
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