CN113136458A - 基于双立足点介导的链置换反应检测hbv的荧光传感器及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于双立足点介导的链置换反应检测HBV的荧光传感器及其制备与应用，基于靶物质触发的双立足点介导的链置换反应(DTSDR)体系构建而成，所述体系包括底物复合物、燃料链FS和靶物质T链，底物复合物包括底物链ST、辅助链AS‑FAM和封闭链BK‑BHQ1；其中，靶物质与底物复合物结合，通过DTSDR取代AS和BK，暴露出FS可识别的中间立足点；FS与暴露的中间立足点杂交置换出靶物质；置换出的靶物质结合其他底物复合物触发下一个循环反应，从而产生大量荧光信号，通过检测荧光信号即可获知靶物质含量，实现HBV的检测。本发明的传感器具有无酶、特异性好、灵敏度高、检测速度快的优点，适用于现场即时检测。

Description

基于双立足点介导的链置换反应检测HBV的荧光传感器及其 制备与应用

技术领域

本发明涉及乙肝病毒检测技术领域，特别是涉及一种基于双立足点介导的链置换反应检测HBV的荧光传感器及其制备与应用。

背景技术

尽管具备有效的疫苗和抗病毒治疗，乙型肝炎病毒感染(HBV)仍然是世界范围内的主要健康问题。并且，持续感染HBV会极大增加肝硬化和肝细胞癌(HCC)的风险。虽然随着医疗状况的改善，HBV在几个高流行国家的流行率有所下降，但全世界已有约2亿人被感染，2.57亿人是携带者。此外，全球疾病负担(GBD)表明HBV的死亡率很高。由于许多人已经感染HBV，检测HBV对于疾病的临床诊断、预防和治疗是极其必要的。

目前，酶联免疫吸附试验仍是医院HBV感染的主要检测方法。此方法集中于酶标记抗体，以放大来自外周血的循环乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)的输出信号，从而在体外检测HBV感染。一般来说，乙肝表面抗原的检测通常在HBV感染后6～8周。但是，乙肝表面抗原在某些临床病例中不表达或难以检测。例如，隐匿性HBV感染是乙型肝炎表面抗原不表达的HBV感染的一种临床形式。在这种情况下，HBV感染的诊断失败可能导致肝硬化、HCC病，甚至死亡。此外，酶联免疫吸附试验还存在一些缺点，如操作复杂、重复性和灵敏度差(0.5ng/mL)、耗时，抗体要求和酶标记等。更糟糕的是，用酶联免疫吸附法筛选HBV既不能有效地反映血清病毒载量，也不能监测肝炎活动。HBV相关基因是HBV感染诊断及其进展的可靠生物标志物，通过强大的核酸扩增技术，血清中的核酸可以从几个拷贝/毫升到超过109个拷贝/毫升不等。综上所述，有必要建立一种高敏感，无标记的检测方法来检测HBV相关的特异性DNA。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于双立足点介导的链置换反应检测HBV的荧光传感器及其制备与应用，通过构建双立足点介导的链置换反应(DTSDR)输出与靶物质相关的荧光信号，从而实现对靶物质的快速、无酶、灵敏和特异检测。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基于双立足点介导的链置换反应检测乙型肝炎病毒(HBV)的荧光传感器，基于靶物质触发的双立足点介导的链置换反应(DTSDR)体系构建而成，所述链置换反应体系包括底物复合物、燃料链FS和靶物质T链，所述底物复合物包括底物链ST、带有荧光报告基团的辅助链AS和带有荧光淬灭集团的封闭链BK，将所述底物复合物加入到荧光传感系统中，靶物质可与底物复合物的ST链两端的双立足点结合，并通过立足点介导的链置换反应取代辅助链AS和封闭链BK，暴露出燃料链FS可识别的ST链中间的立足点区域；燃料链FS与暴露的中间立足点区域杂交置换出靶物质T链；置换出的靶物质结合其他底物复合物，触发下一个循环反应，从而产生大量的荧光信号，通过检测荧光信号即可获知靶物质的含量，实现HBV的检测。

