CN118127137A - 一种通过预先pcr改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法 - Google Patents
一种通过预先pcr改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118127137A CN118127137A CN202410274764.3A CN202410274764A CN118127137A CN 118127137 A CN118127137 A CN 118127137A CN 202410274764 A CN202410274764 A CN 202410274764A CN 118127137 A CN118127137 A CN 118127137A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- target
- sequence
- primer pair
- universal primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 82
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 82
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 66
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 52
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 17
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 17
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 17
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 9
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 6
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 claims 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 74
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 30
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 30
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，包括如下步骤：S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤；S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤；S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤。S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT‑PCR反应的步骤。本发明所公开的一种通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，以达到改变不同核酸靶标相对扩增速度的目的。
Description
技术领域
本发明涉及核酸扩增领域，具体涉及一种通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法。
背景技术
不同核酸靶标通过RT-PCR(real-time-Polymerase Chain Reaction，实时聚合酶链式反应)扩增时，即使这些靶标的起始量相同，其扩增速度可能不同[1,2]。造成这一差异的原因是多方面的，比如不同靶标处于基因组DNA(genomic DNA，gDNA)的不同位置(即位置效应)、不同靶标特异引物具有不同的熔解温度(melting temperature，Tm)、多重(multiplex)PCR过程中不同引物的相互干扰、具体的RT-PCR扩增参数等等。
因此亟需一种通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，以达到改变不同核酸靶标相对扩增速度的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法。
本发明所提供的一种通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，包括如下步骤：
S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤；
S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤；
S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤。
S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤。
优选的，所述S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤中的靶标特异探针为GAPDH-P/cg313-P，其中，GAPDH-P的碱基序列为SEQ ID NO.6所示序列，cg313-P的碱基序列为SEQ ID NO.3所示序列。
优选的，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的通用引物为u-F和u-R，其中，所述u-F的碱基序列为SEQ ID NO.7所示序列，u-R的碱基序列为SEQ ID NO.8所示序列。
