KR102275304B1 - 대리 바이러스를 이용한 압타머 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스를 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계를 포함하는, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스를 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계를 포함하는, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스와 순수 분리한 표적 단백질을 번갈아 사용하여 결합력과 특이도가 높은 압타머를 효율적으로 개발하는 방법에 관한 것이다.
압타머(aptamer)란 특정 표적에 높은 친화도와 특이성을 갖는 약 20내지 100 뉴클레오티드(nucleotides) 크기의 DNA, RNA, 또는 그 유도체를 의미한다. 압타머들은 항체와 같이 표적 단백질에 강하면서 특이적으로 결합하는 성질을 가지고 있으므로 진단이나 치료 목적으로 항체 대신 사용된다 (Jo,H and Ban, C. et. al, Experimental & Molecular Medicine volume 48, page e230 (2016)). 압타머는 생산 과정이 화학 합성을 통하여 이루어지므로 항체에 비해서 생산이 용이하고, 품질 표준화(quality control)가 쉽고, 상온 보관 시의 안정성이 높은 장점 등이 있다.
압타머를 발굴하는 방법은 일반적으로 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 통하여 이루어진다. SELEX를 통하여 여러 종류의 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머들을 찾아낼 수 있지만 사용자가 원하는 특성을 가지는 압타머를 찾아내기 위해서는 기본적인 SELEX 방법을 변화시켜서 원하는 특성을 가지는 압타머를 따로 응축(enrichment)시키는 방법을 고안하여야 한다. 세포질에 존재하는 단백질들은 과발현시킨 후, 순수분리하는 것이 비교적 용이하여 순수 분리한 후에 SELEX를 위한 표적 단백질로 사용할 수 있다. 그러나, 세포막에 존재하는 단백질들의 경우에는 당화(glycosylation)되어 있고 소수성 부분이 단백질의 바깥에 노출되어 있어서 자연상태의 형태로 순수 분리하는 것이 어렵다. 따라서 자연 상태의 표적 단백질에 잘 결합하는 압타머들을 응축시키기 위한 SELEX 과정에 표적으로 사용할 수 있는 상기 단백질을 준비하기에 많은 어려움이 있다. 게다가 병원성 바이러스나 박테리아의 표면에 있는 단백질 표적들에 대한 압타머를 개발하는 과정에서는 이 병원체들을 그대로 표적으로 사용하여 SELEX를 하는 경우에서 감염이 우려되기 때문에 특별한 장치 내에서 허가 받은 사람들만 압타머를 개발해야 하므로 만족하는 조건들을 갖추기가 매우 어렵다.
이 문제를 극복하기 위해서 세포막 단백질에서 세포막 바깥에 있는 단백질 부분만 발현시켜 재조합 단백질을 생산하고 분리해서 표적 단백질로 이용하여 SELEX하는 경우들이 많다. 그러나, 이 경우에는 세포막을 가로지르는 부위가 제거된 새로운 단백질을 사용하게 되므로 실제로는 자연 상에 존재하지 않는 새로운 단백질 면이 생기고 homo-dimer나 trimer 등의 결합 단백질로 존재하는 경우 변형된 단백질에서는 자연계에 존재하는 형태의 결합체가 만들어지지 않을 수도 있다. 압타머는 표적의 삼차원적인 구조를 인식하여 결합하므로 압타머 선별과정에서 사용되는 표적의 구조가 선별된 압타머의 결합력이나 특이성에 매우 중요하게 작용한다. 따라서 변형된 SELEX를 진행하게 되면 실제 단백질에는 결합하지 못하거나 낮은 결합력을 갖거나 좋은 특이성을 갖지 못하는 압타머를 발굴할 가능성이 높다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 자연상태의 단백질과 유사한 조건으로 결합하는 압타머를 제조하는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 대리 바이러스를 이용할 경우 실제 단백질과 결합력이 우수하고 높은 특이성을 갖는 압타머를 제조함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스를 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계를 포함하는, 변형된 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 수행하여 압타머를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 압타머를 제조하는 방법으로부터 제조된 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 압타머를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 핵산서열로 이루어진 압타머를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 압타머를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 핵산서열로 이루어진 압타머를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염용 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 변형된 SELEX 방법을 이용하여 실제 단백질에 결합력이 우수하고 높은 특이성을 갖는 압타머를 제조할 수 있다.
도 1. 배큘로바이러스를 재조합하여 제작한 대리 바이러스와 여러 가지의 bead간의 결합 정도를 Sypro ruby staining으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2. 배큘로바이러스를 재조합하여 제작한 대리 바이러스와 여러 가지의 bead간의 최대 결합율을 Sypro ruby staining으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3. 대리 바이러스가 2mM NaOH를 처리한 상황에서도 Talon bead와 결합을 유지하고 있는 지를 Sypro ruby staining으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4. 대리 바이러스가 2mM NaOH를 처리한 상황에서도 Streptavidin Ultralink bead와 결합을 유지하고 있는 지를 Sypro ruby staining으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5. 대리 바이러스와 단일 사슬 변형 핵산 라이브러리와의 비특이적 결합을 저해하는 조건을 찾은 결과를 나타낸 것이다.
도 6. 대리 바이러스를 사용한 SELEX에 적합한 DxSO4 조건을 찾은 결과를 나타낸 것이다.
도 7. 대리 바이러스를 사용한 SELEX를 통해 얻은 eDNA가 대리 바이러스에 결합하는 것을 필터결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a. 대리 바이러스의 생성을 Western blot 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다
도 8b. 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 생산하고 분리정제한 표적 단백질의 바이러스 외피 바깥 부위에 해당하는 polypeptide를 Western blot 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9. 압타머의 표적 단백질에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10. 압타머의 특이성을 보여주는 결과로 표적 단백질과 비표적 단백질에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11. 압타머의 표적 대리 바이러스에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 표적인 A형 인플루엔자 바이러스의 HA가 발현되지 않은 막 바이러스에는 압타머가 결합하지 않고, 표적이 발현된 바이러스에만 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
도 12. 압타머의 A형 인플루엔자 바이러스(H3N2)에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13. 실시예 3의 방법으로 발굴한 압타머의 표적 단백질에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14. 실시예 3의 방법으로 발굴한 압타머의 특이성을 보여주는 결과로 표적 단백질과 비표적 단백질에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15. 실시예 3의 방법으로 발굴한 압타머의 특이성을 보여주는 결과로 측면유동법을 통하여 발굴된 압타머가 실제 바이러스에 결합하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16. 대리 바이러스를 이용한 SELEX 방법을 개략적으로 표현한 모식도이다.
도 2. 배큘로바이러스를 재조합하여 제작한 대리 바이러스와 여러 가지의 bead간의 최대 결합율을 Sypro ruby staining으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3. 대리 바이러스가 2mM NaOH를 처리한 상황에서도 Talon bead와 결합을 유지하고 있는 지를 Sypro ruby staining으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4. 대리 바이러스가 2mM NaOH를 처리한 상황에서도 Streptavidin Ultralink bead와 결합을 유지하고 있는 지를 Sypro ruby staining으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5. 대리 바이러스와 단일 사슬 변형 핵산 라이브러리와의 비특이적 결합을 저해하는 조건을 찾은 결과를 나타낸 것이다.
도 6. 대리 바이러스를 사용한 SELEX에 적합한 DxSO4 조건을 찾은 결과를 나타낸 것이다.
도 7. 대리 바이러스를 사용한 SELEX를 통해 얻은 eDNA가 대리 바이러스에 결합하는 것을 필터결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a. 대리 바이러스의 생성을 Western blot 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다
도 8b. 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 생산하고 분리정제한 표적 단백질의 바이러스 외피 바깥 부위에 해당하는 polypeptide를 Western blot 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9. 압타머의 표적 단백질에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10. 압타머의 특이성을 보여주는 결과로 표적 단백질과 비표적 단백질에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11. 압타머의 표적 대리 바이러스에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 표적인 A형 인플루엔자 바이러스의 HA가 발현되지 않은 막 바이러스에는 압타머가 결합하지 않고, 표적이 발현된 바이러스에만 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
도 12. 압타머의 A형 인플루엔자 바이러스(H3N2)에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13. 실시예 3의 방법으로 발굴한 압타머의 표적 단백질에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14. 실시예 3의 방법으로 발굴한 압타머의 특이성을 보여주는 결과로 표적 단백질과 비표적 단백질에 대한 결합력을 필터 결합 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15. 실시예 3의 방법으로 발굴한 압타머의 특이성을 보여주는 결과로 측면유동법을 통하여 발굴된 압타머가 실제 바이러스에 결합하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16. 대리 바이러스를 이용한 SELEX 방법을 개략적으로 표현한 모식도이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스를 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계를 포함하는, 변형된 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 수행하여 압타머를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일반적인 SELEX를 통하여 여러 종류의 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머들을 제조하는 경우, 분리 또는 정제된 단백질을 이용하는 경우가 대부분이다. 이 경우, 세포막에 존재하는 단백질들의 경우에는 자연상태의 형태로 순수 분리하는 것이 어려우며, 병원성 바이러스나 박테리아의 표면에 있는 단백질 표적들에 대한 압타머를 개발하는 과정에서는 이 병원체들을 그대로 표적으로 사용하여 SELEX를 하는 경우에서 감염이 우려되기 때문에 어려운 문제점이 있다. 그러나, 본 발명의 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법을 이용하는 경우, 실제 자연상태의 단백질과 유사한 조건의 단백질을 이용하여 압타머를 제조할 수 있으므로, 실제 단백질과 결합력이 우수하고 높은 특이성을 갖는 압타머를 제조할 수 있다는 점에서 의의가 크다고 할 수 있다.
