CN110283887B - 包含别构转录因子调控系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及将小分子信号转化为DNA扩增产物信号的体外(in vitro)检测技术，用于精准检测小分子的生物传感器、试剂盒及其相关的方法和用途。所述生物传感器的机理在于，自然界里微生物利用别构转录因子(allosteric transcription factor，aTF)与换能蛋白专一性竞争换能DNA上的换能位点；小分子与别构转录因子的特异性结合使得别构转录因子与换能DNA脱离，换能蛋白得以与换能位点相互作用，从而触发信号转换，将小分子信号转换为不同形式的DNA信号，通过对DNA信号的定量检测，从而精确测定小分子的浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及借助别构转录因子(allosteric transcriptionfactor，aTF) 与换能蛋白竞争处于换能DNA片段上的靶序列来触发扩增反应，将小分子信号转化为DNA 扩增产物信号的体外(in vitro)检测方法和试剂盒。
背景技术
对样品中小分子的有效检测，在环境污染监控、食品质量控制和疾病诊断等领域都极为 重要。现有技术中的小分子检测方法主要分为两大类，理化分析方法和生物分析方法。理化 分析方法主要通过波谱法、色谱法及其联用技术。这些技术分离效能高、选择性好、定性和 定量能力强。然而，其样品制备过程复杂，仪器价格昂贵，耗时长。即便熟练的操作人员也 需要较长时间才能得到结果，且不适用于现场分析。
生物分析方法通常借助体内固有的小分子与蛋白/核酸的特异性相互作用，在较小的体 系或芯片上实现信号的生成、放大、信号转换和读出。这样的方法能够实现现场、实时检测。 特别地，通常通过模拟激动剂/拮抗剂-受体、或者抗原-抗体相互作用对，利用与小分子相互 作用的受体或抗体对小分子进行抓取。或者，通过筛选或进化获得能够与小分子特异性相互 作用的核酸(例如适体)，实现对小分子的特异性识别。随后，通过抗体级联放大、石英晶 体微量天平等方式，将此类相互作用的信号转化并放大为光/显色/电化学信号，从而读出小 分子的定性或定量的信息。
为了扩大能够分析的小分子的范围，已经提出利用别构转录因子与其靶DNA片段以及 效应物小分子的相互作用，将小分子的有无或浓度的信息转换为别构转录因子-靶DNA-小分 子三者相互作用的结合信号，并将该相互作用信号转化放大为可检测的光学信号来实现定量 检测(Chem.Commun.2017，53，99-102)。然而，该方法需要使用酶标仪等专业设备，更适 合实验室和医疗机构。对于使用者来说，仍存在对携带和操作方便、能够即时即地获得较高 精确度结果的测试(point of care testing)的需求。
此外，本领域技术人员所理解的是，不同的传感器设置具有不同的检测下限和工作范围， 因此适用于不同的检测对象和检测体系。在这方面，本领域仍存在开发新型小分子检测用传 感器的需求。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种用于检测小分子的生物传感器，所述生物传感器包含识 别元件和换能元件，其中，
所述识别元件为别构转录因子；
所述换能元件包含换能DNA片段和至少一种换能蛋白，所述换能DNA片段包含别构转录因子作用位点和换能位点；其中，所述别构转录因子与所述别构转录因子作用位点的结 合阻碍至少一种所述换能蛋白与换能位点的结合，所述别构转录因子与所述小分子的结合改 变所述别构转录因子与所述换能DNA片段的相互作用；其中，所述换能DNA片段在所述 转录因子作用位点处为双链，至少一种所述换能蛋白为DNA聚合酶。
在第二方面，本发明提供了一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所 述的生物传感器以及检测元件，其中，所述检测元件用于对DNA扩增产物进行检测。
在第三方面，本发明提供了别构转录因子在制备第一方面所述的生物传感器中的用途。
在第四方面，本发明提供了一种对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包括将所 述样品与第一方面所述的生物传感器接触，并检测DNA扩增的产物。
附图说明
图1为根据本发明的实施方式，利用本发明的传感器进行识别和换能原理图。aTF与换 能DNA片段的结合对至少一种换能蛋白(限制性内切酶、TdT或T4连接酶)与换能位点的相互作用造成空间位阻；而小分子与aTF的结合使得aTF从换能DNA上脱离，从而至少 一种换能蛋白得以与换能位点相互作用，触发信号传递并改变DNA扩增产物的量。
图2为根据实施例1，造成双链断裂的II型限制性内切酶(RE)作为第一换能蛋白，DNA聚合酶作为第二换能蛋白，对转换后的DNA进行RT-qPCR扩增和检测的实施方式。 (a)别构转录因子与换能DNA的结合使得造成双链断裂的限制性内切酶不能结合限制性 酶切位点，因此DNA聚合酶能够利用结合于换能DNA两侧的引物进行延伸，从而采用RT- qPCR能够检测到扩增产物。小分子与别构转录因子的特异性结合使得别构转录因子与换能 DNA脱离，暴露限制性酶切位点，RE对DNA的切割使得换能DNA断裂，DNA聚合酶不 能利用其作为模板扩增。(b)利用非变性凝胶电泳检测不同浓度下HosA与HindIII-HF对 DNA片段TL+R的竞争。第1-3泳道分别为仅加入作为对照的TR(对应于切割后的右侧片 段)、TL(对应于切割后的左侧片段)和TL+R片段的结果。第4-9泳道分别为0、0.17μM、 1.7μM、3.4μM、16.8μM以及33.5μM HosA与0.15U/μL HindIII-HF对200nM TL+R片段切割 的结果。(c)利用非变性凝胶电泳检测不同浓度的PHBA对HosA、HindIII-HF以及换能DNA 之间相互作用的调控。所采用的体系为0.15U/μL HindIII-HF、33.5μM HosA和200nM TL+R片段。第1-3泳道分别为仅加入作为对照的TR、TL和TL+R片段；第4-9泳道分别为在0、 0.01mM、0.1mM、0.5mM、1mM和5mM PHBA条件下的结果。(d)不同PHBA浓度下， RT-qPCR输出的荧光强度随扩增周期的变化。其中，NTC为无模板对照。Threshold为自动 读出的指数增长期荧光信号临界值。箭头表示PHBA浓度由低到高对应的结果。(e)Ct值 (即，到达阈值时的循环数)与PHBA浓度对数的关系。用最小二乘法进行线性拟合，得到 R2为0.947。误差线表示三次独立实验的标准差。(d)和(e)所采用的体系为：0.15U/μL HindIII-HF、1.0nM HosA和200pM换能DNA。
图3为根据实施例2，末端转移酶(TdT)作为换能蛋白，检测无模板扩增获得的G四链体浓度的实施方式。(a)别构转录因子结合其作用位点保护了换能DNA的3'末端，使得TdT不能对3'末端延伸。小分子与别构转录因子的结合使得别构转录因子与换能DNA脱离，TdT能够利用dNTP对3'末端进行无模板延伸。(b)-(d)为通过控制溶液中的dNTP浓度， 对延伸生成G四链体进行检测。(b)借助荧光法，不同PHBA浓度下荧光强度随时间的变 化。(c)240s时荧光强度与PHBA浓度的关系。(d)比色法检测G四链体脱氧核酶催化H2O2氧化ABTS反应产物的吸光谱。插图显示不同浓度的PHBA所造成检测溶液的颜色改变的 照片。(e)420nm下吸光度与PHBA浓度的关系。全部实验重复进行三次，曲线示出三次独 立实验的平均值，误差线为标准差。
图4为根据实施例3的尿酸(UA)和土霉素(OTC)传感器的检测结果。(a)借助无 模板延伸生成G四链体的检测方式，HucR/TdT传感器对尿酸进行检测的结果。(b)借助无 模板延伸生成G四链体的检测方式，OtrR/TdT传感器对土霉素进行检测的结果。全部实验 重复进行三次，曲线示出三次独立实验的平均值，误差线为标准差。
图5为根据实施例4，换能DNA的一条链在别构转录因子作用位点处带有缺口，换能蛋白包含DNA连接酶。(a)别构转录因子与带有缺口的别构转录因子作用位点之间相互作用的示意图，标出断开的磷酸二酯键与正常的磷酸二酯键。DBD和EDB分别是别构转录因 子的DNA结合结构域和小分子结合结构域。(b)别构转录因子与换能DNA的结合保护了 换能DNA上的缺口。由于缺口的存在，该DNA片段不能作为模板进行扩增。小分子与别 构转录因子的特异性结合使得别构转录因子与换能DNA脱离，从而DNA连接酶能够将缺 口修复，为DNA扩增提供模板，触发DNA扩增。(c)与不具有缺口的换能DNA与HosA 的相互作用相比，在不同位置具有缺口的换能DNA与HosA相互作用的Kon、Koff和KD的 倍数改变。其中，灰色序列为HosA的转录因子作用位点。(d)借助变性凝胶电泳检测，不 同浓度的PHBA对HosA、T4连接酶以及换能DNA之间相互作用的调控。所采用的体系为0.2U/μL T4连接酶、33.5μM HosA和200nM等摩尔混合的双链DNA片段(TL1、TR1和TH互补构成)。第3-9泳道分别为加入0、0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1mM和10mM 的PHBA条件下HosA与T4连接酶竞争的结果。
图6为根据实施例4，采用多种扩增检测方式的aTF/连接酶传感器对PHBA的检测。(a)-(c)采用RT-qPCR的方式检测。所采用的体系为：0.1U/μL T4连接酶、1.0nM HosA 和20pM换能DNA。(b)不同PHBA浓度下，RT-qPCR荧光强度随扩增周期的变化。其中， NTC为无模板对照。Threshold为自动读出的指数增长期荧光信号临界值。(c)Ct值与PHBA 浓度负对数的线性关系。用最小二乘法进行线性拟合，得到R2为0.968。(d)-(g)采用滚 环扩增(RCA)并检测G四链体的实施方式。(e)不同的PHBA浓度下扩增得到的G四链 体生成的脱氧核酶(DNAzyme)催化检测溶液的颜色改变。1-11分别为0、10nM、20nM、 30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM和100nM下的检测结果。(f)比色方式 检测的420nm下吸光度与PHBA浓度的关系。(g)采用荧光方式检测，不同PHBA浓度下 荧光强度随时间的改变。(h)-(j)采用测流层析(LF)的方式对重组酶聚合酶扩增(RPA) 产物进行检测。(i)不同浓度下的测流层析结果。C和T分别为对照线和测试线。(j)LF测 试线信号的相对强度与PHBA浓度的关系。测试线的灰度为使用ImageJ(NIH)测得。利用 PHBA浓度为0的对照获得的LF测试线强度对结果进行归一化。用最小二乘法对PHBA浓 度的对数与测试带信号强度关系进行线性拟合，得到R2为0.957。全部实验进行三次。(c)、 (f)和(g)中的误差线表示三次独立实验的标准差。
图7为根据实施例5，采用多种检测方式的aTF/连接酶传感器对四环素(TC)或UA检测的结果。(a)利用TetR/连接酶传感器对TC浓度进行RT-qPCR检测获得的Ct值与TC浓 度负对数的线性关系。用最小二乘法进行线性拟合，得到R2为0.939。(b)利用TetR/连接 酶传感器，通过LF检测RPA扩增产物的方式检测TC浓度的结果。C和T分别为对照线和 测试线。(c)利用TetR/连接酶传感器，通过G四链体荧光检测对RCA扩增产物进行检测， 获得的荧光强度与TC浓度的关系。(d)用HucR/连接酶传感器对UA浓度进行RT-qPCR检 测获得的Ct值与UA浓度负对数的线性关系。用最小二乘法进行线性拟合，得到R2为0.966。 (e)利用HucR/连接酶传感器，通过LF检测RPA扩增产物的方式检测UA浓度的结果。C 和T分别为对照线和测试线。(f)利用HucR/连接酶传感器，通过G四链体荧光检测对RCA 扩增产物进行检测，获得的荧光强度与UA浓度的关系。全部实验进行三次。(a)、(c)、(d) 和(f)中的误差线表示三次独立实验的标准差。(g)不同检测模式的传感器对PHBA、UA 和TC检测的定量结果统计。NA为没有进行该试验。
具体实施方式
本发明利用别构转录因子与至少一种换能蛋白对换能DNA片段上换能位点的竞争，将 小分子与别构转录因子结合的信号转化并放大为DNA扩增产物的信号(图1)，实现对小分 子的定性或定量的检测。具体而言，由于换能DNA片段上别构转录因子作用位点与换能位 点临近或重叠，别构转录因子与别构转录因子作用位点的结合造成至少一种换能蛋白与该蛋 白的作用位点(即，换能位点)结合的位阻增大，从而由DNA聚合酶扩增获得的延伸产物 的量改变。
在优选的实施方式中，小分子的存在触发扩增反应，从而扩增产物的存在表明所述样品 中存在所述小分子。即，小分子的量与扩增产物的量正相关。
识别元件
对于同时能够作为酶-底物方式和本发明的别构转录因子-效应物方式的检测对象的小分 子而言，由于与酶-底物的平衡解离常数KD相比，别构转录因子-效应物的平衡解离常数数值 相当或更低，本发明方法的检测灵敏度等同甚至优于采用酶-底物机制的生物传感器。而通 过采用不同的换能方法，可以获得具有不同检测下限和线性范围的传感器，为污染控制、诊 断预防等多种使用目的提供更多的选择。
本发明所使用的术语“别构转录因子”具有本领域公知的含义。别构转录因子包含与效 应物(通常为小分子)结合的结构域以及DNA结合结构域，其与效应物的结合引起构象改 变，使得该别构转录因子和与其特异性相互作用的DNA片段(天然状态下通常为启动子操 纵序列)的结合亲和力发生改变，从而增强或减弱由该操纵序列控制的DNA序列的转录(Nat Methods.2016，13(2)：177–183)，通过这样的方式使得基因的转录依赖于小分子的浓度。在 原核生物中，操纵序列通常出现在与代谢有关的操纵子或报告基因的上游；别构转录因子常 常起到针对细胞内效应物小分子的传感器的作用，反馈小分子的浓度信息，从而对细胞内的 生物合成途径进行动态调控。在真核生物中，此类别构转录因子常存在于控制细胞分化与个 体发育的通路中。鉴于本发明中别构转录因子与DNA的相互作用发生在体外，原核和真核 来源的别构转录因子均可作为本发明的识别元件。在本发明中，转录因子作用位点也称为转 录因子结合位点。不希望被理论所限地，转录因子作用位点通常为互补的双链DNA。此外， 如本发明实施例所展示的，转录因子作用位点附近存在单个3',5'-磷酸二酯键断裂(缺口)不 影响别构转录因子与其作用位点的结合。
天然转录系统中转录因子作用位点的序列是已知的。不同物种的转录因子结合位点长度 略有不同。转录因子结合位点在大肠杆菌中的平均长度为24.5bp，在果蝇中为12.5bp(J Mol Biol.1998，284(2)：241-54；Nucleic Acids Res.2003，31(1)：374-8)。在本发明中，转录因 子作用位点的长度优选10-40bp。在本发明中，别构转录因子作用位点也称为别构转录因子 结合位点。与别构转录因子作用的DNA片段并不限于在天然系统中存在的别构转录因子作 用位点。通过对作用位点序列进行随机或定向突变，或者结合计算机模拟选出数条候选序列 并验证别构转录因子与各DNA片段的结合能力是本领域成熟的技术(Mol Microbiol.2005， 55(3)：712-23.)。另外，也可对别构转录因子的小分子结合结构域和/或DNA结合结构域进 行突变，优化别构转录因子与小分子和/或DNA的结合亲和力。可通过定向突变和进化，提 高别构转录因子和与该别构转录因子作用的DNA片段之间的平衡解离常数和/或降低别构 转录因子与小分子之间的平衡解离常数，进一步提高本发明传感器的灵敏度。
