CN117037925A - 一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法 - Google Patents
一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117037925A CN117037925A CN202310961984.9A CN202310961984A CN117037925A CN 117037925 A CN117037925 A CN 117037925A CN 202310961984 A CN202310961984 A CN 202310961984A CN 117037925 A CN117037925 A CN 117037925A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hairpin
- toehold
- reaction
- leakage
- cha
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 abstract description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012984 biological imaging Methods 0.000 abstract 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000032484 Accidental exposure to product Diseases 0.000 description 1
- 231100000818 accidental exposure Toxicity 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
- G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
- G16C20/10—Analysis or design of chemical reactions, syntheses or processes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Computing Systems (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明涉及一种DNA自组装技术，特别涉及一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法。本发明通过将发卡中有引发泄漏嫌疑的toehold片段部分移除，并将其移动至输入链中，只有当输入链被输入体系时，缺失的部分再次完整，以保证甚至提升催化反应速率，达到保证催化反应动力学的基础上降低泄露反应速率的效果，最大限度提高催化发卡自组装系统的信噪比与反应性。本发明提出的自组装系统具有高效性、简便性、鲁棒性，在临床诊断、生物成像、纳米机器人等领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于动态DNA纳米技术领域，特别涉及一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法。
背景技术
沃森-克里克碱基配对的自然性质使DNA成为一种强大而独特的工程材料，具有理想的生物相容性、高可预测性和纳米级可控性。基于toehold介导链置换反应的核酸电路是动态DNA系统构建的基础，在计算、纳米技术和诊断方面产生了许多有用的方法。其中无酶、高效、等温的催化发夹组装法(CHA)是一个典型的例子。CHA电路已被应用于多种方面，如生物传感、生物成像、纳米机器人和逻辑电路等。
实现这种无酶放大器的主要障碍包括在没有入侵链的情况下误触发扩增级联(也称为电路泄漏)，这限制了更复杂、可扩展和敏感工具的工程设计。总泄漏是由于亚稳态和平衡态之间的能量势垒不足而发生的，可分为初始泄漏和渐近泄漏。初始泄露主要来源于合成错误或者反应中错误折叠的DNA分子，可以通过精心地设计来减少反应物非目标构象或使用高度纯化的DNA链来降低；而渐进泄露主要由于DNA底物自发的瞬时构象变化，底物之间可以从双链末端或同轴末端堆叠处发生无toehold的链置换反应，引发自组装循环。
近年来，多种设计方式已被用于减少泄露反应，例如“DNA钳”、锁核酸底物、四向分支迁移和错配结构域等，也有研究团队提出了发夹的设计原则和纯化方法，以尽量减少催化发夹组件(CHA)系统中的泄漏。这些设计本质上都是通过提升泄露途径能量势垒减少泄露反应，虽然被证明在减少由呼吸作用引发，或由缺陷DNA引起的泄漏方面是有效的，但大都会导致催化反应动力学减慢，有时甚至损失反应产率。因此，我们探索能在保证催化反应动力学的基础上降低泄露反应速率的方式。
发明内容
本发明针对传统CHA电路中通常产生难以忽视的背景信号的问题，通过分析CHA电路的内在泄漏途径，提供了一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法。
本发明是一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，包括：
(1)通过移除发夹1与发夹2的toehold片段，降低CHA反应的背景信号：
根据反应输入，利用NUPACK软件(https://www.nupack.org/partition/new)设计传统CHA反应体系所包含的两个发夹序列，并将发夹1与发夹2的toehold片段移除至不同长度；在TE Mg2+缓冲液中将发夹进行退火，具体的操作步骤为95℃处理5分钟，再缓慢将温度降至室温备用；于20μLTE Mg2+体系中加入两个发夹进行反应，反应温度为37℃，通过Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪(QIAGEN，德国)监测toehold移除前后的背景荧光变化。
(2)通过将发夹中被移除的toehold移动至输入链，提升CHA催化速率：
对从发夹中移除的核酸片段进行长度与序列的适当优化，将其移动至传统输入序列中与打开发夹1无关的一端，形成新的输入链；在20μL TE Mg2+体系中加入两个发夹以及输入链进行CHA反应，反应温度为37℃，通过Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪监测被移除片段移动前后的催化荧光变化，以及对不同浓度的两种输入的响应性变化。
本发明提供建立了一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，解决泄露反应与目标反应的交织会导致严重的非特异性背景信号问题。其基本原理为将发夹中有引发泄漏嫌疑的toehold部分移除，降低泄漏反应速率，并将其移动至输入链中，只有当输入链被输入电路时，缺失的部分再次完整，以保证甚至提升催化反应速率，达到保证催化反应动力学的基础上降低泄露反应速率的效果，实验证明最大限度提高信噪比至100以上。本发明的设计及操作简便，有效提高CHA检测灵敏度、扩大CHA应用范围。
