CN114196735A - 一种芯片上恒温扩增测序的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种芯片上恒温扩增测序的方法。将修饰了两种扩增引物的微球首先固载到基因测序芯片上，然后在芯片内进行恒温扩增反应，从而应用于基因测序。本发明所述的方法效率比较高，不需要特殊的仪器，不需要复杂的建库流程，并且可以和现有的测序方法兼容，特别的也适合于荧光切换的测序方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种芯片上恒温扩增测序的方法，属于基因测序领域。
背景技术
高通量测序技术是目前生命科学领域常见的分析技术之一，该技术可以将DNA样本片段进行测序，得到对应样本的DNA序列，建立生物表型与基因组、转录组等层面上的联系。现在，第二代测序技术因为其巨大的通量和相对廉价的价格，已经占据了测序领域的绝大部分市场。第二代测序技术的一大特点就是不是对单独的一条DNA进行测序，而是将一条DNA进行扩增几千几万倍后再进行测序和信号采集，而这其中就要用到不同的DNA扩增技术。目前当今世界上的主流测序技术都有着自己对应的特有的扩增技术。Illumina公司可逆末端终止测序技术使用了桥式扩增方法：在平面芯片表面种植两种不同引物后进行桥式PCR并得到DNA簇；ion torrent公司的半导体测序方法对应的是乳液PCR的扩增方法：在形成的乳液内的微球上进行固相PCR，之后再固载到芯片上；华大测序仪则是使用的DNA纳米球的扩增方式：将DNA固载到芯片表面后扩增成一团DNA纳米球。但是这些方法要么直接与现有的荧光发生测序方法不兼容，要么需要特殊且复杂的文库构建过程，要么需要额外的复杂仪器单独进行扩增。
本发明阐述了一种基于固载了两种引物微球的、在芯片上发生的的恒温扩增方法。将预先修饰好的微球通过固载基团固载到芯片上，然后通入试剂，经过杂交，恒温扩增的步骤就可以进行测序反应。本发明提供一种高通量基因测序反应的恒温扩增的微球准备方法，不需要复杂的仪器，特殊的设备，并且和已知的大部分测序反应可以兼容，特别的可以应用于荧光发生或者成为荧光切换的测序反应。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种通过芯片上恒温扩增测序的方法，在将微球固载到芯片上，原位的发生杂交、扩增反应，并且应用于测序的方法。
为实现上述目的，本发明采取下述方案：
一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于包括以下步骤，
(1)将微球固载到基因测序芯片的表面
所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物，并且至少一种扩增引物的序列上含有可被剪切的位点；
所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团,利用固载基团将微球固载到基因测序芯片的表面；
(2)杂交，延伸，解旋，清洗
将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；
加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；
解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；
(3)恒温扩增
加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；
加入剪切试剂，将扩增后的双链模板剪切为单链；
加入封端试剂，将微球表面的DNA链的3’端进行封堵；
(4)测序
杂交测序引物，测序。
根据优选的实施方式，其中所述微球上修饰有两种扩增引物，并且连接有固载用基团；扩增模板的两端含有公共的接头序列，接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增引物至少部分序列是相同的。
本发明提供一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于包含以下步骤，
(1)将微球固载到基因测序芯片的表面
所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物；
所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团；
(2)杂交，延伸
将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；
加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；
(3)恒温扩增
加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；
