CN112063696A

CN112063696A - 基于核酸自我催化的逻辑环路及其应用

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Publication number: CN112063696A
Application number: CN202010868287.5A
Authority: CN
Inventors: 范小波
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2040-08-26
Also published as: CN112063696B

Abstract

基于核酸自我催化的逻辑环路及其应用，由5条核酸单链组成，所述核酸单链为B、C、D、E链和目标检测链A；反应起始时：B链和C链杂交，D链和E链杂交；加入目标检测A链后，形成一个闭合的反应环路：A置换C链并和B链杂交生成AB产物，C置换E链并和D链杂交生成CD产物，E置换C链并和B链杂交生成EB产物。本发明将描述新的基于熵驱动催化的核酸自我扩增的逻辑环路，显著提高了基于熵驱动催化的核酸扩增的效率，可用于临床RNA的检测。

Description

基于核酸自我催化的逻辑环路及其应用

技术领域

本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种基于熵驱动催化的核酸自我扩增的逻辑环路及其应用。

背景技术

目前，临床核酸检测主要基于PCR/分子杂交和测序技术发展而来，这两类技术对仪器和样品要求较高，尤其是临床常用的PCR/分子杂交技术要求在超净台中完成，试剂和操作环节复杂，要求在精密的PCR仪中完成，不利于大规模应用。

熵驱动催化（entropy-driven catalysis，EDC）是近年来发展起来的将核酸的链置换技术与DNA程序化自组装结合起来的一种能部分移动或者随时间变化动态非酶催化核酸纳米技术。从朗讯公司贝尔实验室的Bernard Yurke发现了核酸链置换现象到后来加州理工学院Erik Winfree等人基于该反应设计出多种程序化的级联瀑布式反应，该方法已被广泛应用于各种核酸相关的纳米技术领域，如核酸传感器、核酸计算机等。通过借助计算机辅助计算，对反应的核酸链的碱基序列进行精心得设计，该反应体系可按照预先设计的反应顺序进行程序化反应，且该方法显示出极高的特异性，对核酸的单碱基错配显示出极高的敏感。基于此特性，使用EDC技术对核酸进行扩增可以获得极高的特异度，满足临床对诊断实验的要求。

基于支点的链置换（Toehold mediated strand displacement），是一种基于熵驱动催化的核酸单链之间的竞争结合反应，其反应过程主要决定于反应过程中的吉布斯自由能变，无需任何酶催化反应。根据反映前后是否会产生新的Toehold，可以将链置换反应分为两类：Toehold介导的链置换反应（Toehold mediated strand displacement）以及Toehold介导的链交换反应（Toehold exchange）。因反应后不产生新的toehold，toeholddisplacement易于发生，其反应的吉布斯自由能远小于toehold exchange反应。但是toehold exchange反应因其反应自由能接近于零，表现出对toehold区碱基错配的极高特异性，因此选用toehold exchange反应可满足核酸检测中对特异度的高要求。近年来，链置换反应结合其他不同的检测方法用于各种检测方法、生物传感器的构建等方面已有大量研究。同时，该方法是一种等温环境中进行的核酸扩增反应，因此无需昂贵的实时荧光定量PCR仪，仅靠简单的恒温设备即可使得反应进行；因反应体系无需酶促，试剂盒成本低廉，且省去了相应的存储、运输过程中的冷链成本。

但是，该技术存在着反应扩增倍数不足的缺陷。据相关研究报道，通过不同的设计，在一小时等温扩增后可扩增十到近千倍，这与聚合酶链式反应的指数级扩增还有较大差距，导致其灵敏度不够，易产生假阴性假阳性。本发明所述方法基于熵驱动催化可以实现核酸的高效扩增，提高方法灵敏度，并减少了检测时间，在核酸检测中有显著应用意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种基于核酸自我催化的逻辑环路及其应用，可以极大提高基于支点的链置换技术的信号扩增效率，本方法可以应用于临床、科研和制药领域。