首先验证了部分移除发夹1的toehold(T1)或发夹2的toehold(T2)对泄漏反应的影响，以移除的T2为例，如图1所示，若发夹1靠近环的双链末端发生呼吸作用，意外暴露出之前被封闭在茎中的碱基，那么T2的自由碱基便会被吸引而向发夹1茎的部分不断入侵，图1中向左的箭头表示入侵力，由于T2已经被缩短，入侵力相对于普通长度的toehold长度被削弱；此外，在发夹1的茎中本身已存在大量已互补配对的碱基，会促进近环双链的再杂交，图1中向右的箭头表示碱基杂交力，此时碱基杂交力大于入侵力，且两者的差值应该是随着T2长度的减小而增大，使发夹1能拒绝发夹2的入侵，反向置换出发夹2，达到降低泄漏反应发生的效果。如图2所示，随着T2的不断降低，泄漏反应产生的荧光信号不断减少；同样地，随着T1的不断降低，泄漏反应产生的荧光信号不断减少(图3)。这证明了部分移除toehold对泄漏反应的成功抑制且移除T2效果更佳。
如图4所示，由于泄漏反应与催化反应共用一套发夹，如果将T2部分移除之后采用普通的输入链进行反应，降低泄漏反应的同时也会降低催化反应动力学。为了保证催化反应的速率，如图5所示，将从发夹中移除的核酸片段优化至8nt，再将其移动至传统输入中，形成新的输入链，让系统在发夹中损失的能量在引入输入链后得到补偿。从荧光动力学可以看出(图6)，催化反应速率h显著提升；此外，通过计算信噪比，证明了基于可移动toehold的低泄漏CHA具有优良的信噪比，其中将T2移动至4nt的效果最佳(图7)。
另外，还对低泄漏CHA的鲁棒性进行验证。在不同温度下(图8-图9)、不同缓冲液中(图10-图11)将toehold进行移动，均可以降低泄漏、提高信噪比。
最后，将传统CHA(图12)与低泄漏CHA(图13)对不同浓度输入的响应能力进行比较，可以看出我们提出的可移动toehold策略有效提高了灵敏度约50倍。
综上所述，我们证明了基于可移动toehold的低泄漏CHA反应具有高效性、简便性、鲁棒性，在保证催化反应动力学的基础上有效降低泄露反应速率，提高系统响应性能，从而扩展催化发夹自组装技术在实践中的应用范围。
附图说明
图1是通过缩短toehold抑制泄漏反应的原理示意图。
图2是不同长度T2的泄漏反应的荧光动力学曲线。
图3是不同长度T1的泄漏反应的荧光动力学曲线。
图4是部分移除T2后普通输入的反应效果图。
图5是可移动toehold设计原理图。
图6是基于可移动toehold设计的新输入的反应效果图。
图7是不同T1与T2的信噪比图。
图8是31℃下的反应效果图。
图9是43℃下的反应效果图。
图10是1xTBE缓冲液中的反应效果图。
图11是5xTBE缓冲液中的反应效果图。
图12是传统CHA对不同浓度输入的响应效果图。
图13是低泄漏CHA对不同浓度输入的响应效果图。
具体实施方式
一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，按以下步骤操作：
(1)通过移除发夹1与发夹2的toehold片段，降低CHA反应的背景信号：
根据反应输入，利用NUPACK软件(https://www.nupack.org/partition/new)设计传统CHA反应体系所包含的两个发夹序列，并将发夹1与发夹2的toehold片段移除至不同长度；在TE Mg2+缓冲液中将发夹进行退火，具体的操作步骤为95℃处理5分钟，再缓慢将温度降至室温备用；于20μLTE Mg2+体系中加入两个发夹进行反应，反应温度为37℃，通过Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪(QIAGEN，德国)监测toehold移除前后的背景荧光变化。
(2)通过将发夹中被移除的toehold移动至输入链，提升CHA催化速率：
对从发夹中移除的核酸片段进行长度与序列的适当优化，将其移动至传统输入序列中与打开发夹1无关的一端，形成新的输入链；在20μL TE Mg2+体系中加入两个发夹以及输入链进行CHA反应，反应温度为37℃，通过Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪监测被移除片段移动前后的催化荧光变化，以及对不同浓度的两种输入的响应性变化。
Claims (9)
1.本发明是一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，包括：
(1)通过移除发夹1与发夹2的toehold片段，降低CHA反应的背景信号：
根据反应靶标，利用NUPACK软件(https://www.nupack.org/partition/new)设计传统CHA反应体系所包含的两个发夹序列，并将发夹1与发夹2的toehold片段移除至不同长度；在TE Mg2+缓冲液中将发夹进行退火，具体的操作步骤为95℃处理5分钟，再缓慢将温度降至室温备用；于20μLTE Mg2+体系中加入两个发夹进行反应，反应温度为37℃，通过Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR分析仪(QIAGEN，德国)监测toehold移除前后的背景荧光变化。
(2)通过将发夹中被移除的toehold移动至输入链，提升CHA催化速率：
优化从发夹中移除的核酸片段长度，将其移动至传统输入序列中与打开发夹1无关的一端，形成新的输入链；在20μL TE Mg2+体系中加入两个发夹以及输入链进行CHA反应，反应温度为37℃，通过Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪监测被移除片段移动前后的催化荧光变化，以及对不同浓度的两种靶标的响应性变化。
2.如权利要求1所述的用两种特殊设计的发夹进行高效循环扩增方法。
3.如权利要求1所述的一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，其制备方法步骤(1)中发夹1的退火后终浓度是1μΜ。
4.如权利要求1所述的一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，其制备方法步骤(1)中发夹2的退火后终浓度是1μΜ。
5.如权利要求1所述的一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，其制备方法步骤(1)中发夹1移除后的toehold长度为5nt、4nt。
6.如权利要求1所述的一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，其制备方法步骤(1)中发夹2移除后的toehold长度为4nt、3nt。
7.如权利要求1所述的一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，其制备方法步骤(2)中优化后的移动toehold长度为8nt。