如上所述，别构转录因子与小分子的结合可使得被调控基因的表达升高(激活系统)或 降低(阻遏系统)。在一些实施方式中，本发明的别构转录因子为激活系统的别构转录因子。 在该系统中，别构转录因子与效应物小分子的结合使得其与靶DNA的结合亲和力增强(即， 小分子的结合使得别构转录因子能够结合于靶DNA片段)。优选地，所述别构转录因子与所 述小分子结合后形成的转录因子-小分子复合体与所述换能DNA片段结合的平衡解离常数 大于所述别构转录因子与所述换能DNA片段结合的平衡解离常数；优选地，所述别构转录 因子-小分子复合体与换能DNA片段结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述换能 DNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。在一 些实施方式中，本发明的别构转录因子为阻遏系统的别构转录因子。在该系统中，别构转录 因子与效应物小分子的结合使得其与靶DNA的结合亲和力减弱(即，小分子的结合使得别 构转录因子从其作用位点处脱离)。优选地，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解 离常数大于所述别构转录因子与所述换能DNA片段结合的平衡解离常数；优选地，所述别 构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述换能DNA片段结 合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。
本发明的传感器、试剂盒和方法可用于诊断用途或非诊断用途。在本发明中，作为检测 对象的小分子为使得别构转录因子构象变化的效应物。一般而言，小分子的特征在于它具有 大于约50道尔顿但小于约5000道尔顿(5kD)的分子量。优选小分子具有小于1kD的分子 量。在本发明中，小分子可为例如环境指标、疾病指标或健康指标，包括但不限于重金属离 子、毒素、药物、代谢物、污染物或上述物质的分解产物等。小分子可存在于环境中或为细 菌、真菌、植物或动物源性，或者为人工合成。甚至对于不存在相对应的别构转录因子的效 应物小分子，本领域技术人员能够通过计算机模拟设计将效应物结合结构域添加至DNA结 合结构域，或改造天然转录因子的效应物结合结构域，构建人工的别构转录因子(Nat Methods. 2016，13(2)：177–183)。
在本发明中，待检测的小分子可存在于任何液体样品或可通过适当操作转换为液体样品 的固体样品中。样品可为环境样品，例如为地下水、中水、海水、废水、采矿废料的样品。 或者，样品可为生物样品，特别是来自受试者的样品，例如以下样品中的一种或多种：血液、 血清、血浆、痰、脑脊液流体、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、囊液、组织、唾液。样品也可来自于食品、饮用水或饲料。
在一些实施方式中，可对样品进行预处理，从而对待检测的小分子进行富集和提取，或 者去除可能干扰检测的杂质。例如，可通过离心、过滤、超声、匀浆化、加热、冷冻、解冻、 机械处理或多种操作方法的组合，和/或加入预处理的试剂。本领域技术人员知晓针对特定样 品的常见预处理方法和预处理试剂。例如，常用的预处理试剂包括表面活性剂和洗涤剂、盐、 细胞裂解剂、抗凝血剂、降解酶(例如蛋白酶、脂酶、核酸酶、脂肪酶、胶原酶、纤维素酶、 淀粉酶等)以及溶液(例如缓冲液)等。
表1列出了多种别构转录因子、与其相互作用的DNA序列及对应的效应物小分子。本 领域技术人员能够理解的是，用于本发明的别构转录因子并不限于所列举的这些。另外，也 可对与所列举的别构转录因子相互作用的DNA序列的一个或多个碱基进行替换、删除或加 入一个或多个碱基，从而改变别构转录因子和与其相互作用的DNA序列的结合强度。
表1：示例性的别构转录因子、与其相互作用的DNA序列以及所对应的效应物
换能元件和检测元件
如上所述，本发明的生物传感器借助别构转录因子与至少一种换能蛋白对换能位点的竞 争，利用对DNA扩增产物的检测实现对小分子与别构转录因子相互作用的信号的检测。本 发明所使用的术语“换能DNA片段”为包含别构转录因子作用位点和换能位点的DNA片 段，其在别构转录因子作用位点处为双链。本文使用的术语“换能位点”是指与别构转录因 子作用位点临近或重叠的位点，别构转录因子与别构转录因子作用位点的结合阻碍换能位点 与至少一种的换能蛋白结合。
如一些实施例所展示的，本方法能够整合本领域熟知的多种等温扩增方法(例如重组酶 聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)、自持序列复制、滚环扩增(RCA)、交叉引物恒温扩增、Q-β扩增系统和OneCutEventAmplificatioN等)，由于无需使用复杂的变温设备 和处理设备，本发明的传感器和方法在简单易行、便携性和性价比方面也具有明显优势。
在一些实施方式中，所述换能元件包含一种换能蛋白，所述换能蛋白为DNA聚合酶。 在该实施方式中，所述换能蛋白是末端转移酶，所述换能位点为别构转录因子作用位点的3' 末端。末端转移酶(也称为末端脱氧核苷酸转移酶，terminal deoxynucleotidyltransferase，TdT) 是一种无需模板的DNA聚合酶，它催化脱氧核苷酸结合到单链或双链DNA分子的3'羟基 端，带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。如图3a所示， 在别构转录因子为负控系统的情况下，别构转录因子与别构转录因子作用位点的结合封闭了 换能DNA片段各链的3'末端，对末端转移酶与DNA片段的3'羟基端的结合造成空间位阻。 小分子与别构转录因子的结合使得别构转录因子从DNA片段脱离，使得末端转移酶能够与 DNA片段的3'羟基端相互作用，实现对3'羟基端的无模板延伸扩增。在优选的实施方式中， 在所述换能DNA中，各链的转录因子作用位点3'端侧翼的碱基数均不超过2bp。可使用随 机引物，采用RT-PCR的方法对扩增产物进行检测。考虑到TdT介导的延伸产物很大程度上 取决于反应体系中四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的比例，当反应体系中dGTP含量较高 (不少于50％)时，扩增产物序列富含鸟嘌呤，该富含鸟嘌呤(G)的片段能够折叠为G四 链体(G-quadruplex)结构，从而能够用本领域已知的荧光方法(借助硫黄素T，ThT)或比 色方法(G四链体/hemin DNA酶催化H2O2氧化ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺 酸)二铵盐)的反应)进行检测，或者也可通过肉眼观测颜色变化直接获得测量结果 (Biosensors&bioelectronics 86,811-817,doi:10.1016/j.bios.2016.07.083(2016)；Biosensors& bioelectronics 77,971-977,doi:10.1016/j.bios.2015.10.080(2016))。因此，在优选的实施方式 中，可通过调整体系中加入的dNTP混合物的比例，使得扩增产物包含G四链体序列，通过 对G四链体进行定性或定量来测定体系中小分子的量。在一些实施方式中，dNTP混合物为 50％的dGTP、40％的dATP和10％dTTP的混合物。在一些实施方式中，dNTP混合物为60％ 的dGTP和40％的dATP的混合物。包含TdT的传感器使用方便快捷，肉眼直接观察即可获 得检测结果。
在一些实施方式中，利用本发明的aTF/TdT传感器进行的检测的方法可包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子、换能DNA片段与dNTP混合物进行混合并孵育；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT和随机引物；
(3)对步骤(2)的反应的扩增产物进行检测。
在另一些实施方式中，利用本发明的aTF/TdT传感器进行的检测的方法可包含如下步 骤：
(1)将待测样品、别构转录因子、换能DNA片段与dNTP混合物进行混合并孵育；其中，所述dNTP混合物包含不少于50％的dGTP；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT；
(3)对步骤(2)的反应生成的G四链体进行检测。
在一些实施方式中，利用本发明的aTF/TdT传感器进行检测的方法可包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子、换能DNA片段、dNTP混合物与硫黄素T进行混合 并孵育；其中，所述dNTP混合物包含不少于50％的dGTP；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT；
(3)通过荧光分析对步骤(2)的反应生成的G四链体进行检测。
在一些实施方式中，利用本发明的aTF/TdT传感器进行检测的方法可包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子、换能DNA片段与dNTP混合物进行混合并孵育；其中，所述dNTP混合物包含不少于50％的dGTP；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT；
(3)将步骤(2)获得的溶液与氯化血红素孵育，随后向其中加入ABTS2-和H2O2，通过对吸光度进行分析对步骤(2)的反应生成的G四链体进行检测。
在一些实施方式中，所述换能元件包含第一换能蛋白和第二换能蛋白，其中，所述第一 换能蛋白与所述换能位点相互作用，所述第二换能蛋白为DNA聚合酶。
在一些实施方式中，所述第一换能蛋白为造成双链断裂的限制性内切酶(RE)，所述换 能元件进一步包含能够与换能DNA片段退火的引物对，换能DNA片段包含别构转录因子 作用位点、换能位点以及一对引物结合位点，其中，换能位点是限制性酶切位点，一对引物 结合位点分别位于别构转录因子作用位点两侧。大部分II型限制性内切酶能够识别特定的 双链回文序列，并在被识别序列的特定位点切割DNA分子核糖核苷酸之间的磷酸二酯键， 造成双链断裂。本领域已经发现400余种此类限制性内切酶，其中100余种已经被商业化， 其对应的限制性酶切位点是本领域所公知的。如图2a所示，在别构转录因子为负控系统的 情况下，DNA片段上的限制性酶切位点与别构转录因子作用位点临近(例如，限制性酶切 位点与别构转录因子作用位点相邻(即，二者间没有其它碱基))或至少部分重叠，从而别 构转录因子与别构转录因子作用位点的结合对限制性内切酶与DNA片段上限制性酶切位点 的相互作用造成空间位阻。由于别构转录因子与DNA片段的结合不阻碍扩增反应，在存在 引物对和DNA聚合酶时可对该DNA片段进行扩增。小分子与别构转录因子的结合使得别 构转录因子从DNA片段脱离，从而允许限制性内切酶对限制性位点切割，造成DNA片段的断裂。由于引物对结合位点位于别构转录因子作用位点的两侧，DNA片段的断裂使得扩增反应不能进行，因此扩增产物定量反应了体系中小分子的浓度。可使用紫外吸收或EB染色等方法对DNA进行定量检测。在优选的实施方式中，为提高检测精度，采用本领域熟知 的RT-qPCR的方法对扩增产物进行检测。出于扩增的效率的考虑，换能DNA片段的长度不 超过300bp，优选100-300bp。
利用本发明的aTF/RE传感器进行的检测的方法可包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子与换能DNA片段混合并孵育；
(2)在步骤(1)的混合物中加入造成双链断裂的II型限制性内切酶；反应结束后对内 切酶高温失活；
(3)向步骤(2)获得的溶液中加入dNTP和DNA聚合酶，进行扩增，并对扩增产物 进行检测。
在一些实施方式中，换能元件包含换能DNA片段、第一换能蛋白和第二换能蛋白。其 中，第一换能蛋白是DNA连接酶，第二换能蛋白是DNA聚合酶，换能位点是别构转录因 子作用位点内或临近位置的单个缺口。考虑到多种别构转录因子的DNA结合结构域所识别 的序列为回文序列(Schreiter,E等，Nat.Rev.Microbiol.5,710-720(2007))，经发明人验证(实施例4)，在别构转录因子作用序列上造成单个磷酸二酯键断裂(即缺口，如图5a)将 不会影响别构转录因子与其作用位点的相互作用。因此，可利用别构转录因子与T4DNA聚 合酶对转录因子作用位点处的竞争，将小分子浓度信号转化为DNA扩增产物的定量信号。 具体而言，如图5b所示，在别构转录因子为负控系统的情况下，未与小分子结合的别构转 录因子与别构转录因子作用位点的结合对DNA连接酶造成空间位阻，从而DNA连接酶不 能将别构转录因子作用位点处的缺口(nicking)修复。此时由于DNA上存在缺口，该DNA 无法作为模板被扩增。小分子与别构转录因子的结合使得别构转录因子从DNA片段脱离， DNA连接酶将换能DNA片段修复成完整，因此能够利用本领域已知的多种方法(例如等温 扩增、定量PCR(qPCR))对扩增产物的量进行测定。优选地，缺口位于别构转录因子作用 位点内或者与别构转录因子作用位点间的距离不多于4bp。
在一些实施方式中，以定量PCR作为检测方法。其中，换能元件进一步包含能够与换 能DNA片段退火的引物对，换能DNA片段上进一步包含一对引物结合位点(如图6a所示)，其分别位于别构转录因子作用位点两侧。如上所述，出于扩增的效率的考虑，换能DNA片段的长度不超过300bp，优选100-300bp。
在一些实施方式中，以滚环扩增的方法进行检测。其中，换能元件中的DNA聚合酶为 phi29，换能DNA片段的两条链互补时其中一条链环化(即，较短的单链DNA可以和较长的单链DNA的5'和3'端完美地互补为双链)，从而造成环化链在双链区(即，转录因子作用位点处)带有缺口(如图6d所示)。在优选的实施方式中，换能元件进一步包含缺刻内切酶，换能DNA片段的环化链的单链区从5'至3'顺序设置有间隔排列的缺刻内切酶识别位点和G四链体互补序列。缺刻内切酶(nicking endonuclease或者nicking enzyme)也称为切刻核酸 内切酶，是一类特殊的限制性内切酶，能够识别特定的双链序列，并造成被识别序列的特定 位点处一条DNA链断裂，即在双链DNA中的一条上造成缺口(nick)。本领域已知多种缺刻内切酶，例如NEB公司的Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI等，其 DNA底物也是已知的。在该实施方式中，phi29介导的扩增将缺刻内切酶识别位点处补平为 双链，缺刻内切酶能够识别该位点，并将G四链体序列切出，从而能够用如上所述的G四 链体检测方法对生成的G四链体进行定性或定量检测。本领域已知的是，G四链体为具有如 下特征的序列：G3TiG3TjG3TkG(其中i、j、k不大于3)或(G3T4)3G3。另外，该序列两端具 有冗余碱基并不影响G四链体的折叠。示例性的G四链体序列包括且不限于De-Ming Kong， Methods 64(2013)199–204表1中列出的那些。出于效率优化的考虑，优选地，换能DNA片 段的环化链的单链区从5'至3'顺序设置有间隔排列的3个缺刻内切酶识别位点和2个G四 链体互补序列。
