JP2022544217A - 核酸配列の多重等温増幅のための方法 - Google Patents

Abstract

場合により固体支持体上での、核酸分子の等温増幅のための方法が開示される。この方法は、３’及び５’末端の両方に共通／ユニバーサルヘアピン領域を有する一本鎖核酸、又はその伸長産物を使用する。

Description

核酸の等温増幅のための方法が開示される。溶液中又は固体支持体上のいずれかで実施することができるループ媒介増幅の形態を可能にする構築物、方法及びキットが開示される。

ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）は、２０００年にＮｏｔｏｍｉらによって最初に報告された技術であり（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００；２８（１２）：Ｅ ６３）、核酸の等温増幅のための迅速かつ効率的な方法である。この技術は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ（典型的には、Ｂｓｔポリメラーゼ）と、標的鋳型ＤＮＡの６つの異なる領域に設計された４つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーのセットとを使用し、典型的には、少ない鋳型投入量を短い反応時間（例えば、６５℃で６０分）内に約１０^９コピーまで忠実に増幅することができる。

ＬＡＭＰは、その感度、特異性、及び結果までの迅速な時間のために、様々な感染症及び疾患の多数の診断アッセイの基礎として使用されてきた。等温法であることは、高度な熱サイクリング装置を必要とせずに現場で使用できることを意味し、ポイントオブケア用途に理想的に適している。

次世代核酸配列決定のための方法は、多数の配列を並行して増幅することを含み得る。増幅は、異なる配列の鎖が物理的単離で増幅されるように、固体支持体又はビーズの集団で行われることが多く、いわゆるクローン増幅である。

ＬＡＭＰは、クローン増幅法として魅力的となる以下のいくつかの特徴を有する。
高速増幅；投入鋳型の複数のコピーを可能な限り迅速に生成することが最も重要である。親鋳型分子あたりの絶対コピー数もまた、検出シグナルを最大化するための鍵である。
等温方法；これにより、コンポーネントのワークフロー及びカートリッジ機能が簡素化される。アッセイを実行するために高度な熱サイクリングハードウェアを必要としない。
高忠実度；増幅が、配列決定されたときに出発鋳型の同一性を可能な限り反映する複数の特徴を生成することを確実にする。
低複雑度反応；増幅をサポートするために必要な反応成分はほとんどなく、ロバストで再現可能な性能が保証される。
商品の低コスト化；この方法は安価に実施することができる。

しかしながら、従来のＬＡＭＰは、クローン増幅法として魅力的とならない以下のいくつかの欠点を有する。

単一試験管反応で試料及び遺伝子座を多重化するのは困難で複雑である。各アンプリコンは４つのプライマーの固有のセットを必要とするため、ＬＡＭＰ反応は典型的にはシングルプレックス又はデュプレックスアッセイに限定される。単一反応のプレックスを増加させると、誤プライミング及びオフターゲット増幅のリスクが増加する。従来のＬＡＭＰを多重化する唯一の実用的な方法は、複数の異なるシングルプレックス反応を並行して実行することである。

典型的には、ＬＡＭＰ増幅の進行又はＬＡＭＰ反応の産物は、リアルタイム又はエンドポイント法（典型的には、濁度又は増幅による蛍光の増加）によって検出される。ＬＡＭＰ産物は、それらの低い多重化能力及び低コストのアッセイにおけるそれらの典型的な使用のためにＤＮＡ配列決定技術に適しているが、ＤＮＡ配列決定と組み合わせたそれらの使用は、正しい増幅の確認に限定され、診断読み出しとしてＤＮＡ配列決定自体を使用しない。

ＬＡＭＰ増幅の産物は、パテント鋳型鎖のいくつかの逆方向反復コンカテマー性コピーから形成された高分子量構造である。これらは、反応条件に応じて、直鎖又はより複雑な分岐したカリフラワー様構造であり得る。

様々なＬＡＭＰ増幅検出方法が存在するが、これらはリアルタイム又はエンドポイント溶液増幅産物の検出に依存する傾向がある。表面結合等温増幅を生成するためにＬＡＭＰを使用した報告はこれまでにない。

本発明の発明者らは、溶液中及び固体支持体上の両方でループ媒介増幅を可能にする手段を考案した。

本発明者らは、改良された等温増幅法を開発した。本発明の方法は、溶液中及び表面上の両方で機能し、そのためクローン増幅方法として受け入られやすく、そのようにすることにより溶液－ＬＡＭＰ等温増幅で遭遇する有益な特徴の多くを保持し、否定的な特徴の多くを改善した。

本発明の方法は、３’末端及び５’末端の両方にヘアピン領域を含有するように操作された一本鎖核酸分子に依存する。ヘアピンの３’末端はポリメラーゼ伸長を受けることができ、それにより、中央のヘアピンによって連結された「開いた」平滑末端である１つの末端を有する二本鎖材料を作製する。したがって、増幅される材料は、完全変性条件下で、５’及び３’末端の両方にもアダプターを有する中央のアダプターを介して互いに連結されたセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を有する一本鎖分子であり、末端のアダプターは相補的である。

二本鎖形態の場合、３’末端は平滑末端であるため、鋳型を有さない。一本鎖形態の場合、末端は自己相補的であり、したがって自己プライミングすることができる。増幅は、中央のループにハイブリダイズすることによって鎖の半分を伸長するプライマーを使用して行われる。それにより、第１のプライマー伸長は、半分の二本鎖及び半分の一本鎖を有する材料を与える。一本鎖３’末端は自己プライミングすることができ、それによって二本鎖産物を複製する分子を生成する。二本鎖コンカテマーは、やはり中央の既知の二本鎖アダプター領域を有する中央のヘアピンによって連結された「開いた」平滑末端である１つの末端を有する。

プライマーの中央ループへのハイブリダイゼーション及びその伸長は、再び、鎖の半分が一本鎖であり、半分が二本鎖である分子を生成する。この場合も、一本鎖領域の３’末端は自己アニールし、伸長することができる。このようにして、一本鎖ループに相補的なプライマー及び解放された３’－末端の自己伸長を使用して、コンカテマー増幅を達成することができる。各「サイクル」について、置換された鎖が鎖全体のコピーを生成することができるので、分子はポリメラーゼによって生成される３’末端の長さを効果的に２倍にする。