优选的，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的含有通用引物序列的靶标特异引物对为uGAPDH-F/uGAPDH-R和ucg313-F/ucg313-R，其中，uGAPDH-F的碱基序列为SEQ ID NO.4所示序列，uGAPDH-R的碱基序列为SEQ ID NO.5所示序列，ucg313-F的碱基序列为SEQ ID NO.1所示序列，ucg313-R的碱基序列为SEQ ID NO.2所示序列。
优选的，所述S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤中所述PCR反应体系为10μL～50μL，优选20μL，293T gDNA加入量为10ng～200ng，优选30ng。
优选的，所述通用引物对的终浓度为0.05μM～0.5μM，优选0.2μM，所述靶标特异探针的终浓度为0.05μM～0.5μM，优选0.2μM，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM～4nM。
优选的，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM、800pM、1.6nM或4nM。
优选的，所述S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤中的靶标特异探针为ACTB-P/cg315-P，其中，ACTB-P的碱基序列为SEQ ID NO.16所示序列，cg315-P的碱基序列为SEQ ID NO.13所示序列。
优选的，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的通用引物为u-F和u-R，其中，所述u-F的碱基序列为SEQ ID NO.7所示序列，u-R的碱基序列为SEQ ID NO.8所示序列。
优选的，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的含有通用引物序列的靶标特异引物对为uACTB-F/uACTB-R和ucg315-F/ucg315-R，其中，uACTB-F的碱基序列为SEQ ID NO.14所示序列，uACTB-R的碱基序列为SEQ ID NO.15所示序列，ucg315-F的碱基序列为SEQ ID NO.11所示序列，ucg315-R的碱基序列为SEQ ID NO.12所示序列。
优选的，所述S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤中所述PCR反应体系为10μL～50μL，优选20μL，293T gDNA加入量为10ng～200ng，优选15ng。
优选的，所述通用引物对的终浓度为0.05μM～0.5μM，优选0.2μM，所述靶标特异探针的终浓度为0.05μM～0.5μM，优选0.2μM，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM～4nM。
优选的，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM、800pM、1.6nM、2.4nM、3.2nM或4nM。
优选的，所述S3用于在反应体系中加入痕量且梯度终浓度的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行PCR扩增并生成PCR产物的步骤，还包括：
S31设置温度为94-98℃预变性，时间为10秒-5分钟，优选94℃预变性，时间为30秒；
S32预变性完成后，设置温度94-98℃变性5秒-1分钟，优选94℃变性5秒；
S33变性完成后，设置温度55-72℃延伸5秒-1分钟30秒，优选60℃延伸30秒；
S34重复S32和S33步骤10-50个循环，优选30个循环；
S35延伸后向体系中加入蛋白酶K(终浓度：0.05-1mg/mL，优选0.5mg/mL)，之后设置温度10-70℃反应5-60分钟，优选60℃反应30分钟，随后设置温度95-98℃反应5-60分钟，优选98℃反应10分钟。
优选的，所述S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤，包括：
S41设置温度为94-98℃预变性，时间为10秒-5分钟，优选94℃预变性，时间为30秒；
S42预变性完成后，设置温度94-98℃变性5秒-1分钟，优选94℃变性5秒；
S43变性完成后，设置温度55-72℃延伸5秒-1分钟30秒，优选60℃延伸30秒；
S44重复S42和S43步骤30-50个循环，优选45或50个循环。
优选的，所述S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤中的RT-PCR的反应体系，除qPCR Supermix、通用引物和靶标特异探针外，剩余体积用PCR产物和水按不同比例补至所需反应体积，优选剩余体积用PCR产物补至所需反应体积。
本发明所提供的一种通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，通过在靶标特异引物的5’端引入通用引物序列，之后在PCR体系中加入痕量且不同比例的靶标特异引物进行扩增，随后以该PCR产物为模板，通过通用引物对及靶标特异探针进行RT-PCR扩增，以达到改变不同核酸靶标相对扩增速度的目的。
附图说明
图1为本发明所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法的技术线路示意图；
图2为本发明实施例1所述的cg313片段特异引物和GAPDH片段特异引物针对293TgDNA的PCR扩增后的电泳胶图；
图3为本发明实施例1所述的cg313片段特异的引物/探针，和/或，GAPDH片段特异的引物/探针针对293T gDNA的RT-PCR的扩增曲线；
图4为本发明实施例1所述的通用引物对u-F/R针对图2产物(100×稀释)的PCR扩增后的电泳胶图；
