KR20220016769A - 신종 코로나바이러스 특이적 압타머 및 이의 이용 - Google Patents
신종 코로나바이러스 특이적 압타머 및 이의 이용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신종 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2; COVID-19) 특이적 압타머 및 이의 이용에 관한 것이다.
본 발명에 따른 압타머는 SARS-CoV-2의 다양한 부위에 특이적으로 결합하고, SARS-CoV-2 단백질에 대해 높은 민감도 및 특이도를 나타내는 것을 확인하였는 바, SARS-CoV-2 의 진단 용도로 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 압타머는 SARS-CoV-2의 다양한 부위에 특이적으로 결합하고, SARS-CoV-2 단백질에 대해 높은 민감도 및 특이도를 나타내는 것을 확인하였는 바, SARS-CoV-2 의 진단 용도로 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 신종 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2; COVID-19) 특이적 압타머 및 이의 이용에 관한 것이다.
신종 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2; COVID-19)는 2019년 12월 중국 후베이성 우한시에서 최초 보고된 신규한 바이러스로, 외피가 있는 양성가닥 RNA 바이러스(non-segmented positive-strand RNA virus)이고 50-200 nm 직경, 9-12nm의 표면돌기(spike) 단백질을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, 계통 분석 결과 SARS-관련 코로나바이러스와 가장 가까운 것으로 확인되었다.
COVID-19는 폐 ACE2(angiotensin-converting enzyme 2) 수용체를 매개로 진입하여, 기침·호흡곤란·폐렴 등의 호흡기 증후군을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 전파 경로는 비말 접촉으로 보고되어 있다. 전세계적으로 치명율은 4.3%이나, 이에 특이적인 항바이러스제가 아직까지 개발되지 않아, 수액보충, 해열제 등 보존적 치료만 이루어지고 있는 실정이다.
SARS-CoV-2의 표준 진단 방법은 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응(real-time reverse transcription polymerase chain reaction, rRT-PCR)이다. rRT-PCR 방법은 가장 민감하고 정확하지만 비용과 시간이 많이 걸리는 단점이 있다. 이의 대안으로, SARS-CoV-2의 POCT(point-of care test)를 위한 바이러스 항원을 검출하기 위해 바이러스 단백질에 대한 항체를 사용하는 면역학적 방법이 개발되었다. 그러나, 항체 기반 POCT 방법은 민감도가 55 %에서 75 % 사이로, 정확성이 낮은 단점이 있다. 따라서 SARS-CoV-2의 진단을 위한 새로운 정확한 진단 방법이 필요한 실정이다.
한편, 압타머는 높은 친화성과 특이성을 가진 다양한 표적 분자와 상호 작용하는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)이다. 압타머는 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라는 방법으로 생성된다. 항체와 비교하여 압타머는 분자 프로브로서 바람직한 특성을 가지고 있는 바, 향후 진단 및 치료 용도로 유용하게 사용될 것으로 예상된다.
이에, 본 발명자들은 SARS-CoV-2의 표면돌기에 선택적으로 결합하는 압타머를 개발하고, SARS-CoV-2의 진단에 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
1. Chunqin Long, et al., Diagnosis of the Coronavirus disease (COVID-19): rRT-PCR or CT?, Eur J Radiol. 2020 May; 126: 108961.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 58의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 표면돌기(spike)에 특이적으로 결합하는 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 압타머를 포함하는, SARS-CoV-2 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 압타머 중 선택되는 어느 1종 이상을 포함하는, SARS-CoV-2 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 개체로부터 분리된 생체 시료와 접촉하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 내지 58의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 표면돌기(spike)에 특이적으로 결합하는 압타머를 제공한다.
본 발명에서 용어, "압타머"는 "Chemical Antibody"로서 특정 화합물부터 단백질까지 다양한 종류의 표적 리간드에 높은 특이도와 친화도로 결합할 수 있는 특성을 가지는 짧은 길이 (20~80개 염기)의 단일 가닥 핵산 분자를 의미한다. 압타머는 SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 통해 생체 외 (In Vitro)에서 개발할 수 있다.
압타머는 표적 단백질에 대해 나노몰 (nM) 내지 펨토몰 (fM)수준의 높은 결합력과 선택성을 지니고 있다는 점에서 항체와 유사한 특성을 가지는 올리고 핵산 분자로 여겨진다. 한편, 항체와 비교할 때 압타머는 다음과 같은 여러 가지 장점을 가지고 있다: (1) 화학 합성법으로 제조되는 압타머는 항체와 같은 단백질 기반의 물질보다 목적하는 화학적 변형이 용이하며, (2) SELEX 과정을 통해 선택성과 친화도를 극대화할 수 있으며, (3) 화학적 합성으로 만들어지므로 순도가 높고, (4) 기기 분석을 통해 만들어진 물질을 동정할 수 있으며, (5) 열에 안정하여 실온에서 장기간 보존이 가능하다.
본 발명에서 용어, "SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)"는 표적 물질과 결합하는 압타머를 선별하는 방법이다. 일반적으로 공지된 방법의 경우, 표적 단백질을 무작위적인 염기서열을 가진 올리고 뉴클레오티드 라이브러리 (DNA 또는 RNA)와 함께 일정 온도에서 반응시킨 후에, 표적과 결합하지 않은 DNA/RNA 라이브러리는 제거한다. 표적과 결합한 뉴클레오티드를 분리한 후 유전자 증폭 방법을 통해 증폭시켜 위 과정을 여러 차례 반복하여 표적에 높은 결합력을 가지는 압타머를 선별해낸다.
본 발명의 경우, 상기와 같은 일반적인 SELEX 방법을 변형하여 압타머를 제조하였으며, 그에 관한 구체적인 방법에 대해서는 하기에 기재되어 있다.
압타머 선별 과정에는 일반적으로 1014 내지 1015개 정도의 서로 다른 서열, 즉 다양성을 가지는 라이브러리로부터 단일 가닥 핵산 풀(pool)을 확보하는 과정이 필요하다. 이를 위한 방법으로 여러 가지 방법이 이용되고 있으나 일반적으로 비대칭 PCR을 사용하여 한쪽 가닥만을 증폭시키는 방법, 이중 가닥 핵산의 한 가닥 끝 부분에 비오틴(biotin)을 붙인 후 스트렙타비딘(streptavidin)으로 감싼 비드 (bead)를 이용하여 한 가닥만을 선택적으로 분리하는 방법이 가장 많이 이용되고 있다.