本明細書中に記載されるように、プライマーの１つを固体支持体上に固定化することによって、クローン増幅を達成することができる。

一般的なＬＡＭＰｌａｔｅ構造を示す図である。分子は、３’末端及び５’末端の両方にヘアピンが隣接する一本鎖中央部分を有する。３’末端は、図４に示す構築物に到達するように伸長させることができる。伸長は、増幅の初期段階であってもよく、又は別個の「前増幅」ステップとして実行されてもよい。 ＬＰ１アダプター及びＬＰ２アダプターを一本鎖鋳型分子に同時にライゲーションするだけで、どのようにＬＡＭＰｌａｔｅを生成できるかを示す図である。 ５’ステム－ループ構造を有する遺伝子座特異的ＰＣＲプライマーを使用することによって、ＰＣＲによってＬＡＭＰｌａｔｅをどのように生成することができるかを示す図である。 内部３’末端からの分子内自己プライミング伸長後のＬＡＭＰｌａｔｅを示す図である。伸長は、さらなるプライマーを必要とせずに、鎖置換を介してヘアピンを開いて配列の５’末端に達する。伸長は、増幅が図１の構築物を使用して開始されるように、増幅の初期段階であり得るか、又は別個の「増幅前」ステップとして実行され得、その場合、増幅される材料は図４に示されている。 ハイブリダイズされた第１のプライマーから内部一本鎖ループ（プライマーＬＰ１、ＬＰ１とのハイブリダイゼーション）への伸長を示す図である。伸長後、分子は半一本鎖及び半二本鎖である。置換された３’－末端は、自己プライミングすることができるヘアピンステムを有し（ＬＰ２’）、それによってコンカテマーを作製し、伸長したプライマーを置換する。置換された伸長されたプライマーも、自己プライミングすることができる自己相補的末端を有する（同じくＬＰ２’）。したがって、第１のプライマーは、各々が平滑末端及び閉ループ末端（ＬＰ２’）を有する二本鎖鋳型の「単一」コピー及び二重コピーを生じる。両方の中央ループは、同じ配列の一本鎖領域である。 ハイブリダイズされた第２のプライマーから新たに形成された内部一本鎖ループ（プライマーＰ２、ＬＰ２’へのハイブリダイゼーション）への伸長を示す図である。プライマー伸長後、分子は再び半一本鎖及び半二本鎖である。置換された３’－末端は、自己プライミングすることができるヘアピンステムを有し（再びＬＰ２’）、それによってコンカテマーを作製し、伸長したプライマーを置換する。置換された伸長プライマーはまた、自己プライミングすることができる自己相補的末端を有する。したがって、第１のプライマーは、各々が平滑末端及び閉ループ末端（ＬＰ２’）を有する二本鎖鋳型の「単一」コピー及び二重コピーを生じる。両方の中央ループは、同じ配列（ＬＰ２’）の一本鎖領域であり、ループは、増幅の第１段階からのループと同じ配列を有する。Ｐ２プライマーは、繰り返しハイブリダイズして伸長することができ、それによって長さが増加する複数のコピーを作製する。 増幅プライマーＬＰ１のみが固定化された図４の同等物を示す図である。ＬＡＭＰｌａｔｅの自己プライミングされた３’末端及び固定化プライマーの３’末端の両方が伸長を受けることができる。伸長した材料は、二本鎖部分及び一本鎖部分の形態をとる（図７） 一本鎖部分は自己プライミング３’－末端を有し、これは伸長を受けることができ、それによって固体支持体から溶液中にそれ自体を除去することができる（図８）。 変位した材料は「死んでおり」、支持体上に相補的プライマーは存在しない。しかしながら、置換は、固定化生成物の３’末端を解放し、それは自己プライミングし、伸長して固定化材料を中央ループから完全に二本鎖にすることができる（図９）。 固定化ループにハイブリダイズされた溶液相プライマーを使用した置換を示す図である。ループにハイブリダイズされたプライマーは伸長することができ、それによって固定化分子の３’末端を置換する。変位した３’末端は、自己プライミングし、それによって伸長することができる。しかしながら、置換された３’末端はまた、固定化プライマーに相補的な遊離一本鎖ループを放出する。ループは、局所的なプライマーにハイブリダイズし、それによってそれ自体の局所的なコピーを伸長することができる（図１０）。 溶液中のシングルループ及びダブルループと同様に、表面上の各アンプリコンはここで、固定化核酸の長さの範囲内に局在化したシングルループ及びダブルループを有する（図１１）。非固定化プライマーからの伸長産物は、溶液中で二本鎖分子を形成することができる。固定化プライマーＬＰ１は、ループにハイブリダイズすることができ、それにより、固定化鋳型の到達範囲内に空間的に局在するさらなる増幅を可能にする。したがって、鎖を局所的に増幅することができる。 溶液中のシングルループ及びダブルループと同様に、表面上の各アンプリコンはここで、固定化核酸の長さの範囲内に局在化したシングルループ及びダブルループを有する（図１１）。非固定化プライマーからの伸長産物は、溶液中で二本鎖分子を形成することができる。固定化プライマーＬＰ１は、ループにハイブリダイズすることができ、それにより、固定化鋳型の到達範囲内に空間的に局在するさらなる増幅を可能にする。したがって、鎖を局所的に増幅することができる。 非変性アガロースゲル画像は、ＩＮＳ０１ ＬＡＭＰＬａｔｅライゲーション産物を示し、アダプターのみ、モノアダプターＩＮＳ０１及び二重アダプターＩＮＳ０１からの分子量シフトの傾向が明らかに観察可能である。レーン１及び１３は分子量ラダーである。レーン２はインサートのみである。レーン３～６は、２つの設計（ｖ１及びｖ２）及び２つの濃度（アダプター当たり２８０ｐｍｏｌのＬ３、４又は６６０ｐｍｏｌのＬ５、６のいずれか）のアダプター対ＬＰ１及びＬＰ２である。レーン７～１０は、モノアダプターライゲーションである。レーン１１～１２は、ｖ１及びｖ２アダプター設計のための完全ライゲーションである。 非変性アガロースゲル画像は、ループＰＣＲプライマーを使用した５つの個々の遺伝子座特異的ＰｈｉＸ－１７４ ＰＣＲアンプリコンを示し、きれいなバンドは、予想される分子量の産物の増幅を示す。レーン１及び７は分子量ラダーである。レーン２～６は、領域ＬＡＭＰ＿ＰｈｉＸ＿０１～０５に対するアンプリコンである。ＰＣＲ＿Ｆプライマー及びＰＣＲ＿Ｒプライマーの５’ループは、インサート長にさらに１０３ｎｔを付加し、したがって、予想されるアンプリコンインサート長を超える分子量の予想されるシフトを付加する。 非変性アガロースゲル画像は、ＬＡＭＰ増幅ＤＮＡに典型的なバンドのパターンを示す。増加する分子量のバンドのラダーは、この方法を示すタンデムリピートコンカテマー増幅と一致する。レーン１及び６は分子量ラダーである。レーン２～３及び４～５は、それぞれ１Ｅ８及び１Ｅ１０コピーの全長ウルトラマーＬＡＭＰｌａｔｅ ＬＡＭＰ＿Ｔ０１＿ｖ１の溶液ＬＡＭＰ増幅によって生成されたＬＡＭＰｌｉｃｏｎである。 ライゲーションによって調製された単一ＬＡＭＰｌａｔｅの溶液ＬＡＭＰ増幅を示す図である。 非変性アガロースゲル画像は、様々な単一ＬＡＭＰｌｉｃｏｎ構築物のＬＡＭＰ増幅に典型的なバンドのパターンを示す。ゲルは増幅の特異性を明確に示す。完全な二重ライゲーションされたＬＡＭＰｌａｔｅのみが増幅を支持する。Ｖ１アダプターの設計は、ｖ２の設計よりも優れていると思われる。レーン１、１５は分子量ラダーである。レーン２は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたＳＨＲＫ＿ＩＮＳ０１インサートのみである。レーン３、４のアダプター対（それぞれｖ１及びｖ２）を溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供した。レーン５、６は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたｖ１モノアダプターインサートである。レーン７、８は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたｖ２モノアダプターインサートである。レーン９、１０は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供された完全二重アダプターＬＡＭＰｌａｔｅ（それぞれｖ１及びｖ２）である。レーン１１、１２は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供された完全二重アダプターＬＡＭＰｌａｔｅ（それぞれｖ１及びｖ２）のためのリガーゼなし対照である。レーン１３、１４は、誤った溶液プライマー（それぞれｖ２及びｖ１プライマー）を使用して溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供された完全二重アダプターＬＡＭＰｌａｔｅ（それぞれｖ１及びｖ２）である。 ライゲーションによって調製された単一ＬＡＭＰｌａｔｅの溶液ＬＡＭＰ増幅を示す図である。 非変性アガロースゲル画像は、様々な構築物を用いたＬＡＭＰ増幅ＤＮＡに典型的なバンドのパターンを示す。ゲルは増幅の特異性を明確に示す。完全な二重ライゲーションされたＬＡＭＰｌａｔｅのみが増幅を支持する。レーン１、１８、１９及び３０は分子量ラダーである。レーン２～８、２０～２１は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたｓｓＤＮＡインサートのみである。レーン９～１６は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供した７プレックスライゲーション生成ＬＡＭＰｌａｔｅプール（投入された１Ｅ７、１Ｅ８及び１Ｅ９コピー）の段階希釈である。レーン２２、２３は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたアダプターのみである。レーン２４、２５は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたＬＰ１モノアダプターインサート（それぞれインサートＳＢＬ＿Ｔ０１及びＳＢＬ－Ｔ０２）である。レーン２６、２７は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたＬＰ２モノアダプターインサート（それぞれインサートＳＢＬ＿Ｔ０１及びＳＢＬ－Ｔ０２）である。レーン２８、２９は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたリガーゼなし対照である（それぞれインサートＳＢＬ＿Ｔ０１及びＳＢＬ－Ｔ０２）。