在一些实施方式中，借助重组酶聚合酶扩增(RPA)进行DNA扩增。在该实施方式中，换能元件中的DNA聚合酶为链置换DNA聚合酶，换能元件进一步包含能结合单链核酸(寡 核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)，换能DNA片段上进一步包含一对引 物结合位点，该引物结合位点分别位于别构转录因子作用位点两侧。重组酶聚合酶扩增通常 借助商业化试剂盒(例如TwistAmp@试剂盒)进行。可使用本领域已经知晓的多种对RPA 扩增产物进行检测的方式(例如实施荧光检测方法和测流层析(LF))对本发明的扩增产物 进行检测。在实施荧光检测方法中，与待扩增序列一部分互补的核酸探针的两端分别带有荧 光基团和淬灭基团，并在中间位置具有脱碱基位点类似物(THF)或dSpacer。THF可被一 种来自大肠杆菌核酸内切酶IV(Nfo)识别并进行剪切，因此扩增到THF或dSpacer时 能够使得荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光强度增加。在LF检测方法中，探针的两端 分别带有两个抗原标签(例如FAM和生物素)，并在中间位置具有脱碱基位点类似物或 dSpacer，使得扩增时生成两条链分别带有FAM和生物素标记的双链DNA，因此能够借助 LF试纸进行检测。
利用本发明的aTF/T4连接酶传感器进行的检测的方法可包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子与换能DNA片段混合并孵育；
(2)在步骤(1)的混合物中加入T4连接酶；
(3)向步骤(2)获得的溶液中加入dNTP和DNA聚合酶，进行扩增，并对扩增产物 进行检测。
不希望被理论所限地，在本发明中，首先通过RE或连接酶进行换能，并在后续步骤中 利用DNA聚合酶进行DNA扩增，能够将本领域已经优化的多种扩增方法整合至本发明的传感器、试剂盒和方法，从而提供更多不同精度和线性范围的传感器。就这一点而言，采用RE或连接酶进行换能是优选的。
本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：
1.一种用于检测小分子的生物传感器，所述生物传感器包含识别元件和换能元件，其中，
所述识别元件为别构转录因子；
所述换能元件包含换能DNA片段和至少一种换能蛋白，所述换能DNA片段包含别构转录因子作用位点和换能位点；其中，所述别构转录因子与所述别构转录因子作用位点的结 合阻碍至少一种所述换能蛋白与换能位点的结合，所述别构转录因子与所述小分子的结合改 变所述别构转录因子与所述换能DNA片段的相互作用；其中，所述换能DNA片段在所述 转录因子作用位点处为双链，至少一种所述换能蛋白为DNA聚合酶，所述DNA聚合酶催化所述换能DNA片段的扩增反应。
2.如段落1所述的生物传感器，其中，所述小分子具有50-5000道尔顿的分子量。
3.如段落1或2所述的生物传感器，其中，所述小分子为重金属离子、毒素、药物、代谢物、污染物或上述物质的分解产物。
4.如段落1-3中任一项所述的生物传感器，其中，小分子的存在触发所述扩增反应。
5.如段落1-4中任一项所述的生物传感器，其中，所述转录因子作用位点的长度为10- 40bp。
6.如段落1-5中任一项所述的生物传感器，其中，所述扩增为等温扩增，所述等温扩增 选自于如下的任一种：重组酶聚合酶扩增、环介导等温扩增、自持序列复制、滚环扩增、交 叉引物恒温扩增、Q-β扩增系统以及OneCutEventAmplificatioN。
7.如段落1-5中任一项所述的生物传感器，其中，所述换能蛋白为TdT，所述换能位点 为别构转录因子作用位点的3'末端。
8.如段落7所述的生物传感器，其中，在所述换能DNA片段中，所述别构转录因子作用位点各链的3'端侧翼具有的碱基数不多于2bp。
9.如段落7或8所述的传感器，其中，所述换能元件进一步包含随机引物。
10.如段落7或8所述的生物传感器，其中，所述换能DNA片段的扩增产物为G四链体。
11.如段落10所述的生物传感器，其中，所述换能元件进一步包含dNTP混合物，在所 述dNTP混合物中dGTP的含量不少于50％。
12.如段落11所述的生物传感器，其中，通过荧光分析或比色分析对所述换能DNA片 段的扩增产物进行分析。
13.如段落1-5中任一项所述的生物传感器，其中，所述换能元件包含第一换能蛋白和 第二换能蛋白，其中，所述第一换能蛋白与所述换能位点相互作用，所述第二换能蛋白为 DNA聚合酶。
14.如段落13所述的生物传感器，其中，所述第一换能蛋白为造成双链断裂的限制性 内切酶，所述换能位点是限制性酶切位点，所述换能元件进一步包含能够与换能DNA片段 退火的引物对，所述换能DNA片段进一步包含一对引物结合位点，所述引物结合位点分别 位于别构转录因子作用位点两侧。
15.如段落13或14所述的生物传感器，其中，所述别构转录因子作用位点与所述限制 性酶切位点重叠或相邻。
16.如段落13-15中任一项所述的生物传感器，其中，所述换能DNA片段的长度不超过300bp。
17.如段落16所述的生物传感器，其中，所述扩增反应通过RT-qPCR进行。
18.如段落13所述的生物传感器，其中，所述第一换能蛋白为DNA连接酶，所述换能位点为存在于所述换能DNA片段双链区的缺口。
19.如段落18所述的生物传感器，其中，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶。
20.如段落18或19所述的生物传感器，其中，所述缺口位于别构转录因子内或者与所 述别构转录因子作用位点间的距离不多于4bp。
21.如段落18-20中任一项所述的生物传感器，其中，所述扩增反应为选自于如下的任 一种：定量PCR、滚环扩增或重组酶聚合酶扩增。
22.如段落21所述的生物传感器，其中，所述扩增反应为定量PCR，其中，所述换能元件进一步包含能够与换能DNA片段退火的引物对，换能DNA片段上进一步包含一对引 物结合位点，其分别位于别构转录因子作用位点两侧。
23.如段落22所述的生物传感器，其中，所述换能DNA片段的长度不超过300bp。
24.如段落21所述的生物传感器，其中，所述扩增反应为滚环扩增，其中，所述第二换 能蛋白为phi29DNA聚合酶，所述换能DNA片段的两条链互补时其中一条链环化。
25.如段落24所述的生物传感器，其中，所述换能元件进一步包含缺刻内切酶，所述换 能DNA片段的环化链的单链区从5'至3'顺序设置有间隔排列的缺刻内切酶识别位点和G四 链体互补序列。
26.如段落25所述的生物传感器，其中，所述换能DNA片段的环化链的单链区从5'至 3'顺序设置有间隔排列的3个缺刻内切酶识别位点和2个G四链体互补序列。
27.如段落25或26所述的生物传感器，其中，通过荧光分析或比色分析对所述换能DNA片段的扩增产物进行分析。
28.如段落21所述的生物传感器，其中，所述扩增反应为重组酶聚合酶扩增，其中，所 述第二换能蛋白为链置换DNA聚合酶，所述换能DNA片段上进一步包含探针结合位点以及一对引物结合位点，该引物结合位点分别位于别构转录因子作用位点两侧。
29.如段落28所述的生物传感器，其中，通过荧光检测方法或测流层析对所述换能DNA 片段的扩增产物进行分析。
30.一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含识别元件、换能元件和检测元件， 其中，
所述识别元件为别构转录因子；
所述换能元件包含换能DNA片段和至少一种换能蛋白，所述换能DNA片段包含别构转录因子作用位点和换能位点；其中，所述别构转录因子与所述别构转录因子作用位点的结 合阻碍至少一种所述换能蛋白与换能位点的结合，所述别构转录因子与所述小分子的结合改 变所述别构转录因子与所述换能DNA片段的相互作用；其中，所述换能DNA片段在所述 转录因子作用位点处为双链，至少一种所述换能蛋白为DNA聚合酶，所述DNA聚合酶催化所述换能DNA片段的扩增反应；
所述检测元件用于对所述扩增反应的产物进行检测。
31.如段落30所述的试剂盒，其中，所述小分子具有50-5000道尔顿的分子量。
32.如段落30或31所述的试剂盒，其中，所述小分子为重金属离子、毒素、药物、代谢物、污染物或上述物质的分解产物。
33.如段落30-32中任一项所述的试剂盒，其中，小分子的存在触发所述扩增反应。
34.如段落30-33中任一项所述的试剂盒，其中，所述转录因子作用位点的长度为10- 40bp。
35.如段落30-34中任一项所述的试剂盒，其中，所述扩增为等温扩增，所述等温扩增 选自于如下的任一种：重组酶聚合酶扩增、环介导等温扩增、自持序列复制、滚环扩增、交 叉引物恒温扩增、Q-β扩增系统以及OneCutEventAmplificatioN。
36.如段落30-34中任一项所述的试剂盒，其中，所述换能蛋白为TdT，所述换能位点 为别构转录因子作用位点的3'末端。
37.如段落36所述的试剂盒，其中，在所述换能DNA片段中，所述别构转录因子作用位点各链的3'端侧翼具有的碱基数不多于2bp。
38.如段落36或37所述的试剂盒，其中，所述换能元件进一步包含随机引物。
39.如段落36或37所述的试剂盒，其中，所述换能元件进一步包含dNTP混合物，所述dNTP混合物中dGTP的含量不少于50％。
40.如段落39所述的试剂盒，其中，所述检测元件用于通过荧光分析或比色分析对所 述换能DNA片段的扩增产物进行分析。
41.如段落30-34中任一项所述的试剂盒，其中，所述换能元件包含第一换能蛋白和第 二换能蛋白，其中，所述第一换能蛋白与所述换能位点相互作用，所述第二换能蛋白为DNA 聚合酶。
42.如段落41所述的试剂盒，其中，所述第一换能蛋白为造成双链断裂的限制性内切 酶，所述换能位点是限制性酶切位点，所述换能元件进一步包含能够与换能DNA片段退火 的引物对，所述换能DNA片段进一步包含一对引物结合位点，所述引物结合位点分别位于 别构转录因子作用位点两侧。
43.如段落42所述的试剂盒，其中，所述别构转录因子作用位点与所述限制性酶切位 点重叠或相邻。
44.如段落42或43所述的试剂盒，其中，所述换能DNA片段的长度不超过300bp。
45.如段落44所述的试剂盒，其中，所述检测元件用于对通过RT-qPCR扩增的产物进 行检测。
46.如段落41所述的试剂盒，其中，所述第一换能蛋白为DNA连接酶，所述换能位点为存在于所述换能DNA片段双链区的缺口。
47.如段落46所述的试剂盒，其中，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶。
48.如段落47所述的试剂盒，其中，所述缺口位于别构转录因子内或者与所述别构转 录因子作用位点间的距离不多于4bp。
49.如段落48所述的试剂盒，其中，所述扩增反应为选自于如下的任一种：定量PCR、 滚环扩增或重组酶聚合酶扩增。
50.如段落49所述的试剂盒，其中，所述扩增反应为定量PCR，其中，所述换能元件进一步包含能够与换能DNA片段退火的引物对，换能DNA片段上进一步包含一对引物结 合位点，其分别位于别构转录因子作用位点两侧，所述检测元件用于对定量PCR扩增的产 物进行检测。
51.如段落50所述的试剂盒，其中，所述换能DNA片段的长度不超过300bp。
52.如段落49所述的试剂盒，其中，所述扩增反应为滚环扩增，其中，所述第二换能蛋 白为phi29DNA聚合酶，所述换能DNA片段的两条链互补时其中一条链环化。
53.如段落52所述的试剂盒，其中，所述换能元件进一步包含缺刻内切酶，所述换能 DNA片段的环化链的单链区从5'至3'顺序设置有间隔排列的缺刻内切酶识别位点和G四链 体互补序列。
54.如段落53所述的试剂盒，其中，所述换能DNA片段的环化链的单链区从5'至3'顺 序设置有间隔排列的3个缺刻内切酶识别位点和2个G四链体互补序列。
55.如段落53或54所述的试剂盒，其中，所述检测元件用于通过荧光分析或比色分析 对所述换能DNA片段的扩增产物进行分析。
56.如段落49所述的试剂盒，其中，所述扩增反应为重组酶聚合酶扩增，其中，所述第 二换能蛋白为链置换DNA聚合酶，所述换能DNA片段上进一步包含探针结合位点以及一对引物结合位点，该引物结合位点分别位于别构转录因子作用位点两侧。
57.如段落56所述的试剂盒，其中，所述检测元件为用于通过荧光检测方法或测流层 析对所述换能DNA片段的扩增产物进行分析。
58.别构转录因子在制备段落1-29中任一项所述的生物传感器或如段落30-57中任一项 所述的试剂盒的用途。
59.如段落58所述的用途，其中，所述生物传感器或所述试剂盒用于环境污染监控、食 品质量控制和疾病诊断。
60.一种对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包括将所述样品与段落1-29中任 一项所述的生物传感器或如段落30-57中任一项所述的试剂盒接触，并检测DNA扩增的产 物。
61.一种利用如段落9所述的生物传感器或如段落38所述的生物传感器对样品中的小 分子进行检测的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子、换能DNA片段与dNTP混合物进行混合并孵育；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT和随机引物；
(3)对步骤(2)的反应的扩增产物进行检测。
62.一种利用如段落10-12中任一项所述的生物传感器或如段落39或40所述的生物传 感器对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将所述样品、别构转录因子、换能DNA片段与dNTP混合物进行混合并孵育；其中，所述dNTP混合物包含不少于50％的dGTP；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT；
(3)对步骤(2)的反应生成的G四链体进行检测。
63.如段落62所述的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将所述样品、别构转录因子、换能DNA片段、dNTP混合物与硫黄素T进行混合 并孵育；其中，所述dNTP混合物包含不少于50％的dGTP；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT；
(3)通过荧光分析对步骤(2)的反应生成的G四链体进行检测。