이후, 확보한 라이브러리를 표적 분자에 결합시켜 결합력이 높은 압타머를 골라내는 선택 과정을 진행한다. 표적 분자가 단백질인 경우에는 보통 단백질에 표지된 비오틴을 스트렙타비딘 비드를 이용해 풀 다운(Pull down)한다. 표적 단백질과 변형 핵산 라이브러리의 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내어 표적 단백질에 결합하지 않은 변형 핵산 라이브러리들을 제거한다.
플레이트(Plate)의 경우에도 마찬가지로 핵산 라이브러리와 표적 단백질의 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내어 표적 단백질에 결합하지 않는 핵산들을 제거한다. 이러한 방법들을 사용하여 리간드에 대해 친화도를 가지는 압타머들을 얻을 수 있다. 보통 5-15 회의 선별-증폭 과정을 반복하면 높은 친화도를 가지는 압타머를 얻을 수 있다. 선별 과정이 종료되면 증폭한 핵산을 클로닝한 후 개개의 클론으로부터 서열 분석을 통해 그 서열을 확인하고, 압타머를 합성하여 표적 분자와의 친화도 및 결합력을 측정한다.
본 발명에서 용어, "표적 분자"는 본 발명의 압타머로 검출할 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 상기 표적 분자는 분리된 시료 내에 존재하는 것으로 포획 압타머가 결합할 수 있는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 보조인자 (cofactor), 약물, 염료, 성장인자 및 규제 물질 (controlled substance)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 표적 분자는 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 표면돌기(spike) 또는 이의 RBD(Receptor Binding Domain)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 압타머는 이의 5' 말단 및 3' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 1 내지 30 개의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 압타머는 이의 5' 말단 및 3' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 전술한 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하여, 30 내지 150 개의 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 압타머는 서열번호 1 내지 58의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로 90% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치 (Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다 (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스 (동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
상기 압타머는 이의 폴리뉴클레오티드 서열을 이루는 하나 이상의 뉴클레오티드에 하기 중 선택되는 어느 하나 이상의 변형(modification)을 포함할 수 있다:
i) 하나 이상의 뉴클레오티드 중 T 염기의 5번 탄소가 벤질기, 나프틸기, 2-나프틸기, 피롤벤질기 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 치환;
ii) 하나 이상의 뉴클레오티드 내 2번 탄소 위치에서 -OH 기가 데옥시(deoxy), 메톡시(methoxy), 아미노(amino) 및 불소(F)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 치환; 및
iii) 하나 이상의 뉴클레오티드가 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트, LNA(Locked Nucleic Acid), PNA(Peptide Nucleic Acid) 및 HNA(Hexitol Nucleic acid)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환.
예를 들면, 상기 벤질기로의 치환은 Bn-dU(5'-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)로의 치환일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 Bn-dU는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 1]
예를 들면, 상기 나프틸기로의 치환은 NapdU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)로의 이에 제한되지 않는다.
예를 들면, 상기 2-나프틸기로의 치환은 2NapdU(5-(N-(2-naphthylmethyl)carboxyamide)-2'-deoxyuridine)로의 치환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 NapdU는 하기 화학식 2로 표시되는 것일 수 있고, 상기 2NapdU는 하기 화학식 3로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 2]
[화학식 3]
상기와 같이 T 염기의 5번 탄소가 특정 작용기로 치환되어 변형됨으로써, 변형되지 않은 경우와 비교하여 SARS-CoV-2 표면돌기와의 친화력(affinity)이 현저하게 높아질 수 있다.
상기 압타머는 이의 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 5' 말단 및 3' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 PEG(폴리에틸렌 글리콜), HEG(헥사 에틸렌 글리콜), idT(inverted deoxythymidin, 역-데옥시티미딘), 비오틴, 형광물질, 아민 링커, 티올 링커, 콜레스테롤 및 지방산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 접합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 압타머를 포함하는, SARS-CoV-2 진단용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 SARS-CoV-2 감염증의 발병 여부를 확인하는 것이다.
상기 조성물은 서열번호 1 내지 58의 염기서열을 포함하는 압타머 중 선택되는 어느 1종 이상의 압타머를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 다양한 농도의 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질(0~0.5 pmol)을 사용하여 LFA(lateral flow assays)를 수행하고 압타머 기반 LFA의 검출 한계(Limit of Detection, LOD)를 결정한 결과, 0.05 pmol 이상의 표면돌기 단백질 농도에서 양성 신호가 관찰되고(도 9A 및 9B), LFA의 LOD는 표면돌기 단백질 0.05 pmol보다 낮은 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 구현 예에서 서열번호 3과 서열번호 5의 압타머 쌍을 이용한 LF 버퍼 하(도 11) 또는 VTM(Viral Transport Medium) 하(도 12)의 LFA에서 낮은 농도의 S1 단백질(~0.05 ug/ml(0.065 pmol)) 검출하였으며, 서열번호 3과 서열번호 2의 압타머 쌍을 이용한 VTM 하의 LFA에서 낮은 농도의 S1 단백질(~0.05 ug/ml)을 검출하였다(도 13).
또한, DxSO4 없이 SB18 LF 버퍼에 혼합한 재조합 SARS-CoV-2 표면돌기 전체 단백질 6.5pmol, 8.97ug/ml에서 상기와 동일한 방법으로 검출 감도를 확인한 결과, 도 14와 같이 SARS-CoV-2 표면돌기 전체 단백질이 검출되는 것을 확인하였다.
상기 조성물에 포함된 서열번호 1 내지 58의 염기서열을 포함하는 압타머 중 선택되는 어느 1종 이상의 압타머는 다양한 코로나 바이러스 중에서 SARS-CoV-2만을 특이적으로 검출 및 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 SARS-CoV-2 표면돌기가 적용된 LFA는 양성 신호를 나타낸 반면(도 15), 다른 인간 베타 코로나 바이러스 HKU1 및 OC43의 표면돌기 단백질이 적용된 LFA의 테스트 라인에서는 많은 양의 표면돌기 단백질(각각 1pmol)이 분석에 사용되었음에도 불구하고 신호가 검출되지 않았다.