图5为本发明实施例1所述的通用引物对u-F/R及cg313-P，和/或，GAPDH-P针对图2稀释产物(100×稀释)的RT-PCR的扩增曲线；
图6为本发明实施例1所述的RT-PCR产物的电泳结果；
图7为本发明实施例1所述的不同痕量靶标特异引物对针对293T gDNA扩增后，以其为模板进行的RT-PCR的扩增曲线；
图8为本发明实施例1所述的固定痕量ucg313-F/R终浓度，不同痕量uGAPDH-F/R终浓度针对293T gDNA扩增后，以其为模板进行的RT-PCR的扩增曲线；
图9为本发明实施例2所述的不同痕量靶标特异引物对针对转化后gDNA扩增后，以其为模板进行的RT-PCR的扩增曲线；
图10为本发明实施例2所述的固定痕量ucg315-F/R终浓度，不同痕量uACTB-F/R终浓度针对转化后gDNA扩增后，以其为模板进行的RT-PCR的扩增曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：如图1-图8所示，本实施例提供的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，包括如下步骤：
S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤；
S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤；
S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤。本领域技术人员可以理解，如加入和模板分子数相同的引物对，及基于此量梯度增加的引物对。
S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤。本领域技术人员可以理解，根据RT-PCR的扩增结果/扩增曲线，选择感兴趣的不同靶标的不同引物投入量的组合，再次进行RT-PCR，验证并达到改变不同核酸靶标相对扩增速度的目的。通用引物对的使用量为RT-PCR试剂盒推荐的靶标引物使用量(或稍有调整)。靶标特异探针的使用量为RT-PCR试剂盒推荐的探针使用量(或稍有调整)。
本领域技术人员可以理解，本实施例所提供的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，通过在靶标特异引物的5’端引入通用引物序列，之后在PCR体系中加入痕量且不同比例的靶标特异引物进行扩增。之后以该PCR产物为模板，通过通用引物对及靶标特异探针进行RT-PCR扩增，可达到改变不同核酸靶标相对扩增速度的目的。如图1所示，u-F/u-R：通用引物对(universal primer pair)；uA-F/uA-R：靶标A(target A)的含有通用引物序列的靶标特异引物对(universal primer-containing target-specific primerpair)；A-P：靶标A的特异探针(target-specific probe)；uB-F/uB-R：靶标B的含有通用引物序列的靶标特异引物对；B-P：靶标B的特异探针；RT-PCR：实时PCR(real-time PCR)；cycles：RT-PCR循环数；
signal：RT-PCR扩增信号值。
进一步，所述S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤中的靶标特异探针为GAPDH-P/cg313-P，其中，GAPDH-P的碱基序列为SEQ ID NO.6所示序列，cg313-P的碱基序列为SEQ ID NO.3所示序列。
进一步，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的通用引物为u-F和u-R，其中，所述u-F的碱基序列为SEQ ID NO.7所示序列，u-R的碱基序列为SEQ ID NO.8所示序列。
进一步，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的含有通用引物序列的靶标特异引物对为uGAPDH-F/uGAPDH-R和ucg313-F/ucg313-R，其中，uGAPDH-F的碱基序列为SEQ ID NO.4所示序列，uGAPDH-R的碱基序列为SEQ ID NO.5所示序列，ucg313-F的碱基序列为SEQ ID NO.1所示序列，ucg313-R的碱基序列为SEQ ID NO.2所示序列。
进一步，所述S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤中所述PCR反应体系为10μL～50μL，优选20μL，293T gDNA加入量为10ng～200ng，优选30ng。进一步，所述通用引物对的终浓度为0.05μM～0.5μM，优选0.2μM，所述靶标特异探针的终浓度为0.05μM～0.5μM，优选0.2μM，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM～4nM。
进一步，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM、800pM、1.6nM或4nM。
进一步，所述S3用于在反应体系中加入痕量且梯度终浓度的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行PCR扩增并生成PCR产物的步骤，还包括：
S31设置温度为94-98℃预变性，时间为10秒-5分钟，优选94℃预变性，时间为30秒；
S32预变性完成后，设置温度94-98℃变性5秒-1分钟，优选94℃变性5秒；
S33变性完成后，设置温度55-72℃延伸5秒-1分钟30秒，优选60℃延伸30秒；
S34重复S32和S33步骤10-50个循环，优选30个循环；
S35延伸后向体系中加入蛋白酶K(终浓度：0.05-1mg/mL，优选0.5mg/mL)，之后设置温度10-70℃反应5-60分钟，优选60℃反应30分钟，随后设置温度95-98℃反应5-60分钟，优选98℃反应10分钟。
