JPS5921398A - 検体の前処理方法 - Google Patents

検体の前処理方法

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JPS5921398A
JPS5921398A JP12888282A JP12888282A JPS5921398A JP S5921398 A JPS5921398 A JP S5921398A JP 12888282 A JP12888282 A JP 12888282A JP 12888282 A JP12888282 A JP 12888282A JP S5921398 A JPS5921398 A JP S5921398A
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ammonia
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nicotinamide
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Yoshiki Yamagata
山縣 孝樹
Takeshi Fujita
剛 藤田
Yasuo Suzuki
康生 鈴木
Isamu Kokawara
高河原 勇
Katsumi Fujii
克美 藤井
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は嵌体の前処理方法にIuJするものである。史
VC詳細に11、不発IJj Fま尿、+(+1#i[
等の検体中番こ存在する目的物質をアンモニア生成系で
定]1;:ず乙にあたり、予め検体中+′Cイ’フイ1
ミするアンモニアを消去ゼし、l)る方法IC関−J″
るものでるる。
従来、生体に由来する尿、血液等の検体Vこ存在する反
応生成物としてアンモニアを生ずる物質、例えばフレア
デニン、尿素ζ9の’IJI ICEtJ、フレアデニ
ンあるいt」、尿素と特)°4的PC反応する試薬、例
えばアルカリビロリン酸(フレアデニンの場合=Taf
fe  法)べ・ジアセナル士ノオキシム(尿素の場合
二F6aron反応)を添加し2、化学反応により生じ
た物質の吸収極大をもって測定する方法があった。しか
しながら、この化学的呈色法1j検体中VC目的物質と
同様の呈色を示す物ア〔が多数存在−ノーるという欠点
かめって好ましくない。
他の方法として、検体中のクレフーテニンあるいtま尿
素をアンモニアに変換せしめるr■i素肴・用い゛(、
りLl)′チニンあるいtt尿累を77/モニfV′C
変j1へぜしめ、化1戊し、/こ−rン七ニアを定−j
l;することによりクレアチニンあるいは尿素のノル1
金知る方γノ日が;jlつ/r、、、シかしこのツノ法
Fま+Mi tド々力法な、・バら検体中(・こすでe
こ多(、・シのfン七二′ア/l噌昆在′J−るため、
11−、イ1(Iiに足litできないという欠点があ
1)た。
イ(発明:1イーがtl、上fiSアン・ヒニ′fのυ
I、在する検体でし2かもfン七二f台・反応生成物と
1−7で生じる物り′)の定1ル全研死の結!1!、、
本発明ンζ刊・)L、/こ 。
即し、本発明t、l検体中の[1的物1(合一定tit
する((=あ/Cり、イ・BH本にグルタミン酸ノ悦水
素酵禦(以トG (? I) 1(とい′)l、2−二
jへソグルタール酸0:J、下α−1ぐGという)、還
元型ニコゾーンノ′ミドアフ′ニニ/ノヌクレAナトホ
スフェ−1・(I″丈1ニー14A 1.) I) I
Iというン−f−゛t、でニコプーンアミドノ′アニ7
′ジヌクレオチドホスフェート(以F NAI)■〕 
 という)をで1元する酵禦及び基質を添加14114
合し、検体中1こすで1(を(EするNADIプ   
 含 、  N A  [、)  ]’    イr−
’  j’iL  ノt、 、+!−1,め 、、’ 
 t:jl (]1ノ1jい−Cf’)吸IJ A D
 l) II I□こ:′!リド□し1(7ん)イ、(
−)を(p、)化(と −J 8 ξ、 と 。  1
)’  )ff  it  ウ ”  −”   −”
  S、’  l小i  711111j  汀するこ
とk lI’a徴とJイ)441本Q:) 1)lJ 
・QニーL理ノJ?ノ、イi、、 、El、1供ず/)
本発明の116色と−Jると(−ろは、イ鵠イ□l−’
l’ lc゛JT’、 tC(I: rLす、’4〉−
)” 士” ’)−’:+゛、G11)11. (t−
KG。
NAI)PJI)CL:つてグルタミ7 E’tk、と
水((−λ化(スし2め、−f: v> 1yd12 
]戊いれ;cNADl’  +1XNADP”を還元−
(!(−2めるf;目Kを用い−(,1リハjIq A
 1.) 1.) 4iV(二il )% 4Bシめ乙
1点1/(あり、史K t、J、ウレフ−−−ヒVこよ
って尿素をアンモニー、γF(−′紹ソ7′tシグルタ
ミ〉・f゛しと水に刃化せしめイ、−の際41−成び7
L k−NAI)P”金ftj1炙LNAIJP11に
変4す4−LLシめる点にある。
ここJ、l(:本ジl QIJ +/、)ワ′ン七−二
ア消去の反応糸の一例37式(1)でjl<わう′。
グルタミンr戊 本発明P′Cおいて検H3中Vこ(j在−Jるアンモニ
ーfをあらかじ々:)消去させるトCは、tli−にこ
