JP2022514629A - イリノテカンに対するアプタマー - Google Patents
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Abstract
本発明は、特に、イリノテカンに特異的に結合するアプタマー及びその使用の方法に関する。
Description
本発明の実施形態は、イリノテカンに特異的に結合するアプタマー及びそれを使用する方法に関する。例えば、本発明のある特定の実施形態は、本明細書に記載のアプタマーを使用して、試料中のイリノテカンの存在、非存在又は量を検出する方法に関する。本発明のある特定の実施形態は、本明細書に記載のアプタマーを使用して、イリノテカン治療を受けている患者から得られた試料をモニタリングする方法に関する。
イリノテカン（7-エチル-10[4-(1-ピペリジノ)-1-ピペリジノ]カルボニルオキシカンプトテシン、CPT-11）は、DNAトポイソメラーゼIを阻害する、合成的にデザインされたカンプトテシンのアナログである。イリノテカンは、カルボキシルエステラーゼ転換酵素によって、生物学的に活性な代謝産物7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)に転換される。SN-38は、トポイソメラーゼIの活性を阻害し、結果としてDNA複製及び転写の阻害をもたらす。
イリノテカンは、がん、特に結腸がん、膵臓がん、及び肺がんを治療するために使用される。例えば、イリノテカンは、遠隔転移を有する大腸がんの治療における第一選択治療として使用される（例えば、5-フルオロウラシル及びロイコボリンとともに投与される場合）。イリノテカンはまた、進展型小細胞肺がんの治療に関して、シスプラチンと組合せて使用することができる。
イリノテカン治療は、用量制限毒性及び個人間の薬物動態の大きなばらつきによって、特徴づけられる。例えば、イリノテカンは、副作用、例えば、重度の下痢及び免疫系の極度の抑制をもたらし得る。薬物の治療レベルをモニタリングすること（及び必要とされる標的レベルに調整すること）は、対象において、毒性を最小化し及び腫瘍応答の可能性を最大化するのに有用である。
イリノテカンは低分子量薬(C33H38N4O6、平均分子量586.678Da)であり、このことは、この標的に対するイムノアッセイを開発する努力の妨げとなる。例えば、小分子は、多くの親和性試薬にとって非常に不良な標的になる。典型的には、小分子は、官能基が非常に少数であることを特徴とし、したがって、親和性試薬がそのような基質に特異的に結合するのは困難である。更に、小分子は、毒性問題及び/又は免疫原性の欠如を有しうる。
これらの問題にもかかわらず、密接に関連する化合物又は薬物代謝産物との交差反応性がない、アッセイプラットフォームに適合させるのがより単純で、より簡単であり、生産がより確実であり、一対の親和性リガンドに依存せず、シグナルゲイン読取り情報を与える一方で、イリノテカン及びその薬理学的に活性な塩に特異的に結合することができる薬剤を開発する必要が依然としてある。例えば、生物学的に活性な代謝産物SN-38への交差反応なしに、イリノテカン及びその薬学的に活性な塩に特異的に結合することができる薬剤を開発する必要が依然としてある。イリノテカン治療を受けている患者から得られる試料中のイリノテカン及び/又はSN-38を定量することができる薬剤を開発する必要が依然としてある。
がん患者の血清におけるイリノテカンレベルは、質量分析を伴う又は伴わないHPLC等のクロマトグラフィー技術を使用して評価されてきた(Chen, X. et al, J Pharm Biomed Anal. 2012 Mar 25; 62: 140-148)。しかしながら、そのような技術は、費用がかかり、時間がかかり、専門研究所、高価な設備、生物学的材料、溶媒及び他の材料の大量使用を必要とする。
イリノテカンの場合、抗体ベース試験が開発されているが、これらは全て、小分子標的イムノアッセイに伴う同じ限界を有し、これらは一対の抗体(単離するのが難しく、生産するのに費用がかかりうる)を利用し、及び/又は「シグナルロス」アウトプットを使用する競合アッセイフォーマットを利用する。この性質の競合アッセイは、バックグラウンドシグナルが高く、感度が不足しやすいことが公知である。従来のイムノアッセイのこれらの限界に伴い、代替的なアッセイフォーマットが必要とされている。
Chen, X. et al, J Pharm Biomed Anal. 2012 Mar 25; 62: 140-148
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本発明の一部の実施形態の目的は、抗体ベース試験と比較して、迅速であり、生産がより確実であり、シグナルゲイン読取り情報をもたらす検出物質を開発することによって、先行技術において特定された問題の一部を少なくとも部分的に軽減することである。
本発明は、イリノテカン結合アプタマー及びそれを使用する方法の開発に関する。本明細書に記載のアプタマーは、効果的に働き、単純なシグナルゲインアッセイフォーマットを使用して試料中のイリノテカンの存在、非存在又は量を試験する単純な手段を提供することが示されている。特に、本明細書に記載のアプタマーは高い親和性でイリノテカンに結合することができる。有利なことには、本明細書に記載のアプタマーは、臨床範囲の活性イリノテカン(例えば、約10ng/mlから約10,000ng/mlの間)及び／又はSN-38(例えば、約0.1ng/mlから約100ng/mlの間)が生体液中で検出されることを可能にする。
したがって、本発明のある特定の態様は特に、
- イリノテカンに特異的に結合することができるアプタマーであって、
(a)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つの少なくとも約30連続ヌクレオチドを有する核酸配列;又は
(d)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約30連続ヌクレオチドを有する核酸配列
を含む又はそれからなるアプタマー;
- イリノテカンへの結合について本明細書に記載のアプタマーと競合するアプタマー;
- 本明細書に記載の任意のアプタマー及び検出可能な分子を含む複合体;
- 本明細書に記載の任意のアプタマーを含むバイオセンサー又は試験ストリップ;
- 試料中のイリノテカンの存在、非存在又はレベルを検出するための装置であって、
(i)支持体;及び
(ii)本明細書に記載の任意のアプタマー
を含む装置;
- イリノテカンを検出、濃縮、分離及び/又は単離するための、本明細書に記載の任意のアプタマー、複合体、バイオセンサー、又は試験ストリップの使用;
- 試料中のイリノテカンの存在、非存在又は量を検出する方法であって、
(i)試料を本明細書に記載の任意のアプタマーと相互作用させる工程;及び
(ii)イリノテカンの存在、非存在又は量を検出する工程
を含む方法;
- 試料中のSN-38の存在、非存在又は量を検出する方法であって、
(a)試料を本明細書に記載の第一のアプタマー（例えば、CP-13アプタマー）と相互作用させ、イリノテカンの量を検出する工程;
(b) 試料を本明細書に記載の第二のアプタマー（例えば、CP-11アプタマー）と相互作用させ、イリノテカン及びSN-38の量を検出する工程;並びに
(c)(a)及び(b)で検出された量を比較して、試料中のSN-38の存在、非存在又は量を決定する工程
を含む方法;
- 対象においてがんを治療又は防止する方法であって、
(i)初回用量のイリノテカンを対象に投与する工程;
(ii)対象から得られた試料中のイリノテカン及び／又はSN-38の量を本明細書に記載の任意の方法に従って検出する工程;並びに
(iii)(a)イリノテカン及び／又はSN-38のレベルが下方閾値レベル未満である場合、増加用量のイリノテカンを対象に投与し;
(b) イリノテカン及び／又はSN-38のレベルが上方閾値レベルを超える場合、減少用量のイリノテカンを対象に投与する工程
を含む方法;
- イリノテカンを検出及び/又は定量化するためのキットであって、本明細書に記載の任意のアプタマーを含むキット
を提供する。
- イリノテカンに特異的に結合することができるアプタマーであって、
(a)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つの少なくとも約30連続ヌクレオチドを有する核酸配列;又は
(d)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約30連続ヌクレオチドを有する核酸配列
を含む又はそれからなるアプタマー;
- イリノテカンへの結合について本明細書に記載のアプタマーと競合するアプタマー;
- 本明細書に記載の任意のアプタマー及び検出可能な分子を含む複合体;
- 本明細書に記載の任意のアプタマーを含むバイオセンサー又は試験ストリップ;
- 試料中のイリノテカンの存在、非存在又はレベルを検出するための装置であって、
(i)支持体;及び
(ii)本明細書に記載の任意のアプタマー
を含む装置;
- イリノテカンを検出、濃縮、分離及び/又は単離するための、本明細書に記載の任意のアプタマー、複合体、バイオセンサー、又は試験ストリップの使用;
- 試料中のイリノテカンの存在、非存在又は量を検出する方法であって、
(i)試料を本明細書に記載の任意のアプタマーと相互作用させる工程;及び
(ii)イリノテカンの存在、非存在又は量を検出する工程
を含む方法;
- 試料中のSN-38の存在、非存在又は量を検出する方法であって、
(a)試料を本明細書に記載の第一のアプタマー（例えば、CP-13アプタマー）と相互作用させ、イリノテカンの量を検出する工程;
(b) 試料を本明細書に記載の第二のアプタマー（例えば、CP-11アプタマー）と相互作用させ、イリノテカン及びSN-38の量を検出する工程;並びに
(c)(a)及び(b)で検出された量を比較して、試料中のSN-38の存在、非存在又は量を決定する工程
を含む方法;
- 対象においてがんを治療又は防止する方法であって、
(i)初回用量のイリノテカンを対象に投与する工程;
(ii)対象から得られた試料中のイリノテカン及び／又はSN-38の量を本明細書に記載の任意の方法に従って検出する工程;並びに
(iii)(a)イリノテカン及び／又はSN-38のレベルが下方閾値レベル未満である場合、増加用量のイリノテカンを対象に投与し;
(b) イリノテカン及び／又はSN-38のレベルが上方閾値レベルを超える場合、減少用量のイリノテカンを対象に投与する工程
を含む方法;
- イリノテカンを検出及び/又は定量化するためのキットであって、本明細書に記載の任意のアプタマーを含むキット
を提供する。
本発明のある特定の実施形態は、添付の図を参照して、下により詳細に記載される。
配列表
配列番号1は、アプタマーCP13の第一のランダム化領域(R1)を示す
GAGAGGATTT
配列番号1は、アプタマーCP13の第一のランダム化領域(R1)を示す
GAGAGGATTT
配列番号2は、アプタマーCP13の第二のランダム化領域(R2)を示す
CGCTGTAAGGCTCGGGTATGAGAGTGTGGAGGCCAGAGGC
CGCTGTAAGGCTCGGGTATGAGAGTGTGGAGGCCAGAGGC
配列番号3は、アプタマーCP13の最良の性能の最小有効核酸断片(F4c)を示す
配列番号4は、全長CP13と比較してイリノテカンへの結合が向上したアプタマーCP13の核酸断片(F4)を示す
配列番号5は、全長CP13と比較してイリノテカンへの結合が向上したアプタマーCP13の核酸断片(F4e)を示す
配列番号6は、全長CP13と比較してイリノテカンへの結合が向上したアプタマーCP13の核酸断片(F5)を示す
配列番号7は、アプタマーCP13の全長核酸配列を示す
配列番号8は、アプタマーCP11の第一のランダム化領域(R1)を示す
TGGTCTTTAGA
TGGTCTTTAGA
配列番号9は、アプタマーCP11の第二のランダム化領域(R2)を示す
CGCTGTAAGGCTCGGGTATGAGAGTGTGGAGGCCAGAGGC
CGCTGTAAGGCTCGGGTATGAGAGTGTGGAGGCCAGAGGC
配列番号10は、アプタマーCP11の最良の性能の最小有効核酸断片(F3e)を示す
配列番号11は、全長CP11と比較してイリノテカンへの結合が向上したアプタマーCP11の核酸断片(F3)を示す
配列番号12は、アプタマーCP11の全長核酸配列を示す
配列番号13は、例示的な固定化領域(I)を示す
TGAGGCTCGATC
TGAGGCTCGATC
配列番号14は、例示的な第一のプライマー領域(P1)を示す
ATCCACGCTCTTTTTCTCC
ATCCACGCTCTTTTTCTCC
配列番号15は、例示的な第二のプライマー領域(P2)を示す
GCATTGAGGGTGACATAGG
GCATTGAGGGTGACATAGG
配列番号16は、例示的な固定化配列を示す
GATCGAGCCTCA
GATCGAGCCTCA
配列番号17は、例示的なリバースの第二のプライマー領域(P2)を示す
CCTATGTCACCCTCAATGC
CCTATGTCACCCTCAATGC
下で更に説明される通り、任意の下線が引かれた配列は第1(P1)及び第2(P2)のプライマー部位を指し、任意のイタリック体の配列はアプタマーの固定化領域(即ち、固定化配列の少なくとも一部に結合することができるアプタマーの核酸配列)を指す。R1及びR2は、それぞれ第1及び第2のランダム化領域を指す。
本発明のある特定の実施形態の更なる特徴は下に記載される。本発明の実施形態の実践は、特に指示されていない限り、当業者の技能の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学の従来技術を使用する。
最も一般的な分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学的技術はSambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual (2001) Cold Harbor-Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.又はAusubelら、Current protocols in molecular biology (1990) John Wiley and Sons、N.Y.に見出すことができる。特に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology、Juo、 Pei-Show、第2版、2002、CRC Press;The Dictionary of Cell and Molecular Biology、第3版、Academic Press;及びOxford University Pressは当業者に、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を提供する。
単位、接頭語及び記号は、それらの国際単位系(SI)承認形態で示される。数値範囲は範囲を定義する数字を含む。特に指示されていない限り、アミノ酸配列はアミノ基からカルボキシ基の方向で左から右に書かれ、核酸配列は5'から3'の方向で左から右に書かれる。
以下において、本発明は特定の実施形態の非限定的な例によってより詳細に説明される。例示的な実験において、汚染のない標準の試薬及び緩衝液が使用される。
イリノテカン
本発明は、イリノテカンに特異的に結合することができるアプタマーを提供する。
本発明は、イリノテカンに特異的に結合することができるアプタマーを提供する。
イリノテカンは、以下の構造
を有する。
イリノテカン及びその薬学的に許容される塩（例えば、イリノテカン塩酸塩）は、がんを治療するために使用される。例えば、イリノテカンは、多くの固形がんにおける抗がん活性を実証し、近年、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がんで広く使用されている。
イリノテカン及びその薬学的に許容される塩は、活性なSN-38及びその薬学的に許容される塩を投与するためのプロドラッグである。SN-38は、構造：
を有する。