进一步，所述底物复合物由底物链ST、辅助链AS-FAM和封闭链BK-BHQ1这三条链通过变性退火组装而成。

进一步，所述底物链ST的核苷酸序列为：

5′-TT TTT TAC CGT CCC CAA GAA GAT CTG CCG T-3′(SEQ ID NO.1)。

进一步，所述辅助链AS中间的T碱基上修饰有荧光报告基团FAM，其核苷酸序列为：

5′-TTG GGG ACG/i6FAMdT/TT TTT-3′(SEQ ID NO.2)。

进一步，所述封闭链BK的5′端带有荧光淬灭基团BHQ1，其核苷酸序列为：

5′-BHQ1-GCA GAT CTT C-3′(SEQ ID NO.3)。

进一步，所述燃料链FS的核苷酸序列为：

5′-TT TTT TTG GGG ACG GCA GAT CTT C-3′(SEQ ID NO.4)。

进一步，所述靶物质T链的核苷酸序列为：

5′-ACG GCAGAT GAAGAAGGG GAC GGTA-3′(SEQ ID NO.5)。

本发明第二方面提供一种如第一方面所述的荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备底物复合物：采用底物链ST、辅助链AS和封闭链BK，经变性退火制备三链产物底物复合物；

(2)取步骤(1)所得三链产物底物复合物，将其与燃料链FS、靶物质T链混合，孵育，构建链置换反应(DTSDR)体系。

进一步，所述步骤(1)中，底物链ST、辅助链AS和封闭链BK的摩尔比为1∶1∶1。

进一步，所述步骤(1)中，将底物链ST、辅助链AS和封闭链BK分别溶解于TE缓冲液中，再混合于STE-Mg²⁺缓冲液中进行变性退火，所述TE缓冲液包括：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0mM EDTA(pH8.0)，所述STE-Mg²⁺缓冲液包括：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0mM EDTA(pH8.0)，150mM NaCl，12.5mM MgCl₂。

进一步，所述步骤(1)中，变性温度为90-100℃，优选为95℃；变性时间为5-10min，优选为5min。

进一步，所述步骤(2)中，将底物复合物、燃料链FS、靶物质T链溶解于STE-Mg²⁺缓冲溶液中，进行置换反应，所述STE-Mg²⁺缓冲液包括：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0mMEDTA(pH8.0)，150mM NaCl，12.5mM MgCl₂。

进一步，所述步骤(2)中，孵育温度为37℃，孵育时间为60-90min，优选为60min。

本发明第三方面提供一种基于双立足点介导的链置换反应检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法，采用第一方面所述的荧光传感器和/或根据第二方面所述的方法制备得到的荧光传感器。

进一步，所述方法包括以下步骤：

(1)荧光比色皿清洗：将荧光比色皿用酒精浸泡，并用ddH₂O清洗；

(2)设置参数：设置激发波长为490nm，发射波长范围为500-600nm，电压为600V；

(3)调零：向荧光比色皿中加入ddH₂O，进行调零；

(4)进行检测：将链置换反应体系加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。

可选地，所述荧光比色皿为石英比色皿。

如上所述，本发明的基于双立足点介导的链置换反应检测HBV的荧光传感器及其制备与应用，具有以下有益效果：

本发明构建了一种可用于检测乙型肝炎病毒(HBV)相关基因的荧光传感器，，通过双立足点介导的链置换反应输出与靶物质相关的荧光信号，实现靶物质的快速、无酶和特异性检测，并通过双立足点介导的链置换反应的信号放大作用，提高对靶物质检测的灵敏度。

本发明的优势在于：(1)高保真度识别，利用碱基互补配对原理特异性识别，可确保检测具有高特异性的目标；(2)高灵敏度，双立足点介导的链置换反应具有更高的链迁移速率，并且可以循环利用靶物质，提高了检测的灵敏度；(3)等温反应，适用于现场即时检测；(4)避免了任何用于靶循环扩增的酶的参与，并且具有降低背景噪声的特性。

附图说明

图1显示为本发明的荧光传感器的检测原理图。

图2显示为本发明实施例2中验证荧光传感器可行性的电泳结果图。

图3显示为本发明实施例2中验证荧光传感器的荧光信号对比图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

DNA纳米机器的原理遵循一个简单的规则，即核酸的特定碱基互补配对。因此，两个主要驱动因素决定了所有常见的基于DNA的纳米结构的动力学：(i)基于DNA的纳米结构(例如杂交，脚趾介导的链置换等)，以及(ii)化学/物理触发因素(例如由于以下原因引起的构象变化，盐，pH，适体，温度，光照等)。其中，链置换反应是非常适用于传感检测信号放大的反应。立足点介导的DNA链置换反应(TSDR)是一种竞争性的加速杂交反应，在该反应中，启动子ssDNA(输入)通过与另一DNA暴露的立足点区域结合来取代其补体链中原来结合的单链，这将导致分支迁移，并最终将原来结合的单链从部分互补双链中释放出来。碱基配对的普遍性、简单性和特异性使TSDR机制成为生物传感领域工作的分子机器的首选。该方法避免了任何用于靶循环扩增的酶的参与，并且具有降低背景噪声的特性。