64.如段落62所述的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将所述样品、别构转录因子、换能DNA片段与dNTP混合物进行混合并孵育；其中，所述dNTP混合物包含不少于50％的dGTP；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT；
(3)将步骤(2)获得的溶液与氯化血红素孵育，随后向其中加入ABTS2-和H2O2，通过对吸光度进行分析对步骤(2)的反应生成的G四链体进行检测。
65.一种利用如段落13-29中任一项所述的生物传感器或如段落41-57中任一项所述的 生物传感器对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将所述样品、别构转录因子与换能DNA片段混合并孵育；
(2)在步骤(1)的混合物中加入所述第一换能蛋白；
(3)向步骤(2)获得的溶液中加入dNTP和DNA聚合酶，进行扩增，并对扩增产物 进行检测。
66.如段落65所述的方法，其中，所述第一换能蛋白是造成双链断裂的II型限制性内 切酶，所述方法包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子与换能DNA片段混合并孵育；
(2)在步骤(1)的混合物中加入造成双链断裂的II型限制性内切酶；反应结束后对内 切酶高温失活；
(3)向步骤(2)获得的溶液中加入dNTP和DNA聚合酶，进行扩增，并对扩增产物 进行检测。
66.如段落65所述的方法，其中，所述第一换能蛋白是DNA连接酶，所述方法包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子与换能DNA片段混合并孵育；
(2)在步骤(1)的混合物中加入DNA连接酶；
(3)向步骤(2)获得的溶液中加入dNTP和DNA聚合酶，进行扩增，并对扩增产物 进行检测。
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实施例
实施例中使用的寡核苷酸为由生工生物工程有限公司(北京)合成并纯化。Nb.BbvCI、 TdT、HindIII-HF和4种脱氧核糖核苷5'-三磷酸(dNTP)购自New EnglandBiolabs(北京)。 2-[4-(二甲基氨基)苯基]-3,6-二甲基苯并噻唑鎓阳离子(ThT)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑- 6-磺酸)二铵盐(ABTS)和氯化血红素(hemin)购自Sigma。RT-qPCR试剂盒(FastFire qPCR PreMix)购自天根生化科技有限公司(北京)。Phi29DNA聚合酶购自NEB、RPA试剂盒 和LF试剂盒购自TwistDx(UK)。全部溶液使用灭菌的Milli-Q水(经Millipore纯化系统 纯化的水)配制。全部化学品为分析纯，购自Aladdin，未经进一步纯化。实验中使用的培 养基和缓冲液参见《分子克隆实验指南》下册(第三版，科学出版社，2002年)附录2。实 施例所使用的全部引物在表2中给出。实施例涉及的别构转录因子编码序列和各换能蛋白识 别位点在表3中给出。
实施例1包含HosA和HindIII-HF的对羟基苯甲酸传感器
在本实施例中，以来自大肠杆菌UMN026的别构转录因子HosA[1]作为识别元件，以造 成双链断裂的限制性内切酶HindIII-HF、DNA聚合酶、双链换能DNA片段(其中HosA作 用位点和HindIII限制性酶切位点重叠)、与换能DNA片段两侧互补的引物对作为换能元件，通过RT-qPCR检测。
4-羟基苯甲酸(4-HBA)也称为对羟基苯甲酸(PHBA)。天然状态下，PHBA与HosA 的结合使得HosA与HosA作用位点(HAD)的相互作用减弱。作为本实施例的传感器，如 图2a所示，在无PHBA时，HosA结合至HosA作用位点。由于换能DNA上HosA结合位 点与HindIII识别位点有2bp的重叠，HosA与HAD的结合保护了HindIII限制性酶切位点， 阻遏HindIII-HF对换能DNA片段的切割，因此DNA聚合酶能够以换能DNA为模板延伸 引物。当存在PHBA时，PHBA特异性地结合HosA，造成HosA与HAD分离，HindIII-HF 识别换能DNA上的HindIII限制性酶切位点并造成双链断裂，从而DNA聚合酶不能延伸引 物。基于此，扩增产物的量(例如通过RT-qPCR反应到达荧光阈值循环数Ct表征)能够反 应PHBA的浓度。
1.aTF表达和纯化
设计优化的HosA编码序列，并由苏州泓讯生物科技有限公司合成。用NdeI/XhoI消化 该HosA的编码序列，将其插入至pET-23b(Novagen)质粒的相应限制性酶切位点，将连接产物转化至大肠杆菌TOP10菌株(Novagen)，利用Amp阳性平板筛选带有连接产物(pET-23b-HosA质粒)的阳性克隆。提取质粒，测序验证了HosA序列。将质粒转化至表达菌株大 肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。对HosA进行表达和纯化[2]，以胎牛血清白蛋白作为 标准对纯化后蛋白的浓度进行定量，并用18％SDS-PAGE对经纯化的蛋白进行分析。
2.生物膜层干涉(BLI)分析
对DNAHosA-F0和DNAHosA-R0进行退火得到包含HAD的双链模板。使用Octet RED96 系统(FortéBIO)测定HosA与HAD结合的亲和性和特异性。用HBS-EP缓冲液进行基线 平衡和样品稀释。BLI的分析步骤根据[3]进行。空白对照为在结合步骤使用HBS-EP缓冲液 代替HosA。对获得的数据进行基线修正和归一化后，利用Octet Analysis System 21CFR Part 11(9.0版)按照1:1结合模型拟合，获得动力学参数结合速率常数kon、解离速率常数koff和 平衡解离常数KD(KD＝koff/kon)。BLI分析结果表明HosA能够与其结合位点相互作用，且 PHBA与HosA的结合造成HosA-DNA复合物的解离。
3.PHBA调控HosA和HindIII-HF对换能DNA的竞争
借助非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测HosA和HindIII-HF对换能DNA的竞争。将引物 TL+R-s和TL+R-as退火得到双链换能DNA片段TL+R，将引物TL-s和TL-as退火得到双链片段TL，将引物TR-s与TR-as退火得到双链片段TR。其中，TL+R中HAD与HindIII识别位点有 2bp的重叠，TL和TR分别对应于TL+R被HindIII消化后的两个片段。为了验证HosA、HindIII- HF与换能DNA片段的相互作用，在25℃、20μL体系中将不同浓度的HosA(0、0.17μM、 1.7μM、3.4μM、16.8μm、33.5μM HosA)与200nM TL+R以及1×CutSmart缓冲液(50mM乙 酸钾、20mM Tris-乙酸盐、10mM乙酸镁，100μg/ml BSA，pH7.9)混合孵育20min，使得蛋 白与DNA相互作用完全，随后将3U HindIII-HF加入至上述蛋白-DNA混合体系中，37℃孵 育15min。随后在85℃下加热20min终止反应，并缓慢冷却至室温。将混合物与5×上样缓 冲液(100mM Tris、25v/v％甘油、0.2mg/mL BSA，pH 7.9)混合，加样至非变性凝胶。该非 变性凝胶的配制方法为：在5mL 30％丙烯酰胺(丙烯酰胺和双丙烯酰胺的质量比为29:1)中 加入1mL 10×TBE(890mMTris、890mM硼酸和20mM EDTA，pH为8.0)、5μL TEMED、 50μL 10％过硫酸铵，并加入Milli-Q水使得总体积为10mL。以0.5×TBE缓冲液(44.5mM Tris、44.5mM硼酸和1mM EDTA，pH为8.0)作为电泳缓冲液，在室温下中进行电泳。电 泳后，用溶于0.5×TBE的SYBR Gold核酸凝胶染料(Invitrogen)染色30min，并在紫外透 射分析仪(Bio-Rad GelDoc XR)下拍照。结果如图2b所示，HosA浓度的升高使得DNA片 段被保护增强，被切割的产物(TR以及TL减少)，完整片段(TL+R)变多。
为了验证PHBA能够调控HosA与HindIII-HF对换能DNA的竞争，在25℃、20μL体 系下将不同浓度(0、0.01mM、0.1mM、0.5mM、1mM和5mM)的PHBA、200nM TL+R和 33.5μM HosA孵育20min，使得DNA与PHBA对HosA的竞争完全。随后在体系中加入3U HindIII-HF，37℃孵育15min。利用上述方法终止反应并采用15％非变性聚丙烯酰胺凝胶分 析。结果如图2c所示，随着PHBA浓度的升高，切割产物增加，完整片段变少。该结果表 明PHBA能够以浓度依赖性方式调控HosA与HindIII-HF对换能DNA的竞争。
4.传感器的优化
将等量的引物Template-s和Template-as退火，并稀释至20fM至20nM范围内的七个不 同数量级的浓度。对于20μL体系(包含10μL 2×FastFire qPCR PreMix、2μL退火模板、 0.2μM正向引物1和0.2μM反向引物1)，在Roche 
480II实时PCR系统上进行RT-qPCR。首先在95℃热处理1min，随后进行如下的40个循环：95℃变性5s、55℃退火10s 以及72℃延伸15s。在每次循环的延伸步骤后对实时荧光强度进行自动测量。测量不同模板浓度下的信噪比S/N。其中，将ΔCt/(ΔCtmin)计为S/N。该式中，ΔCt表示无模板对照(NTC)的实时荧光值与样品实时荧光值之差；ΔCtmin表示ΔCt最小值。
为了优化传感器中HosA的浓度，将含有200pM换能DNA(等量Template-s和Template- as退火得到)、不同浓度的HosA(0.05nM至20nM范围)以及1×CutSmart缓冲液的混合 物在25℃下孵育20min，使得HosA与模板结合，向其中加入0.05U HindIII-HF，在37℃消 化15min，随后在85℃加热10min失活。如上所述进行RT-qPCR，根据Ct判断，将能够完 全抑制HindIII-HF切割的最小HosA浓度作为优化的HosA浓度。由此得到的优化的HosA 浓度为1.0nM。类似地，将不同浓度的模板进行如上所述的孵育，随后进行消化和扩增，将 能够实现S/N>3的最小模板浓度作为优化的换能DNA浓度。由此得到的优化的换能DNA 浓度为200pM。
5.传感器的性能表征
使用如上所述的优化后的体系对传感器检测PHBA的性能进行研究。将等量的引物Template-s和Template-as退火得到换能DNA。将20μL的反应体系(包含200pM换能DNA、 1nMHosA、不同浓度的PHBA(从0-300nM)以及1×CutSmart缓冲液)在25℃孵育20min， 随后加入0.05U HindIII-HF，在37℃消化15min，反应后在85℃加热10min失活。如上所述 进行RT-qPCR。如图2d所示，随着PHBA浓度升高，RT-qPCR的Ct值明显变大。RT-qPCR 定量结果如图2d和图2e所示，在不同PHBA浓度下，PHBA生物传感器的荧光-PCR循环 数曲线为典型的S形曲线。对到达阈值的循环数与PHBA浓度的对数之间的关系进行最小 二乘法拟合，经计算，本实施例传感器的线性检测区间为5-300nM。以3σ/斜率作为检测极 限(LOD)(其中，σ是三个空白样品的标准差[4])，经计算，本实施例传感器对PHBA的检 测下限是1.06nM。
实施例2包含HosA和TdT的PHBA传感器
在本实施例中，以HosA作为识别元件，以末端转移酶(TdT)和双链换能DNA片段作为换能元件，对无模板扩增生成的G四链体进行检测。
将等量引物HosA-TdT-s和HosA-TdT-as退火得到双链换能DNA片段T-TdT。为了优化 HosA的浓度，将1×TdT缓冲液(0.2M二甲胂酸钾、0.025M Tris、0.01v/v％Triton X-100、 1mM CoCl2，pH 7.2)、1μM T-TdT、1mM dNTP(10％dTTP,40％dATP和50％dGTP)、20μMThT和不同浓度的HosA(0-12μM)在25℃孵育20min。随后向其中加入10U TdT，立刻在 Roche
480II实时PCR系统上进行RT-qPCR，每隔2s检测实时荧光。根据抑制 曲线确定最佳HosA浓度为12μM。
在荧光输出方式中，在25℃下对20μL 1×TdT缓冲液、1μM换能DNA片段T-TdT、 12μM HosA、1mM dNTP(10％dTTP、40％dATP和50％dGTP)、20μM ThT和不同浓度的 PHBA(0μM-100μM)的反应混合物孵育20min。随后加入10U TdT触发TdT扩增反应，立 刻在Roche
480II实时PCR系统上进行RT-qPCR，每隔2s检测实时荧光。结 果如图3b和3c所示。根据实施例1的方法计算，本实施方式下传感器能够检测的PHBA的 线性范围是2μM-100μM，LOD为1.37μM。
在比色输出方式中，在25℃下对20μL 1×TdT缓冲液、1μM退火模板T-TdT、12μMHosA、 1mM dNTP(10％dTTP、40％dATP和50％dGTP)和不同浓度的PHBA(0μM-100μM)的反 应混合物孵育20min。随后加入10U TdT触发TdT扩增反应。在TdT反应20min后将反应 液在95℃加热5min失活。在室温下将反应混合物与处于KT缓冲液(100mM MES、50mM Tris-HCl、40mM KCl、0.05％Triton X-100、1％DMSO，pH 6.2)中的100nM氯化血红素温 育2小时，使得DNA链形成G四链体结构脱氧核酶。为了触发ABTS2-的催化氧化，将 3.6mM ABTS2-和3.6mMH2O2溶液同时加到G四链体-氯化血红素脱氧核酶溶液中，并用TE 缓冲液(10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、0.1M NaCl，pH7.8)稀释至100μL的总体积。反应 5分钟后记录380nm-500nm的吸光度，结果如图3d和3e所示。根据实施例1的方法计算， 本实施方式下传感器对PHBA的检测范围为5μM至150μM，LOD是1.69μM。此外，如上 所述，可直接用肉眼对检测结果进行判断(图3d插图)，直接肉眼判断颜色变化所能检测的 下限为5μM PHBA。虽然本实施例的方法在灵敏度方面不具有优势，然而操作更简便，且传 感器的操作更容易，可有利地用于小分子的浓度较高的检测体系。
实施例3尿酸(UA)和土霉素(OTC)传感器
为了验证本发明传感器和方法的普适性，采用实施例2的理念，设计了分别响应于尿酸 和土霉素的传感器。响应于尿酸的传感器所使用的别构转录因子及其作用元件是HucR和 hucO，响应于土霉素的传感器所使用的别构转录因子及其作用元件是OtrR和OTC(表1)。 通过与实施例1相同的方式进行HucR和OtrR的表达和纯化，并通过BLI分析确认HucR 与其转录因子作用位点的相互作用。采用实施例2的方法，分别将HucR或OtrR与其作用 位点的相互作用转化为换能DNA扩增信号。