SN-38は、イリノテカンよりも100から1000倍、より細胞毒性がある。イリノテカンから活性代謝産物SN-38への代謝的変換は、カルボキシルエステラーゼ酵素によって媒介され、肝臓で主に起きる。SN-38は、その後、酵素UDP-グルクロン酸転移酵素1A1 (UGT1A1)によって大部分がコンジュゲートされ、グルクロニド代謝産物を形成する。
本明細書で使用される用語「イリノテカン」は、イリノテカン及び／又はイリノテカン塩酸塩を含む任意のその薬学的に活性な塩を含むと理解される。
ある特定の実施形態において、本発明のアプタマーは、イリノテカン及び／又はその薬学的に活性な塩に特異的に結合する。ある特定の実施形態において、本発明のアプタマーは、イリノテカン塩酸塩に特異的に結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書のアプタマーは、イリノテカン及び／又はその薬学的に活性な塩に特異的に結合するが、SN-38には結合しない又はほんの低い親和性で結合する。
ある特定の実施形態において、本発明のアプタマーは、イリノテカン塩酸塩に特異的に結合するが、SN-38には結合しない又はほんの低い親和性で結合する。
ある特定の実施形態において、本発明のアプタマーは、イリノテカン及び／又はその薬学的に活性な塩に特異的に結合し、SN-38にも特異的に結合する。
ある特定の実施形態において、本発明のアプタマーは、イリノテカン塩酸塩に特異的に結合し、SN-38にも特異的に結合する。
イリノテカンに「特異的に」結合するアプタマーは、イリノテカン及び／又は薬学的に活性な塩に選択的に又は高い親和性で結合するが、その他の機能的及び構造的に関連する小分子（例えば、イマチニブ）には結合しない又はほんの低い親和性で結合するアプタマーである。例えば、アプタマーは、その他の機能的及び構造的に関連する小分子（例えば、イマチニブ）に実質的な交差反応なく、イリノテカンに結合することができる。
ある特定の実施形態において、約1μM未満、約500nM未満、約400nM未満、約300nM未満、約200nM未満、約100nM未満、約90nM未満、約80nM未満、約70nM未満、約60nM未満、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約1nM未満又はそれ以下の結合解離平衡定数(KD)で結合する場合、アプタマーは選択的又は高親和性で結合する。アプタマーの結合親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴(SRP)、バイオレイヤー干渉法(BLI)、ディスプレイスメントアッセイ及び/又は定常状態分析を含む、当業者に公知の任意の方法によって測定することができる。
ある特定の実施形態において、本発明のアプタマーは、イリノテカン及び／又はその薬学的に活性な塩に特異的に結合し、SN-38には結合しない又はほんの低い親和性で結合する。結合しない又はほんの低い親和性で結合するアプタマーは、SN-38への実質的な交差反応なしに、イリノテカン及び／又はその薬学的に活性な塩に結合することができる。
ある特定の実施形態において、アプタマーが、約1μMを超える、約2μMを超える、約 3μMを超える、約4μMを超える、約5μM超える、約10μMを超える、又はそれ以上の結合解離平衡定数(KD)で結合する場合、アプタマーは、低い親和性で結合する。アプタマーの結合親和性は、例えば、本明細書に記載される技術を使用して測定することができる。
ある特定の実施形態において、アプタマー（例えば、CP11又はその断片）は、イリノテカン及びSN-38に特異的に結合する。例えば、約1μM未満、約500nM未満、約400nM未満、約300nM未満、約200nM未満、約160nM未満、約100nM未満、約90nM未満、約80nM未満、約70nM未満、約60nM未満、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約1nM未満、又はそれ以下のKDでイリノテカンに結合することができる。アプタマーはまた、約1μM未満、約500nM未満、約400nM未満、約300nM未満、約200nM未満、約100nM未満、約90nM未満、約80nM未満、約70nM未満、約60nM未満、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約1nM未満、又はそれ以下のKDでSN-38に結合することもできる。そのような実施形態では、アプタマーは、イリノテカン及びSN-38に関して交差反応性である。
ある特定の実施形態において、アプタマー（例えば、CP13又はその断片）は、イリノテカンに特異的に結合するが、SN-38には結合しない又はほんの低い親和性で結合する。例えば、アプタマーは、約1μM未満、約500nM未満、約400nM未満、約300nM未満、約200nM未満、約160nM未満、約100nM未満、約90nM未満、約80nM未満、約70nM未満、約60nM未満、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約1nM未満、又はそれ以下のKDでイリノテカンに結合することができる。アプタマーは、SN-38には結合することができないか、又は約1μMを超える、約2μMを超える、約3μMを超える、約4μMを超える、約5μMを超える、約10μMを超える、又はそれ以上のKDでSN-38に結合することができる。そのような実施形態では、アプタマーは、SN-38への交差反応なしに、イリノテカンに結合することができる。
アプタマー
本明細書に記載のアプタマーは、高い親和性及び特異性でイリノテカンに特異的に結合することができる、DNA、RNA又はその改変物を含む小さい人工親和性リガンドである。
本明細書に記載のアプタマーは、高い親和性及び特異性でイリノテカンに特異的に結合することができる、DNA、RNA又はその改変物を含む小さい人工親和性リガンドである。
本明細書で使用される場合、「アプタマー」、「核酸分子」又は「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、標的分子(即ちイリノテカン)に対して望ましい作用を有する天然に存在しない核酸分子を指す。
本発明のアプタマーはDNAアプタマーであってもよい。例えば、アプタマーは、一本鎖DNA(ssDNA)から形成されてもよい。或いは、本発明のアプタマーはRNAアプタマーであってもよい。例えば、アプタマーは一本鎖RNA(ssRNA)から形成することができる。本発明のアプタマーは、本明細書に記載の改変された核酸を含んでもよい。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、標的結合、分離及び標的結合配列の選択的増幅の反復サイクルを含む、当技術分野で公知のin vitro選択の原理を使用して調製される。
ある特定の実施形態では、アプタマーは、一本鎖DNA又はRNA核酸分子ライブラリー等の核酸分子ライブラリーから選択される。典型的には、アプタマーは、任意の選択されたアプタマーが任意の示されたアッセイフォーマットに変換するための適合をほとんど又は全く必要としないように設計された「ユニバーサルアプタマー選択ライブラリー」から選択される。ある特定の実施形態では、「ユニバーサルアプタマー選択ライブラリー」は以下の機能的な部分:第1のプライマー領域、少なくとも1つの固定化領域、少なくとも1つのランダム化領域及び第2のプライマー領域を含む。
ある特定の実施形態では、アプタマーライブラリーのヌクレオチド配列は、以下の構造(5'から3'方向に):
P1-R1-I-R2-P2
(式中、P1は第1のプライマー領域であり、R1は第1のランダム化領域であり、Iは固定化領域であり、R2は更なるランダム化領域であり、P2は更なるプライマー領域であり、少なくともR1及び/若しくはR2又はその一部は標的分子結合に関与する)を有する。
P1-R1-I-R2-P2
(式中、P1は第1のプライマー領域であり、R1は第1のランダム化領域であり、Iは固定化領域であり、R2は更なるランダム化領域であり、P2は更なるプライマー領域であり、少なくともR1及び/若しくはR2又はその一部は標的分子結合に関与する)を有する。
選択されたら、アプタマーは、例えば、一方若しくは両方のプライマー配列及び/又は標的結合に必要とされないランダム化若しくは固定化領域の部分を除去するために、使用される前に更に改変されてもよい。
典型的には、本発明のアプタマーは固定化領域(即ちドッキング配列)を含む。アプタマーの固定化領域は、「固定化オリゴヌクレオチド」の少なくとも一部にわたってハイブリダイズしうる。典型的には、固定化領域は、固定化オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的である。典型的には、固定化領域は、約10～約20ヌクレオチド長、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20ヌクレオチド長である。
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズ」及び「ハイブリダイゼーション」は、従来のハイブリダイゼーション条件下、好ましくは例えばSambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYに記載のストリンジェントな条件下で、アプタマーライブラリー内の固定の領域と「固定化オリゴヌクレオチド」内の相補的な配列とのワトソン・クリック塩基対合に基づく相互作用を形成することを意味する。
当業者は、例えば、出発ライブラリー及び/又はアプタマー選択プロトコールによって、アプタマーの固定化領域が選択されてもよいことを理解するであろう。様々なコンビナトリアルランダムライブラリーが、商業的供給源から入手可能である。例えば、固定化領域は配列番号13を含み得り、及び/又は固定化オリゴヌクレオチドは配列番号16を含み得る。
典型的には、本発明のアプタマーは、第1のプライマー領域(例えば5'末端に)、第2のプライマー領域(例えば3'末端に)、又はその両方を含む。プライマー領域は、ライブラリー及び選択されたアプタマーのPCR増幅のためのプライマー結合部位として役立ちうる。
当業者は、例えば、出発ライブラリー及び/又はアプタマー選択プロトコールによって、様々なプライマー配列を選択することができることを理解するであろう。例えば、本発明のアプタマーは配列番号14及び/又は15を含んでもよい。
第1のプライマー領域及び/又は第2の領域は、本明細書に記載の検出可能な標識及び/又は標的標識を含んでもよい。例えば、第1及び/又は第2のプライマー領域は蛍光(例えばFAM)標識されてもよい。ある特定の実施形態では、第1及び/又は第2のプライマー領域はリン酸(PO4)標識される。
本発明のアプタマーは、第1のランダム化領域(R1)及び/又は第2のランダム化領域(R2)を有する核酸分子ライブラリーから選択されてもよい。本発明のアプタマーは、R1及び/又はR2の少なくとも一部を含んでもよい。ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号1若しくは配列番号8の少なくとも一部(例えば、少なくとも8連続ヌクレオチド以上)及び/又は配列番号2若しくは配列番号9の少なくとも一部(例えば、少なくとも8連続ヌクレオチド以上)を含む。ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号1又は配列番号8を含む。ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号2又は配列番号9の少なくとも30連続ヌクレオチド以上を含む。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3～7又は10～12(例えば、「CP13」及び/又は「CP11」アプタマーに関連する)のいずれか1つから選択される核酸配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3～7(例えば「CP13」アプタマーに関連する)のいずれか1つから選択される核酸配列を含む又はそれからなる。本明細書に記載されるように、CP13アプタマーは、イリノテカンに特異的に結合することができ、SN-38には結合しない又はほんの低い親和性で結合する。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3～6のいずれか1つを含む又はそれからなる。これらの配列は、全長CP13と比較してイリノテカンへの向上した結合を有することが示されているCP13断片に関する。ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3を含む又はそれからなる。この最小有効断片は、本明細書では、イリノテカンに対する最良の性能のアプタマーとして示される。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号10～12(例えば「CP11」アプタマーに関連する)のいずれか1つから選択される核酸配列を含む又はそれからなる。本明細書に記載されるように、CP11アプタマーは、イリノテカン及びSN-38に特異的に結合することができる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号10又は11から選択される核酸配列を含む又はそれからなる。これらの配列は、全長CP11と比較してイリノテカンへの向上した結合を有することが示されているCP11断片に関する。ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号10を含む又はそれからなる。この最小有効断片は、本明細書では、イリノテカン及びSN-38に特異的に結合することができる最良の性能のアプタマーとして示される。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、CP13アプタマー（例えば、配列番号3～7のいずれか一つ）又はCP11アプタマー（例えば、配列番号10～12のいずれか一つ）を含む又はそれからなる。これらのアプタマー（例えば、本明細書に記載される「第一の」及び「第二の」アプタマー）の組合せは、イリノテカン及び/又はSN-38の存在、非存在又はレベルを試料中で測定することを可能にし得る。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3～7又は10～12のいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の配列同一性を有する核酸配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3～6のいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の配列同一性を有する核酸配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3のヌクレオチド配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の配列同一性を有する核酸配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号10又は11のいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の配列同一性を有する核酸配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号10のいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の配列同一性を有する核酸配列を含む又はそれからなる。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し、最大パーセント配列同一性を達成した後の、前記配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを指す。パーセント核酸配列同一性を決定するための整列は、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、CLUSTALW又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の技能の範囲内である様々な方法で達成することができる。