ヘアピンループ（ＬＰ１及びＬＰ２と呼ばれる）を標的鋳型ＤＮＡ断片の末端に付加することにより、本明細書で「ＬＡＭＰｌａｔｅ」と呼ばれるＬＡＭＰ増幅を支援することができるライブラリー分子が生成される。一般的なＬＡＭＰｌａｔｅ構造が図１に示されている。このヘアピンアダプターの対は、所与のプール内のすべてのＬＡＭＰｌａｔｅライブラリー分子について同じであり得、したがってユニバーサルアダプターである。この特徴は、インサート配列にかかわらず、プール中のすべてのライブラリー分子を、これらのユニバーサルヘアピンアダプターに特異的な共通のプライマーセットで調べ、増幅することを可能にする。本発明のこの態様は、標準的な等温ＬＡＭＰ増幅では達成することが困難又は不可能なものである、シングルポット反応における高多重ＬＡＭＰｌａｔｅ分子のｉｎ ｓｉｔｕ増幅への経路を提供する。

ユニバーサルアダプターのＤＮＡ配列はプラットフォーム特異的であり、要件に合わせて容易に調整することができる。唯一の制約は、各アダプターのステム領域が相補的ＤＮＡ二重鎖である必要があり、ループ領域がステムの２つのアームを接続し、ミスハイブリダイゼーションを防ぐためにステムとは異なる配列を有する必要があることである。ステムアームの長さ及びＧＣ含有量は、分子内ヘアピンループの効率的な形成、したがって得られる増幅の効率にとって重要であり得る。ステムアームの長さは、１５～３０ｂｐの間の長さであり、４５～５５℃の範囲のＴｍを有する可能性がある。

ループの長さ及びＧＣ含有量は、増幅プライマーの効率的なハイブリダイゼーションを達成するために重要であり得、したがって得られる増幅の効率及び特異性に重要であり得る。ループの長さは１５～３０ｂｐの間の長さであり、５５～６５℃の範囲内のＴｍ（その相補的増幅プライマーにアニールした場合）を有する可能性が高い。得られるＬＡＭＰｌａｔｅ増幅の特異性及び効率を促進するために、ＬＰ１及びＬＰ２ヘアピンアダプターのＤＮＡ配列が互いに十分に異なることが必要である。アダプターの対は、標的インサートに約９０～１８０ｎｔの配列を付加することが予想される。

ステム二重鎖は、増幅されたＬＡＭＰｌａｔｅの増幅後処理に有用であり得る１つ又は複数の制限又はニッキングエンドヌクレアーゼモチーフをコードするように設計することができる。

適合させることができるインサートの長さに制限はないと予想されるが、実際の目的では、サイズ５０～２００ヌクレオチドのインサートがＬＡＭＰｌａｔｅ増幅効率に最適である可能性が高く、１０００ヌクレオチドを超えるインサートが必要とされる可能性は低い。

ＬＡＭＰｌａｔｅは、単にＬＰ１アダプター及びＬＰ２アダプターを一本鎖鋳型分子に同時ライゲーションすることによって（図２）、又は５’ステムループ構造を有する遺伝子座特異的ＰＣＲプライマーを使用することによるＰＣＲによって（図３）生成することができる。