本领域技术人员可以理解，PCR之后，可对产物进行蛋白酶K处理以去除DNA聚合酶和已经失活的抗体(因为此时的DNA聚合酶为非热启动酶)。
进一步，所述S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤，包括：
S41设置温度为94-98℃预变性，时间为10秒-5分钟，优选94℃预变性，时间为30秒；
S42预变性完成后，设置温度94-98℃变性5秒-1分钟，优选94℃变性5秒；
S43变性完成后，设置温度55-72℃延伸5秒-1分钟30秒，优选60℃延伸30秒；
S44重复S42和S43步骤30-50个循环，优选45或50个循环。
本领域技术人员可以理解，RT-PCR反应体系为20μL，RT-PCR试剂盒(PerfectStartII Probe qPCR SuperMix)购自北京全式金生物技术股份有限公司(中国)。RT-PCR的体系配置按照试剂盒说明书进行。
进一步，所述S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤中的RT-PCR的反应体系，除qPCR Supermix、通用引物和靶标特异探针外，剩余体积用PCR产物补至20μL。本领域技术人员可以理解，对照组(NTC)用水补至20μL。
碱基序列如表1所示：
表1：碱基序列
其中，FAM/SF670：探针5’端的荧光基团；MGB：探针3’端的猝灭基团；cg313fragment：cg313片段；GAPDH fragment：GAPDH片段。
本领域技术人员可以理解，RT-PCR试剂盒(PerfectStart IIProbe qPCRSuperMix)购自北京全式金生物技术股份有限公司(中国)，并用于PCR和RT-PCR实验。该试剂盒中含有DNA聚合酶特异抗体，因此可实现热启动PCR和热启动RT-PCR。PCR的体系配置按照试剂盒说明书进行，但不加探针；RT-PCR的体系配置按照试剂盒说明书进行。PCR和RT-PCR反应体系为20μL，293T gDNA加入量为30ng。PCR和RT-PCR反应步骤为两步法：94℃预变形30秒；94℃变性5秒，60℃延伸30秒(循环数见图示或图注)。PCR之后，若需对产物进行蛋白酶K处理以去除DNA聚合酶和已经失活的抗体(所以此时的DNA聚合酶为非热启动酶)，其步骤为：向体系中加入蛋白酶K(终浓度为0.5mg/mL)(ZYMO RESEARCH，美国)，之后60℃反应30分钟，之后98℃反应10分钟。配置RT-PCR体系时，除过qPCR Supermix、通用引物和靶标特异探针，剩余体积用PCR产物和水按不同比例补至20μL(NTC用水补至20μL)。
图2为cg313片段特异引物和GAPDH片段特异引物针对293T gDNA的PCR扩增后的电泳胶图，其中，“M”：DNA分子量标准；“NTC”：无模板对照；“Different contrast”：不同对比度；“Final conc.”：终终浓度；PCR循环数为40。
图3为cg313片段特异的引物/探针，和/或，GAPDH片段特异的引物/探针针对293TgDNA的RT-PCR扩增，其中，“Relative signal”：相对荧光信号值，即原始荧光信号值除以基线荧光信号值；“absolute signal”：绝对荧光信号值，即原始荧光信号值减去基线荧光信号值；Final conc：ucg313-F/R(0.2μM)，cg313-P(0.2μM)，和/或，uGAPDH-F(0.2μM)，GAPDH-P(0.2μM)。
如图2所示，同时用引物对ucg313-F/R(表1)和uGAPDH-F/R(表1)针对293T gDNA进行PCR扩增时，所分别扩增的cg313片段和GAPDH片段的产量存在明显的差异，即cg313片段的产量显著高于GAPDH片段的产量，和图2的PCR后的胶图结果相一致；用引物对ucg313-F/R和taqman探针cg313-P针对293T gDNA可成功扩增cg313片段(图3第1列和图6)；用引物对uGAPDH-F/R和taqman探针GAPDH-P针对293T gDNA亦可成功扩增GAPDH片段(图3第2列和图5)；进一步，同时用cg313片段特异的引物/探针和GAPDH片段特异的引物/探针可以同时扩增cg313片段和GAPDH片段，同时cg313片段的信号起跳时间更早且信号值持续高于GAPDH片段的信号值(图3第3列、图3第4列和图6)。概括讲，cg313和GAPDH可以同时扩增，且cg313片段的引物扩增效率高于GAPDH片段的引物扩增效率。
图4为通用引物对u-F/R针对图2产物(100×稀释)的PCR扩增，其中，泳道“DilutedPCR product”：图2产物100×的稀释样(作为模板)，且其上样量和泳道“cg313&GAPDH”对应的模板的上样量相同；“w/o pro.K”：PCR产物未进行蛋白酶K处理；“w/pro.K”：PCR产物进行了蛋白酶K处理。PCR循环数为30。
图5为通用引物对u-F/R及cg313-P，和/或，GAPDH-P针对图2稀释产物(100×稀释)的RT-PCR扩增，其中Final conc：u-F/R(0.2μM)，cg313-P(0.2μM)，GAPDH-P(0.2μM)。PCR产物未进行蛋白酶K处理。
图6为RT-PCR产物的电泳结果胶图。
将图2的PCR产物稀释100×(即diluted PCR product)，并作为模板，进一步用通用引物对u-F/R进行扩增，结果显示u-F/R可以成功的扩增cg313片段和GAPDH片段，且cg313片段的产量显著高于GAPDH片段的产量(图4)，从图4亦可知，蛋白酶K处理与否不影响u-F/R对靶标的扩增。与图4的结果相一致，u-F/R和cg313-P针对图2稀释产物可以成功扩增cg313片段(图5第1列、图6)；u-F/R和GAPDH-P针对图2稀释产物可以成功扩增GAPDH片段(图5第2列、图6)。进一步，u-F/R、cg313-P和GAPDH-P针对图2稀释产物可以同时扩增cg313片段和GAPDH片段，且cg313片段的信号起跳时间更早且信号值持续高于GAPDH片段的信号值(图5第3列、图6)。概括讲，u-F/R结合cg313-P和GAPDH-P可进一步同时扩增cg313片段和GAPDH片段，且能够保持模板中cg313片段和GAPDH片段的相对量差异；同时PCR之后的蛋白酶K处理与否不影响后续的扩增。