또한, LF 버퍼 하에서 서열번호 3과 서열번호 5의 압타머 쌍(도 16), VTM 하에서 서열번호 3과 서열번호 5의 압타머 쌍(도 17) 및 서열번호 3과 서열번호 2의 압타머 쌍(도 18)은 SARS 또는 MERS 유래 S1 단백질은 검출하지 않고 SARS-CoV-2의 S1 단백질만을 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 압타머 중 선택되는 어느 1종 이상을 포함하는, SARS-CoV-2 진단용 키트를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 진단 키트는 서열번호 1 내지 58의 염기서열을 포함하는 압타머 중 선택되는 어느 1종 이상 또는 2종 이상의 압타머를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일예로, 상기 진단 키트에 2종 이상의 압타머(압타머 쌍)이 포함되는 경우, 상기 서열번호 1 내지 58의 염기서열을 포함하는 압타머 중 2개를 선택하여 압타머 쌍으로 사용할 수 있으며, 구체적으로 서열번호 3 및 서열번호 5의 압타머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 2의 압타머 쌍, 서열번호 55 및 서열번호 56의 압타머 쌍, 서열번호 55 및 서열번호 57의 압타머 쌍, 서열번호 55 및 서열번호 58의 압타머 쌍, 서열번호 56 및 서열번호 58의 압타머 쌍, 서열번호 57 및 서열번호 58의 압타머 쌍 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 진단 키트에 압타머 쌍이 포함되는 경우, 압타머 중 하나는 멤브레인에 고정하여 고정상으로 사용하고, 다른 하나는 분리된 생체 시료 내에 존재하는 SARS-CoV-2을 표지하는 이동상으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 압타머는 이의 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 5' 말단 및 3' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 PEG(폴리에틸렌 글리콜), HEG(헥사 에틸렌 글리콜), idT(inverted deoxythymidin, 역-데옥시티미딘), 비오틴, 형광물질, 아민 링커, 티올 링커, 콜레스테롤 및 지방산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 접합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 진단 키트는 전술한 압타머뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 진단 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질액 등을 포함할 수 있다.
상기 기질은 니트로셀룰로오스 멤브레인, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스테린 수지로 합성된 96-웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 완충용액은 LF 버퍼, VTM(Viral Transport Medium) 및 SB18 버퍼 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 형광물질은 Alexa647, FITC(Fluorescein isothiocyanate) 및 RITC(Rhodamine B isothiocyanate) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발색 기질액은 ABTS(2,2´-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민) 및 TMB(테트라메틸 벤지딘) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 생체 시료는 생물학적 샘플, 환경 샘플, 약제학적 샘플, 식품 샘플, 농업 샘플 및 가축 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 예로, 상기 생체 시료는 개체로부터 분리된 코 분비물(nasal swab), 인후 분비물(throat swab), 전혈(whole blood), 혈장, 혈청, 가래(sputum), 입깁(breath), 소변, 정액, 침(saliva), 뇌막액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 세포, 세포 추출물, 대변(stool), 조직 추출물, 조직 생검 및 뇌척수액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "개체"는 SARS-CoV-2 감염증을 진단하거나 SARS-CoV-2 감염증의 예후를 예측하고자 하는 대상을 의미한다. 이때, 상기 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼 등의 SARS-CoV-2 감염증이 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 진단용 키트는 개체로부터 분리된 생체 시료에서 SARS-CoV-2의 존재 및 양을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 정상 개체/SARS-CoV-2 감염증 개체로부터 분리된 시료에는 존재하는 SARS-CoV-2 양에 차이가 존재하며 본 발명은 이러한 차이점을 이용하여 정상 개체와 SARS-CoV-2 감염증 개체를 구분함으로써, SARS-CoV-2 감염증의 발병이나 상태를 판단할 수 있다.
본 발명에서 용어, "정상 개체"란 SARS-CoV-2 바이러스를 보유하지 않은 개체를 의미하며, 본 발명에서 용어, "SARS-CoV-2 감염증 개체"란 SARS-CoV-2 바이러스를 보유하거나 SARS-CoV-2 바이러스를 보유하여 관련 증상을 나타내는 개체를 의미한다.
상기 정상 개체로부터 분리된 시료와 SARS-CoV-2 감염증의 진단 또는 예후를 예측하고자 하는 개체로부터 분리된 시료에서 SARS-CoV-2의 양을 측정하고 비교함으로써, 개체의 SARS-CoV-2 감염증 발병 여부 또는 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명에 따른 진단용 조성물 및 진단용 키트는 표적 단백질에 결합하는 2종의 압타머(압타머 쌍)를 이용하는 샌드위치(sandwich) 분석법을 기본으로 한 면역크로마토그라피법을 적용한 것이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 진단용 조성물 및 진단용 키트는 압타머 한 종을 스트렙타비딘(streptavidin)과 공유 혹은 비공유 결합으로 결합 후 유색의 미세한 입자(착색미립자) (예를 들면, 금속 나노 입자)와 공유 또는 비공유 결합으로 결합시켜 이동상으로 사용하고, 다른 한 종의 압타머는 니트로셀룰로오스 멤브레인에 점적하여 고정상으로 사용한다.
이후, 분석하고자 하는 시료를 이동상과 혼합하여 고정상인 멤브레인을 통해 전개시키면 모세관 현상에 의해 이동상이 전개되는데, 이 때 시료 내에 표적 단백질이 포함되어 있으면, 표적 단백질을 매개로 고정상과 이동상이 서로 결합하게 되어 고정상 부위에서 착색미립자가 선으로 나타나게 된다. 이러한 선의 출현 유무로 시료 중 타겟 단백질의 존재 여부를 육안으로 판단할 수 있다.
이러한 샌드위치 분석법에 사용되는 압타머는 시료의 민감도 및 특이도를 결정하기 때문에 압타머의 선별이 매우 중요하다. 예를 들어, SARS-CoV-2을 샌드위치 분석법을 이용하여 분석하기 위해서는 SARS-CoV-2 내 타겟 단백질에 대한 결합 위치가 각기 다른 압타머 쌍이 필요하다. 만약 사용되는 두 압타머와 항원과의 결합 부위가 유사하거나 근접된 곳에 있으면 구조적 방해(steric hindrance)로 인하여 민감도가 떨어지게 된다.
본 발명에 따른 압타머 쌍은 SARS-CoV-2에 대한 민감도 및 특이도가 우수한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 압타머를 포함하는 SARS-CoV-2 진단 키트를 이용하여 LF 버퍼 하에서 서열번호 3과 서열번호 5의 압타머를 각각 캡쳐 압타머 및 디덱션 압타머로 하였을 때의 민감도 및 특이도를 확인한 결과, 상기 압타머 쌍은 0.05 ug/ml(0.065pmol)의 낮은 농도에서 S1 단백질을 검출하였으며, SARS 또는 MERS 유래 S1 단백질은 검출하지 않고 SARS-CoV-2의 S1 단백질만을 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다.