例えば、%核酸配列同一性値は、欧州バイオインフォマティクス研究所ウェブサイト(http://www.ebi.ac.uk)で見出される配列比較コンピュータープログラムを使用して得ることができる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号7(全長CP13)又は配列番号12(全長CP11)の最小有効断片を含む又はそれからなる。本明細書において、「最小有効断片」は、全長アプタマーと比較して同じ、同等な又は向上した親和性でイリノテカンに結合することができる全長アプタマー(例えば、配列番号7又は12)の最小サイズの断片(例えば一部)を意味すると理解される。最小有効断片は、イリノテカンへの結合について全長アプタマー(例えば配列番号7又は配列番号12)と競合しうる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3～7又は10～12のいずれかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の同一性を有する配列の少なくとも約30、35、40、45以上の連続ヌクレオチド（例えば、全長まで）を含む核酸配列を含む又はそれからなる。この文脈において、用語「約」は、典型的には、参照ヌクレオチド配列長プラス又はマイナス参照長の10%を意味する。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3～7のいずれかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の同一性を有する配列の少なくとも約30、35、40、45以上の連続ヌクレオチド（例えば、全長まで）を含む核酸配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3～6のいずれかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の同一性を有する配列の少なくとも約30、35、40、45以上の連続ヌクレオチド（例えば、全長まで）を含む核酸配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の同一性を有する配列の少なくとも約30、35、40、45以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号10～12のいずれかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の同一性を有する配列の少なくとも約30、35、40、45、46、47、48、49、50以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号10又は11のいずれかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の同一性を有する配列の少なくとも約30、35、40、45、46、47、48、49、50以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号10と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上の同一性を有する配列の少なくとも約30、35、40、45、46、47、48、49、50以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む又はそれからなる。
本発明のアプタマーは、天然又は非天然ヌクレオチド及び/又は塩基誘導体(又はそれらの組合せ)を含んでもよい。ある特定の実施形態では、アプタマーは、デオキシリボース、リボース、リン酸、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、又はウラシル(U)以外の化学構造を含むように、1つ又は複数の改変を含む。アプタマーは、核酸塩基、糖又はリン酸骨格において改変されてもよい。
ある特定の実施形態では、アプタマーは1つ又は複数の改変されたヌクレオチドを含む。例示的な改変は、例えば、アルキル化、アリール化又はアセチル化、アルコキシル化、ハロゲン化、アミノ基、又は別の官能基を含むヌクレオチドを含む。改変されたヌクレオチドの例は、RNAアプタマーに使用される、2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-NH2-、2'-OCH3-及び2'-O-メトキシエチルリボヌクレオチドを含む。
本発明のアプタマーは、全体が、又は部分的に、ホスホロチオエート若しくはDNA、ホスホロジチオエート若しくはDNA、ホスホロセレノエート若しくはDNA、ホスホロジセレノエート若しくはDNA、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、N3'-P5'ホスホロアミデートRNA/DNA、シクロヘキセン核酸(CeNA)、トリシクロDNA(tcDNA)又はスピーゲルマー(spiegelmer)、又はホスホロアミデートモルホリン(PMO)成分又は当業者に公知の任意の他の改変(Chanら、Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2006) 33、533～540も参照されたい)であってもよい。
改変の一部はアプタマーが核酸切断酵素に対して安定化されることを可能にする。アプタマーの安定化において、アプタマーのその後の改変と既に改変されたRNA/DNAを用いた選択は一般的に区別されうる。安定化は改変されたRNA/DNAアプタマーの親和性に大きな影響を与えないが、RNase/DNaseによる生体又は生物学的溶液中でのアプタマーの急速な分解を防止する。アプタマーは、試料(例えば生物学的媒体)中の半減期が1分を超える、好ましくは1時間を超える、より好ましくは1日を超える場合、本発明の文脈において安定化されていると称される。アプタマーは、標識されたアプタマーの検出に加えて、安定性の増加にも寄与しうるレポーター分子で改変されてもよい。
アプタマーは、核酸配列に依存する特定の三次元構造の形成によって特徴付けられる。アプタマーの三次元構造は、ワトソン・クリック分子内塩基対合、フーグスティーン塩基対合(四重)、ゆらぎ対形成又は他の非標準的塩基相互作用が原因で生じる。この構造は、アプタマーが、抗原-抗体結合のように、標的構造に正確に結合できるようにする。アプタマーの核酸配列は、定義された条件下では、定義された標的構造に特異的である三次元構造を有しうる。
ある特定の実施形態では、アプタマーは図1に示される二次構造を含む。アプタマーの二次構造分析は、遊離エネルギー最小化アルゴリズムMfoldによって行った(M Zuker.Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.Nucleic Acids Res.31(13)、3406～3415、2003)。ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、配列番号3～7又は10～12のいずれか1つと比較して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上のヌクレオチド変異を含有してもよい。そのような変異が導入されうる位置は、例えば図1に示される二次構造に基づいて決定することができる。
本発明は、イリノテカンへの結合について本明細書に記載のアプタマーと競合するアプタマーも提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イリノテカンへの結合について配列番号3～7又は10～12のいずれか1つに示されるアプタマーと競合するアプタマーを提供する。ある特定の実施形態では、競合アッセイは、イリノテカンへの結合について競合するアプタマーを同定するために使用することができる。例示的な競合アッセイにおいて、固定されたイリノテカンは、イリノテカンに結合する第1の標識されたアプタマー及びイリノテカンへの結合について第1のアプタマーと競合するその能力について試験されている第2の標識されていないアプタマーを含む溶液中でインキュベートする。対照として、固定されたイリノテカンは、第1の標識されたアプタマーを含むが、第2の標識されていないアプタマーを含まない溶液中でインキュベートしてもよい。第1のアプタマーのイリノテカンへの結合を許容する条件下でのインキュベーション後、余分な結合していないアプタマーを除去し、固定されたイリノテカンに伴う標識の量を測定することができる。固定されたイリノテカンに伴う標識の量が、対照試料に対して、試験試料中で実質的に減少した場合、それは第2のアプタマーがイリノテカンへの結合について第1のアプタマーと競合していることを示す。
固定化オリゴヌクレオチド
ある特定の実施形態では、アプタマーは任意の固定化オリゴヌクレオチドの非存在下で検出される。例えば、本発明のアプタマーは、本明細書に記載のリンカー配列を介して支持体に固定されてもよい。
ある特定の実施形態では、アプタマーは任意の固定化オリゴヌクレオチドの非存在下で検出される。例えば、本発明のアプタマーは、本明細書に記載のリンカー配列を介して支持体に固定されてもよい。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは固定化領域を含む。アプタマーの固定化領域は、適切に設計された固定化オリゴヌクレオチドの少なくとも一部にわたってハイブリダイズしうる。
ある特定の実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドは、アプタマーの固定化領域とその長さの少なくとも一部にわたってハイブリダイズするように構成されている核酸配列を含む。例えば、固定化オリゴヌクレオチド(又はその一部)は、アプタマーの固定化領域(又はその一部)と二本鎖二重構造を形成するように構成されてもよい。
ある特定の実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドは、約10～約20ヌクレオチド長、例えば、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20ヌクレオチド長である。典型的には、固定化オリゴヌクレオチドはアプタマーの固定化領域と相補的である。ある特定の実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドは、複数のアプタマーに含まれる固定化領域とハイブリダイズすることができる「ユニバーサル」オリゴヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、固定化オリゴヌクレオチド又はアプタマーは、固定化オリゴヌクレオチドの表面結合を可能にする適切な官能基を有するリンカー部分を含む。官能基は、ビオチン、チオール、及びアミン又は当業者に公知の任意の他の適切な基から選択されてもよい。
ある特定の実施形態では、固定化オリゴヌクレオチド又はアプタマーは、スペーサー分子、例えば、ポリヌクレオチド分子、C6スペーサー分子、C12スペーサー分子、別の長さのCスペーサー分子、ヘキサエチレングリコール分子、ヘキサンジオール、及び/又はポリエチレングリコールから選択されるスペーサー分子を含む。リンカーは、例えばビオチンリンカーであってもよい。ある特定の実施形態では、固定化オリゴヌクレオチド又はアプタマーは、ストレプトアビジン、アビジン及び/又はニュートラアビジンとコンジュゲート形成してもよい。
ある特定の実施形態では、固定化オリゴヌクレオチド又はアプタマーは、支持体表面への結合のために改変されてもよい。例えば、固定化オリゴヌクレオチド又はアプタマーは、シラン結合を介して結合していてもよい。固定化オリゴヌクレオチド又はアプタマーは、スクシニル化されてもよい(例えば、固定化オリゴヌクレオチド又はアプタマーをアミノフェニル又はアミノプロピル誘導体化ガラスに結合させるため)。適切には、支持体はアミノフェニル又はアミノプロピル誘導体化される。ある特定の実施形態では、固定化オリゴヌクレオチド又はアプタマーは、NH2改変(例えば、エポキシシラン又はイソチオシアネートコーティングガラスに結合させるため)を含む。典型的には、支持体表面はエポキシシラン又はイソチオシアネートでコーティングされる。ある特定の実施形態では、固定化オリゴヌクレオチド又はアプタマーは、アルデヒド又はエポキシド分子に結合するためにヒドラジド改変される。
支持体
ある特定の実施形態では、アプタマー又は固定化オリゴヌクレオチドは支持体に結合している。典型的には、支持体は膜又はビーズ等の固体支持体である。支持体は二次元支持体、例えばマイクロプレート又は三次元支持体、例えばビーズであってもよい。ある特定の実施形態では、支持体は少なくとも1つの磁性ビーズを含んでもよい。
ある特定の実施形態では、アプタマー又は固定化オリゴヌクレオチドは支持体に結合している。典型的には、支持体は膜又はビーズ等の固体支持体である。支持体は二次元支持体、例えばマイクロプレート又は三次元支持体、例えばビーズであってもよい。ある特定の実施形態では、支持体は少なくとも1つの磁性ビーズを含んでもよい。
ある特定の実施形態では、支持体は少なくとも1つのナノ粒子、例えば金ナノ粒子等を含んでもよい。更なる実施形態では、支持体はマイクロタイタープレート又は他のアッセイプレート、ストリップ、膜、フィルム、ゲル、チップ、微粒子、ナノファイバー、ナノチューブ、ミセル、ミクロポア(micropore)、ナノポア又はバイオセンサー表面を含む。ある特定の実施形態では、バイオセンサー表面は、プローブ先端表面、バイオセンサー流路又は同様のものであってもよい。
ある特定の実施形態では、アプタマー又は固定化オリゴヌクレオチドは、例えば、カルボキシ末端化、アビジン改変、又はエポキシ活性化、或いは適合する反応基で改変されてもよい磁性ビーズに、直接的又は間接的に結合していてもよい。
オリゴヌクレオチドの支持体、例えば固相支持体への固定化は、DNA又はRNAを固体に固定するための当業者に公知の様々な方法及び任意の様式で達成することができる。ナノ粒子上のアプタマーの固定化は、例えばWO2005/13817に記載の通りである。例えば、紙又は多孔材料の固相を液相アプタマーで湿らせ、その後液相を揮発させ、アプタマーを紙又は多孔材料中に残すことができる。
ある特定の実施形態では、支持体は、膜、例えば、ニトロセルロース、ポリエチレン(PE)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリプロピレン(PP)、酢酸セルロース(CA)、ポリアクリロニトリル(PAN)、ポリイミド(PI)、ポリスルホン(PS)、ポリエーテルスルホン(PES)膜又は酸化アルミニウム(Al2O3)、酸化ケイ素(SiO2)及び/若しくは酸化ジルコニウム(ZrO2)を含む無機膜を含む。支持体を調製することができる特に適した材料は、例えば、無機ポリマー、有機ポリマー、ガラス、有機及び無機結晶、鉱物、酸化物、セラミックス、金属、とりわけ貴金属、炭素及び半導体を含む。特に適した有機ポリマーは、ポリスチレンベースのポリマーである。特にニトロセルロース又は臭化シアンSephadexとして機能化されうる、セルロース、デキストラン、寒天、アガロース及びSephadex等の生体ポリマーが固体支持体を提供するポリマーとして使用されうる。
検出可能な標識
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、試料中のイリノテカンの量を検出及び/又は定量化するために使用される。典型的には、アプタマーは検出可能な標識を含む。アプタマーの検出及び/又は定量化を促進することができる任意の標識が、本明細書において使用されてもよい。
ある特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、試料中のイリノテカンの量を検出及び/又は定量化するために使用される。典型的には、アプタマーは検出可能な標識を含む。アプタマーの検出及び/又は定量化を促進することができる任意の標識が、本明細書において使用されてもよい。