(4)测序
杂交测序引物，测序；
根据优选的实施方式，优选地，所述扩增为恒温扩增。
根据优选的实施方式，优选地，所述扩增为RPA、RAA、桥式扩增中的一种。
根据优选的实施方式，所述RPA扩增的时间为5-90分钟。
根据优选的实施方式，所述扩增引物的长度为20-45bp。
根据优选的实施方式，所述微球上有生物素作为固载用的基团，所述基因测序芯片上有修饰的链霉亲和素；通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到基因测序芯片上。
根据优选的实施方式，所述微球的直径为0.3-5微米，优选0.5-4微米，更优选1-2微米。
本发明提供一种基因测序方法，其特征在于，将待测的DNA分子打断成50-1000bp的片段，作为扩增模板，按照前面任一项技术所述所述的方法测序。
有益效果：
本发明采用一种基于固载了两种引物的微球的在芯片上发生的的恒温扩增用于测序的方法。通过将带有两种引物的微球固载到坑内进行固相扩增，使得多数坑内的DNA簇都由同一种模板扩增出来，实现了与荧光发生测序兼容的效果。本发明相比于illumina和ion torrent等公司的扩增方法，不仅快速高效，不需要特殊、复杂的建库流程，也没有PCR的复杂温控流程和乳液扩增的复杂流体装置。并且本发明的技术还可以应用于illumina的可逆末端终止测序等其他测序技术。
(1)本发明将固载了引物的微球直接固载到芯片表面，这样既可以与荧光发生测序技术兼容，又不破坏芯片坑内外的区分修饰，因此不会影响后续测序时的液封。(2)本发明使用的是重组酶聚合酶恒温扩增技术，该技术更加快速高效，对装置的要求更低，不需要PCR的复杂温控流程和乳液扩增的复杂流体装置。(3)本发明不需要特殊的、复杂的建库流程，只要在DNA样本两端连接上接头即可，建库流程更方便，操作时间更少。(4)本发明可与其他高通量测序技术兼容，兼容性更强。
附图说明
图1.微球在芯片上的固载以及扩增的示意图；
图2.芯片上扩增流程图。
具体实施方式
本发明所述的基因测序芯片指的是一般的具有流体出入口，具备反应室的芯片。常见的，申请人之前的专利中曾多次公开类似的基因测序芯片，例如专利CN2017105741742、CN201710630287X，必要的时候，上述专利的内容可以以引用的方式加入本专利。
微球和基因测序芯片的化学连接可以用多种方式。一般的，使用两个相互可以反应的化学基团进行连接是比较优选的。特殊的，可以用物理卡位的方式进行微球的固定，但是实际操作的时候是很难的，对于微球和底板的相互匹配的要求比较高。
化学连接是常见的可以想到的方法，常见的，利用点击化学进行连接，例如一种表面上有炔基基团，另一个表面上有叠氮基团。总体来说，化学的连接方法更为常见，并且可以根据不同的应用环境选择不同的连接方式。此处也就不再重复讨论。
RPA为37～42度的恒温扩增反应，反应时主要依靠DNA聚合酶、重组酶和单链结合蛋白等关键蛋白。在结合到互补序列前，引物会先和重组酶结合形成引物-重组酶纤维。在反应时，引物在重组酶及其相关辅酶的作用下将作为模板的双链DNA打开并进行链交换，在互补配对处结合到打开的单链上。紧接着，单链结合蛋白会结合到被打开的单链上并维持单链结构。之后，引物在具有5’-3’链取代活性的DNA聚合酶的作用下边解旋双链边进行新一条链的合成，并最终形成一条新的DNA双链和被取代下来的DNA单链。两端的引物均在酶的作用下进行以上反应，便可以对模板进行指数扩增
RPA扩增循环:在扩增时，引物会和重组酶结合并在其作用下与互补配对区域结合，形成D型茎环结构。然后单链结合蛋白与解旋的单链结合，结合的引物则在DNA聚合酶的作用下延伸，形成新的双链和解旋单链，完成扩增过程。引物-重组酶聚合物的形成过程中，当ATP水解时，引物-重组酶聚合物会解体，重组酶uvsX会被单链结合蛋白gp32所取代。而在辅助结合因子uvsY和高分子Carbowax 20M存在的情况下，该平衡又会朝向生成引物-重组酶的方向移动。
在RPA反应中较为关键的是引物-重组酶纤维的形成过程，这是借助ATP和重组酶uvsX完成的。当ATP水解时，引物-重组酶聚合物会解体，重组酶uvsX会被单链结合蛋白gp32所取代。而在辅助结合因子uvsY和高分子Carbowax 20M存在的情况下，该平衡又会朝向生成引物-重组酶的方向移动。
早在2006年首次报道了RPA技术，并利用该技术完成了DNA的荧光定量。随后，Piepenburg所在的TwistDx公司推出了基于RPA扩增技术的TwistAmp扩增试剂盒。2017年，TwistDx公司继续推出了全新的液态RPA试剂盒。2018年，TwistDx公司推出了新的利用甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶的RPA检测手段，实现了在试纸条上的RPA直接检测。