또한, 상기와 동일한 진단 키트를 이용하여 VTM(Viral Transport Medium) 하에서 서열번호 3과 서열번호 5의 압타머를 각각 캡쳐 압타머 및 디덱션 압타머로 하였을 때 또는 서열번호 3과 서열번호 2의 압타머를 각각 캡쳐 압타머 및 디덱션 압타머로 하였을 때의 민감도 및 특이도를 확인한 결과, 도 10 및 도 11과 같이 상기 압타머 쌍은 낮은 농도의 S1 단백질을 검출하였으며(~0.05 ug/ml), SARS 또는 MERS 유래 S1 단백질은 검출하지 않고 SARS-CoV-2의 S1 단백질만을 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 진단용 조성물을 개체로부터 분리된 생체 시료와 접촉하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 방법은 (a) SARS-CoV-2에 특이적으로 결합하는 압타머를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 진단용 조성물을 개체로부터 분리된 생체 시료와 접촉시켜, 시료 내 SARS-CoV-2의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 생체 시료에서 측정된 수준과 비교하여 SARS-CoV-2의 양이 증가한 개체를 SARS-CoV-2 감염증 위험군으로 분류하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 측면 유동 분석(lateral flow assay, LFA) 유형 테스트, 면역 흡착 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 유형 테스트, 전계 효과 트랜지스터(field-effect transistor, FET) 유형 테스트 및 방사 면역 분석(radioimmunoassay, RIA) 유형 테스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 당업계에 알려진 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 압타머는 SARS-CoV-2의 다양한 부위에 특이적으로 결합하고, SARS-CoV-2 단백질에 대해 높은 민감도 및 특이도를 나타내는 것을 확인하였는 바, SARS-CoV-2 의 진단 용도로 적용할 수 있다.
도 1은 viro-SELEX 과정의 모식도이다.
도 2는 SELEX 과정의 모식도이다.
도 3은 압타머 필터 결합 분석, Kd 및 Bmax 값을 나타낸 도이다.
도 4는 SARS-CoV-2 표면돌기의 RBD(Receptor Binding Domain)에 대한 압타머의 결합력을 확인한 도이다.
도 5는 SARS-CoV-2 표면돌기의 S1(spike 1)에 대한 압타머의 결합력을 확인한 도이다.
도 6는 SARS-CoV-2 표면돌기의 S2에 대한 압타머의 결합력을 확인한 도이다.
도 7은 단백질 결합 결쟁 분석 결과이다.
도 8은 SARS-CoV-2 진단 키트의 모식도이다.
도 9는 Alexa647 (A) 또는 금 나노 입자 (B)와 결합된 디텍션 압타머를 이용한 LFA의 검출 한계(Limit of Detection, LOD)를 확인한 도이다.
도 10은 압타머 쌍을 포함하는 진단 키트를 이용하여 SARS-CoV-2 표면돌기의 S1에 대한 검출능을 확인한 도이다.
도 11은 LF 버퍼 조건 하에서 서열번호 3번 및 서열번호 5번 압타머 쌍의 민감도 및 특이도를 확인한 도이다.
도 12는 VTM(Viral Transport Medium) 조건 하에서 서열번호 3번 및 서열번호 5번 압타머 쌍의 민감도 및 특이도를 확인한 도이다.
도 13은 VTM 조건 하에서 서열번호 3번 및 서열번호 2번 압타머 쌍의 민감도 및 특이도를 확인한 도이다.
도 14는 압타머 쌍을 포함하는 진단 키트를 이용하여 SARS-CoV-2 표면돌기 전체 단백질에 대한 검출능을 확인한 도이다.
도 15는 압타머 기반 LFA(lateral flow assays)의 SARS-CoV-2에 대한 특이도를 확인한 도이다.
도 2는 SELEX 과정의 모식도이다.
도 3은 압타머 필터 결합 분석, Kd 및 Bmax 값을 나타낸 도이다.
도 4는 SARS-CoV-2 표면돌기의 RBD(Receptor Binding Domain)에 대한 압타머의 결합력을 확인한 도이다.
도 5는 SARS-CoV-2 표면돌기의 S1(spike 1)에 대한 압타머의 결합력을 확인한 도이다.
도 6는 SARS-CoV-2 표면돌기의 S2에 대한 압타머의 결합력을 확인한 도이다.
도 7은 단백질 결합 결쟁 분석 결과이다.
도 8은 SARS-CoV-2 진단 키트의 모식도이다.
도 9는 Alexa647 (A) 또는 금 나노 입자 (B)와 결합된 디텍션 압타머를 이용한 LFA의 검출 한계(Limit of Detection, LOD)를 확인한 도이다.
도 10은 압타머 쌍을 포함하는 진단 키트를 이용하여 SARS-CoV-2 표면돌기의 S1에 대한 검출능을 확인한 도이다.
도 11은 LF 버퍼 조건 하에서 서열번호 3번 및 서열번호 5번 압타머 쌍의 민감도 및 특이도를 확인한 도이다.
도 12는 VTM(Viral Transport Medium) 조건 하에서 서열번호 3번 및 서열번호 5번 압타머 쌍의 민감도 및 특이도를 확인한 도이다.
도 13은 VTM 조건 하에서 서열번호 3번 및 서열번호 2번 압타머 쌍의 민감도 및 특이도를 확인한 도이다.
도 14는 압타머 쌍을 포함하는 진단 키트를 이용하여 SARS-CoV-2 표면돌기 전체 단백질에 대한 검출능을 확인한 도이다.
도 15는 압타머 기반 LFA(lateral flow assays)의 SARS-CoV-2에 대한 특이도를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SARS-CoV-2 압타머 제작
1.1. 대리 바이러스의 준비
Sf9(Spodoptera frugiperda) 세포를 Sf 900 II SFM(Gibco, Waltham, MA)에서 0.1 % 페니실린/스트렙토마이신 및 0.2 % 암포테신 B(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)와 함께 27℃의 진탕 배양기에서 배양하였다. SARS-CoV-2 표면돌기의 엑토(ecto) 도메인, T4 파지의 폴돈(foldon) 도메인 및 소포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus)의 G-스템(stem)을 포함하는 대리 바이러스를 배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 생성하였다. 감염 3 일 후, 배양 배지를 5 분 동안 500 x g로 원심분리하여 수집하고, 다시 15 분 동안 15,000 x g로 원심분리하여 제거한 뒤 바이러스를 2 시간 동안 160,000 x g로 초원심분리하여 침전시켰다. 펠릿을 PBS에 재현탁시켰다. 이를 통해 대리 바이러스를 생성하고 부분적으로 정제하였다(도 1).
1.2. SARS-CoV-2 표면돌기 단백질 제조
SARS-CoV-2의 재조합 표면돌기(spike) 단백질을 배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 발현하고, 친화성 컬럼을 이용하여 정제하였다. SARS-CoV-2의 표면돌기 단백질에서 유래하는, 바이러스 외피의 바깥쪽에 걸쳐 있는 표면돌기 단백질의 his- 및 flag- 태그가 붙은 엑토 도메인을 포함하는 엑토-표면돌기는 재조합 배큘로 바이러스 DNA를 Sf9 세포로 형질감염시켜 제작하였다.