技术方案：基于核酸自我催化的逻辑环路，由5条核酸单链组成，所述核酸单链为B、C、D、E链和目标检测链A；反应起始时：B链和C链杂交，D链和E链杂交；加入目标检测A链后，形成一个闭合的反应环路：A置换C链并和B链杂交生成AB产物，C置换E链并和D链杂交生成CD产物，E置换C链并和B链杂交生成EB产物。

上述A链是含有a-c结构域的目标检测序列；B链由b’-c’-a’结构域组成；C链由c-b-d-X结构域组成组成；D链由Y-a’-d’-b’结构域组成；E链由d-a-c结构域组成；以上核酸序列均按5’-3’顺序；所述a和a’互补，b和b’互补，c和c’互补，d和d’互补；a、a’、b和b’序列长度为2-8个核苷酸；c、c’、d和d’序列长度为10到30个核苷酸；以上序列除互补配对外，各序列之间连续配对残基少于4个；当X=0表示0个核苷酸，Y=0表示0个核苷酸时，产物为线性扩增，每经过一个扩增逻辑环路所新增的产物CD和EB的量和加入A链的量成正比；当X=(a-d)_n-a，表明X序列为n个结构域a-d重复串联后加上a序列；Y=(a’-d’)_n，表明Y序列为n个结构域a’-d’重复串联，产物为指数扩增，每经过一个扩增逻辑环路所新增的产物CD和EB的量为扩增前的n倍。

上述逻辑环路在检测DNA单链、RNA单链、以及环状单链DNA和RNA中的应用。

上述逻辑环路在检测临床单链核酸中的应用。

有益效果：1. 提供了一种快速、简便、高效的新颖的基于熵驱动催化的核酸检测方法，只需要将血清或者其它样品与检测试剂混合孵育数十分钟到数小时，既可检测血清或者其它样品中的单链核酸比如单链RNA病毒。2. 本方法只要有目标核酸触发自我扩增逻辑环路，就可以实现信号自我成倍扩增，实现信号的成倍或者指数级增长，大大提高了信号生成效率，缩短了反应时间，提高了方法的灵敏度。3. 本方法无需昂贵的实时荧光定量PCR仪或者测序仪，仅靠简单的恒温设备即可使得反应进行；本方法反应体系无需酶促，试剂盒成本低廉，且省去了相应的存储、运输过程中的冷链成本。

附图说明

图1为参与反应所形成的逻辑环路示意图；

图2为核酸序列结构域示意图，其中a和a’互补，b和b’互补，c和c’互补，d和d’互补；a、a’、b和b’序列长度为2-8个核苷酸；c、c’、d和d’序列长度为10到30个核苷酸；以上序列除互补配对外，各序列之间连续配对残基少于4个；

图3为检测新型冠状病毒的核酸序列以及链式反应逻辑环路的设计示意图；其中新型冠状病毒含有特异性序列5’-AUUACGUUUGGUGGA-3’，在此基础上设计B、C、D和E链。B链3’端标记荧光素FAM，C链5’端标记淬灭基团Q；核酸序列设计：

A链 5’-…AUUACGUUUGGUGGA…-3’；

B链 5’-GCACCTCCACCAAACGTAAT-3’-FAM；

C链 Q-5’-GTTTGGTGGAGGTGCTCCTCTCTCCATTACTCCTCTCTCCATTAC-3’；

D链 5’-GTAATGGAGAGAGGAGTAATGGAGAGAGGAGCACC-3’；

E链 5’-TCCTCTCTCCATTACGTTTGGTGGA-3’；

图4为不同的链共孵育的电泳图；

图5为链式反应逻辑环路产生的荧光强度与目标检测片段浓度的关系示意图；

图6为感染HPV子宫刮片细胞原位检测示意图。

具体实施方式

实施例1

检测人乳头瘤病毒HPV-18的序列设计

通过对新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）的核酸序列进行分析发现其含有高度特异性序列5’-AUUACGUUUGGUGGA-3’，在此基础上确定目标检测序列为:5’-…AUUACGUUUGGUGGA…-3’，并通过软件设计获得其它4条序列（图3），A序列为目标检测序列。