鋳型は、コンカテマーを形成する増幅に適している。増幅は、鎖置換ポリメラーゼを用いて行う。ヘアピンステムは自己相補的であり、ポリメラーゼによって置換されて一本鎖になると、解放された一本鎖３’－末端が自己アニールして伸長することができる。したがって、コピーされた分子をそれ自体の鋳型として使用して、増幅を効果的に行うことができる。

少なくとも５０ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子（ｓｓ１）の集団が開示されており、一本鎖は異なる配列を有し、一本鎖の各々は３’末端に共通のヘアピン領域（ＬＰ１）及び５’末端に共通のヘアピン領域（ＬＰ２）を有し、各ヘアピンは１５～３０塩基対長のハイブリダイズするステムアームを有し、ステムアームは４５～５５℃の範囲のＴｍを有する。

基になる一本鎖核酸は、ゲノムポリヌクレオチドであり得る。原料材料は、真核生物、原核生物、又は古細菌であり得る。１つ以上の原料材料が提供されてもよい。元になる核酸は、ゲノムの断片、例えば、単一の染色体又は単一のゲノム遺伝子座（例えば、対立遺伝子多型の迅速な配列決定のため）を表し得る。特定の例では、増幅は、試料内の病原性物質に特異的であり得る。例えば、増幅は、ヒト試料内に存在する細菌又はウイルス核酸を選択し得る。鋳型は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらのｃＤＮＡコピーであり得る。

ウイルス核酸は、コロナウイルスに由来し得る。コロナウイルスは、哺乳動物及び鳥類において疾患を引き起こす関連ＲＮＡウイルスの群である。それらは、一般的な風邪、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、及びＣＯＶＩＤ－１９としても知られる重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）などの気道感染症を引き起こす。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＣＯＶＩＤ－１９の世界的パンデミックの原因であるコロナウイルスの株であり、これは、プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは直径５０～２００ナノメートルであり、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質として知られる４つの構造タンパク質を有する。Ｎタンパク質はＲＮＡゲノムを保持し、Ｓ、Ｅ及びＭタンパク質は一緒にウイルスエンベロープを形成する。

したがって、一実施形態では、増幅は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各構造タンパク質をコードする１つ又は複数のウイルス核酸を選択し得る。

一実施形態では、増幅は、１つ又は複数の核酸を選択することができ、その存在は宿主における活性なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を示す。一実施形態では、増幅は、１つ又は複数の核酸を選択することができ、その存在は宿主における以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を示す。これらの核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する免疫応答の一部として宿主によって産生される核酸であり得る。

一実施形態では、各一本鎖核酸分子（ｓｓ１）は、ステムアーム間に一本鎖ループ（Ｌ）を有し、ループは１５～３０ヌクレオチド長であり、相補的プライマーにアニールした場合、５５～６５℃の範囲のＴｍを有する。

一実施形態では、一本鎖核酸分子は５０～２００ヌクレオチド長である。一実施形態では、一本鎖核酸分子は１００～２００ヌクレオチド長である。

一実施形態では、集団の一本鎖核酸分子は、全長が１９０～３８０であり、３’末端及び５’末端は、４５℃未満の温度で１５～３０塩基対の二本鎖配列を有する。

複数の核酸配列のコンカテマー増幅のための方法が開示され、方法は、本発明の前述の実施形態のいずれか１つによる核酸分子の集団と、鎖置換ポリメラーゼ、ヌクレオチドモノマー及び増幅プライマーを含有する反応混合物とを採取することを含み、増幅プライマー（Ｐ１’）の少なくとも１つはＬＰ１のループ（Ｌ）の少なくとも一部に相補的であり、増幅プライマー（Ｐ２）の１つはＬＰ２のループ（ＬＰ２’）のコピーの少なくとも一部と同じ配列を含む。

複数の核酸配列のコンカテマー増幅のための方法が開示され、方法は、
ａ）長さが少なくとも５０ヌクレオチドの異なる一本鎖核酸分子（ｓｓ１）の集団を採取することであって、一本鎖は異なる配列を有し、一本鎖の各々は３’末端に共通のヘアピン領域（ＬＰ１）及び５’末端に共通のヘアピン領域（ＬＰ２）を有し、各ヘアピンは１５～３０塩基対の長さのハイブリダイゼーションステムアームを有し、ステムアームが４５～５５℃の範囲のＴｍを有することと、
ｂ）鎖置換ポリメラーゼ、ヌクレオチドモノマー及び増幅プライマーを含有する反応混合物を使用して異なる一本鎖核酸分子（ｓｓ１）の集団を増幅することであって、増幅プライマーの少なくとも１つ（Ｐ１’）はＬＰ１のループ（Ｌ）の少なくとも一部に相補的であり、増幅プライマーの１つ（Ｐ２）はＬＰ２のループのコピー（ＬＰ２’）の少なくとも一部と同じ配列を含むことと
を含む。

本方法の一実施形態では、ステムアームの３’末端は、少なくとも５０ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子の完全なコピー（ｓｓ１’）及び配列ＬＰ２の完全なコピー（ＬＰ２’と呼ばれる）を作製するように伸長される。伸長は、増幅反応の最初の部分であり得る。あるいは、ステムアームの３’末端を伸長して、少なくとも５０ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子の完全なコピー（ｓｓ１’）及び配列ＬＰ２の完全なコピー（ＬＰ２’と呼ばれる）を作製し、その後、伸長した分子を増幅反応混合物中に配置することができる。

本方法のさらなる実施形態では、Ｐ１’はＬＰ１のループにハイブリダイズし、鎖置換し、それによってＬＰ２とＬＰ２’を分離するまで伸長する。鎖置換は、ｓｓ’及びＬＰ２’の相補的コピーを生じる（すなわち、ｓｓのレプリカ及びＬＰ２のレプリカ）。

本方法のさらなる実施形態では、ＬＰ２’の末端のステムアームは、自己プライミングして伸長し、ｓｓ１’、ＬＰ１、ｓｓ１及びＬＰ２のすべての完全なコピーを作製することができる。