本方案创新地提出了一种乙型肝炎病毒(HBV)相关基因响应的新型链置换反应生物传感器，通过构建双立足点介导的链置换反应输出与靶物质相关的荧光信号，从而实现对靶物质的快速，无酶，灵敏和特异检测。

本方案主要有以下几点优势：(1)高保真度识别，利用碱基互补配对原理特异性识别，可确保检测具有高特异性的目标；(2)高灵敏度，双立足点介导的链置换反应具有更高的链迁移速率，并且可以循环利用靶物质，提高了检测的灵敏度；(3)等温反应，适用于现场即时检测；(4)避免了任何用于靶循环扩增的酶的参与，并且具有降低背景噪声的特性。

本发明的具体实施过程如下：

实施例1

制备荧光传感器并检测乙型肝炎病毒(HBV)相关基因

1、材料

HPLC纯化的寡核苷酸由上海生工合成。DNA杂交缓冲液(pH7.4)包含10mM Tris-HCl，1.0mM EDTA，150mM NaCl和10mM MgCl2。实验中使用的去离子水由Millipore净水系统(≥18MΩcm，Milli-Q，Millipore)制备。

2、检测仪器

Cary Eclipse荧光分光光度计为安捷伦公司产品。

3、检测原理

如图1所示，本发明的荧光传感器基于靶物质触发的双立足点介导的链置换反应(DTSDR)体系构建而成，所述链置换反应体系包括底物复合物、燃料链FS和靶物质T链，底物复合物由底物链ST、辅助链AS-FAM和封闭链BK-BHQ1，将所述底物复合物加入到荧光传感系统中，靶物质可与底物复合物的ST链两端的双立足点结合，并通过立足点介导的链置换反应取代辅助链AS-FAM和封闭链BK-BHQ1，暴露出燃料链FS可识别的ST链中间的立足点区域；燃料链FS与暴露的中间立足点区域杂交置换出目标链，即靶物质T链；置换出的靶物质结合其他底物复合物，触发下一个循环反应，从而产生大量的荧光信号，通过检测荧光信号即可获知靶物质的含量，实现HBV的检测。

底物链ST的核苷酸序列为：

5′-TT TTT TAC CGT CCC CAA GAA GAT CTG CCG T-3′(SEQ ID NO.1)。

辅助链AS-FAM的核苷酸序列为：

5′-TTG GGG ACG/i6FAMdT/TT TTT-3′(SEQ ID NO.2)。

封闭链BK-BHQ1的核苷酸序列为：

5′-BHQ1-GCA GAT CTT C-3′(SEQ ID NO.3)。

燃料链FS的核苷酸序列为：

5′-TT TTT TTG GGG ACG GCA GAT CTT C-3′(SEQ ID NO.4)。

靶物质T链的核苷酸序列为：

5′-ACG GCAGAT GAAGAAGGG GAC GGTA-3′(SEQ ID NO.5)。

4、构建双立足点介导的链置换反应(DTSDR)：

(1)制备底物复合物：将底物链(ST)、辅助链(AS-FAM)和封闭链(BK-BHQ1)先分别溶解于TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0mM EDTA(pH8.0))中，再以1∶1∶1的摩尔比混合于STE-Mg²⁺缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0mM EDTA(pH8.0)，150mMNaCl，12.5mMMgCl₂)中，在95℃条件下变性5分钟，缓慢退火至室温，获得终浓度为2M的底物复合物。

将所得底物复合物放置4℃备用。

(2)构建DTSDR反应体系：将待测靶物质T链、底物复合物和燃料链FS共同溶解于STE-Mg²⁺缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0mM EDTA(pH8.0)，150mM NaC1，12.5mMMgCl₂)，在37℃条件下进行60min置换反应。

(3)检测荧光信号：将上述反应产物加入石英比色皿中，利用荧光分光光度计进行测量，具体包括以下步骤：

(1)石英比色皿清洗：将石英比色皿用酒精浸泡，并用ddH₂O清洗；

(2)设置参数：设置激发波长为490nm，发射波长范围为500-600nm，电压为600V；

(3)调零：向石英比色皿中加入ddH₂O，进行调零；

(4)进行检测：将反应液加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。

实施例2

验证检测miRNA荧光传感器的可行性

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳

对实施例1中整体检测过程用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证，结果如图2所示，从左至右依次为泳道1至8，其中，泳道1为20bp DNAMarker；泳道2为由ST+AS+BK反应所得的底物复合物；泳道3为ST+AS+BK+FS；泳道4为ST+AS+BK+Target；泳道5为ST+Target；泳道6为ST+Target+FS；泳道7为靶物质、底物复合物和FS链反应的产物；泳道8为20bpDNA Marker。