RPA扩增技术反应迅速，通常整个反应只需要5～20分钟，最终可以将模板扩增1011～1012倍。RPA的扩增引物不同于PCR引物，一般引物长度在30nt左右，扩增的模板最适长度为100～200bp，可以扩增80～400bp的模板，最长可以扩增1.5kb的模板，但扩增效果受到显著影响。另外，RPA扩增的序列特异性较好，可以对不同靶序列进行扩增，且扩增不受多种PCR抑制剂的影响(Lillis et al.,2016；Lobato and O'Sullivan,2018；Piepenburg etal.,2006)。由于其出色的扩增速率和扩增特异性，RPA技术常被用于液态活检等领域。
本发明中所述的恒温扩增可以是RPA或者RAA。RPA重组酶聚合酶扩增涉及到两种引物。一般的涉及到三种酶，分别是重组酶，单链DNA结合蛋白，聚合酶。更多的关于RPA的信息可以查询appendix to the twistamp reaction kit。
荧光发生测序的信号产生原理是DNA聚合酶按照碱基互补配对原则将5’磷酸上标记了荧光基团的反应底物结合到测序模板上，释放下来的基团会在碱性磷酸酶的作用下进一步分解出荧光发生基团，这样DNA模板发生延伸时就会释放出荧光基团并在特定波长激发光下发出荧光。荧光发生测序的一个特点是释放出的荧光基团会在反应液内扩散，在敞开的反应池内相邻的两个不同模板释放的荧光基团会因为扩散作用而互相混合，最终导致信号无法识别。为了解决这个问题，荧光发生测序技术的芯片存在微坑结构，且坑内外经过修饰。在测序时，会用非水相的另一种溶液将微坑上方的反应液推走，仅留下坑内的反应液，达到液封的效果，这样测序时释放的荧光基团就不会在微坑间扩增串扰。
本专利里阐述的扩增技术就巧妙地利用了芯片的修饰和微坑结构，实现了与荧光发生测序的兼容，同时和其他的高通量测序里使用的扩增方式相比更加快速、建议、温控要求低，且与多种测序方法兼容。本扩增方法首先会将固载了两种扩增引物、尺寸固定且含有固载用基团的高分子微球固载到加工出微坑并修饰好的芯片表面，达到绝大多数的芯片的微坑内都有微球而坑外不存在微球的状态。扩增的第一步会将扩增模板杂交到芯片的微球表面。扩增的模板两端含有公共的接头序列，该序列与微球表面的引物互补配对，因此可以按照碱基互补配对的原则进行杂交。在杂交结束后，会将多余的模板清洗掉并进入含有DNA聚合酶的反应液反应，这样固相的引物会根据杂交上的DNA模板延伸出一条完整的互补配对的模板链。紧接着，加入DNA解旋液反应并将解旋下的DNA清洗走。这样整个芯片内部就不再存在液相的游离DNA，所有模板DNA都复制到了固载的微球表面。之后会采用重组酶聚合酶恒温扩增技术(RPA)进行扩增，重组酶会在结合DNA模板后特异性地将模板结合到微球上与DNA模板互补配对的引物上，然后与单链结合蛋白结合并在DNA聚合酶的帮助下开始新一条DNA链的合成，最后在其他蛋白的作用下DNA与单链结合蛋白分离并再次与重组酶结合。如此循环，DNA模板便可以在微球表面进行扩增，这一扩增过程温度为恒温37摄氏度左右，仅需1小时左右便可完成。
扩增结束后，需要对扩增产物进行进一步处理才能进行后续测序。首先，微球表面的两种引物里，有一种引物内有特殊修饰(U碱基)，在加入剪切液后可以被特异性的剪切掉。之后，会向芯片内加入封端液，使得所有固相DNA的3’端都被封住，无法在DNA聚合酶的作用下延伸产生杂信号。最后，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋掉，暴露出可以结合测序引物的单链。在经过上述处理步骤后，只要杂交测序引物便可以进行正常的测序反应了。
引物在扩增反应中经常用到。本发明中涉及到至少两种扩增引物。两种引物的作用在于不仅仅和模板结合配对，还在重组酶存在的情况下，将DNA链的另一端连接到微球上面。这样在扩增的过程中，就形成了在微球表面扩增的过程。引物的设计与合成并没有特殊的要求。本发明中涉及到的两种引物分别是:
引物1：31bp5‘-dUGAAGGTGTGCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG；
引物2(41bp)：5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT。
所述的引物1和引物2是其中的一个示例。不同的扩增反应对于引物的数量等的要求是不一样的。本发明中涉及到的恒温扩增反应可以使用至少两种引物的形式。引物的具体设计是可以变化的。
本发明中所述的模板指的是待测的DNA片段，也可以称为扩增模板。扩增模板是需要扩增的片段。所述的模板的序列可以是未知的。由上面的陈述可以知道，在测序的时候，将长片段的DNA打断以后，形成小的片段，然后连接上接头序列以后，就可以进行所述的测序过程。整个过程中，对于待测的DNA片段或核酸序列片段是没有限制的，任意的序列都可以进行该操作。这也是完整测序的概念。
