KR20220129814A - 원스텝 핵산증폭 반응 시 비특이적인 반응산물의 생성을 차단하는 올리고 수식 - Google Patents

Abstract

본 발명은 원스텝 핵산증폭 반응 시 비특이적인 반응산물의 생성을 차단하는 올리고 수식에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 열 불안정성 수식 그룹을 포함하는 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 원스텝 RT-PCR 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, RT-PCR, 특히 다중 증폭 RT-PCR에서 발생할 수 있는 비특이적인 반응산물의 생성을 효과적으로 차단할 수 있다.

Description

원스텝 핵산증폭 반응 시 비특이적인 반응산물의 생성을 차단하는 올리고 수식{Oligo modification for preventing the generation of non-specific reaction product during one-step nucleic acid amplification}

본 발명은 원스텝 핵산증폭 반응 시 비특이적인 반응산물의 생성을 차단하는 올리고 수식에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 열 불안정성 포스포 트라이 에스터 수식 그룹을 포함하는 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 원스텝 RT-PCR 방법에 관한 것이다.

역전사 중합효소 연쇄반응(reverse tranion polymerase chain reaction, RT-PCR), 특히 다중(multiplex) 증폭 RT-PCR은 COVID-19와 같은 감염병 진단 또는 유전자 발현의 상대적 정량화에 사용되는 대중적인 기법이다. 다중 증폭 RT-PCR은 일반적으로 RNA로부터 cDNA를 합성하는 과정과 PCR 증폭과정의 2단계(two-step)로 진행된다. 그렇지만 이러한 과정을 1단계, 즉 원스텝(one-step)으로 단순화하면 시간과 시약이 절약될 뿐 아니라 시험과정 상의 교차오염도 차단할 수 있어 여러 가지로 장점이 있다. 그러나 이 경우 역전사 단계에서 원치 않는 프라이머 확장이 발생할 수 있고, 이를 극복하기 위해서는 집중적인 PCR 최적화가 필요한 경우가 많다.

본 발명의 주된 목적은 RT-PCR, 특히 다중 증폭 RT-PCR에서 발생할 수 있는 비특이적인 반응산물의 생성을 차단하기 위한 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 열 불안정성 포스포 트라이 에스터 수식 그룹을 포함하는 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 원스텝 RT-PCR 방법을 제공한다.

본 발명의 원스텝 RT-PCR 방법에 있어서, 상기 열 불안정성 포스포 트라이 에스터 수식 그룹은 4-옥소-페닐(4-oxo-phenyl) 그룹인 것이 바람직하다.

본 발명의 원스텝 RT-PCR 방법에 있어서, 상기 원스텝 RT-PCR은 다중 증폭 RT-PCR일 수 있다.

본 발명에 따르면, RT-PCR, 특히 다중 증폭 RT-PCR에서 발생할 수 있는 비특이적인 반응산물의 생성을 효과적으로 차단할 수 있다.

도 1은 본 발명의 원스텝 RT-PCR 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 열 불안정성 포스포 트라이 에스터 수식 그룹, 즉 4-옥소-페닐(4-oxo-phenyl) 그룹을 포함하는 프라이머를 나타낸 것이다.

본 발명의 원스텝 RT-PCR 방법은 기존의 일반적인 원스텝 RT-PCR에서 발생할 수 있는 비특이적인 반응 물질의 생성을 차단하기 위한 것으로, 열 불안정성 포스포 트라이 에스터 수식 그룹(thermolabile phosphotriester modification group)을 포함하는 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 한다.

원스텝 RT-PCR은 일반적으로 하나의 반응액 내에서 역전사 반응과 PCR 반응이 이루어진다. 예를 들어 도 1과 같이 상대적으로 낮은 온도인 약 23℃ 및 약 42℃에서 시료 내 RNA로부터 cDNA를 합성하는 역전사 과정이 이루어지며, 상대적으로 높은 온도인 약 95℃ 및 약 60℃에서 표적 부위를 증폭하는 PCR 과정이 이루어진다. 그런데 이러한 낮은 온도에서 이루어지는 역전사 과정에서, PCR 과정에 작용하는 프라이머가 비특이적으로 결합하여 원치않는 비특이적 반응산물이 생성될 수 있다.

본 발명은 이를 차단하기 위해 열 불안정성 포스포 트라이 에스터 수식 그룹을 포함하는 프라이머를 사용한다. 본 발명에서 상기 열 불안정성 포스포 트라이 에스터 수식 그룹은 바람직하게는 4-옥소-페닐(4-oxo-phenyl) 그룹이다.

본 발명의 프라이머는 상기와 같은 열 불안정성 포스포 트라이 에스터 수식 그룹을 하나 이상 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 2와 같이 하나 또는 둘의 4-옥소-페닐 그룹을 포함할 수 있다.

프라이머에 상기와 같은 수식 그룹이 있으면 역전사 반응이 진행되는 동안 PCR 프라이머 확장을 최소화하고 높은 온도에 도달할 때까지 PCR 프라이머 확장을 제어할 수 있다.

역전사 반응이 충실하게 진행되어 정확하게 합성된 초기 템플릿 샘플이 존재하는 반응에서는 수식 그룹이 있는 프라이머를 사용함으로 반응 특이성이 개선되고, 비특이적인 PCR 반응산물이 감소하기 때문에 원스텝 RT-PCR 반응에서 정확한 반응산물을 얻을 수 있게 된다.

본 발명의 방법은 상기와 같은 비특이적인 반응 물질의 생성을 효과적으로 차단할 수 있어, 특히 다중 증폭 RT-PCR에 유용하다.

Claims (3)

1. 열 불안정성 포스포 트라이 에스터 수식 그룹을 포함하는 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 원스텝 RT-PCR 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 열 불안정성 포스포 트라이 에스터 수식 그룹은 4-옥소-페닐 그룹인, 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 원스텝 RT-PCR은 다중 증폭 RT-PCR인, 방법.
   

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