由图2可知，泳道2所形成的单一条带表明底物复合物的成功构建。泳道3表明燃料链FS不能直接置换AS和BK链。泳道4、5表明靶物质成功将两条AS和BK链置换下来。泳道6显示在FS链的辅助下能够形成新的双链DNA，并促进靶物质的循环。泳道7表示加入所有反应物后，整个传感器顺利进行。

2、荧光检测

对含靶物质和不含靶物质的DTSDR反应体系进行荧光响应检测，结果如图3所示，其中，红色曲线为实验组，黑色曲线为缺乏靶物质的对照组；

由图3可知，在有靶物质(红色曲线b)和无靶物质(黑色曲线a)的情况下，荧光信号有明显差异，表明该本发明的略用于靶物质检测是可行的。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学

<120> 基于双立足点介导的链置换反应检测HBV的荧光传感器及其制备与应用

<130> PCQYK2110477-HZ

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ST

<400> 1

ttttttaccg tccccaagaa gatctgccgt 30

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AS

<400> 2

ttggggacgt ttttt 15

<210> 3

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> BK

<400> 3

gcagatcttc 10

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> FS

<400> 4

tttttttggg gacggcagat cttc 24

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 靶物质T链

<400> 5

acggcagatg aagaagggga cggta 25

Claims (10)

1.一种基于双立足点介导的链置换反应检测乙型肝炎病毒HBV的荧光传感器，其特征在于，基于靶物质触发的双立足点介导的链置换反应体系构建而成，所述链置换反应体系包括底物复合物、燃料链FS和靶物质T链，所述底物复合物包括底物链ST、带有荧光报告基团的辅助链AS和带有荧光淬灭集团的封闭链BK，将所述底物复合物加入到荧光传感系统中，靶物质可与底物复合物的双立足点结合，并通过立足点介导的链置换反应取代辅助链AS和封闭链BK，暴露出燃料链FS可识别的中间立足点区域；燃料链FS与暴露的中间立足点区域杂交置换出靶物质T链；置换出的靶物质结合其他底物复合物，触发下一个循环反应，从而产生大量的荧光信号，通过检测荧光信号即可获知靶物质的含量，实现HBV的检测。

2.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于：所述底物链ST的核苷酸序列为：

5′-TT TTT TAC CGT CCC CAA GAA GAT CTG CCG T-3′(SEQ ID NO.1)；

所述辅助链AS的核苷酸序列为：

5′-TTG GGG ACG/i6FAMdT/TT TTT-3′(SEQ ID NO.2)；

所述封闭链BK的5′端带有荧光淬灭基团BHQ1，其核苷酸序列为：

5′-BHQ1-GCA GAT CTT C-3′(SEQ ID NO.3)；

所述燃料链FS的核苷酸序列为：

5′-TT TTT TTG GGG ACG GCA GAT CTT C-3′(SEQ ID NO.4)；

所述靶物质T链的核苷酸序列为：

5′-ACG GCAGAT GAAGAAGGG GAC GGTA-3′(SEQ ID NO.5)。

3.根据权利要求1-2任一项所述的荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备底物复合物：采用底物链ST、辅助链AS和封闭链BK，经变性退火制备三链产物底物复合物；

(2)取步骤(1)所得三链产物底物复合物，将其与燃料链FS、靶物质T链混合，孵育，构建链置换反应体系。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，底物链ST、辅助链AS和封闭链BK的摩尔比为1∶1∶1。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，将底物链ST、辅助链AS和封闭链BK分别溶解于TE缓冲液中，再混合于STE-Mg²⁺缓冲液中进行变性退火，所述TE缓冲液包括：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0mM EDTA(pH8.0)，所述STE-Mg²⁺缓冲液包括：10mMTris-HCl(pH8.0)，1.0mM EDTA(pH8.0)，150mM NaCl，12.5mM MgCl₂。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，变性温度为90-100℃，变性时间为5-10min。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将底物复合物、燃料链FS、靶物质T链溶解于STE-Mg²⁺缓冲溶液中，进行置换反应，所述STE-Mg²⁺缓冲液包括：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0mM EDTA(pH8.0)，150mM NaCl，12.5mM MgCl₂。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，孵育温度为37℃，孵育时间为60-90min。

9.一种基于双立足点介导的链置换反应检测乙型肝炎病毒HBV的方法，采用权利要求1-2任一项所述的荧光传感器和/或根据权利要求3-8任一项所述的方法制备得到的荧光传感器。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)荧光比色皿清洗：将荧光比色皿用酒精浸泡，并用ddH₂O清洗；

(2)设置参数：设置激发波长为490m，发射波长范围为500-600nm，电压为600V；

(3)调零：向荧光比色皿中加入ddH₂O，进行调零；

(4)进行检测：将链置换反应体系加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。

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