本发明所述的基因测序芯片指的是高通量的基因测序芯片，常见的二代基因测序芯片。申请人之前申请了多项关于基因测序芯片的专利。必须指出的是，本发明所述的基因测序芯片并不限定与任意一款芯片。本发明所述的基因测序芯片需要包含有合适尺寸的微坑。所述的合适尺寸指的是和微球的大小相匹配的微坑。例如比微球直径大10％的微坑，例如比微球直径大20％的微坑，例如比微球直径大30％的微坑，例如比微球直径大40％的微坑，例如比微球直径大50％的微坑，例如比微球直径大100％的微坑；任意的其中任意两个比例组成的区间范围是可以使用的。当测序芯片不含有包括微坑的时候，微球固载的区域是不固定的，可以在任意的位置，并且不能应用于荧光切换的测序方法。
微坑的尺寸为0.2-10微米，优选0.25-5微米，更优选0.3-3微米，更优选0.5-2微米。所述的微坑指的是规则排列的微坑。一般的，在基因测序芯片的至少一个内表面上，有大量的，规则排列的微坑，用于高通量的测序。微坑与芯片内表面交界的地方形成圆形，或者近似圆形。微坑并不一定是严格的圆柱体形状，由于微纳米加工的手段多种多样，加工出来的微坑也会有很多的形状，最常见的是近似椭圆形的微坑，还可以接近立方柱形，但是在边角的区域没有尖锐存在的微坑。微坑的形状更多的是影响的实际测序的光学效果，对于反应的影响并不是很大。
基因测序的时候，少量的数据并不具备太多的意义。特别的二代基因测序指的是高通量的测序。少量的几个片段的测序并不具备实际工业上应用的价值。因此，微坑的尺寸一般的都十分的小。并且具备鲜明特点的，整个测序的过程中，不存在对于单个微坑的特殊性操作。一般的都是大量微坑的实验结果或者数据解释。
本发明中所述的微坑指的是常见的测序芯片的微结构，一般的，是具备凹凸性能的结构，类似圆形或者类似椭圆形，或者类似方形的凹凸结构。每个小的微坑都是一个反应的反应室，反馈到测序数据的时候就对应一个数据点。这在测序反应中也是常见的事实。
本发明中所述的测序指的是二代测序。
本发明所述的基因测序芯片指的是密封的基因测序芯片。包括流体的出入口，包括反应室，以及反应室侧壁的微坑。微球通过化学或者物理的手段固定在微坑中。每一个微坑都是一个反应单元。基因测序的时候，通过判断每一个微坑中的信号，来判断基因的序列。
引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。本发明中涉及到扩增引物与测序引物。引物的设计是常见的技术。现有的技术中，有很多的研究，本发明中不再进行重点描述。
基因测序是一个对于碱基进行确定的过程。常规的基因测序中，特别是有意义的二代基因测序一般的是将化学的信号转变为光信号或者其它信号的过程。一般的，单个分子的光学信号是很难检测的，极为灵敏的CCD也不能分辨，因此，需要通过扩增的方法将所需要测序的片段复制很多份，结合与本申请中的微球扩增技术，在同一个微球上一般只有一个待检测的片段，并且通过扩增的方法复制很多份，这样在后面化学反应的过程中可以通过CCD等设备原件检测到对应于碱基的反应信号。这个过程中，前期的准备是很重要的。不同扩增方法的结果是有一些差别的，例如华大基因使用了桥式扩增的方法，这种方法扩增获得了类似球状的结构。而本申请中，利用微球上的短片段的恒温扩增，获得的是微球上连接的，非球状的扩增结果。
总体来说，严格的比较恒温扩增的结果是没有太多意义的。申请人在之前申请了一些关于测序方法或者技术的专利，例如CN201510155218.9，CN201510212788.7，CN201510212789.1，CN201510822361.9，CN201510815685.X，CN201510944878.5，CN201610899880.X等，这些专利是属于荧光切换的多碱基测序方法。必要的时候，上述专利的内容可以以引用的方式加入本专利。
根据优选的实施方式，所述的测序为3端不封闭的测序。
根据优选的实施方式，本发明中所述的扩增指的是本领域意义上的扩增。扩增指的是基因扩增，通过一定的技术，是的基因的拷贝数增加。
根据优选的实施方式，所述接头序列2和第二扩增引物，至少部分序列是相同的。
一种通过芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于包括以下步骤，
(1)将微球固载到基因测序芯片的表面
所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物；
所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团；
(2)杂交，解旋，清洗
将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；
加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；
解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；