본 발명에서 용어, "SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)"는 압타머를 선별하는 방법이다. 일반적으로 공지된 방법의 경우(Stoltenburg at al. Biomol Eng. 2007 Oct;24(4):381-403. Epub 2007 Jun 16), 표적 단백질을 무작위적인 염기서열을 가진 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 DNA (single-stranded DNA = ssDNA) 또는 단일 가닥 RNA (single-stranded RNA = ssRNA) 라이브러리와 함께 일정 온도에서 반응시킨 후에, 표적 단백질로부터 적절한 방법으로 DNA/RNA와 따로 침전시킨다. 단백질 침전물을 씻어서 결합하지 않은 뉴클레오티드를 제거한다. 단백질과 결합해 있는 뉴클레오티드를 단백질에서 분리한 후에 DNA의 경우에는 PCR(polymerase chain reaction)으로 RNA의 경우에는 reverse transcription PCR(RT-PCR)을 통해 증폭시킨다. RNA 압타머의 경우에는 증폭된 DNA를 주형으로 이용하고 RNA polymerase를 사용하여 합성하고 다음 단계의 SELEX를 수행한다. 이렇게 특정 표적 단백질과 선택적으로 결합하는 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드를 결합(nucleotide-protein interaction), 침전(nucleotide-protein complex precipitation), 세정(washing), 분리(dissociation of nucleotide from protein), 증폭(amplification of nucleotide) 과정을 여러 차례 반복함으로써 표적 단백질에 선택적으로 매우 결합을 하는 압타머를 찾아내는 것이다.
본 발명의 경우, 상기와 같은 일반적인 SELEX 방법을 변형하여 사용하였으며, 그에 관한 구체적인 방법에 대하여는 하기에 기재되어 있다.
본 발명의 목적상 대리 바이러스는 외피(envelope)에 표적 단백질이 발현된 것을 특징으로 하며, 상기 표적 단백질은 자연계에 상응하는 표적 단백질과 동일하거나 75% 이상의 유사한 형태일 수 있으며, 구체적으로는 80%, 85%, 90% 95% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱이 본 발명의 대리 바이러스는 자연계에 존재하는 이량체, 다량체등의 3차원 구조를 그대로 모사하거나 75% 정도로 모사하므로 목적하는 압타머를 효율적으로 제조할 수 있다.
특히, 기존의 SELEX 방법에는 분리 또는 정제된 표적 단백질을 이용하는 경우 자연계에 존재하는 형태의 결합체가 만들어지지 않는 문제점이 있었으나, 대리 바이러스를 이용한 본 발명의 변형된 SELEX를 진행하게 되면 실제 단백질과 결합력이 우수하고 높은 특이성을 가지는 압타머를 발굴할 가능성이 높다.
본 발명의 일 실시예에서도 본 발명의 새롭게 변형된 SELEX 방법을 이용하여 얻은 압타머가 실제 표적 바이러스(인플루엔자 바이러스 아형 H3N2)에 높은 결합력을 보이는 것을 확인하였다(도 12).
본 발명에서 용어, "대리 바이러스(surrogate virus)"는 SELEX 과정에서 순수분리하기 어려운 단백질(예, Transmembrane 도메인을 포함하고 있는 바이러스 및 세포의 표면단백질들)을 사용하는 대신에 표적 단백질을 표면에 발현시킬 수 있는 바이러스를 의미한다. 대리 바이러스는 비드에 결합되어 변형된 SELEX를 수행할 수 있다.
상기 대리 바이러스는 외피(envelope)에 표적 단백질이 발현된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "바이러스의 외피(envelope)"는 인지질 이중막으로 구성된 것을 의미한다. 바이러스는 외피를 보유하고 있는 바이러스와 외피를 보유하고 있지 않은 바이러스로 분류되며, 본 발명의 목적상 대리 바이러스는 바이러스 외피를 보유하고 있는 바이러스 일 수 있으며, 상기 대리 바이러스는 바이러스의 외피에 표적 단백질을 온전하게 발현시킬 수 있는 바이러스 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 외피보유 바이러스는 구체적으로 외피보유 DNA 바이러스 또는 외피보유 RNA 바이러스로 분류될 수 있다.
구체적으로 외피보유 DNA 바이러스는 배큘로바이러스(Baculovirus), 헤파드나바이러스(Hepadnavirus), 헤르페스바이러스(Herpesvirus), 폭스바이러스(poxvirus), 및 백시니아바이러스(vacciniavirus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으며, 외피보유 RNA 바이러스는 코로나바이러스(Coronavirus), 플라비바이러스(Flavivirus), 토가바이러스(Togavirus), 알파바이러스(Alphavirus), 아레나바이러스(Arenavirus), 버냐바이러스(Bunyavirus), 피로바이러스(Filovirus), 오소믹소바이러스(Orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(Paramyxovirus), 랍도바이러스(Rhabdovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 및 렌티바이러스(Lentivirus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 인체에 감염성이 없고 인지질 이중막으로 구성되어 있는 세포막이나 바이러스의 외피에 단백질들을 발현시킬 수 있는 것이면, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 본 발명에서는 일 예로 인체 감염성이 없는 바이러스 배큘로바이러스를 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "핵산 라이브러리"는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 기반의 다양한 형태를 가지는 라이브러리를 의미한다. 본 발명의 목적상 핵산 라이브러리는 다양한 표적 단백질과 결합할 수 있는 핵산 구조체들의 집합을 의미한다. 구체적으로 상기 핵산 라이브러리는 단일가닥 핵산 또는 핵산 유도체, 이중가닥 핵산 또는 핵산 유도체 중 어느 하나 이상인 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 핵산 라이브러리는 목적하는 압타머의 성질에 따라 제조자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 변형된 SELEX에 적절한 변형된 핵산 라이브러리를 제조하기 위하여 비오틴(Biotin)이 결합된 안티센스 라이브러리를 이용하였으며, 이를 통해 단일 사슬 변형 핵산 라이브러리를 추출한 후 이를 사용하였다.
또한, 상기 방법은 (a) 바이러스, 박테리아 또는 진핵 세포를 이용한 유전자 발현 시스템을 이용하여, 별개로 분리 정제된 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계; 또는 (b) 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계를 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스를 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계와 1회 이상 교차로 수행하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 일반적으로 사용되는 SELEX의 과정이 추가로 포함될 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 방법은 실제 단백질과 결합력이 우수하고 높은 특이성을 갖는 압타머를 제조하기 위하여 표적 단백질이 발현된 바이러스를 대량생산하고, 상기 대량생산된 바이러스로부터 분리 정제된 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계를 포함하여, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조할 수 있으며, 및/또는 상업적 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계를 바이러스 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스를 핵산 라이브러리와 접촉시키는 단계와 1회 이상 교차로 사용하는 방법 포함할 수 있다. 이와 같은 1회 이상 반복 수행하는 과정 중 핵산 라이브러리는 바로 전 라운드(round)에서 선택된 핵산들의 총집합체일 수 있다.
상기 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법의 각 단계에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(a) 단계는 바이러스, 박테리아 또는 진핵 세포를 이용한 유전자 발현 시스템을 이용하여, 별개로 분리 정제된 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계이다.
본 발명에서 용어, "표적 단백질"은 압타머가 높은 친화성 및 특이성으로 결합할 수 있도록 하는 목적 물질로서, 본 발명의 목적상 표적 단백질은 압타머를 제조하기 위하여 결합할 수 있는 표적 단백질이면 그 종류에 제한되지 않는다. 상기 표적 단백질은 바이러스, 박테리아 및 진핵 세포를 이용한 유전자 발현 시스템을 이용하여 표적단백질을 대량 생산할 수 있다.
구체적으로 동물의 세포막 단백질, 식물의 세포막 단백질, 미생물의 세포막 단백질 및 바이러스의 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 인플루엔자 바이러스 아형 H3N2, HA, NA을 표적 단백질로 하여 압타머를 제조하였다.
(b) 단계는 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계이다.
상기 표적 단백질은 상업적으로 판매되는 분리 정제된 표적 단백질 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 상기 (i) 바이러스, 박테리아 또는 진핵 세포를 이용한 유전자 발현 시스템을 이용하여, 별개로 분리 정제된 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키거나, (ii) 표적 단백질을 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 것을 1회 이상 교차로 수행하는 것에 특징이 있다. 교차로 수행하는 경우 대리 바이러스의 외피에 있는 표적 단백질을 이용하여 자연 상태의 조건의 단백질과 결합할 수 있어 실제 단백질에 결합하고, 높은 결합력 및 특이성을 갖는 압타머를 제조할 수 있으며, 상업적 표적 단백질을 포함한 분리된 표적 단백질을 이용하는 경우에는 대리 바이러스를 이용하는 경우 표적 단백질 이외의 다른 부위에 비특이적으로 결합하는 것을 제외할 수 있어 정확도를 높일 수 있기 때문에 본 발명의 목적상 상기 방법을 1회 이상 교차로 이용할 수 있다. 상기 반복 단계는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회 이상 등 특이도가 높은 압타머를 제조할 수 있는 횟수까지 제한 없이 수행될 수 있다.