ある特定の実施形態では、検出可能な標識は蛍光部分、例えば、蛍光/クエンチャー化合物である。蛍光/クエンチャー化合物は当技術分野で公知である。例えばMary Katherine Johansson、Methods in Molecular Biol.335:Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes:Designs and Protocols、2006、Didenko編、Humana Press、Totowa、NJ、及びMarrasら、2002、Nucl.Acids Res.30、el22(参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
ある特定の実施形態では、検出可能な標識はFAMである。ある特定の実施形態では、FAM標識は、アプタマーの第1又は第2のプライマー領域に位置する。当業者は、標識がまた、アプタマー内の任意の適した場所に位置しうることを理解するであろう。例えば蛍光共鳴エネルギー移動(「FRET」)の結果として、互いに近位にある場合に検出可能なシグナルの増加をもたらす部分も本明細書において使用してもよく、適切なペアは、いくつか挙げると、これらに限定されないが、フルオレセイン及びテトラメチルローダミン;ローダミン6G及びマラカイトグリーン、並びにFITC及びチオセミカルバゾールを含む。
ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォア、ナノ粒子、量子ドット、酵素、放射性同位体、事前に定義された配列部分、ビオチン、デスチオビオチン、チオール基、アミン基、アジド、アミノアリル基、ジゴキシゲニン、抗体、触媒、コロイド状金属粒子、コロイド状非金属粒子、有機ポリマー、ラテックス粒子、ナノファイバー、ナノチューブ、デンドリマー、タンパク質、及びリポソームから選択される。
ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、緑色蛍光タンパク質(GFP)又は当業者に公知の任意の他の蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質である。
ある特定の実施形態では、検出可能な標識は酵素である。例えば、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ウレアーゼ、β-ガラクトシダーゼ又は当業者に公知の任意の他の酵素から選択されてもよい。
ある特定の実施形態では、検出の性質は使用される検出可能な標識に依存する。例えば、標識はその色、例えば金ナノ粒子のおかげで検出可能でありうる。色は、光学式リーダー又はカメラ、例えばイメージングソフトウェアを伴うカメラによって、定量的に検出することができる。
ある特定の実施形態では、検出可能な標識は蛍光標識、例えば量子ドットである。そのような実施形態では、検出手段は、蛍光強度を記録するように構成されている、蛍光プレートリーダー、ストリップリーダー又は同様のものを含んでもよい。
検出可能な標識が酵素標識である実施形態では、検出手段は、例えば、比色分析、化学ルミネセンス及び/又は電気化学的(例えば、電気化学検出器を使用する)であってもよい。典型的には、電気化学的感知は、レドックスレポーター(例えば、メチレンブルー又はフェロセン)とアプタマーの一方の末端及びセンサー表面と他方の末端のコンジュゲーションを介する。典型的には、標的結合後のアプタマーの立体構造の変化は、レポーターとセンサーの間の距離を変え、読出し情報を提供する。
ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリフォスファターゼ(APP)又は同様のもの等の酵素を更に含み、基質を触媒的に代謝回転し、増幅されたシグナルをもたらすことができる。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のアプタマー及び検出可能な分子を含む複合体(例えばコンジュゲート)を提供する。典型的には、本発明のアプタマーは、検出可能な分子と共有結合により又は物理的にコンジュゲートする。
ある特定の実施形態では、検出可能な分子は、視覚、光学、光子、電子、音響、光音響、質量、電気化学、電気光学、分光測定、酵素により、或いは物理的に、化学的に又は生化学的に検出可能な標識である。
ある特定の実施形態では、検出可能な分子は、ルミネセンス、UV/VIS分光法、酵素的に、電気化学的に又は放射線により検出される。ルミネセンスは光の放出を指す。例えば、光ルミネセンス、化学ルミネセンス及びバイオルミネセンスが標識の検出に使用される。光ルミネセンス又は蛍光において、励起は光子の吸収により起こる。例示的なフルオロフォアは、限定されないが、ビスベンゾイミダゾール、フルオレセイン、アクリジンオレンジ、Cy5、Cy3又はヨウ化プロピジウム(これらは、アプタマーに共有結合しうる)、テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、テキサスレッド(TR)、ローダミン、Alexa Fluor色素(様々な会社からの様々な波長の蛍光色素)を含む。
ある特定の実施形態では、検出可能な分子は、コロイド状金属粒子、例えば、金ナノ粒子、コロイド状非金属粒子、量子ドット、有機ポリマー、ラテックス粒子、ナノファイバー(例えばカーボンナノファイバー)、ナノチューブ(例えばカーボンナノチューブ)、デンドリマー、タンパク質又はシグナル発生物質を有するリポソームである。コロイド状粒子は比色分析で検出することができる。
ある特定の実施形態では、検出可能な分子は酵素である。ある特定の実施形態では、酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ又はアルカリフォスファターゼは基質を着色生成物に変換することができる。例えば、無色の基質X-galは、β-ガラクトシダーゼの活性によって、その色が視覚的に検出される青色生成物に変換される。
ある特定の実施形態では、検出分子は放射性同位体である。検出は、これらに限定されないが3H、14C、32P、33P、35S又は125I、より好ましくは32P、33P又は125Iを含む、アプタマーが標識される放射性同位体によって行うこともできる。シンチレーションカウントでは、放射性標識アプタマー標的複合体によって放出される放射線が間接的に測定される。シンチレーター物質は、同位体の放射線放出によって励起される。シンチレーション材料の遷移中に、基底状態に戻り、励起エネルギーが閃光として再び遊離され、これが光電子増倍管によって増幅及びカウントされる。
ある特定の実施形態では、検出可能な分子はジゴキシゲニン及びビオチンから選択される。したがって、アプタマーはジゴキシゲニン又はビオチンで標識されてもよく、これには例えば抗体又はストレプトアビジンが結合し、これが酵素コンジュゲート等の標識を有しうる。アプタマーと酵素との事前の共有結合(コンジュゲーション)は、いくつかの公知の方法で達成することができる。アプタマー結合の検出は、RIA(放射性イムノアッセイ)において、放射性同位体、好ましくは125Iでアプタマーを標識することにより、又はフルオロフォア、好ましくはフルオレセイン若しくはFITCを用いるFIA(蛍光イムノアッセイ)における蛍光によって達成することもできる。
装置
本発明に従う装置は、いくつかの様々なフォーマットで提供されてもよい。ある特定の実施形態では、本発明は、試料中のイリノテカンの存在、非存在又はレベルを検出するための装置であって、本明細書に記載のアプタマーを含む装置を提供する。
本発明に従う装置は、いくつかの様々なフォーマットで提供されてもよい。ある特定の実施形態では、本発明は、試料中のイリノテカンの存在、非存在又はレベルを検出するための装置であって、本明細書に記載のアプタマーを含む装置を提供する。
ある特定の実施形態では、装置は本明細書に記載の支持体を含む。例えば、イリノテカンの非存在下では、アプタマーは、支持体に直接的又は間接的にしっかり留められ、固定されうる。
ある特定の実施形態では、装置は本明細書に記載の固定化オリゴヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、アプタマーは、固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズにより結合していてもよく、固定化オリゴヌクレオチドは次に直接的又は間接的に支持体に結合する。或いは、アプタマー自体が直接的又は間接的に(例えばリンカーを介して)支持体表面に結合していてもよい。この実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドは、アプタマーの少なくとも一部とハイブリダイズするように構成されている。この実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドとアプタマーの相互作用の崩壊は、イリノテカンの存在の間接的測定として測定されてもよい。
本発明のある特定の実施形態は、イリノテカンに結合すると立体構造を変えるアプタマーの能力を利用する。立体構造変化はアプタマーを固定化オリゴヌクレオチドから解離させることができ、したがって、どちらが支持体に結合しているかに応じて、固定化オリゴヌクレオチド又はイリノテカンと複合体形成したアプタマーが遊離する。イリノテカンが存在しない場合、アプタマーは立体構造変化を受けないので、固定化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたままである。
ある特定の実施形態では、装置は支持体に結合したリンカー分子を含み、リンカー分子はアプタマーとハイブリダイズするように構成されており、更にアプタマーがリンカー分子とハイブリダイズする場合、固定化オリゴヌクレオチドはアプタマーとハイブリダイズするように構成されている。
適切には、リンカー分子は支持体に結合しており、リンカー分子は固定化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように構成されており、更に固定化オリゴヌクレオチドがリンカー分子とハイブリダイズする場合、アプタマーは固定化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように構成されている。ある特定の実施形態では、リンカー分子はDNA若しくはRNA分子又は混合DNA/RNA分子であり、任意選択でリンカー分子は1つ又は複数の改変ヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、装置はバイオセンサーであってもよい。バイオセンサーは多くの様々なフォーマットで見出される。ある特定の実施形態では、バイオセンサーは、アプタマー及びアプタマーとイリノテカンの結合事象を電気的に定量化可能なシグナルに変換する変換器を含む。バイオセンサーは容器又はプローブ等に含まれてもよい。
更に、装置は、シグナル処理デバイス、出力電子装置、ディスプレイデバイス、データ処理デバイス、データメモリデバイス及び他のデバイスへのインターフェース等の他の要素を更に含んでもよい。ある特定の実施形態では、イリノテカンを含有する試料はバイオセンサーと接触する。次いでイリノテカンは、イリノテカンのアプタマーへの特異的結合後、アプタマー特性の変化により同定することができる。
センサーの感度は使用される変換器による影響を受けうる。変換器は、試料中の標的分子の濃度に比例する、結合事象からのシグナルを電気的に定量化可能な測定シグナルに変換する。シグナル伝達はアプタマーとイリノテカンの分子相互作用により生じる。本発明に従うバイオセンサーがあれば、定性的、定量的及び/又は半定量的分析情報を得ることができる。
光学変換器における測定は測光学の原理に基づくことができ、これにより例えば色又はルミネセンス強度の変化が検出される。光学的方法は、蛍光、リン光、バイオルミネセンス及び化学ルミネセンス、赤外遷移並びに光散乱の測定を含む。光学的方法は、イリノテカンがアプタマーに結合したときの層厚変化の測定も含む。層厚は、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)、反射型干渉分光法(RIfS)、バイオレイヤー干渉法(BLI)又は同様のものによって測定することができる。
更に、薄層への干渉(SPR又はRlfS)及びエバネセント場の変化を測定することができる。音響変換器は圧電水晶振動子の周波数変化を使用し、これは標的がアプタマーに結合したときに生じる高感度な質量変化を検出する。使用される水晶振動子は振動電場に置かれ、水晶の共振周波数が測定される。水晶振動子の表面の質量変化は定量化することができる。
ある特定の実施形態では、装置はBLI(バイオレイヤー干渉法)装置又は同様の装置である。BLIは生体分子相互作用を測定するための無標識技術である。それは、2つの表面:バイオセンサー先端の固定されたリガンドの層及び内部参照層から反射される白色光の干渉パターンの変化を分析する光学分析技術である。バイオセンサー先端に結合した分子の数の任意の変化が、リアルタイムで測定できる干渉パターンのシフトを引き起こす。バイオセンサーに結合する又はそれから解離する分子だけが、干渉パターンをシフトさせ、BLIセンサーに応答プロファイルを生成することができる。結合していない分子、周囲媒体の屈折率の変化、又は流速の変化は干渉パターンに影響しない。ディスプレイスメント選択原理は、アプタマーの固定化配列と固定化オリゴヌクレオチドの二本鎖形成に基づく検出アッセイの開発を可能にする。標的依存立体構造変化は、二本鎖構造からのアプタマーの遊離をもたらすことができる。ハイブリダイズした二本鎖からアプタマーのディスプレイスした段階へのこの切換えは、記録可能なシグナルである標的濃度依存シグナルを生成するために使用することができる。
設計によっては、測定される標的についての定性的、定量的及び/又は半定量的分析情報は、測定デバイスを用いて得ることができる。検出手段は、例えば携帯計量器であってもよい。
本発明は、本明細書に記載の任意のアプタマー又は複合体を含む試験ストリップ及び/又はラテラルフローデバイスも提供する。ラテラルフローデバイスは、ラテラルフロー試験、ラテラルフローアッセイ及びラテラルフローイムノアッセイとも称される。
ある特定の実施形態では、ラテラルフローデバイスは、固定化オリゴヌクレオチドが結合している支持体を含む。固定化オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載のアプタマーの固定化領域の少なくとも一部とハイブリダイズするように構成されている。本明細書に記載の任意の試料(例えば、血液又は血漿試料)を導入することができる。試料がイリノテカンを含む場合、アプタマーはイリノテカンに結合し、立体構造変化を受け、固定化オリゴヌクレオチドから解離するアプタマーをもたらすことができる。
ある特定の実施形態では、装置はELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)等のアッセイにおける使用に適しうる。アプタマーが抗体の代わりに使用される場合、生じるアッセイは「ELONA」(酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ)、「ELASA」(酵素結合アプタマー吸着アッセイ)、「ELAA」(酵素結合アプタマーアッセイ)又は同様のものと称されることが多い。アプタマーは、フルオロフォア、クエンチャー分子及び/又は本明細書に記載の任意の他の検出部分を含む複数のレポーター分子とコンジュゲートすることができるので、アプタマーをこれらのELISA様アッセイプラットフォームに組み込むことは、感度の増加をもたらし、利用可能な抗体及び広範囲のアウトプットがない分析物を含む、より多くの数の分析物が検出されることを可能にすることができる。
ある特定の実施形態では、装置は容器を含んでもよい。イリノテカンに特異的なアプタマーは、容器(例えば容器の表面)において、固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションを介して固定されてもよい。イリノテカンを含有しうる試料は容器に添加することができる。試料がイリノテカンを含有する場合、この標的はアプタマーに結合することができ、立体構造変化をもたらし、次にこれが固定化オリゴヌクレオチドからのアプタマーのディスプレイスメントをもたらす。次いでディスプレイスした(displaced)アプタマーは、本明細書に記載の任意の適切な方法を使用して検出することができる。