(3)恒温扩增
加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；
加入剪切试剂，将扩增后的双链模板剪切为单链；
加入封端试剂，将微球表面的DNA的3’端进行封堵；
(4)测序
杂交测序引物，测序。
dNTP，deoxy-ribonucleoside triphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)用于扩增的反应液。
根据优选的实施方式，所述至少一种扩增引物序列上含有可被剪切的位点指的是，两种扩增引物中，有一种扩增引物含有可以被剪切的位点，或者两种扩增引物都含有可以被剪切的位点。当两种扩增引物都含有可以被剪切的位点的时候，两种扩增引物的剪切位点应该是不一样的，并且剪切的条件也是不一样的。这样在进行剪切的时候，根据具体的需求，选择不同的剪切条件，可控制的进行有利的剪切。
其中，所述的将扩增后的双链模板剪切为单链，指的是将第一扩增引物或者第二扩增引物通过可被剪切的位点剪切为两段，使得第一扩增引物或者第二扩增引物与微球表面的连接断开。
剪切和封端是DNA编辑的过程中的常见步骤。剪切是分子生物学和表面扩增的常见步骤,常见的剪切指的是利用核酸内切酶等工具酶对有特殊修饰的碱基和化学位点进行剪切，最终将某一条固相引物延伸的模板分成两段。封端是固相扩增中的常见步骤，常见的封端是指利用末端转移酶等工具酶将ddNTP等3’端修饰的底物转移到固相扩增产物3’端的步骤。
本发明还公开一种通过芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于包含以下步骤，
(1)将微球固载到基因测序芯片的表面
所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物；
所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团；
(2)杂交
将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；
加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；
(3)恒温扩增
加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；
(4)测序
杂交测序引物，测序；
微球在芯片上的固载以及扩增的示意图参见图1。微球上带有的生物素可以与芯片表面的链霉亲和素结合，因此首先可以将微球通过离心的方式固载到芯片的微坑内，然后加入清洗液将芯片微阱外侧的微球清洗掉。在微球固载后，按步骤加入反应液逐步进行芯片上的原位恒温扩增反应。图1中，最左侧表示芯片，在芯片中通过离心等方式进入微球以后，形成第二个图的模式，单个微球在微坑内的示意图见图1的第3个图，在恒温扩增后，形成第4个图。
芯片上的扩增过程示意图参见图2。微球上带有的生物素可以与芯片表面的链霉亲和素结合，因此首先可以将微球通过离心的方式固载到芯片的微阱内。微球上固定了两种固相引物，其中一种引物上带有剪切位点，用于后续的剪切步骤(步骤1)。在扩增开始前，首先将模板杂交到微球上(步骤2)。之后，进行初始延伸(步骤3)、解旋(步骤4)和液相模板的取出。然后，利用RPA试剂盒进行模板的扩增(步骤5、6)。在RPA结束后，依次进行固相引物的剪切反应(步骤7)、封端反应(步骤8)和解旋步骤(步骤9)。在扩增结束后，微球上的模板为单链，在微球固载之后将测序引物杂交到微球上即可进行测序。
此处，所述的两种固相引物也被称为两种固相扩增引物，或者扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物。
本发明中所述的接头序列有两个，分别可以连在扩增模板的两侧。被称为第一接头序列和第二接头序列。
需要说明的，一般的测序的时候，片段的DNA分子是双链的形式，在杂交之前，需要将双链分子变为单链分子。本发明中所述的扩增模板指的是一端单链DNA片段；并将单链片段两端的接头称为接头序列1和接头序列2。
需要说明的，本发明中所述的扩增模板指的是任意的DNA片段序列。高通量测序的过程中，每次有很多的，例如超过100M的DNA片段，任意一个都可以被称为一个扩增模板。
根据本发明的描述，述的扩增模板两端含有公共的接头序列，指的是，任意的扩增模板，在其两端都连接有相同的接头序列。例如根据3端和5端的区别，连接两种不同的接头序列。当然，存在互补DNA链的情况下，实际上还可以含有接头序列1的互补接头序列，接头序列2的互补接头序列。这都属于本领域的常规知识。
所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的。这样在扩增模板杂交的时候，可以通过互补配对的形式杂交。