将等量的引物HucR-TdT-s与HucR-TdT-as退火得到HucR-TdT换能DNA。在25℃ 下对20μL 1×TdT缓冲液、1μM换能DNA片段HucR-TdT、15nM HucR、1mM dNTP(10％dTTP、 40％dATP和50％dGTP)、20μM ThT和不同浓度的UA的反应混合物孵育20min。随后加入 10U TdT触发TdT扩增反应，立刻在Roche 
480II实时PCR系统上进行RT- qPCR，每隔2s检测实时荧光。结果如图4a所示。根据实施例1的方法计算，本实施方式 HucR/TdT传感器能够检测的UA的范围是5μM-200μM，LOD为1.71μM。
将等量的引物OtrR-TdT-s与OtrR-TdT-as退火得到OtrR-TdT换能DNA。在25℃下对20μL 1×TdT缓冲液、1μM换能DNA片段OtrR-TdT、10nM OtrR、1mM dNTP(10％dTTP、 40％dATP和50％dGTP)、20μM ThT和不同浓度的OTC的反应混合物孵育20min。随后加 入10U TdT触发TdT扩增反应，立刻在Roche 
480II实时PCR系统上进行RT- qPCR，每隔2s检测实时荧光。结果如图4b所示。根据实施例1的方法计算，本实施方式 OtrR/TdT传感器能够检测的OTC的范围是2μM-200μM，LOD为1.0μM。
综上所述，采用类似实施例2的方法所构建的上述传感器能够检测2μM-200μM范围的 小分子。这些传感器由于成本低、易于操作以及可以不借助实验室仪器而直接检测，在实验 室以及日常应用中均具有广阔的应用前景。
实施例4包含HosA和连接酶的PHBA生物传感器
1.单链缺口对别构转录因子aTF与其结合位点相互作用的影响
鉴于与aTF特异性相互作用的别构转录因子结合位点通常具有保守的回文序列[5]，我们 猜测别构转录因子作用位点处单个位点的缺口(即，单个磷酸二酯键的断裂)可能并不干扰 aTF与其结合位点的结合。为验证这一点，针对实施例1的DNAHosA-F0和DNAHosA-R0片 段，合成如下的一组片段：两个片段在退火后能够与DNAHosA-F0形成在不同位置带有缺口 的互补双链。如图5c所示，两条DNAHosA-R1至两条DNAHosA-R9与DNAHosA-F0退火后所 形成的互补双链分别在位置1-9具有缺口。借助凝胶阻滞分析(EMSA)对HosA与带有或 不带缺口的互补双链的相互作用进行测试(154nM的HosA、0-40nM PHBA)。结果表明，当 缺口位于别构转录因子结合位点内部或附近(≤2bp)的情况下，该缺口不对二者的结合造成 显著影响。这一点也可以从别构转录因子与换能DNA三链体结合的Kon、Koff和KD没有显 著变化看出(图5c)。Kon、Koff和KD的计算方法为如实施例1所述。类似地，研究了缺口位 置对TetR或者AvaR1与其结合位点(表1)的相互作用造成的影响。BLI和动力学分析均 表明，在缺口位于别构转录因子作用位点内部或附近(≤2bp)的情况下，该缺口不对别构转 录因子与其作用位点的结合造成显著影响(就TetR体系而言，不同缺口位置所获得的KD在 0.67～2.00nM，无缺口体系的KD为1.08nM；对于AvaR1体系，不同缺口位置所获得的KD在 8.33～22.20nM，无缺口体系的KD为11.70nM)。这些结果表明当转录因子作用位点内或附近 具有缺口时不影响aTF与其作用位点的结合。
2.HosA和T4DNA连接酶对换能DNA的竞争
借助非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测HosA与T4DNA连接酶对换能DNA的竞争。将引物TL1、TR1与TH退火得到具有互补双链且在双链区具有缺口的换能DNA片段。当体系 中无HosA时，T4连接酶催化TR1 5'末端的游离磷酸与TL1 3'末端的羟基发生反应，将TL1与 TR1连接为与TL1+R1互补的单链(第2泳道)。在存在HosA的情况下，随着PHBA浓度升 高，更多的HosA从换能DNA上解离，T4连接酶将更多的TL1与TR1连接为与TL1+R1，因 此TL1与TR1减少，TL1+R1互补处条带增多(图5d)。可见，HosA与T4DNA连接酶竞争带 有缺口的换能DNA，并且PHBA与HosA的结合使得HosA与靶序列上的结合变弱，从而 T4DNA连接酶作用于换能DNA并将缺口修复。
3.RT-qPCR对产物的检测
对T4连接酶、HosA和换能DNA浓度进行优化。将等量的引物HosA-Probe-A、HosA-Probe-B和HosA-Probe-C混合物退火并稀释至20pM，根据制造商的说明，在20μL体系(包 含10μL 2×FastFire qPCR PreMix、2μL退火的模板、0.2μM正向引物2和0.2μM反向引物 2)下进行RT-qPCR。结果如图6b和图6c所示。定量结果如图7g所示。该传感器能够很好 地检测5nM-300nM范围的PHBA，并且根据3σ/斜率算法计算得到LOD为1.12nM。
4.RCA扩增以及对G四链体产物的检测
换能DNA为HosA-circle probe与HosA-PC退火形成双链体。其中，HosA-circleprobe 的两端分别带有部分的HosA结合位点，从而与带有HosA结合位点互补序列的HosA-PC退 火后HosA-circle probe折叠为环状，由HosA-circle probe两个末端形成的缺口位于双链区 (图6d)。HosA-circle probe还带有间隔排列的三个缺刻内切酶识别位点和两个G四链体互 补序列。
在比色方式中，将100nM HosA-circle probe与50nM HosA-PC混合物退火，随后加入 0.625mM dNTP、3nM HosA和不同浓度的PHBA。在25℃对混合物孵育20min，随后加入0.5U Phi29和0.5U Nb.BbvCI，进行RCA反应(37℃)，反应结束后利用与实施例2相同的 方式对G四链体-氯化血红素复合物催化H2O2氧化ABTS的能力进行检测。结果如图6f所 示。该方式下传感器能够检测的PHBA的检测范围是10nM-100nM，LOD为3.48nM。也可 肉眼判断颜色变化获得测量结果(图6e)，直接肉眼判断颜色变化所能检测的下限为10nM PHBA。
在荧光输出方式中，将100nM HosA-circle probe与50nM HosA-PC混合物退火，随后加 入0.625mM dNTP、5μM ThT、3nM HosA和不同浓度的PHBA。在25℃对混合物孵育20min，随后加入0.5U Phi29和0.5U Nb.BbvCI，进行RCA反应(37℃)，并监测实时荧光强度。如 图6g所示，随着PHBA浓度的增大荧光强度增加。根据实施例1的方法计算，本实施方式 下传感器能够检测的PHBA的检测范围是5nM-200nM，LOD为1.73nM(图6g)。
5.RPA扩增以及对LF检测
经优化，最佳的HosA浓度为5pM，模板量为5fM(所获得的S/N为3.7)。将等量的HucR-N-A、HucR-N-B和HucR-N-AB退火得到双链换能DNA并稀释至5fM，随后加入5pM HosA和不同浓度的PHBA。在37℃对混合物孵育20min，随后根据制造商的说明，加入RPA 引物420nM和探针120nM以及试剂盒中的试剂TwistAmp LF Probe(10μM)0.6μL、 Rehydration Buffer29.5μL，然后补ddH2O至50μL，进行RPA反应，反应总体系参照试剂盒 所备说明书为50μL。反应结束后，取RPA反应产物2μL稀释于98μL的Tris缓冲盐溶液 中，随后将试纸条直接插入稀释液中保留5分钟后拍照，并可利用ImageJ对条带的灰度 进行定量检测。如图6i和图6j所示，本实施例对PHBA的检测极限可低至1pM，能够实现 的线性检测范围为1pM-10nM。
将本发明的测量与传统的HPLC方法的测量结果进行比较。本发明的传感器具有优异 的准确性(95.51％-105.98％)、精度(2.86％-4.96％)和回收率(95.7％-108.3％)(图7g)。 其中，准确性为本发明方法测试结果与HPLC结果进行比较得出。精度为三次平行重复之 间的误差。
实施例5包含aTF和连接酶的四环素和尿酸生物传感器
为了验证传感器和方法的普适性，采用实施例4的理念，设计了分别响应于尿酸和四环 素(TC)的传感器。响应于尿酸的传感器所使用的别构转录因子及其作用元件是HucR和 hucO，响应于四环素的传感器所使用的别构转录因子及其作用元件是TetR和tetO。通过与 实施例1相同的方式进行HucR(GeneBank Accession number MH001520)和TetR的表达和纯化，并采用实施例4中各元件的浓度。分别借助RT-qPCR(图7a和图7d)、RCA(图 7c和图7f)以及RPA结合LF(图7b和图7e)进行扩增和测量，结果的定量比较如图7g所 示，UA传感器和TC传感器与PHBA传感器的LOD和检测范围处于相同的量级。
表2实施例使用的引物
其中，-p表示在3'末端修饰有磷酸，p-表示5'末端修饰有磷酸；ddC表示3'末端是一个 双脱氧的碱基C
表3实施例中使用的别构转录因子编码序列、HindIII-HF识别序列、Nb.BbvCI识别序 列以及G四链体互补序列
各转录因子的结合位点请参见表1。
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<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 15
cagaggcgta ttttaataat aactacttag atgtctacct aaattaagag aataaacatg 60
ag 62
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 16
ctcattgttt attctcttaa tttaggtaga catctaagta gttattatta aaatacgcct 60
ctg 63
<210> 17
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 17
cagaggcgta ttttaataat aacttgacaa ggtcttgtcg ttaattaaga gaataaacat 60
gag 63
<210> 18
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 18
ctcattgttt attctcttaa ttttgacaag gtcttgtcgt tgttattatt aaaatacgcc 60
tctg 64
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 19
atacttagat gtctacctaa 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 20
ttaggtagac atctaagtat 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 21
gttgacaagg tcttgtcgtt g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 22
gttgacaagg tcttgtcgtt g 21
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 23
ctcattgttt attctcttaa ttgttcgtat acgaacg 37
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 24
ttattattaa aatacgcctc tg 22
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 25
ctcattgttt attctcttaa ttgttcgtat acga 34
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 26
acgttattat taaaatacgc ctctg 25
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 27
ctcattgttt attctcttaa ttgttcgtat ac 32
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 28
gaacgttatt attaaaatac gcctctg 27
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 29
ctcattgttt attctcttaa ttgttcgtat 30
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 30
acgaacgtta ttattaaaat acgcctctg 29
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 31
ctcattgttt attctcttaa ttgttcgta 29
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 32
tacgaacgtt attattaaaa tacgcctctg 30
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 33
ctcattgttt attctcttaa ttgttcgt 28
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 34
atacgaacgt tattattaaa atacgcctct g 31
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 35
ctcattgttt attctcttaa ttgttc 26
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 36
gtatacgaac gttattatta aaatacgcct ctg 33
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 37
ctcattgttt attctcttaa ttgt 24
<210> 38
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 38
tcgtatacga acgttattat taaaatacgc ctctg 35
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 39
ctcattgttt attctcttaa 20
<210> 40
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 40