实施例2

链式扩增逻辑环路和无逻辑环路方案对游离核酸的检测效果的对比

合成实施例1所设计的核酸序列。将4μM的B和4μM的C加入PCR管中加热到95℃并自然冷却到室温制备BC杂交链并保存于4℃冰箱。将4μM的D和8μM的E加入PCR管中加热到95℃并自然冷却到室温制备DEE杂交链并保存于4℃冰箱待用。取10μL的BC杂交链并加入不同量的A链，并加入10μL的CD杂交链。链间杂交通过聚丙烯酰胺电泳进行分析；FAM荧光信号通过荧光检测仪进行检测。结果显示AB、BC、CD、DE、EB可形成杂交链（图4）；在不应用本发明所述逻辑环路时，即体系只有A和BC杂交链共孵育的荧光信号递增缓慢，且终点最大荧光值较低（图5）；应用本发明所述逻辑环路后，即体系加入A和BC、DEE杂交链共孵育的荧光信号递增明显加快，且最大荧光值比只有A、BC的体系高的多（图5）；在相同的反应时间内，荧光信号和A的量成正相关。

实施例3

链式扩增逻辑环路在临床HPV病毒细胞原位检测中的应用

合成实施例1所设计的核酸序列。将4μM的B和4μM的C加入PCR管中加热到95℃并自然冷却到室温制备BC杂交链并保存于4℃冰箱。将4μM的D和8μM的E加入PCR管中加热到95℃并自然冷却到室温制备DEE杂交链并保存于4℃冰箱待用。取临床病人宫颈刮片浸泡于生理盐水中洗漱回收刮片细胞，回收细胞1000 rpm离心10min，回收细胞片层沉淀，并重悬于新鲜生理盐水中，将10µl细胞悬液涂布于玻片，并在酒精灯上烘焙数秒对细胞进行固定，固定细胞经1%triton洗涤后，加入CD，和DEE杂链，并于37℃孵箱中孵育1小时，置于荧光显微镜下观察，可见临床确诊HPV感染的病人刮片细胞有明显绿色荧光（图6）。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 东南大学

<120> 基于核酸自我催化的逻辑环路及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

auuacguuug gugga 15

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcacctccac caaacgtaat 20

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtttggtgga ggtgctcctc tctccattac tcctctctcc attac 45

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaatggaga gaggagtaat ggagagagga gcacc 35

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctctctcc attacgtttg gtgga 25

Claims

1.基于核酸自我催化的逻辑环路，其特征在于由5条核酸单链组成，所述核酸单链为B、C、D、E链和目标检测链A；反应起始时：B链和C链杂交，D链和E链杂交；加入目标检测A链后，形成一个闭合的反应环路：A置换C链并和B链杂交生成AB产物，C置换E链并和D链杂交生成CD产物，E置换C链并和B链杂交生成EB产物。

2.根据权利要求1所述基于核酸自我催化的逻辑环路，其特征在于所述A链是含有a-c结构域的目标检测序列；B链由b’-c’-a’结构域组成；C链由c-b-d-X结构域组成组成；D链由Y-a’-d’-b’结构域组成；E链由d-a-c结构域组成；以上核酸序列均按5’-3’顺序；所述a和a’互补，b和b’互补，c和c’互补，d和d’互补；a、a’、b和b’序列长度为2-8个核苷酸；c、c’、d和d’序列长度为10到30个核苷酸；以上序列除互补配对外，各序列之间连续配对残基少于4个；当X=0表示0个核苷酸，Y=0表示0个核苷酸时，产物为线性扩增，每经过一个扩增逻辑环路所新增的产物CD和EB的量和加入A链的量成正比；当X=(a-d)_n-a，表明X序列为n个结构域a-d重复串联后加上a序列；Y=(a’-d’)_n，表明Y序列为n个结构域a’-d’重复串联，产物为指数扩增，每经过一个扩增逻辑环路所新增的产物CD和EB的量为扩增前的n倍。

3.权利要求1或2所述逻辑环路在检测DNA单链、RNA单链、以及环状单链DNA和RNA中的应用。

4.权利要求1或2所述逻辑环路在检测临床单链核酸中的应用。