所述的接头序列2和第二扩增引物的至少部分序列是重合的。杂交结束以后，解旋获得是的扩增模板的反向DNA链，或者说获得是互补配对链，这个时候，其接头序列也是反向或者互补配对的。因此，在后续的恒温扩增反应的时候，该反向接头序列是需要同第二扩增引物结合的。也就是说，接头序列2和第二扩增引物的至少部分序列是重合的。当然，扩增引物一般来说，还需要满足连接到微球的其它要求，比如包含有连接到微球的基团等。部分匹配的要求属于常见的设计方式。
对于基因测序方法,常规的,例如ILLUMINA每轮测一个碱基。大部分测序方法每次都是测一个碱基的信号。对于本发明来说，每次反应几个碱基并不是本发明的重点。本发明所述的恒温扩增方法，更加适用于申请人之前公开的2+2荧光切换类的测序；但是并不排除常规的类似illumina类型的测序方法。总体来说，当应用到2+2荧光切换(也被称为荧光发生测序)类的测序的时候，由于后续的测序流程匹配。
本发明所涉及的生物化学用的化合物或者修饰物，均为本领域常见的用品，并且均可以在市场上买到。
实施例1
本实施例公开一种微球在芯片上恒温扩增的流程。其步骤如下：
1.稀释微球：
1)将微球稀释至3M/uL。
2)芯片进样口，通入微球。
2.微球固载：
1)将芯片进行离心，芯片底板面朝上离心。1000rcf下10min。
3.模板预杂交
1)根据扩增反应最终加入的模板浓度，对模板继续稀释并加入合适体积的0.1MNaOH进行解旋。
2)解旋结束后，根据解旋液体积加入5x SSC溶液，使得溶液终体积为400ul。
3)取待扩增芯片，用500ul超纯水进行清洗。
4)将测序反应液加入芯片中，每张芯片加入200ul反应液，放入平板PCR仪中，选择anneal程序：96℃，30s；-0.05℃/s；40℃，10s；25℃，forever。
5)反应完后取出，放置在冰上待用。。
4.初始延伸反应
1)取400ul 2X高保真DNA聚合酶(Phusion)混合液放置在冰上，再加入400ul超纯水，稀释一倍，震荡混匀，放置在冰上。
2)将上述混合液加入芯片中，每张芯片加入400ul，将芯片放置在平板PCR仪上72℃加热2min。
3)反应结束后向芯片内加入400ul甲酰胺，常温反应5min后用清洗液清洗干净芯片。
5.重组酶聚合酶反应
1)根据下表1进行RPA反应液的配制。
表1
2)将芯片用500ul超纯水进行清洗。
3)将配制混和好的扩增反应液加入芯片中，将芯片置于PCR仪上，拧紧盖子，选择加热程序：40℃，60min；4℃，forever。
6.剪切液(USER enzyme mix)反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表2配制切U反应液。
| 试剂 | V/ul |
| USER酶 | 4 |
| Cutsmart | 40 |
| 超纯水 | 356 |
| 总计 | 400 |
表2切U反应液
2)将RPA反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗。
3)将配制混和好的剪切反应液加入芯片中，，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择剪切液反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
7.封端液(TdT enzyme mix)反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表3配制封端反应液。
| 试剂 | V/ul |
| TdT酶 | 4 |
| 10x缓冲液 | 40 |
| CoCl2 | 40 |
| ddNTP(10mM，each) | 8 |
| 超纯水 | 308 |
| 总计 | 400 |
表3封端液配方
2)将RPA反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗。
3)将配制混和好的封端反应液加入芯片中，，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端液反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
8.解旋
1)每张芯片加入200ul的甲酰胺，室温(25℃)反应10min。
2)反应结束后，加入1ml 1xTE进行清洗。
9.杂交测序引物
1)将配制混和好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。
2)反应结束后，加入500uL清洗进行清洗。