또한, 상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합하는 것만을 선택적으로 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합되지 않은 것만을 선택적으로 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합하는 것만을 선택적으로 분리하는 단계에서는 2가 양이온을 포함하는 완충액을 사용할 수 있다. 상기 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ 및 Fe2+로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으며, 완충액의 농도는 0 mM 내지 1M 이하의 농도일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 완충액은 음전하 폴리머를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 음전하 폴리머는 덱스트란 설페이트, 다중 음이온성 셀룰로즈, 히알루론 산, 다중 음이온성 헤파린, 폴리설포네이트 폴리머, 다중 음이온성 덴드리머, 카복시메틸 덱스트란, 헤파린, 아우린트리카트복실산, 및 수라민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 음전하 폴리머는 0 mM 내지10mM 이하의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합되지 않은 것만을 선택적으로 분리하는 경우, 음전하 폴리머를 포함하는 완충액을 사용할 수 있다. 상기 음전하 폴리머 중 덱스트란 설페이트(DxSO4)를 0mM 내지 50mM 이하의 농도로 포함하는 완충액을 사용할 수 있다. 구체적으로, SELEX를 실시하기에 앞서서 단일사슬 핵산 라이브러리와 대리 바이러스간의 비특이적 결합을 저해하기 위하여 DxSO4를 반응액에 넣어주는 경우, 대리 바이러스에 비 특이적으로 결합하는 핵산 라이브러리를 효과적으로 제거할 수 있다.
상기 본 발명의 용어 "결합된 구조체"는 (i) 표적 단백질이 발현된 바이러스를 대량생산하여 분리 정제된 표적 단백질을 바이러스의 외피에 표적 단백질, 또는 (ii) 표적 단백질이 핵산 라이브러리와 결합된 물질로서, 압타머 후보 분자들을 의미한다.
상기 결합된 구조체는 대리 바이러스가 자성 비드(bead) 또는 비자성 비드에 결합하여 고정화된 상태에서 특이도를 갖는 핵산 라이브러리와 결합된 것일 수 있다. 이 후, 비드에 결합되어 고정화된 구조체만을 선별하는 과정을 거치게 된다.
구체적으로 상기 자성 비드는 탈론, 다이나비드, 아가로스, 세파로스, 및 스트렙토아비딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으며, 비자성 비드는 아가로스, 세파로스, 스트렙토아비딘-아가로스, 스트렙토아비딘-세파로스, 조벡스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 탈론, 스트렙토아비-세파로스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 일 예로 대리 바이러스와 상기 비드간의 결합 비율은 비드와 바이러스의 양이 최대 10 pmole인 경우가 효과적이나, 비드의 종류 또는 바이러스의 종류에 따라 달라질 수 있는바, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 선택적으로 분리된 구조체로부터 핵산을 분리하여 증폭하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 일반적으로 사용되는 SELEX의 방법은 제한 없이 추가될 수 있다.
본 발명의 방법은 (a) 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스를 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계; (b) (i) 표적 단백질이 발현된 바이러스로부터 분리 정제된 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계; 또는 (ii) 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계; (c) 상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합하는 것만을 선택적으로 분리하는 단계; (d) 상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합되지 않은 것만을 선택적으로 제거하는 단계; 및 (e) 상기 선택적으로 분리된 구조체로부터 핵산을 분리하여 증폭하는 단계를 1회 이상 반복 수행하는 방법으로부터 제조된 압타머 를 회수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 회수된 압타머인 eDNA를 이용하여 변형된 SELEX의 단계, 즉 상기 방법을 반복 수행하는데 사용하였다. 또한, eDNA가 제대로 선별되었는지 필터 결합 분석법을 통하여 확인한 결과, 각 라운드에서 합성된 eDNA들이 대리 바이러스에 잘 결합하는 것을 확인하였다(도 7).
또한, 표적 단백질로 인플루엔자 바이러스를 이용하여 본 발명의 변형된 SELEX 방법을 이용하여 얻은 압타머가 실제 표적 단백질인 인플루엔자 바이러스에 높은 결합력을 나타내는지 확인한 결과, 표적 단백질에만 특이적으로 결합하고 다른 subtype 인플루엔자의 유사한 단백질과는 결합하지 않는 것을 확인하였다(도 10 및 도 12).
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스를 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계; (b) 선택적으로 (i) 바이러스, 박테리아 또는 진핵 세포를 이용한 유전자 발현 시스템을 이용하여, 별개로 분리 정제된 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계; 또는 (ii) 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계; (c) 상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합하는 것만을 선택적으로 분리하는 단계; (d) 상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합되지 않은 것만을 선택적으로 제거하는 단계; 및 (e) 상기 선택적으로 분리된 구조체로부터 핵산을 분리하여 증폭하는 단계;를 포함하여, 상기 (a) 내지 (e) 단계를 1회 이상 반복 수행하는 방법으로부터 제조된 압타머를 제공하는 것이다.
상기 압타머는 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 핵산서열을 포함하는 압타머로서, 상기 압타머는 인플루엔자 H3N2 바이러스에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 것인, 압타머를 제공하는 것이다.
상기 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 9 중 어느 것과도 75% 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 압타머는 하나 이상의 스템-루프 (stem-loop) 구조를 갖는 것일 수 있으며, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 핵산 서열 또는 이와 80% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 아미노산은 서열번호 1 내지 서열번호 9 및 상기 서열번호와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상동성(homology) 및 동일성(identity)은 두 개의 주어진 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 압타머는 예를 들어 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소와 같은 검출 가능한 분자로 표지 될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 압타머는 분광, 광화학, 형광, 생화학적, 면역 화학적 또는 화학적 수단을 포함하는 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출 가능한 표지를 혼입함으로써 표지할 수 있다. 유용한 검출 분자로는 방사성 물질 (32P, 35S, 3H, 125I), 형광 염료 (5-bromodesoxyuridin, fluorescein, actey laminofluorene, digoxygenin) 또는 비오틴 등이 있다.
본 발명에 따른 압타머는 인플루엔자 바이러스, 구체적으로는 인플루엔자 바이러스 HA, NA 단백질에 대한 결합 특성을 크게 변화시키지 않으면서 이들의 3'- 말단 또는 5'- 말단 뉴클레오티드에서 표지될 수 있으나, 본 발명의 목적상 대리 바이러스를 이용하여 대리 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현될 수 있는 것이면 이에 제한 되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (i) 인플루엔자 H3N2 바이러스에 특이적으로 결합하는 압타머로 개체에 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (ii) (i)단계의 압타머와 결합된 샘플에서 인플루엔자 H3N2 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 H3N2 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 용어 "샘플"은 환자, 피험자, 개체로부터 파생된 모든 생물학적 샘플을 의미한다. 구체적으로 환자로부터 수득된 다양한 샘플 유형을 포함하며 진단 분석에 사용될 수 있다. 또한, 상기 샘플은 개인의 샘플과 같은 임의의 유형의 샘플, 또는 실험실 배양액, 비강쇄 세정액, 누출구, 호흡 기관 면봉, 목구멍 면봉, 기관지 면봉 (tracheal)등을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 인플루엔자 H3N2 바이러스를 함유하거나 포함하는 것으로 의심되는 배양 샘플일 수 있다.
또한, 상기 방법은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 핵산서열을 포함하는 압타머로서, 상기 압타머는 인플루엔자 H3N2 바이러스에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 압타머를 운반하는 고체 지지체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 고체 지지체는 금 나노입자, 은 나노입자, 형광 나노입자 또는 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 압타머를 사용하여 검출하는 방법 및/또는 정량화 방법은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 일 예로, 바람직하지 않은 단백질을 제거 하기 위해, 환자로부터의 샘플을 접촉시키거나, 연어 정자 DNA와 같은 올리고 뉴클레오타이드 또는 전하를 갖는 중합체로부터 선택된 샘플에서 인플루엔자 H3N2 바이러스의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 전하를 갖는 중합체는 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 폴리 음이온성 셀룰로스 중합체(polyanionic cellulose polymer), 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리 음이온 헤파린(polyanionic heparin), 폴리 설포네이트 중합체(polysulfonate polymer), 폴리 음이온성 덴드리머(polyanionic dendrimer), 카르복시 메틸-덱스트란(carboxymethyl-dextran), 헤파린(heparin), 아우린 트리 카르복실산(aurintricarboxylic acid) 또는 수라민(suramin) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 또한, 전하를 갖는 중합체의 평균 분자량은 1,000,000 Da보다 클 수 있다. 전하를 갖는 중합체의 농도는 0 내지 10 mM의 범위 일 수 있다. 특히, 유체 샘플에서 비특이적 결합을 감소시키는 효과를 효과적으로 달성하기 위해, 유체 샘플에서 전하를 갖는 중합체의 농도는 0.01 내지 10 mM, 구체적으로는 0.01 내지 0.1 mM, 더욱 구체적으로는 0.01 내지 10 mM, 0.01 mM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 인플루엔자 H3N2 바이러스에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 핵산서열로 이루어진 압타머를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 압타머를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다. 본 발명에서, 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 구체적으로는 면역 크로마토그래피법(immunochromatographic assay: ICA)을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 방법으로 발굴된 압타머를 사용하여 측면유동법 방식의 진단키트를 제작하고 바이러스가 없는 샘플과 바이러스가 있는 샘플을 각각 처리하여 표적 단백질에 대한 결합여부를 확인하였다. 그 결과, 바이러스가 없는 샘플에서는 아무 시그널도 표지되지 않지만 바이러스가 있는 샘플에서는 멤브레인의 중앙에 원형으로 시그널이 표지되는 것을 확인하였다(도 15).
이는, 상기 압타머를 포함하는 본 발명의 키트는 이는, 인플루엔자 바이러스의 감염 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 인플루엔자 H3N2 바이러스에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 핵산서열로 이루어진 압타머를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염용 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서의 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스로 인하여 발병되는 감기, 독감 등의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스로 인하여 발병되는 감기, 독감 등의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 인플루엔자 바이러스로 인하여 발병되는 감기, 독감, 유행성 독감, 바이러스형 비인두염, 급성 비염 등의 예방 또는 치료는 상기 압타머에 의해 감기, 독감, 유행성 독감, 바이러스형 비인두염, 급성 비염 등의 증세의 완화 효과를 나타냄에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 압타머의 함량은 약학 조성물이 발달장애에 대한 예방 또는 치료 효과를 가지는 한 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 동물에 하루 동안 0.1 내지 500 mg/체중 kg으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 인플루엔자 바이러스로 인하여 발병되는 감기, 독감 유행성 독감, 바이러스형 비인두염, 급성 비염 등이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스로 인하여 발병되는 감기, 독감 유행성 독감, 바이러스형 비인두염, 급성 비염 등의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 예방 및 치료는 상기에서 설명한 바와 같다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 압타머는 인플루엔자 바이러스로 인하여 발병되는 감기, 독감 유행성 독감, 바이러스형 비인두염, 급성 비염 등의 예방 또는 치료 효과를 가지는 바, 이를 포함하는 약학 조성물을 인플루엔자 바이러스로 인하여 발병되는 감기, 독감 유행성 독감, 바이러스형 비인두염, 급성 비염 등을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란 인플루엔자 바이러스로 인하여 발병되는 감기, 독감 등이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등의 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 인플루엔자 바이러스로 인하여 발병되는 감기, 독감 유행성 독감, 바이러스형 비인두염, 급성 비염 등을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 압타머가 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 배큘로 바이러스 유래의 대리 바이러스를 사용한 SELEX
표적 단백질을 외피에 발현시킬 수 있는 대표적인 대리 바이러스로 배큘로 바이러스를 선택하여 실험을 수행하였다.
배큘로 바이러스를 이용한 단백질 발현시스템을 사용하여 배큘로 바이러스 표면(외피)에 표적 단백질을 가지고 있는 대리 바이러스를 유전자 재조합 방법을 이용하여 제작하고, 이 대리 바이러스를 사용하여 SELEX를 진행하였다. 구체적으로, 야생형 배큘로 바이러스와 TNF(tumor necrosis factor) 수용체 단백질을 외피에 가지고 있는 대리 바이러스를 제작하여 대조군으로 사용하였다.
1-1. 배큘로 바이러스를 변형한 대리 바이러스의 제작, 대량 생산 및 분리
배큘로 바이러스 발현 벡터인 pFastBac (ThermoFisher, Cat No.10359016)에 His tag 또는 Flag tag과 표적 단백질(TNF(tumor necrosis factor) 수용체 단백질)의 유전자를 삽입하여 클로닝한 후 배큘로 바이러스 박미드(bacmid)에 전이시켜 재조합 배큘로 바이러스 DNA를 제조하였다. 곤충 유래 세포인 Sf9 세포에 형질도입(Transfection)하여 표적 단백질을 가지고 있는 대리 배큘로 바이러스를 제조하였다. 이 후, 표적 단백질을 가지고 있는 배큘로 바이러스(대리 바이러스)를 대량 배양한 후 바이러스들만 분리한 후에 농축하였다(Margine, I., Palese, P. and Krammer, F. (2013), J Vis Exp, e51112.).
1-2. 대리 바이러스와 bead와의 결합 확인
SELEX 과정에서는 핵산 라이브러리(DNA 또는 RNA)에서 표적 물질에 결합하는 핵산과 결합하지 않는 핵산들을 분리(fractionation)해내는 과정이 반드시 필요하며, 효과적으로 표적 단백질과 결합하는 핵산들을 결합하지 않는 핵산들로부터 따로 분리하기 위하여 표적 단백질을 따로 모을 수 있는 방법이 필요하다. 일반적인 SELEX에서는 표적 단백질을 비드(bead)에 고정하는 방법을 이용한다.
실시예 1-1의 배큘로 바이러스에서 유래한 대리 바이러스에 결합하는 적절한 비드를 찾기 위하여 다양한 비드(Streptavidin UltraLink Resin (Pierce), Dynabead Talon (Invitrogen), Streptavidin Mag Sepharose bead (GE healthcare))를 동일량으로 대리 바이러스에 결합시켰다. 또한, 대리 바이러스를 비오틴(biotin)과 공유결합 시킨 것(covalently conjugated)과 그렇지 않은 것으로 나누어 각각의 비드와 결합시켰다.
그 결과, 비오틴과 결합한(biotinylated) 바이러스와 결합하지 않은 바이러스 모두 Streptavidin Ultralink Resin 및 Talon bead와 잘 결합하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 탈론 비드(Talon bead)를 사용하였을 때 가장 효과적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 1).
1-3. 대리 바이러스와 비드와의 결합 비율
대리 바이러스와 bead간의 결합 가능한 최대량을 알기 위하여 Talon bead양을 고정시킨 후 바이러스 양을 각각 다르게 하여 결합시키는 실험을 수행하였다.
그 결과, 10pmole의 bead를 사용하였을 때, 바이러스 양이 10pmole을 넘어서면 바이러스가 bead에 더 이상 결합하지 못하고 혼합액에 남게 되는 것을 확인하였다.
이를 통해, bead와 바이러스가 각각 10pmole일 때 bead에 바이러스가 최대로 결합되며, 효율적으로 바이러스를 고정시키기 위해서는 10pmole보다 적은 양을 사용하여야 함을 알 수 있다 (도 2).
1-4. 표적 단백질에서 핵산을 용출하는 과정에서의 대리 바이러스와 bead 간의 결합
일반적으로 표적 단백질에 결합한 핵산을 표적 단백질로부터 분리 시킬 때 2mM의 NaOH(pH 11)를 사용하게 되는데, 이러한 높은 pH에서도 표적 단백질이 bead로부터 떨어지지 않고 고정되어 있어야 한다.
Talon bead에 표적 단백질을 부착시킨 후 핵산 라이브러리와 반응시키고, 표적에 결합하지 않는 핵산들을 씻어낸 후에, 2mM NaOH(pH 11)를 사용하여 표적에 결합한 핵산을 추출한 후에도 bead에 표적 바이러스가 남아있는지 여부를 확인하기 위하여 bead를 끓여서 bead와 바이러스를 분리시키고, 전기영동하여 bead에서 분리되는 바이러스를 확인하였다.
그 결과, 높은 pH(pH 11)에서도 바이러스는 계속 bead에 결합해 있음을 확인하였다(도 3). 이는, NaOH로 압타머를 용출하는 방법을 대리 바이러스 기반의 SELEX에서도 사용할 수 있음을 의미하는 것이다.
또한 Streptavidin UltraLink Resin을 사용하였을 때에도 높은 pH에서 바이러스가 bead에 잘 결합하고 있는 것을 확인하였다(도 4). 마찬가지로, 대리 바이러스에 기반한 SELEX에서 Streptavidin UltraLink Resin도 사용할 수 있음을 의미하는 것이다.
1-5. 대리 바이러스와 핵산 라이브러리와의 결합
실시예 1-1에서 준비한 대리 바이러스를 이용하여 SELEX를 실시하기에 앞서 단일 사슬 변형 핵산 라이브러리와 대리 바이러스간의 비특이적 결합을 필터 결합 분석법(Filter binding assay)으로 통하여 확인하였다(도 5).
단일 사슬 변형 핵산 라이브러리의 5' 말단에 T4 PNK (T4 Polynucleotide Kinase, Takara)를 사용하여 32P-ATP(502A, PerkinElmer)를 표지하였다. eDNA 1pmole, 0.25ul의 γ-32P-ATP(3.3uM, PerkinElmer), 0.25ul의 T4 PNK, 10x T4 PNK buffer를 10ul의 반응 용액에서 37℃에서 30분간 반응시킨 후에, 70℃에서 10분간 incubation하여 enzyme을 불활성화시켰다. 32P로 표지된 DNA는 Microspin G-50 column(GE healthcare)을 사용하여 정제하였다. 동위원소로 표지된 DNA(20,000cpm)를 300ul의 선택 완충액 1 (Selection Buffer 1: 40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.002% Tween20 pH 7.5 at 37℃)에 넣고 95℃부터 0.1℃/sec의 속도로 37℃까지 온도를 떨어뜨려 적절한 압타머의 구조가 만들어지게 하였다. 그리고 선택 완충액 1(Selection Buffer 1: 40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.002% Tween20 pH 7.5 at 37℃)에 대리 바이러스를 10nM부터 순차적으로 희석하였고, 대리 바이러스와 라이브러리 DNA가 결합하는 용액에 dextran sulfate (DxSO4)나 salmon sperm DNA를 농도를 달리하여 첨가하여 비특이적인 결합에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 32P가 표지된 압타머를 집계(counting)하여 각 well 당 2,000cpm으로 맞춰 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후에는 각 well에 5.5ul의 Zorbax resin(0.4g/ml, Agilent)를 첨가하였다. 선택 완충액 1으로 미리 적셔놓은 Durapore filter(0.45um PVDF filer, Millipore)에 반응시킨 압타머와 표적 단백질의 혼합물을 넣고 vacuum을 걸어주었다. 그리고 선택 완충액 1으로 필터를 씻어주었다. 필터 플레이트를 FLA-5100의 이미지 플레이트에 -20℃에서 밤새 노출시킨 뒤 FLA-5100(Fuji)으로 필터에 존재하는 방사성 동위 원소량을 측정하였다 (도 5).
그 결과 DxSO4를 반응액에 넣어주었을 때 대리 바이러스와 라이브러리 DNA 사이의 비특이적 결합을 효과적으로 저해할 수 있음을 확인하였다 (도 5).
표적 대리 바이러스에 비특이적으로 결합하는 DNA를 효과적으로 제거하기 위하여 SELEX 과정에서도 DxSO4를 넣어주었으며, 1uM ~ 10mM DxSO4 농도에서 대리 바이러스가 용해되지 않고 안정적인 것을 확인하였다 (도 6).
실시예 2: 대리 바이러스를 사용한 SELEX
2-1. 변형 핵산 라이브러리 합성
SELEX에 필요한 단일 사슬 변형 핵산 라이브러리를 제조하기 위하여 5'-말단에 바이오틴(Biotin)이 결합된 안티센스 라이브러리를 합성하였다. 안티센스 라이브러리를 0.5mM의 dNTP(dATP, dGTP, dCTP, Bz-dU), 0.25U/ul의 KOD enzyme, 10X extension buffer [1.2M Tris-HCl (pH7.8), 100mM KCl, 60mM (NH4)2SO4, 70mM MgSO4, 1% Triton X-100, 1mg/ml BSA) 상에서 70℃, 1시간 동안 50uM의 역방향 프라이머와(서열번호 11) 반응시켜 이중 나선 DNA를 제조하였다. 여기에 20mM NaOH를 이용하여 단일 사슬 변형 핵산 라이브러리를 추출한 뒤 HCl로 중화시켰다. 제조된 핵산 라이브러리는 Amicon Ultra-15(Millipore)를 이용하여 농축한 뒤 UV 분광광도계(Spectrophotometer)로 정량하였다.
2-2. 표적 단백질과의 결합
상기 2-1에서 합성된 라이브러리 1nmole을 선택 완충액 1에 넣고 95℃부터 0.1℃/sec의 속도로 37℃ 까지 온도를 떨어뜨려 단일 사슬 변형 핵산 라이브러리가 구조를 잡을 수 있도록 반응 시킨 후, 음성 선택(Negative Selection)을 위하여 10X 단백질 경쟁 완충액(Protein competition buffer)(10uM prothrombin, 10uM 카제인, 0.1% 휴먼 세럼 알부민 (HSA, sigma), 0.05% 트윈 20) 10ul를 혼합한 뒤, 6x 히스티딘 단백질(Peptron)이 결합되어있는 Talon beads(20ug/ml)에 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 음성 선택 반응 후, 상등액 만을 취하여 새로운 튜브에 옮긴 후, His tag이 결합된 표적 단백질을 발현하고 있는 대리 바이러스와 결합시킨 Talon beads(표적 단백질 50pmole)와 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 때에 필요한 경우, 단일사슬 변형 핵산 라이브러리와의 비특이적 결합을 저해하기 위하여 DxSO4를 넣어주었다. 200ul의 선택 완충액 1으로 표적 단백질과 결합시킨 Talon Beads을 5회 세척하였다. 5번째 세척 시에는 새로운 튜브에 옮긴 후 세척하였다. 세척 후 85ul의 2mM NaOH를 첨가하여 표적에 결합하는 라이브러리를 추출한 뒤 20ul의 8mM HCl로 중화시켰다.
2-3. Quantitative PCR
표적에 결합하는 라이브러리를 Quantitative PCR (QPCR, IQ5 mulicolor real time PCR detection system, Bio-rad)을 이용하여 증폭하였다.
2-1의 라이브러리 제조에 사용된 바이오틴(Biotin)을 포함하고 있는 역방향 프라이머(5uM)(서열번호 11)와 정방향 프라이머(5uM)(서열번호 10)를 사용하여 5 x KOD Buffer, 1mM each dNTP, 25mM MgCl2, 5 x SYBR Green I, 0.075U/ul KOD enzyme의 총 부피가 25ul가 되도록 혼합하여 전 단계에서 추출한 라이브러리 100ul과 혼합하여 총 125ul가 되도록 하였다. 96℃ 15초, 55℃ 10초, 68℃ 30분 조건으로 1회, 그리고 96℃ 15초, 72℃ 1분 조건으로 30회 반복하여 이중 가닥 라이브러리를 제조하였다.
2-4. eDNA제조
eDNA는 enzymatic DNA로 DNA 주형과 폴리머레이즈를 이용해 생산한 압타머를 의미한다. 상기 QPCR을 통하여 만들어진 핵산 라이브러리를 Dynabeads Myone SA bead C1(Invitrogen)에 상온에서 10분간 혼합하여 고정하였다. 20mM NaOH용액을 첨가하여 단일 가닥 DNA로 만들어준 후 0.5mM의 dNTP(dATP, dGTP, dCTP, Bz-dU), 0.015U/ul의 KOD enzyme, 10 x extension buffer(1.2M Tris-HCL pH7.8, 100mM KCl, 60mM (NH4)2SO4, 70mM MgSO4, 1% Triton X-100, 1mg/ml BSA) 상에서 68℃, 1시간 동안 50uM의 정방향 프라이머(서열번호 10)와 반응시켜 이중 나선 DNA를 제조하였다. 그 후 다시 85ul의 20mM NaOH을 처리하여 단일가닥으로 만들어 준 후 이 중 80ul만 획득하여 20ul의 80mM HCl을 사용 하여 중화시켰다. 이 때 합성된 DNA를 다음 라운드에 사용하였다.
2-5. SELEX 라운드의 반복
두 번째 라운드부터는 상기 기술된 2-2부터 2-4까지의 실험을 반복하였다. 대리 바이러스의 양은 대리 바이러스 표면에 발현된 단백질의 양을 기준으로 조절하였다. 라운드가 진행되면서 QPCR의 delta Ct 값을 기준으로 다음 라운드에 사용되는 표적 단백질의 양을 조절하였다. QPCR을 실시 후 대조군과의 Ct값 차이가 클수록 다음 라운드에 넣어주는 표적 단백질의 양을 더 적게 넣었으며 Ct값 차이가 적으면 표적 단백질양을 전 라운드와 동일하거나 비슷한 양을 넣어 SELEX를 진행하였다. 보다 선택적인 결합을 위하여 2라운드부터 12라운드까지는 DNA와 표적 물질의 결합 시에 적정 양의 DxSO4를 혼합하여 주었다.
2-6. SELEX 진행 결과
대리 바이러스를 재료로 하여 진행된 SELEX에서 eDNA가 제대로 선별되었는지 필터 결합 분석법(Filter binding assay)을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 선별된 eDNA의 5' 말단에 T4 PNK를 사용하여 P32ATP(502A,PerkinElmer)를 표지하였다. eDNA 1pmole, 0.25ul의 γ-32P-ATP(3.3uM, PerkinElmer), 0.25ul의 T4 PNK, 10 x T4 PNK buffer(Takara)를 10ul Reaction volume으로 37℃에서 30분간 반응시키고, 70℃에서 10분간 incubation하여, enzyme을 불활성화 시켰다.
32P로 표지된 DNA는 Microspin G-50 column(GE healthcare)을 사용하여 정제하였다. 동위원소로 표지된 DNA(20,000cpm)를 300ul의 선택 완충액 1 (Selection Buffer 1: 40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM EDTA)에 넣고 95℃부터 0.1℃/sec의 속도로 37℃까지 온도를 떨어뜨려 적절한 압타머의 구조가 만들어지게 하였다. 그리고 선택 완충액 1에 대리 바이러스를 10nM부터 순차적으로 희석하였고, 대리 바이러스와 라이브러리 DNA가 결합하는 용액에 SELEX 때와 동일한 농도의 DxSO4를 혼합하여 주었다. 각 well당 2,000cpm를 압타머를 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후에는 각 well에 5.5ul의 zorbax resin(0.4g/ml, Agilent)를 첨가하였다. 선택 완충액 1으로 미리 적셔놓은 Durapore filter(0.45um PVDF filer, Millipore)에 반응시킨 압타머와 표적 단백질의 혼합물을 넣고 vacuum을 걸어주었다. 그리고 선택 완충액 1으로 필터를 씻어주었다. 필터 플레이트를 FLA-5100의 이미지 플레이트에 -20℃에서 밤새 노출시킨 뒤 FLA-5100(Fuji)으로 필터에 존재하는 방사성 동위원소량을 측정하였다 (도 7).
그 결과 각 라운드에서 합성된 eDNA들이 표적 대리 바이러스에 잘 결합하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7). 상기 실시예 1을 통하여, 대리 바이러스만 사용해서도 SELEX를 진행할 수 있고, eDNA를 선별할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 배큘로 바이러스에 기초한 유전자 발현 시스템을 이용한 대리 바이러스와 분리정제한 단백질을 번갈아 사용하여 수행한 SELEX
3-1. 배큘로 바이러스에 기초한 유전자 발현 시스템을 이용한 대리 바이러스 제작 및 표적 단백질의 분리정제
배큘로 바이러스발현 시스템을 사용하여 배큘로 바이러스 표면(외피)에 표적 단백질을 발현하고 있는 대리 바이러스를 제작하였다. 또한 동일한 시스템을 사용하여 표적 단백질의 세포외 부분(ectodomain)을 분리정제 하였다. 본 발명에서는 A형 인플루엔자 바이러스의 HA와 NA 단백질들을 표적으로 사용하였다.
상기 배큘로 바이러스 발현 벡터에 His-tag과 Flag-tag 그리고 표적 단백질의 유전자를 삽입하여 클로닝한 후 배큘로 바이러스 박미드(bacmid)에 대장균 내에서 재조합(recombination)시켜 재조합 배큘로 바이러스 DNA를 생성한다. 곤충 유래 세포인 SF9 cell에 형질주입(Transfection)하여 표적 단백질을 가지고 있는 배큘로 바이러스를 생성한다. 표적 단백질을 발현하고 있는 배큘로 바이러스를 대량 배양한 후 농축하여 대리 바이러스를 준비하였다 (도 8a).
상기 배큘로 바이러스 발현벡터에 His-tag와 Flag-tag, 표적 단백질의 외피 바깥 부분(ectodomain)에 해당하는 유전자를 삽입하여 클로닝한 후 배큘로 바이러스 박미드에 전이시켜 재조합 배큘로 바이러스 DNA를 제조하였다. 곤충 유래 세포인 SF9 cell에 형질도입하여 표적 단백질의 외피 바깥 부분을 발현하는 배큘로 바이러스를 제조하였다. 상기 바이러스를 대량 배양한 후 Ni-NTA bead를 사용하여 표적 단백질을 분리정제하여 준비하였다 (도 8b).
3-2. 배큘로 바이러스 시스템을 사용하여 준비된 대리 바이러스와 표적 단백질을 사용한 SELEX
3-1에서 준비한 배큘로 바이러스 유래의 대리 바이러스와 배큘로 바이러스 시스템을 통하여 분리정제 한 표적 단백질의 외피 바깥 부분을 재료로 하여 SELEX를 진행하였다.
3-2-1. 변형 핵산 라이브러리 합성
SELEX에 필요한 단일 사슬 변형 핵산 라이브러리를 제조하기 위하여 5'-말단에 바이오틴(Biotin)이 결합된 안티센스 라이브러리를 합성하였다. 안티센스 라이브러리의 서열은 하기와 같다.
AB(Biotin)AB(Biotin)-TTTTTTTTCTGGGTGGCTGTCGGTG-N(40)-AAAGGCAGGACGCTCGA TATATAT
안티센스 라이브러리를 0.5mM의 dNTP(dATP, dGTP, dCTP, Bz-dU), 0.25U/ul의 KOD enzyme, 10 x extension buffer [1.2M Tris-HCl (pH7.8), 100mM KCl, 60mM (NH4)2SO4, 70mM MgSO4, 1% Triton X-100, 1mg/ml BSA) 상에서 70℃, 1시간 동안 50uM의 역방향 프라이머와(서열번호 11) 반응시켜 이중 나선 DNA를 제조하였다. 여기에 20mM NaOH를 이용하여 단일 사슬 변형 핵산 라이브러리를 추출한 뒤 HCl로 중화시켰다. 제조된 핵산 라이브러리는 Amicon Ultra-15(Millipore)를 이용하여 농축한 뒤 UV 분광광도계(Spectrophotometer)로 정량하였다.
3-2-2. 표적물질과의 결합
상기 합성된 라이브러리 1nmole을 선택 완충액 2 (Selection Buffer 2)(40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2, 0.05% Tween20)에 넣고 95℃부터 0.1℃/sec의 속도로 25℃ 까지 온도를 떨어뜨려 단일 사슬 변형 핵산 라이브러리가 안정된 구조를 가질 수 있도록 반응 시킨 후, 음성 선택(Negative Selection)을 위하여 10 x 단백질 경쟁 완충액(Protein competition buffer)(10uM prothrombin, 10uM casein, 0.1% Human serum albumin (HSA, sigma), 0.05% Tween20) 10ul를 혼합한 뒤, 6 x 히스티딘 단백질(Peptron)이 결합되어있는 Talon beads(20ug/ml)에 첨가하여 25℃에서 10분간 반응 시켰다.
음성 선택 반응 후, 상층액 만을 취하여 새로운 튜브에 옮긴 후, His-tag이 결합된 표적 단백질과 결합시킨 Talon beads(표적 단백질 50pmole)와 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 200ul의 선택 완충액 2에서 표적 단백질과 결합시킨 Talon Beads을 5회 세척하였다. 5번째 세척 시에는 새로운 튜브에 옮긴 후 세척하였다. 세척 후 85ul의 2mM NaOH를 첨가하여 표적에 결합하는 라이브러리를 추출한 뒤 20ul의 8mM HCl로 중화시켰다.
3-2-3. Quantitative PCR
표적에 결합하는 라이브러리를 QPCR(Quantitative PCR, IQ5 multicolor real time PCR detection system, Bio-rad)을 이용하여 증폭하였다. 앞서 라이브러리 제조에 사용된 바이오틴(Biotin)을 포함하고 있는 5uM의 역방향 프라이머(서열번호 11)와 5uM의 정방향 프라이머(서열번호 10)를 사용하여 5 x KOD Buffer, 1mM each dNTP, 25mM MgCl2, 5 x SYBR Green I, 0.075U/ul KOD enzyme의 총 부피가 25ul가 되도록 혼합하여 전 단계에서 추출한 라이브러리 100ul과 혼합하여 총 125ul가 되도록 하였다. 96℃ 15초, 55℃ 10초, 68℃ 30분 조건으로 1회, 그리고 96℃ 15초, 72℃ 1분 조건으로 30회 반복하여 이중 가닥 라이브러리를 제조하였다.
3-2-4. eDNA제조
상기 QPCR을 통하여 만들어진 핵산 라이브러리를 Dynabeads Myone SA bead C1(Invitrogen)에 상온에서 10분간 혼합하여 결합하였다. 20mM NaOH용액을 첨가하여 단일 가닥 DNA로 만들어준 후 bead를 씻어준 후에 0.5mM의 dNTP(dATP, dGTP, dCTP, Bz-dU), 0.015U/ul의 KOD enzyme, 10 x extension buffer[1.2M Tris-HCl(pH7.8), 100mM KCl, 60mM (NH4)2SO4, 15mM MgSO4, 20% DMSO, 0.01% BSA)가 들어있는 용액에서 50uM의 정방향 프라이머(서열번호 10)와 결합시킨 후에 68℃로 1시간 동안 반응시켜 이중 나선 DNA를 제조하였다. 그 후 다시 85ul의 20mM NaOH을 처리하여 단일가닥으로 만들어 준 후 용액 중에서 80ul만 획득하고 20ul의 80mM HCl을 첨가하여 중화시켰다. 이 때 합성된 DNA를 다음 라운드에 사용하였다.