1.3. viro-SELEX
SELEX 공정은 공지된 방법(Kwon, et al., 2019; Narayan, et al., 2020)를 따랐으며, 도 2에 개략적으로 도시되어 있다. viro-SELEX 공정은 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 단백질 기반 SELEX(왼쪽) 및 바이러스 기반 SELEX(오른쪽)를 SELEX의 각 라운드에서 표적 결합 DNA의 농축에 따라 교대로 실행하였다. 표적 결합 DNA의 농축은 용출된 DNA의 정량화 및 DNA 재결합 역학 원리에 기반한 Cot 분석에 의해 모니터링하였다.
SARS-CoV-2의 표면돌기 단백질에 대한 압타머의 농축을 위해, 포지티브(positive) 및 네거티브(negative) 선택 과정이 viro-SELEX 단계에 포함되었다. 양성 선택을 위해, SARS-CoV-2(Ecto-spike)의 정제된 표면돌기 단백질과 SARS-CoV-2 표면돌기를 포함하는 대리 바이러스(SARS-CoV-2 대리 바이러스)를 viro-SELEX에 사용하였다. 음성 선택을 위해 SELEX에서 인간 베타 코로나 바이러스(HCoV HKU1 및 HCoV OC43)의 표면돌기 단백질 혼합물을 사용하였다. 11 회 또는 12 회 SELEX 중 대리 바이러스로 1 회 또는 2 회 SELEX를 수행하였다. ssDNA 라이브러리는 양쪽 끝에서 17mer 불변 영역이 측면 중앙에 무작위 핵산 서열(40mer)로 구성된 74mer DNA를 포함하였다. 즉, 라이브러리 DNA는 5'-CGAGCGTCCTGCCTTTG-40N-CACCGACAGCCACCCAG-3 '로 구성되며, 여기서 40N은 무작위 서열을 나타내었다.
S 버퍼[40mM HEPES (pH 7.5), 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2 및 0.05 % Tween-20]에 용해된 1 nmole 압타머 라이브러리의 혼합물을 95℃에서 약 5 분 동안 가열하고 압타머 재접힘을 위해 0.1℃/s의 속도로 25℃까지 천천히 냉각하였다. 압타머 라이브러리 DNA를 6 x his-태그 관련 탈론(Talon) 비드(Invitrogen, Carlsbad, CA)와 함께 사전 배양하여 자기 비드 및 His-태그에 대한 비특이적 결합제를 제거하였다. 자기장을 적용하여 탈론 비드를 제거하고 남은 용액을 정제 된 단백질(50 pmol)과 함께 25℃에서 30 분 동안 배양하였다. 탈론 비드를 용액에 첨가한 다음 10 분 동안 교반하였다. 탈론 비드는 자기장을 적용한 다음 S 버퍼로 3 회 세척하여 수집하였다. 표적 단백질에 결합된 압타머를 2 mM NaOH 용액으로 용출하고, 용출된 DNA를 5'-프라이머(5'-CGAGCGTCCTGCCTTTG-3 ', 서열번호 59)와 비오틴이 결합된 3'-프라이머[5'-(2x)비오틴-CTGGGTGGCTGTCGGTG-3', 서열번호 60]로 증폭 후 비오틴이 결합된 DNA를 Myone SA 비드(Invitrogen)에 포획하고 양성 센스 DNA를 20mM NaOH로 용출하였다. 비드의 네거티브 센스 DNA는 DNA 중합 효소, dATP, dGTP, dCTP 및 나프틸-dUTP가 포함된 중합 반응 버퍼에서 비드를 배양하여 나프틸-dUMP(NapdU)를 포함하는 포지티브 센스 압타머를 합성하기 위한 주형으로 사용되었다. 생성된 압타머는 다음 SELEX 라운드에 사용되었다. SELEX 공정은 덱스트란 설페이트(DxSO4)의 부재 또는 존재 하에 실행되었다. 감소하는 양의 표면돌기 단백질(0.01 pmol까지) 및 증가하는 양(최대 10 mM)의 DxSO4를 결합 단계 및/또는 단백질과 DNA 풀의 결합 후에 첨가하였다.
1.4. 복제 및 시퀀싱
11 차 SELEX에서 농축된 ssDNA는 5'- 프라이머 및 3'- 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭되었다. 증폭된 DNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제하고, DNA를 플라스미드에 클로닝하고 삽입된 DNA를 시퀀싱(Solgent, 대전, 대한민국)하였다. 대안으로, 증폭된 DNA는 차세대 시퀀싱 방법을 사용하여 시퀀싱되었다. 분석된 서열은 서열번호 1~58과 같다.
1.5. SARS-CoV-2 표면돌기 결합 압타머 합성
압타머는 포스포르아미다이트 커플링 반응에 의해 올리고 뉴클레오타이드 합성기(Bioautomation의 Mermade 12)에서 변형된 dUTP 포스포르아미다이트로부터 화학적으로 합성되었다. 합성 후 수지(200 nmol-dA(BZ) 합성 컬럼, 1000 A(MM1-1000-2))를 70℃의 t-부틸 아민 : 메탄올 : 물 (1 : 1 : 2 v/v/v)에 침지하였다. 합성된 압타머를 탈보호하기 위해 5 시간 동안 70℃로 유지한 다음 진공에서 건조시켰다. 압타머는 65℃에서 5 ml/분의 속도로 흐르는 아세토니트릴의 농도 구배를 점차 증가시키면서 C18 컬럼(Waters.)(bridge OST C18 10x50mm)을 사용하여 HPLC(High-performance liquid chromatography)로 분리 및 정제하였다.
1.6. 압타머의 Kd 값 측정
압타머와 단백질 사이의 평형 해리 상수(Kd)를 측정하였다(Gold et al., 2010). 압타머의 5'말단은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Takara) 및 [32P]-ATP (Perkinelmer, Waltham, MA)를 사용하여 [32P]로 표지되었다. [32P]-표지된 압타머를 200 μl의 S 완충액에 20,000 cpm으로 희석한 다음 95℃에서 3 분 동안 가열하고 0.1℃/s의 속도로 천천히 25℃로 냉각시켰다. [32P]-표지된 압타머를 표적 단백질(S1S2, SARS-CoV-2 표면돌기(spike)의 도메인 S1 및 S2; S1, SARS-CoV-2 표면돌기의 S1 도메인; RBD, SARS-CoV-의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain))과 함께 25℃에서 15 분 동안 배양하였다. 물에 포함된 Zorbax(Agilent, Santa Clara, CA) 수지(5.5 μl, 400 mg/ml)를 다양한 양의 단백질 (20 nM~2.1 pM)이 포함된 [32P] 표지 압타머 용액에 첨가한 다음, 용액을 Thermomixer와 1 분 동안 1300 rpm에서 혼합하였다. 표적 단백질과 [32P]-표지된 압타머의 혼합물을 PVDF 필터 플레이트에 적용하였다. 세척 후 여과지에 남아있는 방사능을 형광 이미지(Fuji FLA-5100 Image Analyzer)로 측정하였다. 각 슬롯의 방사능은 음성 대조군 슬롯의 방사능으로 표준화되었다. [32P]-표지된 라이브러리 DNA는 음성 대조군으로 사용되었다.
그 결과, 압타머 필터 결합 분석, Kd 및 Bmax 값을 도 3에 나타내었다. 대부분의 압타머는 0.02~8.03 nM 범위의 Kd 값으로 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질(RBD, S1 및 S1S2)의 상이한 영역에 대해 매우 강한 결합 친화성을 나타내었다.
또한, 서열번호 1, 3, 4, 6, 7 내지 10(도 4)은 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질의 RBD에 결합력을 나타내었고, 서열번호 2 및 5(도 5)은 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질의 S1 부위에 결합력을 나타내었으며, 서열번호 11 내지 19의 압타머(도 6)는 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질의 S2 부위에 결합력을 나타내었다.
실시예 2. SARS-CoV-2 진단 방법 개발
2.1. 결합 경쟁 분석
압타머를 사용하여 LFA(lateral flow assays)를 수행하려면 표적 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질의 두 가지 다른 영역(비경쟁 부위)을 인식하는 한 쌍의 압타머가 필요하다. 이에, SARS-CoV-2 표면돌기에 대한 한 쌍의 압타머를 확인하기 위해 표면돌기 단백질을 사용하여 압타머 간의 단백질 결합 경쟁 실험을 수행하였다. [32P]-표지된 고온(hot) 압타머(2,000 cpm)는 경쟁 분석에서 경쟁자로서 표지되지 않은 저온(cold) 압타머(25 pmole)의 존재 하에 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질과 함께 배양되었다. SARS-CoV-2 표면돌기에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하지 않는 쌍을 식별하기 위해 가능한 모든 압타머 조합(SARS-CoV-2 표면돌기에 강하게 결합하는 서열번호 55, 56, 57 및 58)을 테스트하였다. 압타머 용액을 95℃에서 3 분 동안 가열한 다음 0.1℃/s의 속도로 천천히 25℃로 냉각시켰다. [32P]-표지된 압타머(고온 압타머: 서열번호 55, 56, 57 및 58)는 경쟁자인 비표지 압타머(저온 압타머: 서열번호 55, 56, 57, 및 58)의 존재하에 SARS-CoV-2 표면돌기 S1S2와 함께 25℃에서 15 분 동안 배양되었다. 이어서 물에 용해된 5.5 μl의 Zorbax 수지(400 mg/ml)를 반응 혼합물에 첨가한 다음 Thermomixer에서 1 분 동안 1300 rpm으로 교반하였다. 표적 단백질과 압타머의 혼합물을 PVDF 필터 플레이트에 적용하였다. 표적 단백질에 결합된 고온 압타머는 도 1과 같이 인광 영상 장치로 정량화되었다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 고온 압타머인 서열번호 55의 SARS-CoV-2 표면돌기에 대한 결합은 저온 압타머인 서열번호 55에 의해 억제되었으나, 저온 압타머인 서열번호 56, 57 및 58에 의해서는 억제되지 않았다. SARS-CoV-2 표면돌기에 대한 서열번호 56은 저온 압타머 서열번호 56 및 57에 의해 억제되었지만, 저온 압타머 서열번호 55 및 58에 의해서는 억제되지 않았다. SARS-CoV-2 표면돌기에 대한 고온 압타머 서열번호 57의 결합은 저온 압타머 서열번호 56 및 57에 의해 억제되었지만, 저온 압타머 서열번호 55 및 58에 의해서는 억제되지 않았다. SARS-CoV-2 표면돌기에 대한 고온 압타머 서열번호 58의 결합은 저온 압타머 서열번호 58에 의해 억제되었으나, 저온 압타머 서열번호 55, 56 및 57에 의해서는 억제되지 않았다.
이러한 결과는 압타머 쌍(서열번호 55 및 56, 서열번호 55 및 57, 서열번호 55 및 58, 서열번호 56 및 58, 서열번호 57 및 58)이 2 개의 별개 영역에 각각 결합하여, SARS-CoV-2 진단 방법에 사용하기에 적합함을 나타내었다. 특히, 서열번호 55 및 57은 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질에 대해 매우 강한 결합 친화성을 나타내므로, 이후 실시예에서 LFA을 구성할 때 서열번호 55 및 57의 압타머 쌍을 각각 디텍션 및 캡쳐 압타머로 사용하였다.
2.2. LFA에 대한 압타머의 변형
SARS-CoV-2 진단에 사용하기 위해 압타머의 5'와 3' 말단을 변형시켰다.
캡쳐 압타머의 5' 말단은 티올화하여 BSA-설포-SMCC(Bovine Serum Albumin-sulfo-SMCC[sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO])와 접합시켰다. 구체적으로, BSA 및 설포-SMCC를 1:50 비율로 4℃에서 30 분 동안 상하 진탕기로 혼합하여 BSA-SMCC 접합체를 제작하였다. 미 반응 설포-SMCC는 원심 필터 장치로 제거되었다. 물 내 286.5 μl의 티올화 압타머(1000 pmole)에 3 μl의 1 M TEA(Triethylamine), 3 μl의 1 M DTT(Dithiothreitol) 및 7.5 μl의 2 M TEAA(Triethylammonium acetate)를 첨가하 고 25℃에서 1 시간 동안 Thermomixer와 혼합하여 압타머를 환원시켰다. 압타머를 에탄올로 침전시키고 S 완충액에 용해시켰다. 압타머는 가열 및 냉각에 의해 재어닐링되고 1 : 2 v/v 비율로 BSA-SMCC 접합체와 혼합되었다. 반응 혼합물을 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 BSA는 LFA에 사용되는 니트로 셀룰로오스 여과지의 표면에 압타머가 단단히 부착되도록 하였다.
디텍션 압타머의 5' 말단은 스트렙타비딘-접합 콜로이드 금 나노 입자 또는 스트렙타비딘-접합 Alexa647과의 결합을 위해 비오틴화되었다. 구체적으로, 5' 말단에 비오틴이 표지된 캡쳐 압타머를 1xPBS 버퍼로 용해시킨 후, 95℃에서 5분 동안 가열 후 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 준비하였다. 준비된 비오틴이 표지된 캡쳐 압타머를 스트렙타비딘과 섞어 준 뒤 1시간 동안 반응시켰다.
캡쳐 압타머 및 디텍션 압타머의 3' 말단은 뉴클라아제(nuclease)의 공격으로부터 압타머를 보호하는 3' 역-데옥시티미딘(inverted-dT, idT)와 각각 접합시켰다.
다음과 같은 압타머의 최종 구성이 LFA에서 사용되었다.
BSA-SMCC와 접합된 캡쳐 압타머: SH-(HEG)3-CCTGCCTTTG-6GGCGAG666GAG6A6CCCAC6GC6G6GC6CA6AGGCCGC-CACCGACAGC-idT.
Alexa647 또는 금 나노 입자와 결합된 디텍션 압타머: 비오틴-(HEG)3-AGCGTCCTGCCTTTG-6CGG6AAGGGAGC6AG6G6A6GCCCC6GAG66AGGGA6A6-CACCGACAGCCACCC-idT.
(SH: thiol group; HEG: hexaethylene glycol; 6: naphthyl-dU; idT: 3' inverted deoxy-thymidine)
2.3. 테스트 라인(스트립) 조립
LFA은 왼쪽부터 샘플이 적재되는 샘플 패드, 니트로 셀룰로오스 멤브레인(HF180MC100, Millipore, Burlington, MA) 내 캡처 압타머가 포함된 테스트 라인, 올리고 dT DNA(20 mer)가 포함된 대조선 라인 및 흡수 패드로 구성되었다(도 8, 도 9). 샘플 패드는 니트로 셀룰로오스 멤브레인의 바닥 부분에 부착되고 흡수 패드는 니트로 셀룰로오스 멤브레인의 상단 부분에 부착되었다.
2.4. 압타머 고정
BSA-SMCC와 접합된 캡쳐 압타머(1~20 pmole 압타머/스트립)를 디스펜서로 니트로 셀룰로스 멤브레인의 테스트 라인에 고정시켰다.
S 완충액(1-10 pmole/스트립)에서 아민 접합된 올리고 dT DNA(20mer)를 니트로 셀룰로스 멤브레인의 대조선 라인에 고정시켰다. 막을 데시케이터에서 1 일 이상 건조시키고 실온에서 보관하였다.
Alexa647 또는 금 나노 입자와 결합된 디텍션 압타머를 제작하였다.
2.5. LFA 분석
SARS-CoV-2 표면돌기 단백질이 샘플에 존재하면 Alexa647 또는 금 나노 입자와 결합된 디텍션 압타머가 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질과 결합하여 흡수 패드로 이동하였다.
Alexa647과 접합된 디텍션 압타머(서열번호 55)를 사용하는 LFA은 도 9A에 나타내었다. 테스트 라인의 캡쳐 압타머(서열번호 57)는 Alexa647과 접합된 디텍션 압타머와 함께 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질을 포획하여 테스트 라인에서 형광을 강화하였다. 결합되지 않은 디텍션 압타머는 흡수 패드로 계속 이동하였다. 대조군 라인의 올리고 dT DNA는 Alexa647과 접합된 올리고 dA DNA를 포획하여 대조군 라인에서 형광을 나타내었다.
금 나노 입자와 접합된 검출 압타머(서열번호 55)를 사용하는 LFA은 도 9B에 나타내었다. 테스트 라인의 캡쳐 압타머(서열번호 57)는 금 나노 입자와 접합된 디텍션 압타머와 함께 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질을 포획하여 테스트 라인에서 착색을 일으켰다. 결합되지 않은 디텍션 압타머는 흡수 패드로 계속 이동하였다. 대조군 라인의 올리고 dT DNA는 금 나노 입자와 결합된 올리고 dA DNA를 포획하여 대조군 라인에서 착색을 나타내었다.
표면돌기 단백질의 특정 검출에 필요한 적절한 조건을 결정하기 위해 LFA 의 실행 버퍼[40 mM HEPES(pH 7.5), 102 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.2% Tween-20, 4% sucrose, 0.5% BSA 및 0.2% sodium azide]에서 DxSO4의 효과를 조사하였다. LFA는 다양한 농도의 DxSO4(0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 200 μM, 1mM 및 2mM) 하에서 수행되었다. 비특이적 결합은 최소화되었고, 특이적 결합은 10 μM DxSO4 또는 그 이상의 농도에서 유지되었다.
마지막으로 80 μl의 실행 버퍼[40 mM HEPES(pH 7.5), 102 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.2% Tween-20, 4% sucrose, 0.5% BSA, 0.2% sodium azide 및 200 μM DxSO4]를 LFA의 샘플 패드에 적용하였다. 샘플 용액을 넣은 후 20 분 이내에 테스트 구역에서 양성 신호가 관찰되었다.
실시예 3. 압타머 기반 LFA의 검출 한계(Limit of Detection, LOD) 및 민감도 평가
다양한 농도의 SARS-CoV-2 표면돌기 단백질(0~0.5 pmol)을 사용하여 LFA를 수행하고 압타머 기반 LFA의 LOD를 결정한 결과, 0.05 pmol 이상의 표면돌기 단백질 농도에서 양성 신호가 관찰되었고(도 9A 및 9B), LFA의 LOD는 표면돌기 단백질 0.05 pmol보다 낮았다.
다음으로, 96 웰 플레이트에 SARS-CoV-2 표면돌기 S1 단백질 5 ug/ml(6.5pmol) 및 비특이 결합을 최소화하기 위해 경쟁자 역할을 수행하는 1 uM DxSO4를 첨가하여 LFA를 수행한 결과, 도 10과 같이 서열번호 3과 서열번호 2, 서열번호 3과 서열번호 5의 압타머를 각각 캡쳐 압타머 및 디덱션 압타머로 하였을 때, S1 단백질이 검출되었다.
또한, 서열번호 3과 서열번호 5의 압타머 쌍은 LF 버퍼 하(도 11) 또는 VTM(Viral Transport Medium) 하(도 12)에서 낮은 농도의 S1 단백질(~0.05 ug/ml(0.065 pmol)) 검출하였으며, 서열번호 3과 서열번호 2의 압타머 쌍은 VTM 하에서 낮은 농도의 S1 단백질(~0.05 ug/ml)을 검출하였다(도 13).
또한, DxSO4 없이 SB18 버퍼(40 mM HEPES, 105 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.05% [vol/vol] Tween-20 및 0.1 mg mL-1 bovine serum albumin, pH 8.0)에 혼합한 재조합 SARS-CoV-2 표면돌기 전체 단백질 6.5pmol, 8.97ug/ml에서 상기와 동일한 방법으로 검출 감도를 확인한 결과, 도 14와 같이 SARS-CoV-2 표면돌기 전체 단백질이 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 압타머 기반 LFA의 특이도 평가
다양한 코로나 바이러스(SARS-CoV-2, HKU1, OC43, SARS 및 MERS)의 다양한 표면돌기 단백질을 사용하여 압타머 기반 LFA를 수행하고 특이성을 평가하였다. 80 μl의 러닝 버퍼에 각각의 바이러스의 표면돌기 단백질 1 pmol을 포함하는 샘플을 LFA의 샘플 패드에 적용하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 표면돌기가 적용된 LFA는 양성 신호를 나타낸 반면(도 15), 다른 인간 베타 코로나 바이러스 HKU1 및 OC43의 표면돌기 단백질이 적용된 LFA의 테스트 라인에서는 많은 양의 표면돌기 단백질(각각 1pmol)이 분석에 사용되었음에도 불구하고 신호가 검출되지 않았다.
또한, LF 버퍼 하에서 서열번호 3과 서열번호 5의 압타머 쌍(도 11), VTM 하에서 서열번호 3과 서열번호 5의 압타머 쌍(도 12) 및 서열번호 3과 서열번호 2의 압타머 쌍(도 13)은 SARS 또는 MERS 유래 S1 단백질은 검출하지 않고 SARS-CoV-2의 S1 단백질만을 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명의 압타머 기반 LFA이 SARS-CoV-2에 매우 특이적이며 감기를 유발하는 HCoV HKU 및 HCoV OC43과 같은 다른 베타 코로나 바이러스에 감염된 환자 샘플에서 위양성 신호가 나타나지 않음을 나타내었다.
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에 따른 압타머는 SARS-CoV-2의 다양한 부위에 특이적으로 결합하고, SARS-CoV-2 단백질에 대해 높은 민감도 및 특이도를 나타내는 것을 확인하였는 바, SARS-CoV-2 의 진단 용도로 적용할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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60
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60
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<222> (49)
<223> W is NapdU.
<400> 58
cctgcctttg cggaggwgaa ccwwacgwwc aacwggawcg wgwgwaggwa caccgacagc 60
60
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<223> Primer_F-1
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<212> DNA
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<220>
<223> Primer_F-2
<400> 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prime_R-1
<400> 61
ctgggtggct gtcggtg 17
<210> 62
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer_R-2
<400> 62
ggctggtggt gtggctg 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer_3'-1
<400> 63
caccgacagc cacccag 17
<210> 64
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer_3'-2
<400> 64
cagccacacc accagcc 17
Claims (13)
- 서열번호 1 내지 58의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, SARS-CoV-2 표면돌기(spike)에 특이적으로 결합하는, 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 이의 5' 말단 및 3' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 1 내지 30 개의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인, 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 30 내지 150 개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 서열번호 1 내지 58의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상동성이 90% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 이의 폴리뉴클레오티드 서열을 이루는 하나 이상의 뉴클레오티드에 하기 중 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것인, 압타머:
i) 하나 이상의 뉴클레오티드 중 T 염기의 5번 탄소가 벤질기, 나프틸기, 2-나프틸기, 피롤벤질기 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 치환;
ii) 하나 이상의 뉴클레오티드 내 2번 탄소 위치에서 -OH 기가 데옥시(deoxy), 메톡시(methoxy), 아미노(amino) 및 불소(F)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 치환; 및
iii) 하나 이상의 뉴클레오티드가 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트, LNA(Locked Nucleic Acid), PNA(Peptide Nucleic Acid) 및 HNA(Hexitol Nucleic acid)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 이의 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 5' 말단 및 3' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 PEG(폴리에틸렌 글리콜), HEG(헥사 에틸렌 글리콜), idT(inverted deoxythymidin, 역-데옥시티미딘), 비오틴, 형광물질, 아민 링커, 티올 링커, 콜레스테롤 및 지방산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 접합된 것인, 압타머.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 압타머를 포함하는, SARS-CoV-2 진단용 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 압타머 중 선택되는 어느 1종 이상을 포함하는, SARS-CoV-2 진단용 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 분리된 생체 시료 내에 존재하는 SARS-CoV-2를 표지하는 압타머는 착색미립자, 발색효소, 형광물질 및 방사선 동위원소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 결합된 것인, 키트.
- 제7항의 조성물을 개체로부터 분리된 생체 시료와 접촉하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 방법은 측면 유동 분석(lateral flow assay, LFA) 유형 테스트, 면역 흡착 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 유형 테스트, 전계 효과 트랜지스터(field-effect transistor, FET) 유형 테스트 및 방사 면역 분석(radioimmunoassay, RIA) 유형 테스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 생체 시료는 생물학적 샘플, 환경 샘플, 약제학적 샘플, 식품 샘플, 농업 샘플 및 가축 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 생체 시료는 코 분비물(nasal swab), 인후 분비물(throat swab), 전혈(whole blood), 혈장, 혈청, 가래(sputum), 입깁(breath), 소변, 정액, 침(saliva), 뇌막액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 세포, 세포 추출물, 대변(stool), 조직 추출물, 조직 생검 및 뇌척수액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| KR1020200096888 | 2020-08-03 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210052645A KR20220016769A (ko) | 2020-08-03 | 2021-04-22 | 신종 코로나바이러스 특이적 압타머 및 이의 이용 |
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT202200009554A1 (it) * | 2022-05-10 | 2023-11-10 | Instantechnologies S R L | Aptameri nucleotidici per il riconoscimento della proteina spike del sars-cov-2 |
| KR20240173242A (ko) | 2023-06-01 | 2024-12-11 | 대한뉴팜(주) | 압타머-펩타이드 접합체 |
-
2021
- 2021-04-22 KR KR1020210052645A patent/KR20220016769A/ko not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Chunqin Long, et al., Diagnosis of the Coronavirus disease (COVID-19): rRT-PCR or CT?, Eur J Radiol. 2020 May; 126: 108961. |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT202200009554A1 (it) * | 2022-05-10 | 2023-11-10 | Instantechnologies S R L | Aptameri nucleotidici per il riconoscimento della proteina spike del sars-cov-2 |
| KR20240173242A (ko) | 2023-06-01 | 2024-12-11 | 대한뉴팜(주) | 압타머-펩타이드 접합체 |
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