图7为不同痕量靶标特异引物对针对293T gDNA扩增后，以其为模板进行的RT-PCR扩增。PCR产物进行了蛋白酶K处理；PCR循环数为30。
如图7所示，当ucg313-F/R和uGAPDH-F/R的终浓度介于4fM和40pM之间时，以其PCR扩增的产物为模板时，RT-PCR无扩增信号，当ucg313-F/R和uGAPDH-F/R的终浓度为400pM和4nM时，以其PCR扩增产物为模板时，RT-PCR可扩增cg313片段和GAPDH片段，且cg313片段的扩增信号起跳时间更早且持续高于GAPDH片段的扩增信号。相比于400pM，当ucg313-F/R和uGAPDH-F/R的终浓度为4nM时，以其PCR产物为模板进行的RT-PCR的扩增信号起跳时间更早，扩增信号值更强。概括讲，cg313片段的引物的扩增效率高于GAPDH片段的扩增效率。
图8为固定痕量ucg313-F/R终浓度，不同痕量uGAPDH-F/R终浓度针对293T gDNA扩增后，以其为模板进行的RT-PCR扩增。PCR产物进行了蛋白酶K处理；PCR循环数为30。其中，
基于图7的结果，固定uc313-F/R的终终浓度为400pM，当uGAPDH-F/R的终终浓度从400pM升至800pM时，以其PCR产物为模板，RT-PCR结果表明GAPDH片段和cg313片段的扩增信号起跳时间差异缩小；当uGAPDH-F/R的终终浓度升至1.6nM时，GAPDH片段的扩增信号起跳时间甚至略早于cg313片段的扩增信号起跳时间；当uGAPDH-F/R的终终浓度升至4nM时，GAPDH片段的扩增信号起跳时间显著早于和cg313片段的扩增信号起跳时间。图8亦表明，uGAPDH-F/R的终终浓度为所测试的4个终浓度梯度时(即400pM、800pM、1.6nM和4nM)时，cg313片段的扩增未受影响。概括讲，PCR阶段投入不同痕量的cg313片段和GAPDH片段的引物量，以其PCR产物为模板，可改变cg313片段和GAPDH片段的相对扩增速度。
实施例2：本实施例提供的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，包括如下步骤：
S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤；
S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤；
S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤。本领域技术人员可以理解，如加入和模板分子数相同的引物对，及基于此量梯度增加的引物对。
S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤。本领域技术人员可以理解，根据RT-PCR的扩增结果/扩增曲线，选择感兴趣的不同靶标的不同引物投入量的组合，再次进行RT-PCR，验证并达到改变不同核酸靶标相对扩增速度的目的。通用引物对的使用量为RT-PCR试剂盒推荐的靶标引物使用量(或稍有调整)。靶标特异探针的使用量为RT-PCR试剂盒推荐的探针使用量(或稍有调整)。
本领域技术人员可以理解，本实施例所提供的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，通过在靶标特异引物的5’端引入通用引物序列，之后在PCR体系中加入痕量且不同比例的靶标特异引物进行扩增。之后以该PCR产物为模板，通过通用引物对及靶标特异探针进行RT-PCR扩增，可达到改变不同核酸靶标相对扩增速度的目的。如图1所示，u-F/u-R：通用引物对(universal primer pair)；uA-F/uA-R：靶标A(target A)的含有通用引物序列的靶标特异引物对(universal primer-containing target-specific primerpair)；A-P：靶标A的特异探针(target-specific probe)；uB-F/uB-R：靶标B的含有通用引物序列的靶标特异引物对；B-P：靶标B的特异探针；RT-PCR：实时PCR(real-time PCR)；cycles：RT-PCR循环数；
signal：RT-PCR扩增信号值。
进一步，所述S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤中的靶标特异探针为ACTB-P/cg315-P，其中，ACTB-P的碱基序列为SEQ ID NO.16所示序列，cg315-P的碱基序列为SEQ ID NO.13所示序列。
进一步，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的通用引物为u-F和u-R，其中，所述u-F的碱基序列为SEQ ID NO.7所示序列，u-R的碱基序列为SEQ ID NO.8所示序列。
进一步，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的含有通用引物序列的靶标特异引物对为uACTB-F/uACTB-R和ucg315-F/ucg315-R，其中，uACTB-F的碱基序列为SEQ ID NO.14所示序列，uACTB-R的碱基序列为SEQ ID NO.15所示序列，ucg315-F的碱基序列为SEQ ID NO.11所示序列，ucg315-R的碱基序列为SEQ ID NO.12所示序列。
进一步，所述S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤中所述PCR反应体系为10μL～50μL，优选20μL，293T gDNA加入量为10ng～200ng，优选15ng。
进一步，所述通用引物对的终浓度为0.05μM～0.5μM，优选0.2μM，所述靶标特异探针的终浓度为0.05μM～0.5μM，优选0.2μM，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM～4nM。