8.如权利要求1所述的一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，其制备方法步骤(2)中将发夹2的toehold移动至4nt可得到最佳反应效果。
9.如权利要求1所述的一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法，其制备方法步骤(2)中进行CHA反应时最后加入的反应物为发夹1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310961984.9A CN117037925A (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310961984.9A CN117037925A (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117037925A true CN117037925A (zh) | 2023-11-10 |
Family
ID=88629134
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310961984.9A Pending CN117037925A (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117037925A (zh) |
-
2023
- 2023-07-31 CN CN202310961984.9A patent/CN117037925A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6363984B2 (ja) | 修飾した核酸を用いる情報伝播のシステムおよび方法 | |
| Kotani et al. | Multi-arm junctions for dynamic DNA nanotechnology | |
| EP3417078B1 (en) | Molecular programming tools | |
| Li et al. | Simulation-guided engineering of an enzyme-powered three dimensional DNA nanomachine for discriminating single nucleotide variants | |
| Kolpashchikov | Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots | |
| JP5020818B2 (ja) | 生物学的試料中の核酸を検出するための方法及び組成物 | |
| Bi et al. | Metal ions triggered ligase activity for rolling circle amplification and its application in molecular logic gate operations | |
| KR101400995B1 (ko) | 표적물질의 결합에 의한 압타머 구조 변화 특성을 이용한 등온 핵산 증폭방법 및 이를 이용한 초고감도 생체물질 검출방법 | |
| JamesáYang | Carbon nanoparticle-protected aptamers for highly sensitive and selective detection of biomolecules based on nuclease-assisted target recycling signal amplification | |
| Bi et al. | Initiator-catalyzed self-assembly of duplex-looped DNA hairpin motif based on strand displacement reaction for logic operations and amplified biosensing | |
| Bi et al. | Target-triggered cascade recycling amplification for label-free detection of microRNA and molecular logic operations | |
| Komiya et al. | Leak-free million-fold DNA amplification with locked nucleic acid and targeted hybridization in one pot | |
| CN117037925A (zh) | 一种基于可移动toehold的低泄漏自组装方法 | |
| CN103917660B (zh) | 通过pcr检测微生物dna的方法、系统及组合物 | |
| Peng et al. | Hairpin loop-enhanced fluorescent copper nanoclusters and application in S1 nuclease detection | |
| Wang et al. | Controllable DNA strand displacement by independent metal–ligand complexation | |
| CN110506114B (zh) | Pcr引物对及其应用 | |
| Wang et al. | DNA photonic nanowires with tunable FRET signals on the basis of toehold-mediated DNA strand displacement reactions | |
| CN112251496A (zh) | 一种指数扩增反应触发3-D双腿DNA步行器的microRNA生物传感器 | |
| CN113862337B (zh) | 一种基于冻融循环提高dna链置换反应速率的调控方法 | |
| Zhang et al. | Polar organic solvents accelerate the rate of DNA strand replacement reaction | |
| WO2021231687A1 (en) | Quadruplex-based detection of a target nucleic acid | |
| CN112063696B (zh) | 基于核酸自我催化的逻辑环路及其应用 | |
| Xing et al. | Engineering high-performance hairpin stacking circuits for logic gate operation and highly sensitive biosensing assay of microRNA | |
| CN111445951A (zh) | 一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |