CN114369642B - 一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路及其应用，由3条自组装发卡链和1条催化起始链混合杂交形成，反应起始时，A链和B链杂交启动自组装；B链和A链杂交后形成游离单链暴露出与C链、D链结合的区域，并与C链和D链杂交再次形成游离的核酸单链，游离的核酸单链可与B链再次杂交；杂交后的B链游离序列可再次与C链、D链杂交，由此形成一个闭合的超支化的自我催化逻辑环路，操作简单，成本低廉，显著提高了核酸的自组装的效率，可应用于临床核酸检测及相关领域。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体是一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路及其应用。
背景技术
无酶核酸等温自组装技术由于其无需酶参与，操作简单，成本低廉，在核酸检测领域具有巨大的应用潜力。已有的报道中，无酶核酸自组装技术大量应用于细菌、病毒、支原体、衣原体、人和动物来源的核酸的检测分析，但是相较于传统的PCR/分子杂交技术，无酶核酸自组装技术反应效率不高，反应不彻底，信号扩增倍数有限导致其检测性能低下。超支化的非线性组装/扩增技术方案的设计能显著提高核酸反应的速率和效率，可以显著提高信号扩增倍数，极大提高无酶核酸自组装技术的检测性能。目前已有的超支化的非线性组装/扩增技术方案仅有数种，且设计复杂，含有5条以上的反应链，增加了反应的背景干扰；在原理上反应也并不彻底，对信号的扩增提高有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路及其应用，解决了上述技术问题，无酶核酸自组装逻辑环路具有反应速率快，耗时短，反应彻底，信号扩增倍数高，灵敏度高的优势；无需昂贵的实时荧光定量PCR仪或者测序仪，通过简单的恒温设备即可使其反应进行；反应体系无需酶促，试剂盒成本低廉，且省去了相应的存储、运输过程中的冷链成本。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路，由3条自组装发卡链和1条催化起始链混合杂交形成；
所述自组装发卡链包括B链、C链和D链；催化起始链为A链；
所述A链的序列为：5’-AAACUUCCGAACGGUCCCAGCAU-3’。
进一步地，反应起始：A链和B链杂交启动自组装；B链和A链杂交后形成游离单链暴露出与C链、D链结合的区域，并与C链和D链杂交再次形成游离的核酸单链，游离的核酸单链可与B链再次杂交；杂交后的B链游离序列可再次与C链、D链杂交，由此形成一个闭合的超支化的自我催化逻辑环路。
进一步地，所述B链是由d’-a’-b’-m1-m2-b-a-p-d-c-n1-n2-c’-d’-a’结构域组成。
所述C链由m1-b-a-d-n1’-c’-d’-p’-a’-b’-m2’结构域组成。
所述D链由n1’-c’-d’-p’-a’-b’-m2’-a-d-c-n2’结构域组成。
A链、B链、C链和D链的核酸序列均按5‘→3’排列顺序。
进一步地，核酸序列组成：a和a’互补，b和b’互补，c和c’互补，d和d’互补，p和p’互补，m1和m1’互补，m2和m2’互补，n1和n1’互补，n2和n2’互补；b、c、m2和n1结构域序列长度均不多于10个核苷酸；a、b、c、d、p、 m1和n2结构域均含有5-30个核苷酸；以上序列除互补配对外，各序列之间连续配对残基少于3个。
进一步地，结构域之间可以随机插入1-3个核苷酸，不影响自组装效率。
逻辑环路的应用，逻辑环路应用于临床单链核酸的检测。
逻辑环路的应用，逻辑环路用于DNA单链、RNA单链以及环状单链DNA 和RNA的检测。
本发明的有益效果：
1、本发明无酶核酸自组装逻辑环路具有反应速率快，耗时短，反应彻底，信号扩增倍数高，灵敏度高的优势；
2、本发明无需昂贵的实时荧光定量PCR仪或者测序仪，通过简单的恒温设备即可使其反应进行；反应体系无需酶促，试剂盒成本低廉，且省去了相应的存储、运输过程中的冷链成本。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是参与反应的循环反应式；
图2为参与反应所形成的逻辑环路；
图3是不同的链共孵育的电泳图；
图4是链式反应逻辑环路产生的荧光淬灭效率与目标检测片段浓度的关系示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
检测丙肝病毒的序列设计
通过查询NCBI东亚地区从2017-2021年收集的丙肝病毒的rRNA序列进行分析发现其含有高度特异性序列:5’-AAACUUCCGAACGGUCCCAGCAU-3’,将其作为目标检测序列(催化起始链，即A链)并通过软件设计获得其它3条序列(自组装发卡链，即B链、C链、D链)；
B链序列：5’- GCATGCATCGAACGGTCCCAGCTCCTAAATGCTGGGACCGTTCGGAAGTT TATGCATGCAGATCGGACTTAAACGATCTGCATGCATCGAACGGT -3’-FAM；B链3’端标记荧光素FAM；
C链序列：Q-5’- TCCGATCTGCATGCATAAACTTCCGAACGGTCCCAGCATACCGTTCGATGCATGCAGATCGTTTAAG-3’；C链5’端标记淬灭基团Q；
D链序列：5’- TTAGGAGCTGGGACCGTTCGATGCATGCTCCGATCTGCATGCATAAACTTCCGAACGGTCCCAGCAT-3’。
实施例2
超支化核酸自组装逻辑环路对游离核酸的检测效果
合成实施例1所设计的核酸序列。
将1毫升的1μM的A、B、C、D序列分别加入到4个1.5毫升的Ep管中置于100℃的沸水中，使其在室温下自然冷却到室温，使B、C、D序列形成发卡结构，并保存于4℃冰箱备用。链杂交反应温度为室温25℃，反应时间为2 小时；链间杂交通过聚丙烯酰胺电泳进行分析；FAM荧光信号通过荧光检测仪进行检测。
结果显示B和序列C、B和D序列两两孵育后没有新的条带的出现，说明 B和C、B和D较为稳定，不发生反应；B、C、D溶液混合后有较为明显的泄露反应(指三者理想状况下不发生杂交反应生成新的条带，但是实际上发生了反应生成了新的条带，这个就是泄露反应/非特异性杂交)；B、C、D序列在目标检测序列存在的情况下发生比较彻底的杂交反应，如图3所示。以上结果说明超支化核酸自组装逻辑环路可以按照预期进行高效彻底的反应。
实施例3
超支化核酸自组装逻辑环路在HCV假病毒颗粒的检测效果
将1毫升的1μM的B、C、D溶液分别加入到4个1.5毫升的Ep管中置于 4升100℃的沸水中，使其在室温下自然冷却到室温，使B、C、D序列形成发卡结构，并保存于4℃冰箱备用。取检所HCV假病毒颗粒配置成1nM到1pM 的梯度溶液N，取10微升假病毒颗粒溶液加入B、C、D溶液各10微升，用荧光PCR仪检测各反应的荧光信号。
结果显示，相同的时间内，B序列单独存在时荧光信号比较稳定；在加入C 或者C和D后，荧光信号降低发生淬灭；在加入含有目标检测序列的假病毒后，荧光信号大幅降低发生明显淬灭，且淬灭的程度和假病毒颗粒的浓度成正比，如图4所示。以上结果说明，超支化自组装核酸具有反应彻底，速率快的特点，可以应用于单链病毒的检测。
图1是参与反应的循环反应式；图2为参与反应所形成的逻辑环路。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaacuuccga acggucccag cau 23
<210> 2
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatgcatcg aacggtccca gctcctaaat gctgggaccg ttcggaagtt tatgcatgca 60
gatcggactt aaacgatctg catgcatcga acggt 95
<210> 3
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccgatctgc atgcataaac ttccgaacgg tcccagcata ccgttcgatg catgcagatc 60
gtttaag 67
<210> 4
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaggagctg ggaccgttcg atgcatgctc cgatctgcat gcataaactt ccgaacggtc 60
ccagcat 67
Claims (5)
1.一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路，其特征在于，由3条自组装发卡链和1条催化起始链混合杂交形成；
所述自组装发卡链包括B链、C链和D链；催化起始链为A链；
所述A链的序列为：5’-AAACUUCCGAACGGUCCCAGCAU-3’；
所述B链由d’-a’-b’-m1-m2-b-a-p-d-c-n1-n2-c’-d’-a’结构域组成；
所述C链由m1-b-a-d-n1’-c’-d’-p’-a’-b’-m2’结构域组成；
所述D链由n1’-c’-d’-p’-a’-b’-m2’-a-d-c-n2’结构域组成；
A链、B链、C链和D链的核酸序列均按5'-3'排列顺序；
核酸序列组成：a和a’互补，b和b’互补，c和c’互补，d和d’互补，p和p’互补，m1和m1’互补，m2和m2’互补，n1和n1’互补，n2和n2’互补；b、c、m2和n1结构域序列长度均不多于10个核苷酸；a、b、c、d、p、m1和n2结构域均含有5-30个核苷酸；以上序列除互补配对外，各序列之间连续配对残基少于3个。
2.根据权利要求1所述的一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路，其特征在于，反应起始：A链和B链杂交启动自组装；B链和A链杂交后形成游离单链暴露出与C链、D链结合的区域，并与C链和D链杂交再次形成游离的核酸单链，游离的核酸单链可与B链再次杂交；杂交后的B链游离序列可再次与C链、D链杂交，由此形成一个闭合的超支化的自我催化逻辑环路。
3.根据权利要求1或2所述的一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路，其特征在于，所述A链由c’-d’-p’结构域组成。
4.根据权利要求1所述的一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路，其特征在于，所述结构域之间随机插入1-3个核苷酸。
5.权利要求1-2任意一项所述的逻辑环路的应用，其特征在于，逻辑环路用于DNA单链、RNA单链以及环状单链DNA和RNA的检测。
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