ttgttcgtat acgaacgtta ttattaaaat acgcctctg 39
<210> 41
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 41
cctccgattt tcagattgac actctatcat tgatagggat atattccaac tctatcaat 59
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 42
attgatagag ttggaatata tccctatcaa tgatagagtg tcaatctgaa aatcggagg 59
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 43
attgatagag ttggaatata tccctatcaa tgatagagtg 40
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 44
tcaatctgaa aatcggagg 19
<210> 45
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 45
attgatagag ttggaatata tccctatcaa tgatagag 38
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 46
tgtcaatctg aaaatcggag g 21
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 47
attgatagag ttggaatata tccctatcaa tgatag 36
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 48
agtgtcaatc tgaaaatcgg agg 23
<210> 49
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 49
attgatagag ttggaatata tccctatcaa tgat 34
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 50
agagtgtcaa tctgaaaatc ggagg 25
<210> 51
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 51
attgatagag ttggaatata tccctatcaa tg 32
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 52
atagagtgtc aatctgaaaa tcggagg 27
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 53
attgatagag ttggaatata tccctatcaa 30
<210> 54
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 54
tgatagagtg tcaatctgaa aatcggagg 29
<210> 55
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 55
attgatagag ttggaatata tccctatca 29
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 56
atgatagagt gtcaatctga aaatcggagg 30
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 57
attgatagag ttggaatata tccctat 27
<210> 58
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 58
caatgataga gtgtcaatct gaaaatcgga gg 32
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 59
attgatagag ttggaatata tccct 25
<210> 60
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 60
atcaatgata gagtgtcaat ctgaaaatcg gagg 34
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 61
attgatagag ttggaatata tcc 23
<210> 62
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 62
ctatcaatga tagagtgtca atctgaaaat cggagg 36
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 63
attgatagag ttggaatata t 21
<210> 64
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 64
ccctatcaat gatagagtgt caatctgaaa atcggagg 38
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 65
attgatagag ttggaatat 19
<210> 66
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 66
atccctatca atgatagagt gtcaatctga aaatcggagg 40
<210> 67
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 67
cgcaagaggg acttgaagac aaaaccgtct agtacgtatc tttgacctcc agctcttcc 59
<210> 68
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 68
ggaagagctg gaggtcaaag atacgtacta gacggttttg tcttcaagtc cctcttgcg 59
<210> 69
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 69
ggaagagctg gaggtcaaag atacgtacta gacggttttg 40
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 70
tcttcaagtc cctcttgcg 19
<210> 71
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 71
ggaagagctg gaggtcaaag atacgtacta gacggttt 38
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 72
tgtcttcaag tccctcttgc g 21
<210> 73
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 73
ggaagagctg gaggtcaaag atacgtacta gacggt 36
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 74
tttgtcttca agtccctctt gcg 23
<210> 75
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 75
ggaagagctg gaggtcaaag atacgtacta gacg 34
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 76
gttttgtctt caagtccctc ttgcg 25
<210> 77
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 77
ggaagagctg gaggtcaaag atacgtacta ga 32
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 78
cggttttgtc ttcaagtccc tcttgcg 27
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 79
ggaagagctg gaggtcaaag atacgtacta 30
<210> 80
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 80
gacggttttg tcttcaagtc cctcttgcg 29
<210> 81
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 81
ggaagagctg gaggtcaaag atacgtac 28
<210> 82
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 82
tagacggttt tgtcttcaag tccctcttgc g 31
<210> 83
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 83
ggaagagctg gaggtcaaag atacgt 26
<210> 84
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 84
actagacggt tttgtcttca agtccctctt gcg 33
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 85
ggaagagctg gaggtcaaag atac 24
<210> 86
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 86
gtactagacg gttttgtctt caagtccctc ttgcg 35
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 87
ggaagagctg gaggtcaaag at 22
<210> 88
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 88
acgtactaga cggttttgtc ttcaagtccc tcttgcg 37
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 89
ggaagagctg gaggtcaaag 20
<210> 90
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 90
atacgtacta gacggttttg tcttcaagtc cctcttgcg 39
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 91
ggaagagctg gaggtcaa 18
<210> 92
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 92
agatacgtac tagacggttt tgtcttcaag tccctcttgc g 41
<210> 93
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 93
ataacgttcg tatacgaacc gcattcagga tgcgtaagtc cta 43
<210> 94
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 94
taggacttac gcatcctgaa tgcggttcgt atacgaacgt tat 43
<210> 95
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 95
caattaagct taattgttcg tatacgaacg ttatta 36
<210> 96
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 96
gactacacca agggctacaa ggtgtatctt catacgaacg tttaataacg ttcgtatacg 60
<210> 97
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 97
aacaattaag cttaattgtt cgtactcaca tggtcgaggt catcaa 46
<210> 98
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 98
gactacacca agggctacaa ggtgtatctt catacgaacg ttattattgc aagcatatgc 60
ttgttaattc cttaattgtt cgtactcaca tggtcgaggt catcaa 106
<210> 99
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 99
gactacacca agggctacaa ggtgtatctt catacgaacg tttaataacg ttcgtatacg 60
<210> 100
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 100
aacaattaag cttaattgtt cgtactcaca tggtcgaggt catcaa 46
<210> 101
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 101
taataacgtt cgtatacgaa caattaagct taattg 36
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 102
ttgatgacct cgaccatgtg cg 22
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 103