3-2-5. SELEX 라운드의 반복
두 번째 라운드부터는 상기 기술된 3-2-2부터 3-2-4까지의 실험을 반복하였다. 실시예 3-1에서 준비한 분리 정제된 단백질(도 8b)과 대리 바이러스(도 8a)를 SELEX의 표적으로 번갈아 가며 사용하였다. 대리 바이러스의 양은 대리 바이러스 표면에 발현된 단백질의 양을 기준으로 조절하였다. 라운드가 진행되면서 QPCR의 delta Ct 값을 기준으로 다음 라운드에 사용되는 표적 단백질의 양을 조절하였다. QPCR을 실시 후 대조군과의 Ct값 차이가 클수록 다음 라운드에 넣어주는 표적 단백질의 양을 더 적게 넣었으며 Ct값 차이가 적으면 표적 단백질 양을 전 라운드와 동일하거나 비슷한 양을 넣어 SELEX를 진행하였다. 보다 선택적인 결합을 위하여 2라운드부터 12라운드까지는 DNA와 표적 물질의 결합 시에 0.1uM DxSO4를 혼합하여 주었다. 그리고 특이성을 높이기 위하여 대리 바이러스를 사용하였을 때에는 표적 단백질을 가지고 있지 않은 배큘로 바이러스를 사용하여 음성선택을 진행하였으며, 또한 구조가 비슷한 표적 단백질에 결합하는 DNA를 제거하기 위하여 대리 바이러스 외피에 표적 단백질과 구조가 비슷한 단백질을 발현시킨 것을 사용하여 음성선택을 진행하였다.
표 1은 두 가지 재료를 사용한 교차 SELEX 예시(H3N2 HA 특이적 결합 압타머 발굴)를 나타내는 것이며, 각 라운드에서 SELEX가 되는 정도를 검사하여 여러 조건(표적 물질의 종류와 양, 반응 시간, 온도 등)들을 사용하였다.
3-2-6. eDNA 염기서열 분석
11번의 SELEX Round를 거친 후 그 결과물을 이중 가닥 DNA로 증폭한 뒤 클로닝 후 시퀀싱하여 압타머의 서열을 얻었다(Solgent).
3-2-7. 서열이 확인된 eDNA의 합성
3-2-6에서 발생한 클로닝 산물을 template로 하여 바이오틴이 결합되어있는 역방향 프라이머(서열번호 11)와 정방향 프라이머(서열번호 10)를 사용하고 96℃ 15초, 72℃ 1분 조건으로 30회 반복하여 이중 가닥 라이브러리를 제조하였다. QPCR을 통하여 만들어진 핵산 라이브러리를 Dynabeads Myone SA bead C1(Invitrogen)에 상온에서 10분간 혼합하여 고정하였다. 20mM NaOH용액을 첨가하여 단일 가닥 DNA로 만들어준 후 0.5mM의 dNTP(dATP, dGTP, dCTP, Bz-dU), 0.015U/ul의 KOD enzyme, 10 x extension buffer 상에서 68℃로 1시간 동안 50uM의 정방향 프라이머(서열번호 10)와 반응시켜 이중 나선 DNA를 제조하였다.
실시예 4: 압타머 결합 특성
실시예 3에서 발굴된 압타머의 표적에 대한 결합력 및 특이성을 조사하기 위하여 필터 결합 에세이(Filter binding assay)를 진행하였다.
4-1. 표적 단백질에 대한 필터 결합 에세이(Filter binding assay)
선별된 압타머의 5' 말단에 T4 PNK를 사용하여 32P-ATP(502A, PerkinElmer)를 표지하였다. 압타머 1pmole, 0.25ul의 γ-32P-ATP(3.3uM, PerkinElmer), 0.25ul의 T4 PNK(T4 Polynucleotide Kinase, Takara), 10 x T4 PNK buffer(Takara)를 10ul 반응 용량으로 37℃에서 30분간 반응시키고, 70℃에서 10분간 처리하여 enzyme을 불활성화 시켰다. 표지된 압타머는 Microspin G-50 column(GE healthcare)을 사용하여 정제하였다.
표지된 압타머 20,000cpm을 300ul의 선택 완충액 2(Selection Buffer 2)(40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2, 0.05% Tween20)에 넣고 95℃부터 0.1℃/sec의 속도로 25℃까지 온도를 떨어뜨려 안정한 압타머 구조를 만들어 주었다. 그리고 선택완충액에 표적 단백질을 100nM에서 7point로 순차적으로 희석하였고, 이때에는 SELEX 때와 동일한 농도의 DxSO4를 더해 주었다. 그리고 선택 완충액 2에 표적 단백질을 13.3nM부터 순차적으로 희석하였고, 표적 단백질과 라이브러리 DNA가 결합하는 용액에 SELEX 때와 동일한 농도의 DxSO4를 혼합하여 주었다. 각 well당 2,000cpm를 압타머를 첨가하고 25℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후에는 각 well에 5.5ul의 zorbax resin(0.4g/ml, Agilent)를 첨가하였다. 선택 완충액 2로 미리 적셔놓은 Durapore filter(0.45um PVDF filer, Millipore)에 반응시킨 압타머와 표적 단백질의 혼합물을 넣고 vacuum을 걸어주었다. 이후 선택 완충액 2으로 필터를 씻어주었다. 필터 플레이트를 FLA-5100의 이미지 플레이트에 -20℃에서 밤새 노출시킨 뒤 FLA-5100(Fuji)으로 필터에 존재하는 방사성 동위원소량을 측정하였다.
그 결과 합성한 19개의 압타머 중 17개의 압타머가 표적에 높은 결합력으로 결합하는 것을 확인하였다(도 9 및 표 2). 또한 표적에만 특이적으로 결합하고 다른 subtype 인플루엔자의 유사한 단백질과는 결합하지 않는 것을 확인하였다 (도 10).
4-3. 표적 단백질을 가지고 있는 대리 바이러스에 대한 압타머의 결합력 분석(Filter binding assay)
실시예 3에서 발굴된 압타머의 표적에 대한 결합력 및 특이성을 조사하기 위하여 표면에 표적 단백질을 발현하고 있는 대리 바이러스에 대한 필터 결합 분석(Filter binding assay)을 수행하였다.
실시예 3에서 발굴된 압타머 중 높은 결합력과 특이성을 보이는 5 개의 압타머를 선별하여 진행하였고, 4-2에 기술한 방법과 동일한 방법으로 표적 대리 바이러스에 대해 필터 결합 에세이를 수행하였다 (도 11).
그 결과 실시예 3에서 발굴된 압타머가 표적 대리 바이러스에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다 (도 11).
또한, 본 발명의 방법으로 얻어진 인플루엔자 서브타입(H3N2 HA) 바이러스에 특이적으로 결합하는 5개의 압타머는 하기 표 3과 같다.
* U는 변형된 뉴클레오티드를 의미하고, KD는 평형 해리 상수를 의미한다.
4-4. 압타머의 인플루엔자 바이러스에 대한 결합력 분석(Filter binding assay)
실시예 3에서 발굴된 압타머의 표적에 대한 결합력 및 특이성을 조사하기 위하여 실제 표적 바이러스(A형 인플루엔자 바이러스)에 대한 필터 결합 에세이(Filter binding assay)를 수행하였다.
4-3에서 실시한 것과 같이 실시예 3에서 발굴된 압타머 중 높은 결합력과 특이성을 보이는 5 개의 압타머를 선별하여 진행하였고, 4-2에 기술한 방법과 동일한 방법으로 실제 표적바이러스에 대해 필터 결합 에세이를 수행하였다.
그 결과 본 발명에서 기술한 새로운 방법으로 SELEX를 하여 얻은 압타머가 실제 표적 바이러스(인플루엔자 바이러스 아형 H3N2)에 높은 결합력을 보이는 것을 확인하였다 (도 12).
실시예 5. 표적 단백질(H3N2 NA)에 대한 결합 능력
실시예 3과 같은 방법으로 발굴된 압타머의 표적(H3N2 NA)에 대한 결합력 및 특이성을 조사하기 위하여 필터 결합 에세이(Filter binding assay)를 진행하였다.
5-1. 표적 단백질(H3N2 NA)에 대한 필터 결합 에세이(Filter binding assay)
선별된 압타머의 5' 말단에 T4 PNK를 사용하여 32P-ATP(502A, PerkinElmer)를 표지하였다. 압타머 1pmole, 0.25ul의 γ-32P-ATP(3.3uM, PerkinElmer), 0.25ul의 T4 PNK(T4 Polynucleotide Kinase, Takara), 10 x T4 PNK buffer(Takara)를 10ul 반응 용량으로 37℃에서 30분간 반응시키고, 70℃에서 10분간 처리하여 enzyme을 불활성화 시켰다. 표지된 압타머는 Microspin G-50 column(GE healthcare)을 사용하여 정제하였다.
표지된 압타머 20,000cpm을 300ul의 선택 완충액2 에 넣고 95℃부터 0.1℃/sec의 속도로 25℃까지 온도를 떨어뜨려 안정한 압타머 구조를 만들어 주었다. 그리고 선택 완충액 2에 표적 단백질을 100nM부터 순차적으로 희석하였고, 표적단백질과 라이브러리 DNA가 결합하는 용액에 SELEX 때와 동일한 농도의 DxSO4를 혼합하여 주었다. 각 well당 2,000cpm를 압타머를 첨가하고 25℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후에는 각 well에 5.5ul의 zorbax resin(0.4g/ml, Agilent)를 첨가하였다. 선택 완충액 2로 미리 적셔놓은 Durapore filter(0.45um PVDF filer, Millipore)에 반응시킨 압타머와 표적 단백질의 혼합물을 넣고 vacuum을 걸어주었다. 그리고 선택 완충액 2으로 필터를 씻어주었다. 필터 플레이트를 FLA-5100의 이미지 플레이트에 -20℃에서 밤새 노출시킨 뒤 FLA-5100(Fuji)으로 필터에 존재하는 방사성 동위원소량을 측정하였다.
그 결과 합성한 4개의 압타머가 표적에 높은 결합력으로 결합하는 것을 확인하였다(도 13, 표 4 및 표 5). 또한 표적에만 특이적으로 결합하고 다른 subtype 인플루엔자의 유사한 단백질과는 결합하지 않는 것을 확인하였다 (도 14).
본 발명의 방법으로 얻어진 인플루엔자 서브타입(H3N2 NA) 바이러스에 특이적으로 결합하는 4개의 압타머는 하기 표 4와 같다.
* U는 변형된 뉴클레오티드를 의미하고, KD는 평형 해리 상수를 의미한다.
5-2. 측면유동법을 통한 표적 단백질(H3N2 NA)에 대한 압타머의 특성확인
실시예 3과 같은 방법으로 발굴된 압타머를 사용하여 측면유동법으로 표적단백질에 대한 결합을 확인하였다(도 15). 또한, 발굴된 압타머 쌍을 기반으로 하는 측면유동법 방식의 진단키트를 제작하고 바이러스가 없는 샘플과 바이러스가 있는 샘플을 각각 처리하여 결합여부를 확인하였다. 바이러스가 없는 샘플에서는 아무 시그널도 표지되지 않지만 바이러스가 있는 샘플에서는 멤브레인의 중앙에 원형으로 시그널이 표지되는 것을 확인하였다.
이와 같은 결과들은 본 발명의 방법이 실제 자연계에 존재하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머들을 효율적으로 발굴하여 제조함을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Aptamer Sciences Inc.
POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION
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<400> 1
caggugugau augccuucuc cucuauauga ccucgguua 39
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA3-10
<400> 2
acgaugaacu guucuuggaa cugcauuuau aauggucuca 40
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA3-15
<400> 3
uucaaacgau uugucgcaag uccuauuuau aauugggcuc aacac 45
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA3-16
<400> 4
uauauugucg uuaguccuau uuauugauug ggaaaugaaa 40
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA3-18
<400> 5
gauaggcugu caugcaucca ugcucgguua cggguuuca 39
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> NA8-14
<400> 6
ucaacguucu guuaccauag uauuccccua cucuaucauu 40
<210> 7
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<212> DNA
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<400> 7
uccacacacu aaaggagaag uuguuuuuuu aguccccucc u 41
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
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<220>
<223> NA8-16
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aauucgcuuc uuacguucau acuuaauaua auuccacccu 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA8-17
<400> 9
uucgcuucuu acguucucaa uaaauuaaau uuggcccgcu 40
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forword Primer
<400> 10
atatatatcc agcgtcctgc ctttg 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse Primer
<400> 11
ttttttttct gggtggctgt cggt 24
Claims (38)
- 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스를 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계를 포함하는, 변형된 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 수행하여 압타머를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 방법은 하기의 단계를 제1항에 따른 단계와 1회 이상 교차로 수행하는 단계를 포함하는 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법;
(a) 바이러스, 박테리아 또는 진핵 세포를 이용한 유전자 발현 시스템을 이용하여, 별개로 분리 정제된 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계; 또는
(b) 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계. - 제2항에 있어서,
상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합하는 것만을 선택적으로 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제2항에 있어서,
상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합되지 않은 것만을 선택적으로 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제3항에 있어서,
상기 선택적으로 분리된 구조체로부터 핵산을 분리하여 증폭하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제5항에 따른 분리 증폭된 핵산 라이브러리를 이용하여 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단계를 반복 수행하는 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 분리하는 단계에서 음전하 폴리머를 포함하는 완충액을 사용하는 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 음전하 폴리머는 덱스트란 설페이트, 다중 음이온성 셀룰로즈, 히알루론 산, 다중 음이온성 헤파린, 폴리설포네이트 폴리머, 다중 음이온성 덴드리머, 카복시메틸 덱스트란, 헤파린, 아우린트리카트복실산, 및 수라민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 음전하 폴리머는 0mM 내지 50mM 이하의 농도인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 대리 바이러스는 외피(envelope)에 표적 단백질이 발현된 것을 특징으로 하는, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 표적 단백질은 자연계에 상응하는 표적 단백질과 동일하거나 75% 이상 유사한 형태인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제6항의 방법으로부터 제조된 압타머를 회수하는 단계를 포함하는, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 대리 바이러스는 외피보유 DNA 바이러스 또는 외피보유 RNA 바이러스를 포함하는 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제13항에 있어서,
상기 외피보유 DNA 바이러스는 배큘로바이러스(Baculovirus), 헤파드나바이러스(Hepadnavirus), 헤르페스바이러스(Herpesvirus), 폭스바이러스(poxvirus), 및 백시니아바이러스(vacciniavirus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제13항에 있어서,
상기 외피보유 RNA 바이러스는 코로나바이러스(Coronavirus), 플라비바이러스(Flavivirus), 토가바이러스(Togavirus), 알파바이러스(Alphavirus), 아레나바이러스(Arenavirus), 버냐바이러스(Bunyavirus), 피로바이러스(Filovirus), 오소믹소바이러스(Orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(Paramyxovirus), 랍도바이러스(Rhabdovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 및 렌티바이러스(Lentivirus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표적 단백질은 동물의 세포막 단백질, 식물의 세포막 단백질, 미생물의 세포막 단백질 및 바이러스의 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 핵산 라이브러리는 단일가닥 핵산 또는 핵산 유도체, 이중가닥 핵산 또는 핵산 유도체 중 어느 하나 이상인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제3항에 있어서,
상기 결합된 구조체는 자성 비드(bead) 또는 비자성 비드에 결합하여 고정화 되는 것을 특징으로 하는, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제18항에 있어서,
상기 자성 비드는 탈론, 다이나비드, 아가로스, 세파로스, 및 스트렙토아비딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제18항에 있어서,
상기 비자성 비드는 아가로스, 세파로스, 스트렙토아비딘-아가로스, 스트렙토아비-세파로스, 조벡스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제3항에 있어서,
상기 분리하는 단계에서 2가 양이온을 포함하는 완충액을 사용하는 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제21항에 있어서,
상기 완충액은 0mM 내지 1M 이하의 농도인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제21항에 있어서,
상기 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ 및 Fe2+로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제21항에 있어서,
상기 완충액은 음전하 폴리머를 포함하는 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제24항에 있어서,
상기 음전하 폴리머는 덱스트란 설페이트, 다중 음이온성 셀룰로즈, 히알루론 산, 다중 음이온성 헤파린, 폴리설포네이트 폴리머, 다중 음이온성 덴드리머, 카복시메틸 덱스트란, 헤파린, 아우린트리카트복실산, 및 수라민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - 제24항에 있어서,
상기 음전하 폴리머는 0mM 내지10mM 이하의 농도인 것인, 변형된 SELEX를 수행하여 압타머를 제조하는 방법. - (a) 바이러스의 외피에 표적 단백질이 발현된 대리 바이러스를 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계;
(b) 선택적으로, (i) 바이러스, 박테리아 또는 진핵 세포를 이용한 유전자 발현 시스템을 이용하여, 별개로 분리 정제된 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계; 또는 (ii) 표적 단백질을 상기 대리 바이러스와 접촉하여 선택된 핵산 라이브러리에 접촉시키는 단계;
(c) 상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합하는 것만을 선택적으로 분리하는 단계;
(d) 상기 접촉에 의해 결합된 구조체 중 표적 단백질과 결합되지 않은 것만을 선택적으로 제거하는 단계; 및
(e) 상기 선택적으로 분리된 구조체로부터 핵산을 분리하여 증폭하는 단계; 를 포함하여, 상기 (a) 내지 (e) 단계를 1회 이상 반복 수행하는 방법으로부터 제조된 압타머로서,
상기 표적 단백질은 인플루엔자 바이러스의 HA(hemagglutinin) 또는 NA(neuraminidase) 단백질인 것인, 압타머. - 제27항에 있어서,
상기 압타머는 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 것인, 압타머. - 제 28항에 있어서,
상기 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 압타머. - 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는 압타머로서, 상기 압타머는 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 것인, 압타머.
- 삭제
- 제30항에 있어서,
상기 압타머는 하나 이상의 스템-루프 (stem-loop) 구조를 갖는 것인, 압타머. - 삭제
- (i) 인플루엔자 H3N2 바이러스에 특이적으로 결합하는 제28항에 따른 압타머로 개체에 샘플을 접촉시키는 단계; 및
(ii) (i)단계의 압타머와 결합된 샘플에서 인플루엔자 H3N2 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 H3N2 바이러스를 검출하는 방법. - 인플루엔자 H3N2 바이러스에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산서열로 이루어진 압타머를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.
- 제30항의 압타머를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염 진단용 키트.
- 제36항에 있어서, 상기 키트는 면역 크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태인 것인, 키트.
- 인플루엔자 H3N2 바이러스에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산서열로 이루어진 압타머를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염용 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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