本方法のさらなる実施形態では、増幅プライマーＰ２は、ＬＰ２’のループにハイブリダイズし、ｓｓ１’、ＬＰ１、ｓｓ１及びＬＰ２のすべてを置換するように伸長する。

本方法のさらなる実施形態では、解放された末端ＬＰ２’は、コンカテマーｓｓ１’、ＬＰ１及びｓｓ１をコピーするために繰り返し自己プライミングすることができる。

本方法のさらなる実施形態では、増幅プライマーＰ１を固体支持体に結合させる。

本方法のさらなる実施形態では、増幅プライマーＰ２は溶液中にある。

増幅方法は、図７～図１２に示されるスキームに従って、表面結合増幅産物、特にクローン表面結合増幅産物を生成するために使用され得ることが想定される。

その配列がＬＡＭＰｌａｔｅのＬＰ１ループに相補的である、ＬＰ１ＲＣと呼ばれるＤＮＡオリゴプライマーを固体支持体（例えば、スライド、チップ又はビーズの表面）に固定化する。この官能化された表面を、指定された温度で指定された時間、適切なハイブリダイゼーション緩衝液中の希釈濃度のＬＡＭＰｌａｔｅ（例えば、１～１０００ｐＭ）を含む溶液の存在下でインキュベートすることができる。これにより、ＬＡＭＰｌａｔｅを、一本鎖ＬＡＭＰｌａｔｅ ＬＰ１ループ領域との配列相補性を介して固定化プライマーにアニールすることができる。この方法を「ＬＡＭＰｌａｔｅ播種」と呼ぶことができる。

播種したら、過剰なＬＡＭＰｌａｔｅを洗い流して、表面プライマーハイブリダイズ分子のみをその場で残すことができる。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ又はＰｈｉ２９ポリメラーゼ）及びｄＮＴＰを適切な反応緩衝液中に添加することにより、ＬＡＭＰｌａｔｅの遊離３’末端から、及び同時にＬＡＭＰｌａｔｅループＬＰ１にハイブリダイズした表面プライマーの遊離３’末端からの伸長が可能になる。この表面プライマー伸長は、伸長されたＬＡＭＰｌａｔｅ二重鎖の置換を引き起こし、したがって、部分的に一本鎖及び部分的に二本鎖であり、より短い鎖の５’末端を介して固定化された分子を形成する。

したがって、ＬＡＭＰｌａｔｅの伸長した３’末端は一本鎖であり、自己プライミングすることができる。自己プライミングした末端は、完全なコピーを作製するために伸長することができ、その方法で、固定化された鎖から自身を置換する。それによってバルク溶液に置き換えられる材料は、単一のループとは別に完全に自己相補的であり、そのループは表面にハイブリダイズするループとは異なる配列であり、したがってバルク溶液中の材料は増幅にそれ以上の役割を果たさない。

この置換は、固定化されたコピーの３’末端における分子内ＬＰ２’ループの自発的な再形成を引き起こし、これは、自己プライミングすることができ、伸長して、表面に対して遠位のＬＰ２’ヘアピンを有する表面結合二重鎖を生成する。したがって、固定化材料は、１つの内部ループＬＰ２’を除いて、ほとんどが二本鎖である。

必要に応じて、置換された材料を除去するために流体試薬をこの時点で変更することができ、それにより、増幅方法を汚染するか又は単に増幅試薬を消費する可能性がある、この材料のさらなる増幅を防止する。

表面での増幅には、固定化一本鎖ループに相補的な非固定化プライマー（すなわち、ＬＰ２’にハイブリダイズするプライマー）が必要である。固定化二重鎖生成物のＬＰ２’ループに相補的な、ＬＰ２と呼ばれる溶液オリゴプライマーは、ＬＰ２’ループにアニールし、伸長することができる。このＬＰ２プライマー伸長は、固定化二重鎖の半分の忠実なコピーを形成し、同時にコピー鎖に相補的な鎖の３’末端を置換する。置換された３’末端は、一本鎖ループを介して固定化プライマーＬＰ１ＲＣのさらなるコピーに自己プライミング及びハイブリダイゼーションの両方を行うことができるＬＰ１分子内ヘアピンを自発的に再形成する。したがって、２つの新しい伸長可能な３’末端が利用可能である。

１つのコピーから隣接する表面プライマーへの１つの鎖の架橋によって、新たな伝播された相互作用を形成する方法は、「鋳型ウォーキング」と呼ばれる。ハイブリダイズされたＬＰ１ループの遊離３’末端からの、及びウォークされた鋳型鎖のＬＰ１ループと第２のＬＰ１ＲＣ表面プライマーとの間の新たに形成された二重鎖の遊離３’末端からのその後の同時の二重伸長は、伸長、鎖置換及び自己プライミングされた相補的伸長を介した２つの表面固定化ヘアピン二重鎖の生成を可能にする。第１の二重鎖は、表面から遠位のＬＰ１ループを有する初期ＬＡＭＰｌａｔｅの二重コンカテマーであり（すなわち、ｓｓ及びｓｓ’の４つの連続した二本鎖セット）、第２の二重鎖は、表面から遠位のヘアピンループＬＰ１及び単一コンカテマーを有する二重鎖である（すなわち、ｓｓ及びｓｓ’の２回の反復）（図１２に示す）。

固定化された両方の二重鎖は、ＬＰ１ＲＣ表面プライマーに相補的な一本鎖ループを有する。したがって、表面プライマーは、固定化鎖の中心にハイブリダイズすることができる。伸長は、ループＬＰ１を有する固定された３’末端を変位させる。ＬＰ１の再形成は、自己プライマー末端及びプライマーＬＰ１ＲＣのさらなるコピーに固定化され得るループを与える。これにより、２つの新しい伸長可能な３’末端が形成され、１つは自己プライミングされ、１つは固定化プライマー上にある。したがって、増幅は、支持体とのハイブリダイゼーションのサイクルを介して自立しており、変位及び自己プライミング伸長を引き起こす。

プライマーハイブリダイゼーション、伸長、置換及び鋳型ウォーキングのこの連続的な方法は、増幅反応の期間中又は反応中の試薬が消費されるまでのいずれか最初に起こるまで継続する。これらの増幅及びテンプレートウォーキングサイクルの産物は、元の播種されたＬＡＭＰｌａｔｅに空間的に近接した分子内コンカテマー反復二重鎖として、元の播種されたＬＡＭＰｌａｔｅの複数の忠実な表面結合コピーの生成である。複数のそのような近接した忠実な二重鎖コピーは、クローン、又はクラスター又はコロニーと呼ぶことができ、したがって、播種されたＬＡＭＰｌａｔｅの元の一本鎖部分は「クローン増幅された」と言うことができる。