进一步，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM、800pM、1.6nM、2.4nM、3.2nM或4nM。
进一步，所述S3用于在反应体系中加入痕量且梯度终浓度的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行PCR扩增并生成PCR产物的步骤，还包括：
S31设置温度为94-98℃预变性，时间为10秒-5分钟；
S32预变性完成后，设置温度94-98℃变性5秒-1分钟；
S33变性完成后，设置温度55-72℃延伸5秒-1分钟30秒；
S34重复S32和S33步骤10-50个循环；
S35延伸后向体系中加入蛋白酶K(终浓度：0.05-1mg/mL)，之后设置温度10-70℃反应5-60分钟，随后设置温度95-98℃反应5-60分钟。
本领域技术人员可以理解，PCR之后，可对产物进行蛋白酶K处理以去除DNA聚合酶和已经失活的抗体(因为此时的DNA聚合酶为非热启动酶)。
进一步，所述S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤，包括：
S41设置温度为94-98℃预变性，时间为10秒-5分钟，优选94℃预变性，时间为30秒；
S42预变性完成后，设置温度94-98℃变性5秒-1分钟，优选94℃变性5秒；
S43变性完成后，设置温度55-72℃延伸5秒-1分钟30秒，优选60℃延伸30秒；
S44重复S42和S43步骤30-50个循环，优选45或50个循环。本领域技术人员可以理解，RT-PCR反应体系为20μL，RT-PCR试剂盒(PerfectStart IIProbe qPCR SuperMix)购自北京全式金生物技术股份有限公司(中国)。RT-PCR的体系配置按照试剂盒说明书进行。
进一步，所述S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤中的RT-PCR的反应体系，除qPCR Supermix、通用引物和靶标特异探针外，剩余体积用PCR产物补至20μL。本领域技术人员可以理解，对照组(NTC)用水补至20μL。
碱基序列如表2所示：
表2：碱基序列
其中，FAM/SF670：探针5’端的荧光基团；MGB：探针3’端的猝灭基团；cg315fragment：cg315片段(未转化前)；ACTB fragment：ACTB片段(未转化前)。本领域技术人员可以理解，本实施例所用gDNA抽提自一个膀胱癌患者的尿液。所抽提gDNA用EZ DNAMethylation-Gold Kit(ZYMO RESEARCH，USA)进行转化。转化后的DNA用于RT-PCR扩增的模板。模板使用量为15ng。其它方法和实施例1相同。
图9为加入不同痕量靶标特异引物对针对转化后gDNA扩增后，以其为模板进行的RT-PCR扩增。PCR产物进行了蛋白酶K处理；PCR循环数为30。
由图9可知，uACTB-F/R的终终浓度为400fM时，以其PCR产物为模板时，RT-PCR无扩增信号；当uACTB-F/R的终终浓度为4pM或更高时，以其PCR产物为模板时，RT-PCR可扩增ACTB片段。当ucg315-F/R的终终浓度介于400fM和400pM时，以其PCR产物为模板时，RT-PCR无扩增信号；当ucg315-F/R的终终浓度为4nM时，以其PCR产物为模板时，RT-PCR可扩增cg315片段(图9)。另外，ACTB片段的扩增信号起跳时间更早且持续高于cg315片段的扩增信号(图9)。概括讲，ACTB片段的引物的扩增效率高于cg315片段的扩增效率。
图10为固定痕量ucg315-F/R终浓度，不同痕量uACTB-F/R终浓度针对转化后gDNA扩增后，以其为模板进行的RT-PCR扩增。PCR产物进行了蛋白酶K处理；PCR循环数为30。
基于图10的结果，固定ucg315-F/R的终终浓度为4nM，当uACTB-F/R的终终浓度从4nM递减至1.6nM时，以其PCR产物为模板，RT-PCR结果表明ACTB片段的扩增信号起跳时间逐渐推迟，但仍然早于cg315片段的起跳时间；当uACTB-F/R的终终浓度为800pM时，以其PCR产物为模板，RT-PCR结果表明ACTB片段的扩增信号起跳时间和cg315片段的起跳时间几乎相同；当uACTB-F/R的终终浓度为400pM时，以其PCR产物为模板，RT-PCR结果表明ACTB片段的扩增信号起跳时间晚于cg315片段的起跳时间。另外，uACTB-F/R干扰ucg315-F/R的扩增(图10)。概括讲，PCR阶段投入不同痕量的cg315片段和ACTB片段的引物量，以其PCR产物为模板，可改变cg315片段和ACTB片段的相对扩增速度。
综上所述，在PCR阶段加入不同比例的含有通用引物序列的痕量靶标特异引物时，以其PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR，可达到改变不同核酸靶标相对扩增速度的目的。
引用：
1、Wang T,Li P,Qi Q,Zhang S,Xie Y,Wang J,Liu S,Ma S,Li S,Gong T et al:A multiplex blood-based assay targeting DNA methylation in PBMCs enablesearly detection of breast cancer.NAT COMMUN 2023,14(1):4724.
2、Xie Y,Li P,Sun D,Qi Q,Ma S,Zhao Y,Zhang S,Wang T,Wang J,Li S et al:DNA Methylation-Based Testing in Peripheral Blood Mononuclear Cells EnablesAccurate and Early Detection of Colorectal Cancer.CANCER RES2023,83(21):3636-3649.