实施例1公开了一个具体的实施例，详细的列举了整个步骤。其步骤对于权利要求的技术方案是完全支持的。本领域技术人员可以知道的是，确定的数字，例如用量、加热时间、具体的型号等等都属于本领域的常规知识；是本领域技术人员在知道整体步骤的技术上，可以尝试的。同样的，具体的步骤、物料也是本领域技术人员在整体技术的基础上，可以选择的。但是，必须要说明的是，整体步骤的搭配，例如权利要求1中所描述的技术方案，是对于整体的设计，这些对于整体的技术组合有着显著的意义。虽然某些知识明显属于本领域的常规知识，但是还希望简单的介绍并且做出比对。本发明所述的技术方案，属于恒温扩增领域在基因测序方面的应用。基因测序领域并不同于常规的检测，其具备更大的通量，要求更多的精度，并且需要考虑更多的实际应用价值，而不仅仅是简单的是否可用。
以上为本发明较佳的实施方式，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改，因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于包括以下步骤，
(1)将微球固载到基因测序芯片的表面
所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物，并且至少一种扩增引物的序列上含有可被剪切的位点；
所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团,利用固载基团将微球固载到基因测序芯片的表面；
(2)杂交，延伸，解旋，清洗
将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；
加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；
解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；
(3)恒温扩增
加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；
加入剪切试剂，将扩增后的双链模板剪切为单链；
加入封端试剂，将微球表面的DNA链的3’端进行封堵；
(4)测序
杂交测序引物，测序。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：其中所述微球上修饰有两种扩增引物，并且连接有固载用基团；扩增模板的两端含有公共的接头序列，接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增引物至少部分序列是相同的。
3.一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于包含以下步骤，
(1)将微球固载到基因测序芯片的表面
所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物；
所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团；
(2)杂交，延伸
将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；
加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；
(3)恒温扩增
加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；
(4)测序
杂交测序引物，测序。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：优选地，所述扩增为恒温扩增。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：优选地，所述扩增为RPA、RAA、桥式扩增中的一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述RPA扩增的时间为5-90分钟。
7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增引物的长度为20-45bp。
8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述微球上有生物素作为固载用的基团，所述基因测序芯片上有修饰的链霉亲和素；通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到基因测序芯片上。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述微球的直径为0.3-5微米，优选0.5-4微米，更优选1-2微米。
10.一种基因测序方法，其特征在于，将待测的DNA分子打断成50-1000bp的片段，作为扩增模板，按照权利要求1-9任一项所述的方法测序。
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