既θ。
のアンモニアとLl −K Gより水とグルタミノ1伎
を生成すイノ系でG I D IIが必3【となる。こ
の反応糸VCtま助r+′f、AtどしCN A D 
p It ノtJ−(i二カ必須である。(7かしこの
N A D )) Jロユ扱(こ定111−ず、乙際の
反応生成物である)′〉′モニアFこも影響する/こめ
、すで1こ検体中に存在するアンモニアを予め消去する
/こめpc :15 vにl光分JT[4・添加するこ
と1.1−(jさない。
・L′こて本発明fJi IJ的物り(【の>′YlJ
it Vこ影響を及はマ! f(、い作ILLのN A
 I) I) Ii添加)−とする/こめ、N A 1
) I)  を侃ノcJる酵素と基質を反応系1こ共(
1: 34!、と)コトK 、L: =)−CNADP
  ’<(NA4)pHK変化せしめ、N A D )
) I[の添加111を極力おきえイ〕 こ と ((
′: 、L て〜)で上f)+−: l用!1(1“I
を1す′(決 [/4− 。 −)−lわイレ・1々A
 D I’ IIのtコミυ111・lを、J)なくす
、ピ)/(め((反応(1) ””生成ず、41NAD
l−1慴゛猜几”ノ2゛グ/L ml −、:J、 −
6〜リンrsl脱水;4< l’+7 ;イ< (、I
゛t 1G−6−i)tlo トいう)古・のNA1月
) 金題瓦°ノる(lIF =(号6.’ 、i?、3
ζ1′0σ)クル:J−スー6−リンI□j・宕(1ゾ
、−1” G−6−1’とイQ ) ”、’p (、:
、) N A D P  ’rr: J′’L ノにず
7. (4+2 ;(、H〕く応ノ+’、:t’tト−
76h K 添加して」・・い゛((i−ホースホグル
ユ1ン酸(以下(+ −P Gという)4・生成1\0
−イ)ど同時に一1J′ンt、−1−ノ′4・ct −
K G PC−よ′−)(完′i:、に水とグルタミン
′[′I父fcメ、比ン\−t!ニー (: l−=ま
うの−(!ある。
式(1)ノ反応tにI、+ イー(αI(G 〕公c)
、9” ” ;” ミンj“1セの変化(こ、Lつ−C
,’ N A D P IfがN A、 1月)F(二
なると3 4  tl  o n+  ンこ、■、るj
lj )’I’; 1隻が −1,、I、 f=、+ζ
ノ・11屹少−ノイ〕が、G−(+   PI)IS&
(−−して2)−(内ひN A l) l’ +1 V
C−亀化すど)ため−二31IOIn pc 、iるI
JlりI’(: l!1.□14: −J−。
’fIL、、Ii’に、 j(、lJl[)弯什; X
i: l:r < ft −、) /c I’)゛)−
ン−+= =ブが7.: xrt!消費され/にI:(
′こlる。
木光門のアンモI゛、ア消費群のり(ハ G d 1月
1は必偵であるが助[S7=’A )N A Dx)?
rノI′1ノ+ニー1イ)rty 素tri a−a 
−P I) II VC,限らすN A D P  を
助酵素として還元する酵素であれば圧面に選択すること
ができる二 例えばN A D 11  の場合はG −(3−P 
D 11(E C1,1,1,49)、6−ホスホグル
コン酸脱水、+< r1% 素(以j” 6−1)Gl
)IIという)(EC1、1,1,44) 、・インク
エン酸脱水水酵素(以−Htctoiという) [: 
ECl、1.1.42 )等があり、これらを用いる1
局= tit七ノしそれ過剰の基質としてa−6−p、
aptン、イソクエン酸をそれぞれ広大して添加すれば
良い。史には検体中V(多i、jifI−龜するアンモ
ニアを反応生成物としで生ずる尿素をも、検体の前処理
とし−Cウレアーービを添加することPこ、しり尿素を
消)ぐせしめることが出来る。このこと1ゴロ的物質を
定IYするVC用いる酵しくりがウレアーゼを混11す
る411 /’i% ;+、の時rコ効314的テオル
この、l:うK l、で、検体中に゛ノ゛でVこ存在し
゛(いたアンモニアtま消去され、目的物J、父よりア
ンモニアを生成Wしめる酵素の作用によって生成するア
ンモニアVよ!(f接測定できピ)状、)11と乃、つ
/ζわ1ノである。
このl”)Pこ・ド発明はアンモニJ″混6ト検体中の
アンモニア全生成せしめる物!!jLの定:11に」、
・いて予じめ検体中IC存在するアンモニアイf・消失
せしめたために引A恍き同一反応系で直接アンモニアを
生成せ[2め乙物質の定11)肴・可能とし7だもので
アンモニアを一生成せしめる物質の自!11b分析VC
きわめて適した方7′ノミである。
次に本発明の実M11例4・示す。
実施例1(タレアブニンの定114.の」勺合)(x 
  KG                     
    4. 2  +nAiNAI)L)l[0,0
13mM G−6−P        3.2 mMG−6−Pi
)H(酵母由来)3.2u/meGlDH(牛肝臓由来
)    38  u/me以上を含有する0、 1 
M ) リス塩酸緩(!Iij液(1u117.5 )
 3 mlに2111八1アンモニアをn′む様々な濃
度に調整したタレアチニン含有険体(A= 0.12m
L?/mtz  13 = 0.241117./11
1eXC=0.481)If//me、   D  =
  0.9 6  In’//ml  )   2 0
  μ4(1j’c llr> huした。それぞれ2
5℃で5分間保温した後340 nmの吸光度合111
J定し、吸光度の変化が停止し/Cところで、 5 +nM  NADII     72μlを添加し
、340n+nの吸光度の」1!l加を約2分間追跡し
た後、 タレ1テニンラ゛・fミナーゼ  50μlを面別し、
340n+nの吸光度の減少を測定した。
ΔE;AT:0.042  B=0.084  C=0
.1681)=0.335 であった。
これを次式により計算した結4)% %検体中1こすで
にYj在してい/〔アンモニア2 m kl tま完全
に消去され、引き続き測定されるタレアナニンの定tl
tに影響なく検体中のタレアチニン含■迂が定)枝され
/仁。
タレアテニンit Δ1ヱ」3.1ノ12113 m9/ Tne−て’z×o、o2×π箇ΔE−NAD
Iiの減少による吸光度のき1(少6.2 =NAD)
Iのl m Mの吸光度:3.11=全ノ又応11支−
)、1 0.02−イ矢イ本U[ 113=クレアデニンの分子ffl 実施例2 (クレアテニンテ″イミナーゼの粗ri′P素液を用い
てのタレアチニンの定litの% 自、 )α−KG 
              4.2mMNADPII
        O,013mへ1G−6−P    
    3.2+nMG−6−PDH(酵母由来)  
3.2 u/mgGlDII(牛肝臓由来)38″ u
 / me以上を含有するO、 l M ) IJス塩
醗緩衝液(pH7,5)3mil’C2mMアンモニア
並ひに2m IJI尿素を含むように調整したタレ1テ
ニン含有検体(0,48m77 ml ) 20μ!!
を添加した。これ’a: 25℃で5分間保温した後3
40nrnの吸光度を測定し吸光度の変化が停止したと
ころ(!、 5 +n M  N A I) 11        
72μl全添力11シ、:340 n mの吸光度のノ
i、’17JII金約2公約2跡した後、 20 uAノlクレノ′J−二;ンデーfミナーセ1乙
)打工酵素液    50 μl(rざメ加し、340
 nmの吸光度の1jr14少をυ)り定しだ。このと
きの吸光度の変化):J: o、 326 Tあった。
この吸光度変化1ま、タレアナニン含鼠の2倍近い値を
示した。
一方、クレーrチニン含有検体′d:添加した際につl
/ ’)”−ゼを検体当り10uふ加した。1ハ合トC
りいても同様の操作を行lい340 nmの吸)Y、1
川の減少をi+t:j定したところ0.168であつノ
c0この吸光度変化Vまクレアナニン含−ハ(に−−−
一 致 し77′こ 。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)(矢陣中の目的物質を定)、1−する1こあたり
    、検体1(グルタミン酸膜水素rf%素、2−オキソグ
    ルクール酸、還元型ニコチンアミドアrニンノヌクレオ
    チドポスフエート、ソシ′Cニコチンアミ19アデニン
    ノヌクレオテドホスフエートを還元する酵素及び基り!
    jを添加混合し、検体中tCすてに:(j’在するアン
    モニフ゛を消去せしめ、その際生成されたニコチンアミ
    トノ°ブ′ニンジヌクレオチドホスフ工一トをエコ1チ
    ンアミドアデニンジヌクレオチドポスノエートを還元せ
    しめる酵素を〕1」い−CL’) IAI還元型ニコチ
    ンアミドアラ″ニンノヌクレ」ナトホス7エートに変換
    せしめること4−特徴とする検体の前処理方法。
  2. (2)更にウレアーゼを添加混合する特;i’F Nl
    求の範囲第1項記載の検体の前処理方法。
JP12888282A 1982-07-26 1982-07-26 検体の前処理方法 Granted JPS5921398A (ja)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS626699A (ja) * 1985-07-02 1987-01-13 Oriental Yeast Co Ltd イソクエン酸脱水素酵素反応の停止方法
JPS6234061A (ja) * 1985-08-08 1987-02-14 Oriental Yeast Co Ltd クレアチニンの定量方法
JPS6234060A (ja) * 1985-08-08 1987-02-14 Oriental Yeast Co Ltd 尿素の定量方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS626699A (ja) * 1985-07-02 1987-01-13 Oriental Yeast Co Ltd イソクエン酸脱水素酵素反応の停止方法
JPS6234061A (ja) * 1985-08-08 1987-02-14 Oriental Yeast Co Ltd クレアチニンの定量方法
JPS6234060A (ja) * 1985-08-08 1987-02-14 Oriental Yeast Co Ltd 尿素の定量方法

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JPH0218073B2 (ja) 1990-04-24

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