cttgtagccc ttggtgtagt ca 22
<210> 104
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 104
aacaaaaacc tcagcccaac ccgccctacc caccctcagc ccaacccgcc ctacccaccc 60
tcagccgttc gtatacg 77
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 105
tgaggttttt gttcgtatac gaacg 25
<210> 106
<211> 112
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 106
gcatatgctt gcaataattt gcaagcatac ttctatgtgg aacatcggga accacatcag 60
tatcatcgcc gtctatcaaa cgggcctcaa atgtaccgca atgctttatt tc 112
<210> 107
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 107
cggggacagt agggctgcta gtcagagtaa caaataagag aattaactac tggagctggt 60
acactcatgc ttgttaattc gaattaacaa 90
<210> 108
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 108
cttgcaaatt attgcaagca tatgcttgtt aattcgaatt aacaagcatg 50
<210> 109
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 109
gactacacca agggctacaa ggtgtatctt catacgaacg tttaataata cttagatgtc 60
ta 62
<210> 110
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 110
cctaaattaa gcttaattgt tcgtactcac atggtcgagg tcatcaa 47
<210> 111
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 111
caattaagct taatttaggt agacatctaa gtattatta 39
<210> 112
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 112
gtaaaaaacc tcagcccaac ccgccctacc caccctcagc ccaacccgcc ctacccaccc 60
tcagcctagg tagacatcta a 81
<210> 113
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 113
tgaggttttt tacttagatg tctaccta 28
<210> 114
<211> 116
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 114
aatctacaga tggatcaata atttgcaagc atacttctat gtggaacatc gggaaccaca 60
tcagtatcat cgccgtctat caaacgggcc tcaaatgtac cgcaatgctt tatttc 116
<210> 115
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 115
cggggacagt agggctgcta gtcagagtaa caaataagag aattaactac tggagctggt 60
acactcatgc ttgttaattc gaattaaatg 90
<210> 116
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 116
cttgcaaatt attgatccat ctgtagattc atttaattcg aattaacaag catg 54
<210> 117
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 117
gactacacca agggctacaa ggtgtatctt catacgaacg tttaataaac tctatcattg 60
ata 63
<210> 118
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 118
gagtaattaa gcttaattgt tcgtactcac atggtcgagg tcatcaa 47
<210> 119
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 119
caattaagct taattactct atcaatgata gagtttatta 40
<210> 120
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 120
aggaaaaacc tcagcccaac ccgccctacc caccctcagc ccaacccgcc ctacccaccc 60
tcagcctcta tcattgat 78
<210> 121
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 121
tgaggttttt cctatcaatg ataga 25
<210> 122
<211> 113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 122
atcattgata ggcaataatt tgcaagcata cttctatgtg gaacatcggg aaccacatca 60
gtatcatcgc cgtctatcaa acgggcctca aatgtaccgc aatgctttat ttc 113
<210> 123
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 123
cggggacagt agggctgcta gtcagagtaa caaataagag aattaactac tggagctggt 60
acactcatgc ttgttaattc gaattaatct 90
<210> 124
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 124
cttgcaaatt attgcctatc aatgatagat taattcgaat taacaagcat g 51
<210> 125
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 125
gaaataaagc attgcggtac atttgaggcc cgttt 35
<210> 126
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 126
cggggacagt agggctgcta gtcagagtaa caaat 35
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n为dSpacer
<400> 127
gatagacggc gatgatactg atgtggttcc cgatgnttcc acatagaagt atgc 54
<210> 128
<211> 447
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 128
atgatcgcag cagatagcct gccgggtgtt tatatggcac tgcgtaataa agcatttcat 60
cagctgcgtc agctgtttca gcagcatacc gcacgttggc agcatgaact gccggatctg 120
accaaaccgc agtatgcagt tatgcgtgca attgcagata aaccgggtat tgaacaggtt 180
gcactgattg aagcagcagt tagcaccaaa gcaaccctgg cagaaatgct ggcacgtatg 240
gaaaatcgtg gtctggttcg tcgtgaacat gatgcagcag ataaacgtcg tcgttttgtt 300
tggctgaccg cagaaggtga aaaagttctg gcagcagcaa ttccgattgg tgatagcgtt 360
gatgcagaat ttctgggtcg tctgagcggt gaagaacagg aactgtttat gcagctggtt 420
cgtaaaatga tgagcaaact cgagtga 447
<210> 129
<211> 498
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 129
atggccatgg attcctcagc ccctgacctg gccgctctga tcgaggtgac cgccgaggtc 60
ttcgcggtca acggccgcct gctccgcgaa ggcgacagcc tcaccgccca cgcggggctg 120
acctcggcgc gctggcaggt ggccggactg ctgctgagcg gcccctcgac ggtcgcccgc 180
ctggcccgcg agcgggggct gcggcggcag gcggtccagc agaccgtcga gcggctgaag 240
gccgagggcg tcgtcacgac ccggcccaac ccgcaggacc agcgcagccc cctggtcgag 300
ctcaccgcac gcggccggca ggcgctggac gacctgcgtc ccctggaacg gcggtggctg 360
gagtatctgg ccgaggacat tccggtcgag gacatgcgcg tggcgatcgc ggtgctgagc 420
cgcctgcggg agaagctgga cgcccgtccg gcgacggagt tcgggaccgg ggccgggtcc 480
gggcggcagt ccgcctga 498
<210> 130
<211> 701
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 130
ctccaacgtc cgtgccgcgt ccgtcgtact cgctgccgcc gactcccgct gcttcatggc 60
ggcttcgtac acccgcgagc cccgctccgg ggagaagtcc aggcggacca ggatccccgg 120
catggcgaag gacggcatca gatggcggta gaggtcggcc acccgctccg ccaggtccgc 180
gcgcccggtc atgatcctcg agaggacctg cacgccggtg aacgcgccca cgaacagctt 240
ggcgagcgct tccacatcgg cgtggggcag gatctcgccc ttggccctgg cctcttcgaa 300
gagggactgc gtgtgctcgg tccaggcctg catcgggacc cgccggttga gatggtccct 360
gggcgagccc tggtccacgg tcagccgcac actgccctgg acgatcggat cgccggtgcc 420
ttccctgagc agatgggcga gcagcagcgc ctcgtccagc gactgctgga gcttcagctc 480
ctgctcgggg acgcgcggaa gggaggcgac ctgctcggcc agcacggcct gggccagctc 540
ctgcttcgac gtgaagtgga agtagagggc ccccttggtg acccccgagc gcttcagcac 600
gtcggagatg gttgccgcct cgtatcccac ctcgtcgaac acctcggccg cggcgaccag 660
aatcgtctgc cgcgtccgaa tggctcgctc ctgccgcgcc a 701
<210> 131
<211> 630
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 131
atgagccgtc tgaatcgcga aagcgttatt gacgcagcac tggaactgct gaacgaaacc 60
ggtattgacg gtctgaccac ccgtaaactg gcacagaaac tgggcattga acaaccgacc 120
ctgtactggc acgtcaaaaa caaacgcgct ctgctggatg cactggctgt tgaaattctg 180
gcacgtcatc acgattatag tctgccggca gcaggcgaat cttggcaaag ctttctgcgt 240
aacaacgcaa tgagttttcg tcgcgcactg ctgcgttatc gcgacggcgc aaaagttcat 300
ctgggtaccc gtccggacga aaaacagtac gacaccgttg aaacccaact gcgtttcatg 360
accgaaaacg gttttagtct gcgcgacggt ctgtacgcga ttagcgcggt tagccatttt 420
accctgggcg cagttctgga acagcaagaa cataccgcag cactgaccga tcgtccggca 480
gcaccggacg aaaatctgcc gccgctgctg cgcgaggctc tgcaaattat ggatagcgac 540
gacggcgaac aagcatttct gcacggtctg gaaagcctga ttcgcggctt tgaagttcag 600
ctgaccgcac tgctgcaaat tgtgctcgag 630
<210> 132
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 132
aagctt 6
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 133