本発明の核酸増幅産物の存在、非存在又は配列を決定する方法も開示される。

本明細書中に記載される核酸分子の集団にハイブリダイズされる固定化増幅プライマーを有する固体支持体を含む、複数の核酸配列の増幅のためのデバイスも開示される。

複数の核酸配列を増幅するためのキットも開示され、キットは、
ａ．１５～３０塩基対の長さのハイブリダイゼーションステムアームを有し、ステムアームは４５～５５℃の範囲のＴｍ及びステムアーム間の一本鎖ループ（Ｌ）を有し、ループは１５～３０ヌクレオチドの長さであり、相補的プライマーにアニールされたときに５５～６５℃の範囲のＴｍを有する第１のヘアピンアダプターと、
ｂ．１５～３０塩基対の長さのハイブリダイゼーションステムアームを有し、ステムアームは４５～５５℃の範囲のＴｍ及びステムアーム間の一本鎖ループ（Ｌ）を有し、ループは１５～３０ヌクレオチドの長さであり、相補的プライマーにアニールされたときに５５～６５℃の範囲のＴｍを有する第２のヘアピンアダプターと、
ｃ．増幅プライマーが固定化された固体支持体であって、プライマーが第１のヘアピンアダプターのループＬの少なくとも一部に相補的である、固体支持体と、
ｄ．核酸ポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸と
を備える。

方法
ライゲーションによるＬＡＭＰｌａｔｅの調製（Ａ６９＿ＳＢＬＡＭＰ＿Ｅ００１）
材料
－ＬＰ１オリゴ（ＬＡＭＰ＿ＬＰ１＿ｖ１）
－ＬＰ２オリゴ（ＬＡＭＰ＿ＬＰ２＿ｖ１）
－鋳型オリゴ（ＩＮＳ０１）
－Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２０００Ｕ／ｕＬ（ＮＥＢ，Ｍ０２０２Ｔ）
－Ｚｙｍｏ Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ精製カラム
－ＥＢ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ８．０）

方法
典型的には、ライゲーション反応は、等モル比（各アダプター２８０ｐｍｏｌ）のＬＰ１及びＬＰ２アダプターオリゴを１×ライゲーション緩衝液中の鋳型オリゴＩＮＳ０１（１３０ｐｍｏｌ）と混合することによって調製した。反応物をボルテックスによって短時間混合した。得られたオリゴを９５℃で３分間熱変性させ、次いで、サーモサイクラーの徐冷ランプ（－０．１℃／秒で１５℃まで）によってアニールした。２０００Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１ｕＬの２０００Ｕ／ｕＬ Ｔ４リガーゼストック）の添加によってライゲーション反応を開始し、短時間ボルテックスして混合し、次いで１５℃で３０分間インキュベートした。リガーゼを７５℃で５分間の加熱殺菌によって不活性化し、Ｚｙｍｏ Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅスピンカラムを使用して精製した。最終溶出はＥＢ緩衝液中で行った。試料を、可視化のためにゲルレッド染色で染色した３％ ＴＢＥアガロースゲルに流した。

図１３の凡例
非変性アガロースゲル画像は、ＩＮＳ０１ ＬＡＭＰＬａｔｅライゲーション産物を示し、アダプターのみ、モノアダプターＩＮＳ０１及び二重アダプターＩＮＳ０１からの分子量シフトの傾向が明らかに観察可能である。レーン１及び１３は分子量ラダーである。レーン２はインサートのみである。レーン３～６は、２つの設計（ｖ１及びｖ２）及び２つの濃度（アダプター当たり２８０ｐｍｏｌのＬ３、４又は６６０ｐｍｏｌのＬ５、６のいずれか）のアダプター対ＬＰ１及びＬＰ２である。レーン７～１０は、モノアダプターライゲーションである。レーン１１～１２は、ｖ１及びｖ２アダプター設計のための完全ライゲーションである。

ループＰＣＲ（Ａ６９＿ＳＢＬＡＭＰ＿Ｅ０２２）によるＬＡＭＰｌａｔｅの調製
材料
－ループ状ＰＣＲ＿Ｆプライマー
－ループ状ＰＣＲ＿Ｒプライマー
－鋳型ゲノムＤＮＡ（バクテリオファージＰｈｉＸ－１７４、ＮＥＢ、Ｎ３０２２Ｌ）
－ＰＣＲ緩衝液（５Ｘ緩衝液成分、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆ１２２Ｓ）
－Ｐｈｉｒｅ ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼ成分、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆ１２２Ｓ）
－１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス
－Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラム
－ＥＢ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ８．０）

方法
個々のＰＣＲ増幅反応を、ＳＢＬ＿ＰＨＩＸ ＰＣＲプライマーの対を使用して各ＰｈｉＸアンプリコンについて調製した。各５０ｕＬ ＰＣＲ反応物は、１Ｘ Ｐｈｉｒｅ ＰＣＲ緩衝液中１０ｎｇのＰｈｉＸ－１７４ゲノムＤＮＡ、各２０ｐｍｏｌのＰＣＲ＿Ｆ及びＰＣＲ＿Ｒプライマー、１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰミックス、１ｕＬのＰｈｉｒｅ ＩＩ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼからなっていた。反応混合物を９８℃で２分間変性させ、次いで、２５回のその後の変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（６０℃で２０秒間）及び伸長（７２℃で２０秒間）のサイクルに供した。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップカラムを使用してアンプリコンを精製し、最終溶出液をＥＢ緩衝液中に入れた。試料を、可視化のためにゲルレッド染色で染色した３％ ＴＢＥアガロースゲルに流した。

図１４の凡例
非変性アガロースゲル画像は、ループＰＣＲプライマーを使用した５つの個々の遺伝子座特異的ＰｈｉＸ－１７４ ＰＣＲアンプリコンを示し、きれいなバンドは、予想される分子量の産物の増幅を示す。レーン１及び７は分子量ラダーである。レーン２～６は、領域ＬＡＭＰ＿ＰｈｉＸ＿０１～０５に対するアンプリコンである。ＰＣＲ＿Ｆプライマー及びＰＣＲ＿Ｒプライマーの５’ループは、インサート長にさらに１０３ｎｔを付加し、したがって、予想されるアンプリコンインサート長を超える分子量の予想されるシフトを付加する。

完全長ウルトラマーＬＡＭＰｌａｔｅオリゴを用いた溶液ＬＡＭＰ増幅
材料
－ＬＡＭＰｌａｔｅウルトラマー鋳型オリゴ（ＬＡＭＰ＿Ｔ０１＿ｖ１）
－溶液ＬＡＭＰ増幅プライマー（ＬＰ１ｒｃ＿ｖ１及びＬＰ２＿ｖ１）
－ウォームスタートＬＡＭＰ増幅キット（ＮＥＢ，Ｅ１７００Ｓ）
－Ｚｙｍｏ Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ精製カラム
－ＥＢ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ８．０）