イリノテカンを検出する方法
ある特定の実施形態では、本発明は、試料中のイリノテカンの存在、非存在又は量を検出するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、試料中のイリノテカンの存在、非存在又は量を検出するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、試料は合成(例えば非生物学的)である。例えば、試料はイリノテカンを含む(又は含むことが疑われる)医薬組成物であってもよい。ある特定の実施形態では、本発明は、医薬組成物の製造中にイリノテカンの量を定量化するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、試料は生物学的である。例えば、試料は、全血、白血球、末梢血単核細胞、血漿、血清、痰、息、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引物、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、便、組織、組織生検材料又は脳脊髄液を含んでもよい。典型的には、試料は血液(例えば血漿)試料である。ある特定の実施形態では、試料は、例えば、混合、酵素、緩衝液、食塩水若しくはマーカーの添加、又は精製によって前処理される。
ある特定の実施形態では、試料はイリノテカン治療を受けている対象から得られる。対象は任意の動物(例えば、ネコ、イヌ又はウマ)であってもよい。典型的には、対象はヒトである。典型的には、対象は、結腸がん、膵臓がん、又は肺がん等のがんを有する又は有すると疑われる。例えば、対象は、遠隔転移を有する結腸直腸がん、又は進展型小細胞肺がんを有していてもよい。
試料中のイリノテカンの存在、非存在又は量を検出するための方法において、試料は本明細書に記載のアプタマーと相互作用(即ち接触)する。例えば、試料及び本明細書に記載のアプタマーは、アプタマーの少なくとも一部が試料中のイリノテカンに結合するのに十分な条件下でインキュベートしてもよい。
当業者は、本明細書に記載のアプタマーとイリノテカンの間に結合が生じるのに必要とされる条件を理解するであろう。ある特定の実施形態では、試料及びアプタマーは、約20℃～約37℃、好ましくは約22℃の温度でインキュベートしてもよい。ある特定の実施形態では、試料及びアプタマーは、適切な緩衝液(例えばPBS等)で様々な濃度(例えば、少なくとも約1%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%v/v以上)に希釈してもよい。ある特定の実施形態では、試料及びアプタマーは、振盪及び/又は混合しながらインキュベートしてもよい。ある特定の実施形態では、試料及びアプタマーは、少なくとも1分、少なくとも5分、少なくとも15分、少なくとも1時間以上インキュベートする。
ある特定の実施形態では、アプタマー及びイリノテカンの結合はアプタマー-イリノテカン複合体の形成をもたらす。結合又は結合事象は、本明細書に記載の通り、例えば、視覚的に、光学的に、光子的に、電子的に、音響的に、光音響的に、質量により、電気化学的に、電気光学的に、分光測定により、酵素的に、或いは化学的に、生化学的に又は物理的に検出することができる。
ある特定の実施形態では、方法は試料を本発明のアプタマー及び本明細書に記載の固定化オリゴヌクレオチドと相互作用させる工程を含む。上記の通り、イリノテカンの結合は、アプタマーの立体構造変化を引き起こし、固定化オリゴヌクレオチドからのそのディスプレイスメントをもたらすことができる。例えば、固定化オリゴヌクレオチドが支持体に結合している場合、イリノテカンのアプタマーへの結合は、支持体からのアプタマーのディスプレイスメントをもたらすことができる。
ある特定の実施形態では、アプタマーの固定化オリゴヌクレオチドへの結合は、固定化オリゴヌクレオチドの支持体への固定化の前に行われる。別の実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドは、核酸分子の固定化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの前に支持体に結合する。固定化オリゴヌクレオチド及び/又は核酸分子が支持体に結合しうる。結合は直接的であってもよく、又は例えば、リンカー若しくは他の結合部分を介して間接的であってもよい。
アプタマー及びイリノテカンの結合は、任意の適切な技術を使用して検出することができる。上記の通り、例えば、アプタマー及びイリノテカンの結合はバイオセンサーを使用して検出することができる。ある特定の実施形態では、アプタマー及びイリノテカンの結合は、本明細書に記載のSPR、RlfS、BLI、LFD又はELONAを使用して検出される。
有利には、本発明のアプタマーは、臨床的有効量のイリノテカンの検出を可能にする。例えば、本発明のアプタマーは、約10ng～約10,000ng/mlの間のイリノテカンの検出を可能にすることができる。したがって、アプタマーは、高い特異性及び親和性でイリノテカンに結合することができ、臨床範囲の活性イリノテカンが試料中で検出されることを可能にする。
SN-38を検出する方法
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される、任意の試料中のSN-38の存在、非存在又は量を検出するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される、任意の試料中のSN-38の存在、非存在又は量を検出するための方法を提供する。
有利には、本明細書に記載されるCP11アプタマー（例えば、配列番号10～12のいずれか）は、イリノテカン及びSN-38に特異的に結合することができ、一方で本明細書に記載されるCP13アプタマー（例えば、配列番号3～7）は、イリノテカンに特異的に結合することができるが、SN-38には結合できない又は低い親和性で結合する。したがって、これらのアプタマーは、組合せて使用してイリノテカンとその活性な代謝産物SN-38との比を決定することができる。これは、試料中のSN-38の量を定量することを可能にする。
ある特定の実施形態では、方法は、試料を第一のアプタマー（例えば、CP13アプタマー又はその断片）と相互作用させる工程を含み、アプタマーは：
(a)配列番号3～7のいずれか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号3～6のいずれか1つから選択される核酸配列;
(c)配列番号3から選択される核酸配列;
(d)(a)～(c)の配列のいずれか1つと少なくとも85%、90%、95%以上の同一性を有する核酸配列;及び/又は
(e)(a)～(d)の配列のいずれか1つの少なくとも約30、35、40以上の連続ヌクレオチドを有する核酸配列
を含む又はそれからなり、
アプタマーはSN-38には結合しない又はほんの低い親和性で結合する。
(a)配列番号3～7のいずれか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号3～6のいずれか1つから選択される核酸配列;
(c)配列番号3から選択される核酸配列;
(d)(a)～(c)の配列のいずれか1つと少なくとも85%、90%、95%以上の同一性を有する核酸配列;及び/又は
(e)(a)～(d)の配列のいずれか1つの少なくとも約30、35、40以上の連続ヌクレオチドを有する核酸配列
を含む又はそれからなり、
アプタマーはSN-38には結合しない又はほんの低い親和性で結合する。
ある特定の実施形態では、方法は、試料を第二のアプタマー（例えば、CP11又はその断片）と相互作用させる工程を含み、アプタマーは：
(a)配列番号10～12のいずれか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号10又は11のいずれか1つから選択される核酸配列;
(c)配列番号10から選択される核酸配列;
(d)(a)～(c)の配列のいずれか1つと少なくとも85%、90%、95%以上の同一性を有する核酸配列;及び/又は
(e)(a)～(c)の配列のいずれか1つの少なくとも約30、35、40以上の連続ヌクレオチドを有する核酸配列
を含む又はそれからなり、
アプタマーはSN-38に特異的に結合することもできる。
(a)配列番号10～12のいずれか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号10又は11のいずれか1つから選択される核酸配列;
(c)配列番号10から選択される核酸配列;
(d)(a)～(c)の配列のいずれか1つと少なくとも85%、90%、95%以上の同一性を有する核酸配列;及び/又は
(e)(a)～(c)の配列のいずれか1つの少なくとも約30、35、40以上の連続ヌクレオチドを有する核酸配列
を含む又はそれからなり、
アプタマーはSN-38に特異的に結合することもできる。
ある特定の実施形態では、方法は、第一のアプタマーを使用して、イリノテカンの存在、非存在又は量を検出する工程を含む。ある特定の実施形態では、方法は、第二のアプタマーを使用して、イリノテカン及びSN-38の存在、非存在又は量を検出するこうていを更に含む。イリノテカン及び/又はSN-38の存在、非存在又は量は、限定はされないが本明細書に記載の任意の方法を含む、任意の適切な方法を使用して検出することができる。
ある特定の実施形態では、方法は、第一のアプタマーを使用して検出したイリノテカンの量と、第二のアプタマーを使用して検出したイリノテカン及び/又はSN-38の量とを比較する工程を更に含む。イリノテカン及び/又はSN-38の量は、例えば、アプタマー及びそれぞれの標的の適切な較正曲線を使用して、算出することができる。
ある特定の実施形態では、方法は、第一のアプタマーを使用して検出したイリノテカンの量と、第二のアプタマーを使用して検出したイリノテカン及びSN-38の量とを比較する工程を更に含む。例えば、第一のアプタマーを使用して検出したイリノテカンの量は、第二のアプタマーを使用して検出したイリノテカン及び/又はSN-38の総量で除算して、試料中のSN-38に対するイリノテカンの割合を決定することができる。
ある特定の実施形態では、第一のアプタマーを使用して検出したイリノテカンの量は、第二のアプタマーを使用して検出したイリノテカン及びSN-38の総量で除算して、試料中のSN-38の存在、非存在又は量を決定することができる。
有利には、本明細書に記載のアプタマーは、治療的有効量のイリノテカンの検出を可能にする。例えば、本明細書に記載のアプタマーは、約0.1～100ng/mlのSN-38の検出を可能にする。したがって、アプタマーは、高い特異性及び親和性でイリノテカンに結合することができ、臨床的範囲の活性なイリノテカンを試料中で検出することを可能にする。
がん処置中のイリノテカンのモニタリング
ある特定の実施形態では、本発明は、イリノテカン治療を受けている対象から得られた試料中のイリノテカン及び/又はSN-38のレベルをモニタリングする方法を提供する。したがって、本発明は、対象の個々の必要に基づいて処置レジームを調整する機会を提供し、これにより、より有効な個別の処置が可能になる。
ある特定の実施形態では、本発明は、イリノテカン治療を受けている対象から得られた試料中のイリノテカン及び/又はSN-38のレベルをモニタリングする方法を提供する。したがって、本発明は、対象の個々の必要に基づいて処置レジームを調整する機会を提供し、これにより、より有効な個別の処置が可能になる。
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の任意の方法に従って、対象から得られた試料中のイリノテカン及び/又はSN-38の量の検出、続いて、検出されたイリノテカンのレベルに従って対象においてがんを処置又は防止することを提供する。
ある特定の実施形態では、方法は、対象から得られた試料中のイリノテカン及び/又はSN-38の量の検出後に、ある用量(例えば初回用量)のイリノテカンを対象に投与する工程を含む。
典型的には、がんは、結腸がん（例えば、遠隔転移を有する結腸直腸がん）、膵臓がん、肺がん（例えば、進展型小細胞肺がん）である。典型的には、対象は、ヒトである。典型的には、対象は、成人のヒトである。
初回用量のイリノテカンは、対象に投与される、治療的又は予防的に有効な量のイリノテカンである。典型的には、初回用量のイリノテカンは、注入される（例えば、静脈内）。
初回用量は、様々なパラメーター、特に処置される対象の年齢、体重及び状態並びに必要なレジメンに従って決定することができる。医師は任意の対象のための必要な投与経路及び投与量を決定することができるであろう。
特定の実施形態では、遠隔転移を有する結腸直腸がんの成人は、1、8、15、及び22日目に、初回静脈内投与125mg/m2のイリノテカンを90分にわたって処置される（例えば、任意選択で、1、8、16、及び22日目における静脈内投与20mg/m2のロイコボリン、及びその後の静脈内投与500mg/m2の5-フルオロウラシルと組合せて）。
ある特定の実施形態では、進展型小細胞肺がんの成人は、1、8、及び15日目に、初回静脈内投与60mg/m2のイリノテカンを90分にわたって処置される（例えば、任意選択で、1日目における静脈内投与60mg/m2のシスプラチンと組合せて）。がんを治療又は防止する方法において、対象由来の試料中のイリノテカン及び/又はSN-38のレベルは、本明細書に記載の方法に従って検出される。典型的には、試料は、血液試料である。典型的には、血液試料中のイリノテカンの血漿トラフレベル(Cmin)が検出される(例えば、次の用量のイリノテカンが投与される前にイリノテカンによって到達される最低濃度)。
イリノテカン及び/又はSN-38のレベルが下方閾値レベル未満であると決定された場合、増加用量のイリノテカンが対象に投与されうる。本明細書では、「下方閾値レベル」は、対象において腫瘍応答をもたらす可能性がないと考えられるイリノテカン及び/又はSN-38の任意の血漿レベルを意味すると理解される。当業者は、例えば、がんの種類及び/又は対象の年齢、性別若しくはサイズに応じて、適切な下方閾値レベルを選択することができる。例えば、Adiwijaya BS, Kim J, Lang I, et al. Clin. Pharmacol. Ther. 2017;102(6):997-1005も参照（参照によって本明細書に援用される）。
ある特定の実施形態では、イリノテカンの下方閾値レベルは、約50ng/ml、約40ng/ml、約30ng/ml、約10ng/ml、約5ng/ml以下でありうる。
ある特定の実施形態では、SN-38の下方閾値レベルは、約1ng/ml、約0.5ng/ml、約0.4ng/ml、約0.3ng/ml、約0.2ng/ml、約0.1ng/ml、約0.05ng/ml以下でありうる。
「増加用量」は、更なる試料中のイリノテカンのレベルが下方閾値レベルを超えるまで増加させるように作用する初回用量より高い用量を意味すると理解される。当業者は、例えば、初回用量のイリノテカン及び試料中のイリノテカンのレベルに基づいて適切な増加用量を算出することができるであろう。
イリノテカン及び/又はSN-38のレベルが上方閾値レベルを超えると決定された場合、減少用量のイリノテカンが対象に投与されうる。本明細書で、「上方閾値レベル」は、対象において毒性（例えば、好中球減少及び/又は下痢）をもたらす可能性があると考えられるイリノテカン及び/又はSN-38の任意の血漿レベルを意味すると理解される。当業者は、例えば、がんの種類及び/又は対象の年齢、性別若しくはサイズに応じて、適切な上方閾値レベルを選択することができる。例えば、Adiwijaya BS, Kim J, Lang I, et al. Clin. Pharmacol. Ther. 2017;102(6):997-1005も参照（参照によって本明細書に援用される）。
ある特定の実施形態では、イリノテカンの上方閾値レベルは、約3,000ng/ml、約4,000ng/ml、約5,000ng/ml、約6,000ng/ml、約7,000ng/ml、約8,000ng/ml、約9,000ng/ml、約10,000ng/ml、約15,000ng/ml以上でありうる。
ある特定の実施形態では、SN-38の上方閾値レベルは、約3ng/ml、約5ng/ml、約10ng/ml、約20ng/ml、約30ng/ml、約40ng/ml、約50ng/ml、約60ng/ml、約70ng/ml、約80ng/ml、約90ng/ml、約100ng/ml以上でありうる。
「減少用量」は、対象において毒性を減少させる可能性がよりあるレベルまでイリノテカンのレベルを減少させる、初回用量より低い用量を意味すると理解される。当業者は、初回用量のイリノテカン及び試料中のイリノテカンのレベルに基づいて、適切な減少用量を算出することができるであろう。ある特定の実施形態では、イリノテカンの投与は中止される。
SN-38のレベルが下方閾値レベル未満であると決定された場合、増加用量のイリノテカンが対象に投与されうる。「増加用量」はまた、対象において腫瘍応答をもたらす可能性がよりあるレベルまでSN-38のレベルを増加させる、初回用量より高い用量を意味すると理解され得る。当業者は、例えば、初回用量のイリノテカン及び試料中のSN-38のレベルに基づいて適切な増加用量を算出することができるであろう。
SN-38のレベルが上方閾値レベルを超えると決定された場合、減少用量のイリノテカンが対象に投与されうる。「減少用量」は、対象において毒性を減少させる可能性がよりあるレベルまでSN-38のレベルを減少させる、初回用量より低い用量を意味すると理解される。当業者は、初回用量のイリノテカン及び試料中のSN-38のレベルに基づいて、適切な減少用量を算出することができるであろう。ある特定の実施形態では、イリノテカンの投与は中止される。
ある特定の実施形態では、イリノテカンの下方閾値レベルは、約10ng/mlであり、及び/又はイリノテカンの上方閾値レベルは約10,000ng/mlである。
ある特定の実施形態では、イリノテカンの下方閾値レベルは、約5ng/mlであり、及び/又はイリノテカンの上方閾値レベルは約2,000ng/mlである。
ある特定の実施形態では、SN-38の下方閾値レベルは、約0.5ng/mlであり、及び/又はSN-38の上方閾値レベルは約100ng/mlである。
ある特定の実施形態では、SN-38の下方閾値レベルは、約0.1ng/mlであり、及び/又はSN-38の上方閾値レベルは約25ng/mlである。
ある特定の実施形態では、イリノテカン及び/又はSN-38のレベルは、初回用量（又はサイクル）のイリノテカンを（任意選択で、ロイコボリン、5-フルオロウラシル及び/又はシスプラチン等のその他の薬剤と組合せて）対象に投与してから4週間、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月又は12カ月以内に検出される。イリノテカンのレベルは、1回又は複数回、例えば、イリノテカン治療を開始してから一定間隔で検出することができる。典型的には、イリノテカンのレベルは、約3、6及び/又は12カ月目に検出され、イリノテカン治療の最初の年にわたるイリノテカンの治療レベルのモニタリング(及び必要に応じた標的レベルへの調整)が可能になる。
キット
本発明は、イリノテカンを検出及び/又は定量化するためのキットであって、本明細書に記載の1つ又は複数のアプタマーを含むキットも提供する。典型的には、キットは本明細書に記載の検出可能な分子も含む。
本発明は、イリノテカンを検出及び/又は定量化するためのキットであって、本明細書に記載の1つ又は複数のアプタマーを含むキットも提供する。典型的には、キットは本明細書に記載の検出可能な分子も含む。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに従う使用のための指示書を更に含む。
ある特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載の固定化配列、支持体及び/又はリンカーを更に含む。
典型的には、キットは、キット又は行われる方法によって意図される反応のための更なる構成部分、例えば、濃縮、分離及び/又は単離手順の意図される検出のための構成部分を含む。例は、緩衝溶液、呈色反応のための基質、色素又は酵素基質である。キットにおいて、アプタマーは様々な形態、例えば、支持体(例えば固体支持体)に事前に固定された形態、凍結乾燥形態又は液体媒体中で提供されてもよい。
本発明のキットは、本明細書に記載の任意の方法を行うために使用することができる。キットの部品は、バイアルに個々に入れられてもよく、又はコンテナ若しくはマルチコンテナユニットに組み合わせて入れられてもよいことが理解されるであろう。典型的には、キットの製造は当業者に公知の標準手順に従う。
以下において、本発明は、特定の実施形態の非限定的な例によってより詳細に説明される。例の実験において、汚染のない標準の試薬及び緩衝液が使用される。
(実施例1)
アプタマー選択
一本鎖DNAアプタマー選択を、ディスプレイスメント選択プロセスを使用して行った。挿入された蛍光マーカーは、蛍光測定によって、プロセスの様々な工程後のDNAの定量化を可能にした。
アプタマー選択
一本鎖DNAアプタマー選択を、ディスプレイスメント選択プロセスを使用して行った。挿入された蛍光マーカーは、蛍光測定によって、プロセスの様々な工程後のDNAの定量化を可能にした。
選択プロセス中、アプタマーライブラリーのssDNAオリゴマーを、相補的な固定化オリゴヌクレオチドを介して、磁性ビーズに固定する。結合していない及びほんの弱く結合したssDNA分子を除去するための様々な洗浄工程後、バックグラウンド溶出及びその後の標的結合工程を同じ条件下で行う。標的結合はアプタマーの立体構造変化をもたらす。立体構造変化はアプタマーを固定化オリゴヌクレオチドから解離させ、したがって、標的分子と複合体形成したアプタマーを遊離/ディスプレイスさせる。標的分子が存在しない場合、アプタマー分子は立体構造変化を受けないので、固定化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたままである。
バックグラウンド工程中の非特異的溶出物質の量及び標的結合によりディスプレイスしたアプタマーの量の直接比較は、選択プロセスの追跡を可能にする。標的結合物質が、非特異的バックグラウンドと比較して指数関数的に濃縮される場合、アプタマー選択プロセスは成功である。濃縮されたアプタマープールは「ポリクローナルアプタマー」として使用することができ、又は個々のアプタマー分子をプールから単離することができる。
選択プロセス中のストリンジェンシーは、対抗選択工程を導入することによって増強した。これらの工程において、固定されたライブラリーは非特異的/「不要」標的分子と固定され、これらの非特異的/「不要」標的への親和性を有するssDNA分子を除去する。
アプタマーライブラリー及びオリゴヌクレオチド
選択プロセス中、アプタマーライブラリーのssDNAオリゴヌクレオチド配列(IDT社製、Belgium)を、相補的な固定化オリゴヌクレオチド(配列番号16)を介して、磁性ビーズに固定した。
選択プロセス中、アプタマーライブラリーのssDNAオリゴヌクレオチド配列(IDT社製、Belgium)を、相補的な固定化オリゴヌクレオチド(配列番号16)を介して、磁性ビーズに固定した。
アプタマーライブラリーのヌクレオチド配列は、以下の構造(5'から3'方向に):
P1-R1-I-R2-P2
(式中、P1は第1のプライマー領域であり、R1は第1のランダム化領域であり、Iは固定化領域であり、R2は更なるランダム化領域であり、P2は更なるプライマー領域であり、少なくともR1及び/若しくはR2又はその一部は標的分子結合に関与している)を有する。
P1-R1-I-R2-P2
(式中、P1は第1のプライマー領域であり、R1は第1のランダム化領域であり、Iは固定化領域であり、R2は更なるランダム化領域であり、P2は更なるプライマー領域であり、少なくともR1及び/若しくはR2又はその一部は標的分子結合に関与している)を有する。
以下の改変されたプライマーをPCRによるオリゴマーの増幅に使用した:配列:5'-/56FAM/ATCCACGCTCTTTTTCTCC-3'を有するフルオレセイン(FAM)標識フォワードプライマー(P1)及び配列:5'-/5Phos/CCTATGTCACCCTCAATGC-3'を有するPO4改変リバースプライマー(P2)。
例示的なビオチン化固定化オリゴヌクレオチド(I)は、以下の構造:5'Bio-GTC-HEGL-GATCGAGCCTCA-3'を有する。全てのオリゴヌクレオチドはIDT社、Belgiumによって化学的に合成された。
ライブラリーの第1のランダム化領域(R1)は、任意の約10個の核酸の配列である。ライブラリーの第2のランダム化領域(R2)は、任意の約40個の核酸の配列である。
蛍光測定
アプタマーに組み込まれた蛍光マーカーは、蛍光プレートリーダーアッセイによる、プロセスの各工程後のアプタマーDNAの定量化を可能にする。
アプタマーに組み込まれた蛍光マーカーは、蛍光プレートリーダーアッセイによる、プロセスの各工程後のアプタマーDNAの定量化を可能にする。
フルオレセイン(FAM)標識DNAの蛍光測定を、以下の測定条件:励起485nm/発光520nmを使用するBMG蛍光プレートリーダー(FLUOstar OPTIMA、BMG社、UK)を使用して行った。
アプタマーライブラリーの磁性ビーズへの固定化
アプタマーライブラリーのssDNAオリゴマーは、固定化ヌクレオチドを介して磁性ビーズ固定される。固定化オリゴヌクレオチドは、両分子間のハイブリダイゼーションを可能にするssDNA出発ライブラリーの領域と相補的な12ヌクレオチドの定義された領域を含有する。更に、固定化オリゴヌクレオチドは、ヘキサエチレングリコール(HEGL)残基を介して結合した5'ビオチンを有し、これは固定化オリゴヌクレオチドのストレプトアビジン改変磁性ビーズへのカップリングを担う。
アプタマーライブラリーのssDNAオリゴマーは、固定化ヌクレオチドを介して磁性ビーズ固定される。固定化オリゴヌクレオチドは、両分子間のハイブリダイゼーションを可能にするssDNA出発ライブラリーの領域と相補的な12ヌクレオチドの定義された領域を含有する。更に、固定化オリゴヌクレオチドは、ヘキサエチレングリコール(HEGL)残基を介して結合した5'ビオチンを有し、これは固定化オリゴヌクレオチドのストレプトアビジン改変磁性ビーズへのカップリングを担う。
固定化のために、3nmolのナイーブライブラリー及び2nmolの固定化オリゴヌクレオチドを、250μLの結合緩衝液「BB」(20mM Tris-HCl pH7.4、100mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2、1mM CaCl2、0.01%Tween20)中で、混合物を5分間95℃で加熱することによってプレハイブリダイズした。4℃に冷却後、プレハイブリダイズしたライブラリー-固定化オリゴヌクレオチド混合物を、緩衝液B&W(5mM Tris-HCl pH7.5、0.5mM EDTA、1M NaCl、0.01% Tween20)を使用して、製造業者の指示書に従って、109 Dynabeads(登録商標)M-270ストレプトアビジン磁性ビーズ(Thermo Fisher Scientific社、UK)に固定した。
ラウンド2以降、300pmolのFAM標識アプタマーライブラリー及び200pmolの固定化オリゴヌクレオチド配列を、上と同じプロトコールを使用して、100μLの結合緩衝液(BB)中でハイブリダイズした。プレハイブリダイズしたアプタマーライブラリー-オリゴヌクレオチド混合物を、製造業者の指示書に従って、108 Dynabeads(登録商標)M-270ストレプトアビジン磁性ビーズに固定した。
ディスプレイスメント手法を使用するin vitro選択
DNAアプタマー選択は、ディスプレイスメント選択手法を使用して実施した。アプタマーライブラリーに組み込まれた蛍光マーカーは、蛍光プレートリーダーアッセイによる、プロセスの各工程後のアプタマーDNAの定量化を可能にする。フルオレセイン(FAM)標識DNAの蛍光測定を、以下の測定条件:励起485nm/発光520nmを使用するBMG蛍光プレートリーダー(FLUOstar OPTIMA、BMG社、UK)を使用して行った。標的ディスプレイスし、回収されたアプタマーDNAの定量化は、関連するアプタマー選択緩衝液中の各アプタマーライブラリーについて作成された、0～50pmol/mL範囲のFAM標識ssDNA(オリゴヌクレオチドライブラリー)の較正曲線を使用した計算に基づく。
DNAアプタマー選択は、ディスプレイスメント選択手法を使用して実施した。アプタマーライブラリーに組み込まれた蛍光マーカーは、蛍光プレートリーダーアッセイによる、プロセスの各工程後のアプタマーDNAの定量化を可能にする。フルオレセイン(FAM)標識DNAの蛍光測定を、以下の測定条件:励起485nm/発光520nmを使用するBMG蛍光プレートリーダー(FLUOstar OPTIMA、BMG社、UK)を使用して行った。標的ディスプレイスし、回収されたアプタマーDNAの定量化は、関連するアプタマー選択緩衝液中の各アプタマーライブラリーについて作成された、0～50pmol/mL範囲のFAM標識ssDNA(オリゴヌクレオチドライブラリー)の較正曲線を使用した計算に基づく。
標的CPT-11(イリノテカン塩酸塩、Sigma-Aldrich社、UK)をDMSO中1mg/mL保存溶液に希釈し、-20℃で保存した。使用直前に、作業用ストックを選択緩衝液PBS6(10mM Na2HPO4/2mM KH2PO4、pH6.0、137mM NaCl、2.7mM KCl、2mM MgCl2、1mM CaCl2、0.01%Tween20)中10μMで調製した。イリノテカン標的化アプタマーの選択において使用される緩衝液は、選択の効率を向上するために最適化される。
以下の工程を含む連続ラウンドのディスプレイスメント選択プロセスを、Biomek FX (Cat# 717004, Serial# 50111125, Beckman-Coulter社, USA)を使用した自動化手法として行った;これらも不要な標的との相互作用を低減し、弱い結合配列又は機械的プロセスにより遊離する配列を除去し、イリノテカンに対する選択の効率を向上するために最適化される:
- 上のプロトコールに従う、ナイーブアプタマーライブラリー(又は前のラウンドから調製された濃縮されたアプタマーライブラリー)の磁性ビーズへの結合;
- 固定されたアプタマーライブラリーの量の定量化(蛍光測定)、500pmolの固定されたナイーブライブラリーの第1選択ラウンドへのインプット、及び80pmolの固定されたアプタマーライブラリーの全ての続く選択ラウンドへのインプット;
- 選択緩衝液PBS6中で、28℃で15分間の高温洗浄工程において、弱く結合したオリゴマーを除去;
- 選択緩衝液PBS6中で、22℃で45分間のバックグラウンド溶出;
- 選択ラウンド7～11はまた、選択緩衝液PBS6中で、22℃で45分間、10μM SN-38（対抗選択cs1）又は40%ヒト血漿(HUMANPL32NCU2N、BioIVT社、UK)中の10μM SN-38（対抗選択cs2）のいずれかによる対抗選択工程も含んだ;
- 標的分子(10μMイリノテカン、CPT-11)を補充した選択緩衝液PBS6中で、22℃で45分間の標的結合;
- 各選択ラウンド後、標的によりディスプレイスされたアプタマーをディスプレイスされていないアプタマーから分離し、回収し、不均等なプライマーミックス(2μM FAM標識フォワードプライマー及び0.1μM PO4改変リバースプライマー)を使用する半非対称PCRによって直接増幅した;
- 製造業者のプロトコールに従って、37℃でのラムダエキソヌクレアーゼ(EURx社、Poland)による30分の処置によって二本鎖DNAを除去し、AxyPrep Mag PCRクリンナップキット(Axygen Biosciences社、USA)を使用して新生ssDNAを精製し、濃縮されたアプタマーライブラリーを得る。選択され、精製されたアプタマーライブラリーを次のラウンドのディスプレイスメント選択において使用した;
- 各ラウンドにおいて、バックグラウンド溶出、対抗選択（該当する場合）において回収されたアプタマーライブラリーの量及び標的結合分画を蛍光測定によって定量化する。各試料中の回収された物質の量は、標的結合アプタマーの濃縮(バックグラウンド又は対抗標的バインダーに対して)を追跡するために使用される;
- 合計で11ラウンドのこの手順を行い、イリノテカン特異的オリゴヌクレオチド（アプタマー）を濃縮した（図２を参照）。
- 上のプロトコールに従う、ナイーブアプタマーライブラリー(又は前のラウンドから調製された濃縮されたアプタマーライブラリー)の磁性ビーズへの結合;
- 固定されたアプタマーライブラリーの量の定量化(蛍光測定)、500pmolの固定されたナイーブライブラリーの第1選択ラウンドへのインプット、及び80pmolの固定されたアプタマーライブラリーの全ての続く選択ラウンドへのインプット;
- 選択緩衝液PBS6中で、28℃で15分間の高温洗浄工程において、弱く結合したオリゴマーを除去;
- 選択緩衝液PBS6中で、22℃で45分間のバックグラウンド溶出;
- 選択ラウンド7～11はまた、選択緩衝液PBS6中で、22℃で45分間、10μM SN-38（対抗選択cs1）又は40%ヒト血漿(HUMANPL32NCU2N、BioIVT社、UK)中の10μM SN-38（対抗選択cs2）のいずれかによる対抗選択工程も含んだ;
- 標的分子(10μMイリノテカン、CPT-11)を補充した選択緩衝液PBS6中で、22℃で45分間の標的結合;
- 各選択ラウンド後、標的によりディスプレイスされたアプタマーをディスプレイスされていないアプタマーから分離し、回収し、不均等なプライマーミックス(2μM FAM標識フォワードプライマー及び0.1μM PO4改変リバースプライマー)を使用する半非対称PCRによって直接増幅した;
- 製造業者のプロトコールに従って、37℃でのラムダエキソヌクレアーゼ(EURx社、Poland)による30分の処置によって二本鎖DNAを除去し、AxyPrep Mag PCRクリンナップキット(Axygen Biosciences社、USA)を使用して新生ssDNAを精製し、濃縮されたアプタマーライブラリーを得る。選択され、精製されたアプタマーライブラリーを次のラウンドのディスプレイスメント選択において使用した;
- 各ラウンドにおいて、バックグラウンド溶出、対抗選択（該当する場合）において回収されたアプタマーライブラリーの量及び標的結合分画を蛍光測定によって定量化する。各試料中の回収された物質の量は、標的結合アプタマーの濃縮(バックグラウンド又は対抗標的バインダーに対して)を追跡するために使用される;
- 合計で11ラウンドのこの手順を行い、イリノテカン特異的オリゴヌクレオチド（アプタマー）を濃縮した（図２を参照）。
バイオセンサーの構築及びアプタマー標的結合の評価
11番目の選択ラウンド後、濃縮されたアプタマー集団IriP cs1及びIriP cs2を、標的分子イリノテカン(CPT-11)への結合特異性について、バイオレイヤー干渉法(BLI)によって試験した。本明細書に記載される実験はBLItz又はOctet QK機器(ForteBio社、Pall Life Sciences社、USA)のいずれかを使用して行った。
11番目の選択ラウンド後、濃縮されたアプタマー集団IriP cs1及びIriP cs2を、標的分子イリノテカン(CPT-11)への結合特異性について、バイオレイヤー干渉法(BLI)によって試験した。本明細書に記載される実験はBLItz又はOctet QK機器(ForteBio社、Pall Life Sciences社、USA)のいずれかを使用して行った。
バイオセンサープローブ(Streptavidin-SA Dip & Read Biosensors、ForteBio社、Pall Life Sciences社、USA)へのアプタマー固定化のために、1.5μMアプタマー(又はナイーブライブラリー)及び1μM固定化オリゴヌクレオチドを、この混合物を95℃に10分間加熱し、直ちに4℃に5分間冷却した後、等体積の2×B&W緩衝液(10mM Tris-HCl pH7.5、1mM EDTA、2M NaCl、0.02%Tween20)と混合することによって緩衝液BB中でプレハイブリダイズした。次いで、固定化オリゴヌクレオチド上のビオチン基を使用して、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをストレプトアビジンコーティング表面に固定した。ストレプトアビジンコーティングプローブを、このプレハイブリダイズした混合物と5分間インキュベートした。緩衝液PBS6による3回の洗浄工程(30秒、120秒、30秒)を行って、緩く固定されたライブラリー材料を除去した。次いで、プローブを標的溶液(PBS6中10μM CPT-11、10μM 代謝産物SN-38又は10μM 陰性標的イマチニブ)と5分間インキュベートした。標的結合は固定されたアプタマーの立体構造変化を引き起こし、シグナルの減少として見えるアプタマーディスプレイスメントをもたらす(図3)。「ディップアンドリード」BLIアッセイは、アプタマー-標的相互作用をモニタリングし、最良の性能のアプタマークローンを同定するため、及び比較カイネティック解析のために使用した。
ForteBioシステム(ForteBio Data Analysis 8.0)のソフトウェアは、シグナルを「フリップ」することを可能にし、比較カイネティック解析をできるようにする。この手法を使用して、BLI結合アッセイは、ナイーブライブラリー（選択プロセスの出発ライブラリー）と比較して、選択されたアプタマー集団IriP cs1及びIriP cs2の選択標的CPT-11（イリノテカン）への結合の明らかな向上を示す。イリノテカンの主な代謝産物(SN-38)に対するアプタマー結合、及び陰性標的イマチニブ（構造的及び機能的に関連する）に対するアプタマー結合は検出することはできなかった（図４を参照）。
クローニング
最後の選択ラウンド後、改変されていないフォワード及びリバースプライマーを使用して、PCRによって、回収されたアプタマーライブラリーを増幅した。精製されたdsDNAは、製造業者のプロトコール(CloneJET PCRクローニングキット、Thermo Fisher Scientic社、UK)に従って、pJET1.2/平滑末端クローニングベクターにクローニングし、大腸菌(E.coli)の配列決定株(NEB 5-アルファ大腸菌C2987H細胞)を形質転換するために使用し、プラスミド特異的プライマー(pJETフォワードプライマー及びpJETリバースプライマー、CloneJET PCRクローニングキット、Thermo Fisher Scientic社、UK.)を使用して、「コロニーPCR」によって、96個の陽性形質転換体/クローンを分析した。並行して、アプタマー特異的FAM標識フォワードプライマー及びPO4改変リバースプライマーを使用する「アプタマーPCR」によって、アプタマーDNAを同じ形質転換体/クローンから生産した。
最後の選択ラウンド後、改変されていないフォワード及びリバースプライマーを使用して、PCRによって、回収されたアプタマーライブラリーを増幅した。精製されたdsDNAは、製造業者のプロトコール(CloneJET PCRクローニングキット、Thermo Fisher Scientic社、UK)に従って、pJET1.2/平滑末端クローニングベクターにクローニングし、大腸菌(E.coli)の配列決定株(NEB 5-アルファ大腸菌C2987H細胞)を形質転換するために使用し、プラスミド特異的プライマー(pJETフォワードプライマー及びpJETリバースプライマー、CloneJET PCRクローニングキット、Thermo Fisher Scientic社、UK.)を使用して、「コロニーPCR」によって、96個の陽性形質転換体/クローンを分析した。並行して、アプタマー特異的FAM標識フォワードプライマー及びPO4改変リバースプライマーを使用する「アプタマーPCR」によって、アプタマーDNAを同じ形質転換体/クローンから生産した。
個々のアプタマーの同定
上のクローニングプロトコールに従って、一本鎖DNAを、アプタマープールIriP cs2由来の個々のアプタマークローンについて調製した。次いで各クローンを、標的CPT-11への結合について、上記のBLIアッセイを使用して分析した。次いで、6つの最良の結合クローンを、代謝産物SN-38への結合に関して解析した。CPT-11に及びSN-38に結合する、これらの6つのアプタマークローンの応答シグナルを比較して、最良の結合及び最も特異的なアプタマークローンを見出した（図５、６及び以下の表１(Table 1)）。
上のクローニングプロトコールに従って、一本鎖DNAを、アプタマープールIriP cs2由来の個々のアプタマークローンについて調製した。次いで各クローンを、標的CPT-11への結合について、上記のBLIアッセイを使用して分析した。次いで、6つの最良の結合クローンを、代謝産物SN-38への結合に関して解析した。CPT-11に及びSN-38に結合する、これらの6つのアプタマークローンの応答シグナルを比較して、最良の結合及び最も特異的なアプタマークローンを見出した（図５、６及び以下の表１(Table 1)）。
クローンCP11及びCP13の両方のDNAを(MRC PPU DNA Sequencing and Services, University of Dundee, UK)によって配列決定した。EBIウェブサーバーによって提供されるウェブベースツールClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)を使用することによって、得られた配列データを分析し、整列させた。遊離エネルギー最小化アルゴリズムMfold[[Zuker、 M.(2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.Nucleic Acid Res.31(13)](http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold)を使用して、アプタマーの二次構造分析を行った(図1)。
標的イリノテカン(CPT-11)及び代謝産物SN-38への見かけのアプタマー結合親和性の決定
見かけのアプタマー親和性は、上記のプロトコールに従って、BLIアッセイ（ディスプレイスメントアッセイ）を使用して決定した。
見かけのアプタマー親和性は、上記のプロトコールに従って、BLIアッセイ（ディスプレイスメントアッセイ）を使用して決定した。
上述のように、アプタマーを固定化ヌクレオチドにプレハイブリダイズさせ、ストレプトアビジンバイオセンサープローブ上に固定した。両方の標的（イリノテカン(CPT-11)及びSN-38）を、濃度系列（PBS6中に希釈された10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0μM）で、それぞれ、適用した。
アプタマーディスプレイスメント反応は、濃度依存性である。反応は、「フリップ」されたデータを使用して比較し、定常状態分析を使用して適合させることができる。KD値は、ForteBioソフトウェア(ForteBio Data Analysis 8.0, 定常状態分析)を使用して算出した。反応は解離曲線ではないので、これは本当のKD測定ではなく、比較目的のみを意図している。
比較目的に関して、アプタマーCP11のイリノテカンへの親和性（PBS6中）は、1.0×10-7M±0.32 (100nM±32)と算出された。アプタマーCP11のSN-38に対する親和性（PBS6中）は、8.7×10-8M±4.2 (87nM±42)と算出された（図７）。
比較目的に関して、アプタマーCP13のイリノテカンへの親和性（PBS6中）は、2.7×10-7M±0.34 (270nM±34)と算出された。アプタマーCP13のSN-38に対する親和性（PBS6中）は、検出されなかった（図８）。
アプタマー特異性の決定
アプタマー特異性は、上記のプロトコールに従って、BLIアッセイを使用して決定した。標的イリノテカン(CPT-11)、代謝産物SN-38、及び陰性標的イマチニブを10μMでPBS6に入れた。
アプタマー特異性は、上記のプロトコールに従って、BLIアッセイを使用して決定した。標的イリノテカン(CPT-11)、代謝産物SN-38、及び陰性標的イマチニブを10μMでPBS6に入れた。
BLI試験は、アプタマーCP13の高い特異性及びアプタマーCP11の中程度の特異性を確認した。アプタマーCP11は、イリノテカンCPT-11への増加した結合を示した。より低いシグナルが、代謝産物SN-38に関して測定された。陰性標的イマチニブは、非常に低いレベルの結合を有する。アプタマーCP13は、イリノテカン(CPT-11)への増加した結合を示した。代謝産物SN-38及び陰性標的イマチニブに関して、結合は検出できなかった（図９）。
「ELISA様」アプタマーディスプレイスメントアッセイ(マイクロタイタープレートベース蛍光アッセイ)及びヒト血漿におけるアプタマー選択性の評価
ストレプトアビジンコーティングMTP(SuperBlock Blocking Bufferを含むPierce Streptavidin Coated、HBC、黒色96ウェルプレート、Thermo Scientific社、USA)へのアプタマーの固定化のために、0.75μMアプタマー及び0.5μM固定化オリゴヌクレオチドを、この混合物を95℃に10分間加熱し、直ちに4℃に5分間冷却した後、等体積の2×B&W緩衝液と混合することによって、緩衝液BB中でプレハイブリダイズした。マイクロタイタープレートMTP1は、このプレハイブリダイゼーション混合物と、1時間、室温で、MTP振盪機(IKA Schuttler MTS 4、IKA Werke GmbH & Co. KG社、Germany)で、1000rpmで振盪しながらインキュベートした。固定化効率は、それぞれインキュベーション前及びインキュベーション後のインプット及びアウトプット蛍光を比較することによって決定した。これは、蛍光測定によって、ロードされたアプタマーのおよその量の算出を可能にする。アプタマーをロードしたプレート(MTP1)を選択緩衝液PBS6で徹底的に洗浄し、緩く固定されたDNAを除去した後、4つの濃度(緩衝液PBS6中0%、10%、20%及び25%v/vマトリックス)の、緩衝化されたヒト血清(HUMANPL32NCU2N、BioIVT社、UK)中で調製された標的イリノテカンの勾配(10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0μM)と1時間室温(MTP振盪機で1000rpm)でインキュベートした。StreptaWellプレート上に保持された蛍光アプタマーを測定し（洗浄して、放出されたアプタマー及びに任意の残存マトリックスを除去した後）、標的結合物質の量を、標的インキュベーション前及び後の測定結果を使用して算出した。データを使用して、標的インキュベーション前の固定化されたアプタマーに関するアプタマー結合[%]を算出した。データは、対応する「0uM標的」対照ウェルからの測定値を減算することにより補正した。次いで、データを「標的濃度」に対する「アプタマー結合[%]」及び様々な血漿濃度における「アプタマー結合[%]」としてcプロットした。
ストレプトアビジンコーティングMTP(SuperBlock Blocking Bufferを含むPierce Streptavidin Coated、HBC、黒色96ウェルプレート、Thermo Scientific社、USA)へのアプタマーの固定化のために、0.75μMアプタマー及び0.5μM固定化オリゴヌクレオチドを、この混合物を95℃に10分間加熱し、直ちに4℃に5分間冷却した後、等体積の2×B&W緩衝液と混合することによって、緩衝液BB中でプレハイブリダイズした。マイクロタイタープレートMTP1は、このプレハイブリダイゼーション混合物と、1時間、室温で、MTP振盪機(IKA Schuttler MTS 4、IKA Werke GmbH & Co. KG社、Germany)で、1000rpmで振盪しながらインキュベートした。固定化効率は、それぞれインキュベーション前及びインキュベーション後のインプット及びアウトプット蛍光を比較することによって決定した。これは、蛍光測定によって、ロードされたアプタマーのおよその量の算出を可能にする。アプタマーをロードしたプレート(MTP1)を選択緩衝液PBS6で徹底的に洗浄し、緩く固定されたDNAを除去した後、4つの濃度(緩衝液PBS6中0%、10%、20%及び25%v/vマトリックス)の、緩衝化されたヒト血清(HUMANPL32NCU2N、BioIVT社、UK)中で調製された標的イリノテカンの勾配(10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0μM)と1時間室温(MTP振盪機で1000rpm)でインキュベートした。StreptaWellプレート上に保持された蛍光アプタマーを測定し（洗浄して、放出されたアプタマー及びに任意の残存マトリックスを除去した後）、標的結合物質の量を、標的インキュベーション前及び後の測定結果を使用して算出した。データを使用して、標的インキュベーション前の固定化されたアプタマーに関するアプタマー結合[%]を算出した。データは、対応する「0uM標的」対照ウェルからの測定値を減算することにより補正した。次いで、データを「標的濃度」に対する「アプタマー結合[%]」及び様々な血漿濃度における「アプタマー結合[%]」としてcプロットした。
標的イリノテカンへの明確な濃度依存的結合が、4つ全ての血漿濃度において、アプタマーCP11及びCP13の両方に関して見ることができる（図１０）。試験は、イリノテカンの治療範囲を反映するイリノテカン濃度で実施した。イリノテカンの検出の限界は、1μMより低く、この薬剤の治療範囲で明確な濃度依存的反応を示した。
アプタマーCP11及びCP13の結合特異性は、上述のELISA様アッセイを使用して試験した。イリノテカン及び代謝産物SN-38の両方を、緩衝化されたヒト血漿(20%血漿)中で試験した（図１１）。アプタマーCP11は、ヒト血漿において、両方の標的への標的濃度依存的結合を示す一方で、アプタマーCP13は、代謝産物SN-38への結合を示さないが、イリノテカン(CPT-11)への強い濃度依存的結合を示す。したがって、アプタマーCP11及びCP13は、組合せて使用して、イリノテカン(CPT-11)とその活性な代謝産物SN-38との比を決定することができる。
(実施例2)
アプタマーCP13の最小結合断片の同定
アプタマーCP13の最小機能的断片の同定のために、断片（親アプタマーの切断型）のパネルを作製した（IDT社, Belgiumによって製造）。このパネルを、標的イリノテカン（PBS6中の10μM）への結合に関して試験した。特に、BLIディスプレイスメント結合試験を使用して、アプタマーCP13の最小有効断片を同定した。アプタマーCP13の切断型のパネルを、標的イリノテカン（PBS6中の10μM）への結合に関して試験した（図１２）。最小断片同定試験は、BLIディスプレイスメントアッセイ（フリップされたデータ、緩衝液を差し引いた）を使用して、実施した。アプタマー断片の多くが、結合能力を失い、これは結合部位が除去された又は障害されたことを指す。その他の断片は、親アプタマー(CP13)と比較して向上した結合を示す。このパネルの最も小さく且つ最良の性能のアプタマー断片は、CP13-F4cであった（図12、配列番号3）。
アプタマーCP13の最小結合断片の同定
アプタマーCP13の最小機能的断片の同定のために、断片（親アプタマーの切断型）のパネルを作製した（IDT社, Belgiumによって製造）。このパネルを、標的イリノテカン（PBS6中の10μM）への結合に関して試験した。特に、BLIディスプレイスメント結合試験を使用して、アプタマーCP13の最小有効断片を同定した。アプタマーCP13の切断型のパネルを、標的イリノテカン（PBS6中の10μM）への結合に関して試験した（図１２）。最小断片同定試験は、BLIディスプレイスメントアッセイ（フリップされたデータ、緩衝液を差し引いた）を使用して、実施した。アプタマー断片の多くが、結合能力を失い、これは結合部位が除去された又は障害されたことを指す。その他の断片は、親アプタマー(CP13)と比較して向上した結合を示す。このパネルの最も小さく且つ最良の性能のアプタマー断片は、CP13-F4cであった（図12、配列番号3）。
このアプタマー断片の見かけの結合親和性を、上記のBLIディスプレイスメントアッセイを使用して試験した。アプタマーCP13-F4cは、標的濃度依存的なアプタマーディスプレイスメントを示した。シグナル（R平衡(R equilibrium, Req)）は、「フリップ」され、定常状態分析を使用して適合された。親和性定数(KD値)は、ForteBio Data Analysis 8.0ソフトウェアを使用して算出した。比較目的のために、CP13-F4cのイリノテカンへの親和性（PBS6中）は、1.6×10-7M±0.4 (160nM±40)と算出された（図１３）。
CP13-F4cの標的結合特異性を、マイクロタイタープレートベースアプタマーディスプレイスメントアッセイ(ELISA様蛍光アッセイ)を使用して試験した。標的誘導ディスプレイスメントを、いくつかの関連する標的を使用してモニタリングし、最小機能的断片がその標的イリノテカン(CPT-11)に結合することを実証した。イリノテカン代謝産物SN-38及びAPCもまた、イリノテカンより低い程度だが、結合した。試験は、緩衝液PBS6中で、これらの薬剤の治療範囲を反映する標的濃度で行った（図１４）。
ヒト血漿における標的（イリノテカン CPT-11）に結合するアプタマーの評価を、上述の「ELISA様」アプタマーディスプレイスメントアッセイ（マイクロタイタープレートベース蛍光アッセイ）によって検証した。図１５は、ヒト血漿中における、最小機能的断片CP13-F4cの標的結合を示す。結果は、最小断片CP13-F4cは、ヒト血漿の存在下で、標的イリノテカン(CPT-11)へ特異的に結合することができることを示す。試験は、この薬物の治療範囲を反映する標的濃度で行った。
CP13-F4cの二次構造解析を、上述の目的ツールmfoldを使用した、Zuker, 2003による遊離エネルギー最小化アルゴリズムによって実施した（図1D）。
(実施例3)
アプタマーCP11の最小結合断片同定
アプタマーCP11の最小機能的断片の同定のために、実施例2と同じプロトコールに従った。断片（親アプタマーの切断型）のパネルを作製した（IDT社, Belgiumによって製造）。このパネルを、標的イリノテカン（PBS6中の10μM）への結合に関して試験した。特に、BLIディスプレイスメント結合試験を使用して、アプタマーCP11の最小有効断片を同定した。最小断片同定試験は、BLIディスプレイスメントアッセイ（フリップされたデータ、緩衝液を差し引いた）を使用して、実施した。アプタマー断片の多くが、結合能力を失い、これは結合部位が除去された又は障害されたことを指す。その他の断片は、親アプタマー(CP11)と比較して向上した結合を示す。このパネルの最も小さく且つ最良の性能のアプタマー断片は、CP11-F3eであった(配列番号10)(図16)。
アプタマーCP11の最小結合断片同定
アプタマーCP11の最小機能的断片の同定のために、実施例2と同じプロトコールに従った。断片（親アプタマーの切断型）のパネルを作製した（IDT社, Belgiumによって製造）。このパネルを、標的イリノテカン（PBS6中の10μM）への結合に関して試験した。特に、BLIディスプレイスメント結合試験を使用して、アプタマーCP11の最小有効断片を同定した。最小断片同定試験は、BLIディスプレイスメントアッセイ（フリップされたデータ、緩衝液を差し引いた）を使用して、実施した。アプタマー断片の多くが、結合能力を失い、これは結合部位が除去された又は障害されたことを指す。その他の断片は、親アプタマー(CP11)と比較して向上した結合を示す。このパネルの最も小さく且つ最良の性能のアプタマー断片は、CP11-F3eであった(配列番号10)(図16)。
CP11-F3eの二次構造解析を、上述の目的ツールmfoldを使用した、Zuker, 2003による遊離エネルギー最小化アルゴリズムによって実施した（図1C）。
読者の注意は、この出願と関連してこの明細書と同時に又はそれより前に提出され、及びこの明細書と共に公開された全ての論文及び文書に向けられ、全てのそのような論文及び文書の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (30)
- イリノテカンに特異的に結合することができるアプタマーであって、
(a)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つの少なくとも約30連続ヌクレオチドを有する核酸配列;又は
(d)配列番号3～7若しくは10～12のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約30連続ヌクレオチドを有する核酸配列
を含む又はそれからなるアプタマー。 - (a)配列番号3～7のいずれか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号3～6のいずれか1つから選択される核酸配列;
(c)配列番号3から選択される核酸配列;
(d)(a)～(c)の配列のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有する核酸配列;及び/又は
(e)(a)～(c)の配列のいずれか1つの少なくとも約30連続ヌクレオチドを有する核酸配列
を含む又はそれからなり、SN-38には結合しない又はほんの低い親和性で結合する、請求項1に記載のアプタマー。 - (a)配列番号10～12のいずれか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号10若しくは11のいずれか1つから選択される核酸配列;
(c)配列番号10の核酸配列;
(d)(a)～(c)の配列のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有する核酸配列;及び/又は
(e)(a)～(c)の配列のいずれか1つの少なくとも約30連続ヌクレオチドを有する核酸配列
を含む又はそれからなり、SN-38にも特異的に結合することができる、請求項1に記載のアプタマー。 - 一本鎖DNAアプタマーである、請求項1から3のいずれか一項に記載のアプタマー。
- イリノテカンへの結合について請求項1から4のいずれか一項に記載のアプタマーと競合するアプタマー。
- 検出可能な標識を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 検出可能な標識が、フルオロフォア、ナノ粒子、量子ドット、酵素、放射性同位体、事前に定義された配列部分、ビオチン、デスチオビオチン、チオール基、アミン基、アジド、アミノアリル基、ジゴキシゲニン、抗体、触媒、コロイド状金属粒子、コロイド状非金属粒子、有機ポリマー、ラテックス粒子、ナノファイバー、ナノチューブ、デンドリマー、タンパク質、及びリポソームから選択される、請求項6に記載のアプタマー。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のアプタマー及び検出可能な分子を含む、複合体。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のアプタマーを含む、バイオセンサー又は試験ストリップ。
- 試料中のイリノテカンの存在、非存在又はレベルを検出するための装置であって、
(i)支持体;及び
(ii)請求項1から7のいずれか一項に記載のアプタマー
を含む装置。 - 支持体が、ビーズ、マイクロタイタープレート若しくは他のアッセイプレート、ストリップ、膜、フィルム、ゲル、チップ、微粒子、ナノ粒子、ナノファイバー、ナノチューブ、ミセル、ミクロポア、ナノポア又はバイオセンサー表面である、請求項10に記載の装置。
- 固定化オリゴヌクレオチドを含む装置であって、固定化オリゴヌクレオチドが、アプタマーの核酸配列と少なくとも部分的に相補的な核酸配列を含み、アプタマーが固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、請求項10又は11に記載の装置。
- アプタマー又は固定化オリゴヌクレオチドが支持体に直接的又は間接的に結合している、請求項10から12のいずれか一項に記載の装置。
- 表面プラズモン共鳴(SPR)、バイオレイヤー干渉法(BLI)、ラテラルフローアッセイ及び/又はELONAに適している、請求項10から13のいずれか一項に記載の装置。
- イリノテカンを検出、濃縮、分離、及び/又は単離するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項8に記載の複合体、請求項9に記載のバイオセンサー若しくは試験ストリップ又は請求項10から14のいずれか一項に記載の装置の使用。
- 試料中のイリノテカンの存在、非存在又は量を検出する方法であって、
(i)試料を請求項1から7のいずれか一項に記載のアプタマーと相互作用させる工程;及び
(ii)イリノテカンの存在、非存在又は量を検出する工程
を含む方法。 - 試料中のSN-38の存在、非存在又は量を検出する方法であって、
(a)試料を第一の請求項2に記載のアプタマーと相互作用させ、イリノテカンの量を検出する工程;
(b)試料を第二の請求項3に記載のアプタマーと相互作用させ、イリノテカン及びSN-38の量を検出する工程;
(c)(a)及び(b)で検出した量を比較して、試料中のSN-38の存在、非存在又は量を決定する工程
を含む方法。 - アプタマーが、アプタマーの核酸配列と少なくとも部分的に相補的な核酸配列を含む固定化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、アプタマーと試料中の任意のイリノテカンとの結合が、アプタマー及び固定化オリゴヌクレオチドのディスプレイスメントをもたらし、アプタマーの検出を可能にする、請求項16又は17に記載の方法。
- アプタマー又は固定化オリゴヌクレオチドが支持体に結合している、請求項18に記載の方法。
- イリノテカンの存在、非存在又は量が、光子検出、電子的検出、音響的検出、電気化学的検出、電気光学的検出、酵素的検出、化学的検出、生化学的検出又は物理的検出によって検出される、請求項16から19のいずれか一項に記載の方法。
- 試料が合成試料であり、任意選択で試料が、イリノテカンを含有する医薬組成物である、請求項16から20のいずれか一項に記載の方法。
- 試料がイリノテカン治療を受けている対象から得られる、請求項16から20のいずれか一項に記載の方法。
- 試料が血液試料であり、任意選択でイリノテカンの血漿トラフレベル(Cmin)が検出される、請求項22に記載の方法。
- 対象においてがんを治療又は防止する方法であって、
(i)初回用量のイリノテカンを対象に投与する工程;
(ii)請求項16から23のいずれか一項に記載の方法に従って、対象から得られた試料中のイリノテカン及び/又はSN-38の量を検出する工程;及び
(iii)(a) イリノテカン及び/又はSN-38のレベルが下方閾値レベル未満である場合、増加用量のイリノテカンを対象に投与し;
(b) イリノテカン及び/又はSN-38のレベルが上方閾値レベルを超える場合、減少用量のイリノテカンを対象に投与する工程
を含む方法。 - 試料が血液試料であり、任意選択で血液試料中のイリノテカンの血漿トラフレベル(Cmin)が検出される、請求項24に記載の方法。
- イリノテカンの下方閾値レベルが約10ng/ml以下であり、及び/又はイリノテカンの上方閾値レベルが約2,000ng/ml以上である、請求項25に記載の方法。
- SN-38の下方閾値レベルが約0.5ng/ml以下であり、及び/又はSN-38の上方閾値レベルが約25ng/ml以上である、請求項25又は26に記載の方法。
- イリノテカン及び/又はSN-38のレベルが、初回用量のイリノテカンを対象に投与してから、約3、約6及び/又は約12カ月目に検出される、請求項24から27のいずれか一項に記載の方法。
- イリノテカンを検出及び/又は定量化するためのキットであって、請求項1から7のいずれか一項に記載のアプタマーを含むキット。
- 固定化オリゴヌクレオチド、リンカー、支持体及び/又は検出可能な分子を含む、請求項29に記載のキット。
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|---|---|---|---|
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