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (16)
1.一种通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤；
S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤；
S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤。
S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤。
2.如权利要求1所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤中的靶标特异探针为GAPDH-P/cg313-P，其中，GAPDH-P的碱基序列为SEQ ID NO.6所示序列，cg313-P的碱基序列为SEQ IDNO.3所示序列。
3.如权利要求2所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的通用引物为u-F和u-R，其中，所述u-F的碱基序列为SEQ ID NO.7所示序列，u-R的碱基序列为SEQ ID NO.8所示序列。
4.如权利要求3所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的含有通用引物序列的靶标特异引物对为uGAPDH-F/uGAPDH-R和ucg313-F/ucg313-R，其中，uGAPDH-F的碱基序列为SEQ ID NO.4所示序列，uGAPDH-R的碱基序列为SEQ ID NO.5所示序列，ucg313-F的碱基序列为SEQ ID NO.1所示序列，ucg313-R的碱基序列为SEQ ID NO.2所示序列。
5.如权利要求4所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤中所述PCR反应体系为10μL～50μL，293T gDNA加入量为10ng～200ng。
6.如权利要求5所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述通用引物对的终浓度为0.05μM～0.5μM，所述靶标特异探针的终浓度为0.05μM～0.5μM，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM～4nM。
7.如权利要求6所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM、800pM、1.6nM或4nM。
8.如权利要求1所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S1用于准备靶标特异引物对和靶标特异探针的步骤中的靶标特异探针为ACTB-P/cg315-P，其中，ACTB-P的碱基序列为SEQ ID NO.16所示序列，cg315-P的碱基序列为SEQ IDNO.13所示序列。
9.如权利要求8所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的通用引物为u-F和u-R，其中，所述u-F的碱基序列为SEQ ID NO.7所示序列，u-R的碱基序列为SEQ ID NO.8所示序列。
10.如权利要求9所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S2用于对靶标特异引物对的5’端引入通用引物序列，生成含有通用引物序列的靶标特异引物对的步骤中的含有通用引物序列的靶标特异引物对为uACTB-F/uACTB-R和ucg315-F/ucg315-R，其中，uACTB-F的碱基序列为SEQ ID NO.14所示序列，uACTB-R的碱基序列为SEQ ID NO.15所示序列，ucg315-F的碱基序列为SEQ ID NO.11所示序列，ucg315-R的碱基序列为SEQ ID NO.12所示序列。
11.如权利要求10所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S3用于在PCR反应体系中加入不同痕量的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行扩增并生成PCR产物的步骤中所述PCR反应体系为10μL～50μL，293T gDNA加入量为10ng～200ng。
12.如权利要求11所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述通用引物对的终浓度为0.05μM～0.5μM，所述靶标特异探针的终浓度为0.05μM～0.5μM，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM～4nM。
13.如权利要求12所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述含有通用引物序列的靶标特异引物对的终浓度为400pM、800pM、1.6nM、2.4nM、3.2nM或4nM。
14.如权利要求7或13所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S3用于在反应体系中加入痕量且梯度终浓度的含有通用引物序列的靶标特异引物对进行PCR扩增并生成PCR产物的步骤，还包括：
S31设置温度为94-98℃预变性，时间为10秒-5分钟；
S32预变性完成后，设置温度94-98℃变性5秒-1分钟；
S33变性完成后，设置温度55-72℃延伸5秒-1分钟30秒；
S34重复S32和S33步骤10-50个循环；
S35延伸后向体系中加入蛋白酶K(终浓度：0.05-1mg/mL)，之后设置温度10-70℃反应5-60分钟，随后设置温度95-98℃反应5-60分钟。
15.如权利要求14所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤，包括：