方法
例２５ｕＬ溶液ＬＡＭＰ増幅反応は、１２．５ｕＬの ２Ｘ ＬＡＭＰマスターミックス（緩衝液、Ｂｓｔ ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含有）をウルトラマーＬＡＭＰｌａｔｅ ＬＡＭＰ＿Ｔ０１＿ｖ１（０．２５～２．５ ｆｍｏｌ）、ＬＡＭＰプライマーＬＰ１ｒｃ＿ＩＮＶ＿ｖ１（２３０ｐｍｏｌ）及びＬＰ２＿ＩＮＶ＿ｖ１（２３０ｐｍｏｌ）及びＭｉｌｌｉＱ水で希釈することによって調製した。反応を、６５℃に加温し、反応物を６０分間インキュベートすることによって開始した。３ｕＬの５００ｍＭ ＥＤＴＡの添加によって反応を停止させるか、又はＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップカラムによって直接精製した。試料を、可視化のためにゲルレッド染色で染色した３％ ＴＢＥアガロースゲルに流した。

図１５の凡例
非変性アガロースゲル画像は、ＬＡＭＰ増幅ＤＮＡに典型的なバンドのパターンを示す。増加する分子量のバンドのラダーは、この方法を示すタンデムリピートコンカテマー増幅と一致する。レーン１及び６は分子量ラダーである。レーン２～３及び４～５は、それぞれ１Ｅ８及び１Ｅ１０コピーの全長ウルトラマーＬＡＭＰｌａｔｅ ＬＡＭＰ＿Ｔ０１＿ｖ１の溶液ＬＡＭＰ増幅によって生成されたＬＡＭＰｌｉｃｏｎである。

単一ライゲーション調製ＬＡＭＰｌａｔｅを用いた溶液ＬＡＭＰ増幅
材料
－精製ライゲーション調製ＬＡＭＰｌａｔｅ（ＳＨＲＫ＿ＩＮＳ０１）
－ＬＡＭＰアダプター（ＬＰ１＿ｖ１，ＬＰ２＿ｖ１，ＬＰ１＿ｖ２，ＬＰ２＿ｖ２）
－溶液ＬＡＭＰ増幅プライマー（ＬＰ１ｒｃ＿ｖ１，ＬＰ２＿ｖ１，ＬＰ１ｒｃ＿ｖ２，ＬＰ２＿ｖ２）
－ウォームスタートＬＡＭＰ増幅キット（ＮＥＢ，Ｅ１７００Ｓ）
－Ｚｙｍｏ Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ精製カラム
－ＥＢ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ８．０）

方法
例２５ｕＬ溶液ＬＡＭＰ増幅反応は、１２．５ｕＬの２Ｘ ＬＡＭＰマスターミックス（緩衝液、Ｂｓｔ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含有）を個々のライゲーション調製ＬＡＭＰｌａｔｅ（例１に記載されているように、ｖ１又はｖ２アダプター設計のいずれか及びインサートＳＨＲＫ＿ＩＮＳ ０１を使用）、ＬＡＭＰプライマーＬＰ１ｒｃ＿ＩＮＶ＿ｖ＊（２３０ｐｍｏｌ、＊＝ｖ１又はｖ２）及びＬＰ２＿ＩＮＶ＿ｖ＊（２３０ｐｍｏｌ、＊＝ｖ１又はｖ２）及びＭｉｌｌｉＱ水で希釈することによって調製した。図４に概説されているように、一連の条件を試験した。反応を、６５℃に加温し、反応物を６０分間インキュベートすることによって開始した。３ｕＬの５００ｍＭ ＥＤＴＡの添加によって反応を停止させるか、又はＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップカラムによって直接精製した。試料を、可視化のためにゲルレッド染色で染色した３％ ＴＢＥアガロースゲルに流した。

図１６の凡例：ライゲーションによって調製された単一ＬＡＭＰｌａｔｅの溶液ＬＡＭＰ増幅
非変性アガロースゲル画像は、様々な単一ＬＡＭＰｌｉｃｏｎ構築物のＬＡＭＰ増幅に典型的なバンドのパターンを示す。ゲルは増幅の特異性を明確に示す。完全な二重ライゲーションされたＬＡＭＰｌａｔｅのみが増幅を支持する。Ｖ１アダプターの設計は、ｖ２の設計よりも優れていると思われる。レーン１、１５は分子量ラダーである。レーン２は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたＳＨＲＫ＿ＩＮＳ０１インサートのみである。レーン３、４のアダプター対（それぞれｖ１及びｖ２）を溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供した。レーン５、６は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたｖ１モノアダプターインサートである。レーン７、８は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたｖ２モノアダプターインサートである。レーン９、１０は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供された完全二重アダプターＬＡＭＰｌａｔｅ（それぞれｖ１及びｖ２）である。レーン１１、１２は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供された完全二重アダプターＬＡＭＰｌａｔｅ（それぞれｖ１及びｖ２）のためのリガーゼなし対照である。レーン１３、１４は、誤った溶液プライマー（それぞれｖ２及びｖ１プライマー）を使用して溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供された完全二重アダプターＬＡＭＰｌａｔｅ（それぞれｖ１及びｖ２）である。

複数ライゲーション調製ＬＡＭＰｌａｔｅのプールを用いた溶液ＬＡＭＰ増幅
材料
－ＬＡＭＰｌａｔｅインサート（ＳＢＬ＿Ｔ０１－７）
－ＬＡＭＰアダプター（ＬＰ１＿ｖ１及びＬＰ２＿ｖ１）
－溶液ＬＡＭＰ増幅プライマー（ＬＰ１ｒｃ＿ｖ１及びＬＰ２＿ｖ１）
－ウォームスタートＬＡＭＰ増幅キット（ＮＥＢ，Ｅ１７００Ｓ）
－Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラム
－ＥＢ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ８．０）

方法
例２５ｕＬ溶液ＬＡＭＰ増幅反応は、１２．５ｕＬの２Ｘ ＬＡＭＰマスターミックス（緩衝液、Ｂｓｔ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含有）をライゲーション調製ＬＡＭＰｌａｔｅプール（例１で説明したように、ＬＰ１＿ｖ１アダプター及びＬＰ２＿ｖ１アダプター、ならびに７つすべてのインサートＳＢＬ＿Ｔ０１－７のプールを使用）、ＬＡＭＰプライマーＬＰ１ｒｃ＿ＩＮＶ＿ｖ１（２３０ｐｍｏｌ）及びＬＰ２＿ＩＮＶ＿ｖ１（２３０ｐｍｏｌ）及びＭｉｌｌｉＱ水で希釈することによって調製した。図４に概説されているように、一連の条件を試験した。反応を、６５℃に加温し、反応物を６０分間インキュベートすることによって開始した。３ｕＬの５００ｍＭ ＥＤＴＡの添加によって反応を停止させるか、又はＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップカラムによって直接精製した。試料を、可視化のためにゲルレッド染色で染色した３％ ＴＢＥアガロースゲルに流した。

図１７の凡例：ライゲーションによって調製された単一ＬＡＭＰｌａｔｅの溶液ＬＡＭＰ増幅
非変性アガロースゲル画像は、様々な構築物を用いたＬＡＭＰ増幅ＤＮＡに典型的なバンドのパターンを示す。ゲルは増幅の特異性を明確に示す。完全な二重ライゲーションされたＬＡＭＰｌａｔｅのみが増幅を支持する。レーン１、１８、１９及び３０は分子量ラダーである。レーン２～８、２０～２１は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたｓｓＤＮＡインサートのみである。レーン９～１６は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供した７プレックスライゲーション生成ＬＡＭＰｌａｔｅプール（投入された１Ｅ７、１Ｅ８及び１Ｅ９コピー）の段階希釈である。レーン２２、２３は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたアダプターのみである。レーン２４、２５は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたＬＰ１モノアダプターインサート（それぞれインサートＳＢＬ＿Ｔ０１及びＳＢＬ－Ｔ０２）である。レーン２６、２７は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたＬＰ２モノアダプターインサート（それぞれインサートＳＢＬ＿Ｔ０１及びＳＢＬ－Ｔ０２）である。レーン２８、２９は、溶液ＬＡＭＰ増幅反応に供されたリガーゼなし対照である（それぞれインサートＳＢＬ＿Ｔ０１及びＳＢＬ－Ｔ０２）。

配列表１、３ ＜２２３＞位置１のＴは位置５にＰＯ４を有する
配列表５ ＜２２３＞位置１のＧは位置５にＰＯ４を有する
配列表６、８、１０、１２、１４ ＜２２３＞位置１、２、３及び４のＧ、Ａ、Ｃ及びＴはホスホロチオアート結合によって連結される
配列表１７ ＜２２３＞位置３４、３５、３６及び３７のＣ、Ｇ、Ａ及びＧはホスホロチオアート結合によって連結される
配列表１８ ＜２２３＞位置３０、３１、３２及び３３のＣ、Ｃ、Ａ及びＣはホスホロチオアート結合によって連結される
配列表１９ ＜２２３＞位置２９、３０、３１及び３２のＴ、Ｃ、Ｔ及びＧはホスホロチオアート結合によって連結される
配列表２０ ＜２２３＞位置２９、３０、３１及び３２のＧ、Ｔ、Ｇ及びＧはホスホロチオアート結合によって連結される

Claims (10)

1. 以下を含む、複数の核酸配列のコンカテマー増幅のための方法：
   ａ）長さが少なくとも５０ヌクレオチドの異なる一本鎖核酸分子（ｓｓ１）の集団を採取すること、
   ただし、前記一本鎖は異なる配列を有し、前記一本鎖のそれぞれは３’末端に共通のヘアピン領域（ＬＰ１）及び５’末端に共通のヘアピン領域（ＬＰ２）を有し、各ヘアピンは１５～３０塩基対の長さのハイブリダイゼーションステムアームを有し、前記ステムアームは４５～５５℃の範囲のＴｍを有する；ならびに
   ｂ）鎖置換ポリメラーゼ、ヌクレオチドモノマー及び増幅プライマーを含有する反応混合物を使用して異なる一本鎖核酸分子（ｓｓ１）の集団を増幅すること、ただし、前記増幅プライマーの少なくとも１つ（Ｐ１’）はＬＰ１のループ（Ｌ）の少なくとも一部に相補的であり、前記増幅プライマーの１つ（Ｐ２）はＬＰ２のループのコピー（ＬＰ２’）の少なくとも一部と同じ配列を含む。
2. ステムアームの３’末端が、少なくとも５０ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子の完全なコピー（ｓｓ１’）及び配列ＬＰ２の完全なコピー（ＬＰ２’）を作製するように伸長される、請求項１に記載の方法。
3. Ｐ１’がＬＰ１のループにハイブリダイズし、鎖置換し、それによってＬＰ２とＬＰ２’を分離するまで伸長する、請求項２に記載の方法。
4. ＬＰ２’の末端のステムアームが、自己プライミングして伸長し、ｓｓ１’、ＬＰ１、ｓｓ１及びＬＰ２のすべての完全なコピーを作製することができる、請求項３に記載の方法。
5. 増幅プライマーＰ２が、ＬＰ２’のループにハイブリダイズし、ｓｓ１’、ＬＰ１、ｓｓ１及びＬＰ２のすべてを置換するように伸長する、請求項４に記載の方法。
6. 解放された末端ＬＰ２’が、コンカテマーｓｓ１’、ＬＰ１及びｓｓ１をコピーするために繰り返し自己プライミングすることができる、請求項５に記載の方法。
7. 増幅プライマーＰ１が固体支持体に結合している、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. 増幅プライマーＰ２が溶液中にある、請求項７に記載の方法。
9. 核酸増幅産物の存在、非存在又は配列が決定される、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
10. 以下を備える、複数の核酸配列を増幅するためのキット：
    ａ．第１のヘアピンアダプターであって、１５～３０塩基対の長さのハイブリダイゼーションステムアームを有し、前記ステムアームが４５～５５℃の範囲のＴｍ及び前記ステムアーム間の一本鎖ループ（Ｌ）を有し、前記ループが１５～３０ヌクレオチドの長さであり、相補的プライマーにアニールされたときに５５～６５℃の範囲のＴｍを有する第１のヘアピンアダプター；
    ｂ．第２のヘアピンアダプターであって、１５～３０塩基対の長さのハイブリダイゼーションステムアームを有し、前記ステムアームが４５～５５℃の範囲のＴｍ及び前記ステムアーム間の一本鎖ループ（Ｌ）を有し、前記ループが１５～３０ヌクレオチドの長さであり、相補的プライマーにアニールされたときに５５～６５℃の範囲のＴｍを有する第２のヘアピンアダプター；
    ｃ．増幅プライマーが固定化された固体支持体であって、前記プライマーが前記第１のヘアピンアダプターのループＬの少なくとも一部に相補的である、固体支持体；ならびに
    ｄ．核酸ポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸。

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