aacccaaccc gccctaccca a 21
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 134
ccaacccgcc ctacccac 18
Claims (67)
1.一种用于检测小分子的生物传感器，所述生物传感器包含识别元件和换能元件，其中，
所述识别元件为别构转录因子；
所述换能元件包含换能DNA片段和至少一种换能蛋白，所述换能DNA片段包含别构转录因子作用位点和换能位点；其中，所述别构转录因子与所述别构转录因子作用位点的结合阻碍至少一种所述换能蛋白与换能位点的结合，所述别构转录因子与所述小分子的结合改变所述别构转录因子与所述换能DNA片段的相互作用；其中，所述换能DNA片段在所述转录因子作用位点处为双链，至少一种所述换能蛋白为DNA聚合酶，所述DNA聚合酶催化所述换能DNA片段的扩增反应。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其中，所述小分子具有50-5000道尔顿的分子量。
3.如权利要求1所述的生物传感器，其中，所述小分子为重金属离子、毒素、药物、代谢物、污染物或上述物质的分解产物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的生物传感器，其中，小分子的存在触发所述扩增反应。
5.如权利要求1-3中任一项所述的生物传感器，其中，所述转录因子作用位点的长度为10-40bp。
6.如权利要求1-3中任一项所述的生物传感器，其中，所述扩增为等温扩增，所述等温扩增选自于如下的任一种：重组酶聚合酶扩增、环介导等温扩增、自持序列复制、滚环扩增、交叉引物恒温扩增、Q-β扩增系统以及OneCutEventAmplificatioN。
7.如权利要求1-3中任一项所述的生物传感器，其中，所述换能蛋白为TdT，所述换能位点为别构转录因子作用位点的3'末端。
8.如权利要求7所述的生物传感器，其中，在所述换能DNA片段中，所述别构转录因子作用位点的各链的3'端侧翼具有的碱基数不多于2bp。
9.如权利要求7所述的传感器，其中，所述换能元件进一步包含随机引物。
10.如权利要求7所述的生物传感器，其中，所述换能DNA片段的扩增产物为G四链体。
11.如权利要求10所述的生物传感器，其中，所述换能元件进一步包含dNTP混合物，在所述dNTP混合物中dGTP的含量不少于50％。
12.如权利要求11所述的生物传感器，其中，通过荧光分析或比色分析对所述换能DNA片段的扩增产物进行分析。
13.如权利要求1所述的生物传感器，其中，所述换能元件包含第一换能蛋白和第二换能蛋白，其中，所述第一换能蛋白与所述换能位点相互作用，所述第二换能蛋白为DNA聚合酶。
14.如权利要求13所述的生物传感器，其中，所述第一换能蛋白为造成双链断裂的限制性内切酶，所述换能位点是限制性酶切位点，所述换能元件进一步包含能够与换能DNA片段退火的引物对，所述换能DNA片段进一步包含一对引物结合位点，所述引物结合位点分别位于别构转录因子作用位点两侧。
15.如权利要求14所述的生物传感器，其中，所述别构转录因子作用位点与所述限制性酶切位点重叠或相邻。
16.如权利要求13-15中任一项所述的生物传感器，其中，所述换能DNA片段的长度不超过300bp。
17.如权利要求16所述的生物传感器，其中，所述扩增反应通过RT-qPCR进行。
18.如权利要求13所述的生物传感器，其中，所述第一换能蛋白为DNA连接酶，所述换能位点为存在于所述换能DNA片段双链区的缺口。
19.如权利要求18所述的生物传感器，其中，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
20.如权利要求18或19所述的生物传感器，其中，所述缺口位于别构转录因子内或者与所述别构转录因子作用位点间的距离不多于4bp。
21.如权利要求18或19所述的生物传感器，其中，所述扩增反应为选自于如下的任一种：定量PCR、滚环扩增或重组酶聚合酶扩增。
22.如权利要求21所述的生物传感器，其中，所述扩增反应为定量PCR，其中，所述换能元件进一步包含能够与换能DNA片段退火的引物对，换能DNA片段上进一步包含一对引物结合位点，其分别位于别构转录因子作用位点两侧。
23.如权利要求22所述的生物传感器，其中，所述换能DNA片段的长度不超过300bp。
24.如权利要求21所述的生物传感器，其中，所述扩增反应为滚环扩增，其中，所述第二换能蛋白为phi29 DNA聚合酶，所述换能DNA片段的两条链互补时其中一条链环化。
25.如权利要求24所述的生物传感器，其中，所述换能元件进一步包含缺刻内切酶，所述换能DNA片段的环化链的单链区从5'至3'顺序设置有间隔排列的缺刻内切酶识别位点和G四链体互补序列。
26.如权利要求25所述的生物传感器，其中，所述换能DNA片段的环化链的单链区从5'至3'顺序设置有间隔排列的3个缺刻内切酶识别位点和2个G四链体互补序列。
27.如权利要求25或26所述的生物传感器，其中，通过荧光分析或比色分析对所述换能DNA片段的扩增产物进行分析。
28.如权利要求21所述的生物传感器，其中，所述扩增反应为重组酶聚合酶扩增，其中，所述第二换能蛋白为链置换DNA聚合酶，所述换能DNA片段上进一步包含探针结合位点以及一对引物结合位点，该引物结合位点分别位于别构转录因子作用位点两侧。
29.如权利要求28所述的生物传感器，其中，通过荧光检测方法或测流层析对所述换能DNA片段的扩增产物进行分析。
30.一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含识别元件、换能元件和检测元件，其中，
所述识别元件为别构转录因子；
所述换能元件包含换能DNA片段和至少一种换能蛋白，所述换能DNA片段包含别构转录因子作用位点和换能位点；其中，所述别构转录因子与所述别构转录因子作用位点的结合阻碍至少一种所述换能蛋白与换能位点的结合，所述别构转录因子与所述小分子的结合改变所述别构转录因子与所述换能DNA片段的相互作用；其中，所述换能DNA片段在所述转录因子作用位点处为双链，至少一种所述换能蛋白为DNA聚合酶，所述DNA聚合酶催化所述换能DNA片段的扩增反应；
所述检测元件用于对所述扩增反应的产物进行检测。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述小分子具有50-5000道尔顿的分子量。
32.如权利要求30或31所述的试剂盒，其中，所述小分子为重金属离子、毒素、药物、代谢物、污染物或上述物质的分解产物。
33.如权利要求30或31所述的试剂盒，其中，小分子的存在触发所述扩增反应。
34.如权利要求30或31所述的试剂盒，其中，所述转录因子作用位点的长度为10-40bp。
35.如权利要求30或31所述的试剂盒，其中，所述扩增反应为等温扩增，所述等温扩增选自于如下的任一种：重组酶聚合酶扩增、环介导等温扩增、自持序列复制、滚环扩增、交叉引物恒温扩增、Q-β扩增系统以及OneCutEventAmplificatioN。
36.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述换能蛋白为TdT，所述换能位点为别构转录因子作用位点的3'末端。
37.如权利要求36所述的试剂盒，其中，在所述换能DNA片段中，所述别构转录因子作用位点的各链的3'端侧翼具有的碱基数不多于2bp。
38.如权利要求36或37所述的试剂盒，其中，所述换能元件进一步包含随机引物。
39.如权利要求36或37所述的试剂盒，其中，所述换能元件进一步包含dNTP混合物，所述dNTP混合物中dGTP的含量不少于50％。
40.如权利要求39所述的试剂盒，其中，所述检测元件用于通过荧光分析或比色分析对所述换能DNA片段的扩增产物进行分析。
41.如权利要求30或31所述的试剂盒，其中，所述换能元件包含第一换能蛋白和第二换能蛋白，其中，所述第一换能蛋白与所述换能位点相互作用，所述第二换能蛋白为DNA聚合酶。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其中，所述第一换能蛋白为造成双链断裂的限制性内切酶，所述换能位点是限制性酶切位点，所述换能元件进一步包含能够与换能DNA片段退火的引物对，所述换能DNA片段进一步包含一对引物结合位点，所述引物结合位点分别位于别构转录因子作用位点两侧。
43.如权利要求42所述的试剂盒，其中，所述别构转录因子作用位点与所述限制性酶切位点重叠或相邻。
44.如权利要求42或43所述的试剂盒，其中，所述换能DNA片段的长度不超过300bp。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述检测元件用于对通过RT-qPCR扩增的产物进行检测。
46.如权利要求41所述的试剂盒，其中，所述第一换能蛋白为DNA连接酶，所述换能位点为存在于所述换能DNA片段双链区的缺口。
47.如权利要求46所述的试剂盒，其中，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
48.如权利要求47所述的试剂盒，其中，所述缺口位于别构转录因子内或者与所述别构转录因子作用位点间的距离不多于4bp。
49.如权利要求48所述的试剂盒，其中，所述扩增反应为选自于如下的任一种：定量PCR、滚环扩增或重组酶聚合酶扩增。
50.如权利要求49所述的试剂盒，其中，所述扩增反应为定量PCR，其中，所述换能元件进一步包含能够与换能DNA片段退火的引物对，换能DNA片段上进一步包含一对引物结合位点，其分别位于别构转录因子作用位点两侧，所述检测元件用于对定量PCR扩增的产物进行检测。
51.如权利要求50所述的试剂盒，其中，所述换能DNA片段的长度不超过300bp。
52.如权利要求49所述的试剂盒，其中，所述扩增反应为滚环扩增，其中，所述第二换能蛋白为phi29 DNA聚合酶，所述换能DNA片段的两条链互补时其中一条链环化。
53.如权利要求52所述的试剂盒，其中，所述换能元件进一步包含缺刻内切酶，所述换能DNA片段的环化链的单链区从5'至3'顺序设置有间隔排列的缺刻内切酶识别位点和G四链体互补序列。
54.如权利要求53所述的试剂盒，其中，所述换能DNA片段的环化链的单链区从5'至3'顺序设置有间隔排列的3个缺刻内切酶识别位点和2个G四链体互补序列。
55.如权利要求53或54所述的试剂盒，其中，所述检测元件用于通过荧光分析或比色分析对所述换能DNA片段的扩增产物进行分析。
56.如权利要求49所述的试剂盒，其中，所述扩增反应为重组酶聚合酶扩增，其中，所述第二换能蛋白为链置换DNA聚合酶，所述换能DNA片段上进一步包含探针结合位点以及一对引物结合位点，该引物结合位点分别位于别构转录因子作用位点两侧。
57.如权利要求56所述的试剂盒，其中，所述检测元件为用于通过荧光检测方法或测流层析对所述换能DNA片段的扩增产物进行分析。
58.别构转录因子在制备权利要求1-29中任一项所述的生物传感器或如权利要求30-57中任一项所述的试剂盒中的用途。
59.如权利要求58所述的用途，其中，所述生物传感器或所述试剂盒用于环境污染监控、食品质量控制和疾病诊断。
60.一种非诊断目的的对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包括将所述样品与权利要求1-29中任一项所述的生物传感器或如权利要求30-57中任一项所述的试剂盒接触，并检测DNA扩增反应的产物。
61.一种非诊断目的的利用如权利要求9所述的生物传感器或如权利要求38所述的试剂盒对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子、换能DNA片段与dNTP混合物进行混合并孵育；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT和随机引物；
(3)对步骤(2)的反应的扩增产物进行检测。
62.一种非诊断目的的利用如权利要求10-12中任一项所述的生物传感器或如权利要求39或40所述的试剂盒对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将所述样品、别构转录因子、换能DNA片段与dNTP混合物进行混合并孵育；其中，所述dNTP混合物包含不少于50％的dGTP；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT；
(3)对步骤(2)的反应生成的G四链体进行检测。
63.如权利要求62所述的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将所述样品、别构转录因子、换能DNA片段、dNTP混合物与硫黄素T进行混合并孵育；其中，所述dNTP混合物包含不少于50％的dGTP；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT；
(3)通过荧光分析对步骤(2)的反应生成的G四链体进行检测。
64.如权利要求62所述的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将所述样品、别构转录因子、换能DNA片段与dNTP混合物进行混合并孵育；其中，所述dNTP混合物包含不少于50％的dGTP；
(2)向步骤(1)的混合液中加入TdT；
(3)将步骤(2)获得的溶液与氯化血红素孵育，随后向其中加入ABTS2-和H2O2，通过对吸光度进行分析对步骤(2)的反应生成的G四链体进行检测。
65.一种非诊断目的的利用如权利要求13-29中任一项所述的生物传感器或如权利要求41-57中任一项所述的试剂盒对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)将所述样品、别构转录因子与换能DNA片段混合并孵育；
(2)在步骤(1)的混合物中加入所述第一换能蛋白；
(3)向步骤(2)获得的溶液中加入dNTP和DNA聚合酶，进行扩增，并对扩增产物进行检测。
66.如权利要求65所述的方法，其中，所述第一换能蛋白是造成双链断裂的II型限制性内切酶，所述方法包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子与换能DNA片段混合并孵育；
(2)在步骤(1)的混合物中加入造成双链断裂的II型限制性内切酶；反应结束后对内切酶高温失活；
(3)向步骤(2)获得的溶液中加入dNTP和DNA聚合酶，进行扩增，并对扩增产物进行检测。
67.如权利要求65所述的方法，其中，所述第一换能蛋白是DNA连接酶，所述方法包含如下步骤：
(1)将待测样品、别构转录因子与换能DNA片段混合并孵育；
(2)在步骤(1)的混合物中加入DNA连接酶；
(3)向步骤(2)获得的溶液中加入dNTP和DNA聚合酶，进行扩增，并对扩增产物进行检测。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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