S41设置温度为94-98℃预变性，时间为10秒-5分钟；
S42预变性完成后，设置温度94-98℃变性5秒-1分钟；
S43变性完成后，设置温度55-72℃延伸5秒-1分钟30秒；
S44重复S42和S43步骤30-50个循环。
16.如权利要求15所述的通过预先PCR改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法，其特征在于，所述S4用于以PCR产物为模板，用通用引物对和靶标特异探针进行RT-PCR反应的步骤中的RT-PCR的反应体系，除qPCR Supermix、通用引物和靶标特异探针外，剩余体积用PCR产物和水按不同比例补至所需反应体积。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410274764.3A CN118127137A (zh) | 2024-03-11 | 2024-03-11 | 一种通过预先pcr改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410274764.3A CN118127137A (zh) | 2024-03-11 | 2024-03-11 | 一种通过预先pcr改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118127137A true CN118127137A (zh) | 2024-06-04 |
Family
ID=91240258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410274764.3A Pending CN118127137A (zh) | 2024-03-11 | 2024-03-11 | 一种通过预先pcr改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118127137A (zh) |
-
2024
- 2024-03-11 CN CN202410274764.3A patent/CN118127137A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2699698B1 (en) | Oscillating amplification reaction for nucleic acids | |
| EP0379369B1 (en) | Nucleic acid amplification using single primer | |
| EP3192901B1 (en) | Method for constructing nucleic acid single-stranded cyclic library and reagents thereof | |
| CN105803074B (zh) | 一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针 | |
| CN104975013A (zh) | 一种加速聚合酶螺旋反应的方法及其应用 | |
| CN105452480B (zh) | 经由剪刀状结构的dna扩增(dasl) | |
| JP2018515140A (ja) | 液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ | |
| CN106191214A (zh) | 一种多色荧光熔解曲线pcr检测方法 | |
| CN108034757A (zh) | 一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA引物及检测方法 | |
| CN110577979B (zh) | 一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选方法及筛选获得的结构开关型核酸适配体 | |
| CN107119040A (zh) | 一种等温核酸扩增的方法 | |
| CN117343999B (zh) | 基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法 | |
| CN106591287A (zh) | 一种聚合酶链式反应增强的方法 | |
| CN118127137A (zh) | 一种通过预先pcr改变不同核酸靶标相对扩增速度的方法 | |
| US20200131510A1 (en) | Pcr primer pair and application thereof | |
| CN107541507A (zh) | 一种rna反转录扩增方法 | |
| CN105886501B (zh) | 核酸信号放大序列及放大方法 | |
| CN105087795A (zh) | 一种恒温扩增技术 | |
| JP2022523362A (ja) | 単一分子配列決定における使用のための拡張可能ポリマーの固体合成のための方法、組成物、およびデバイス | |
| CN108823288B (zh) | 一种检测模块及方法 | |
| EP3802872A1 (en) | Cleavable co-operative primers and method of amplifying nucleic acid sequences using same | |
| CN117965705A (zh) | 一种改变不同核酸靶标相对pcr扩增速度的方法 | |
| CN105986020A (zh) | 构建测序文库的方法及装置 | |
| CN115873928A (zh) | 一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用 | |
| CN110684826B (zh) | 基于重组酶的环介导扩增方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |