CN105806831A - 一种利用化学发光法检测氯酚污染物的方法 - Google Patents

一种利用化学发光法检测氯酚污染物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分析化学与光学DNA生物传感技术领域,具体公开了一种基于G‑四联体/Hemin过氧化物模拟酶‑双氧水‑鲁米诺化学发光体系检测氯酚污染物的生物传感方法。该化学发光法具有简单、快速、成本低、样品用量少、灵敏性高等优点。为环境体系氯酚污染物的快速检测提供了一种新的检测方法,这在完善现有氯酚污染物检测技术方面具有重要意义,同时拓宽了G‑四联体/Hemin过氧化物模拟酶在分析化学领域中的应用。

Description

一种利用化学发光法检测氯酚污染物的方法
技术领域
本发明涉及分析化学与光学DNA生物传感技术领域,具体地说,涉及一种利用化学发光法检测氯酚污染物的方法。
背景技术
氯酚类化合物是一类分布广泛的有毒环境污染物。氯酚类化合物在制备塑料、染料、农药、除草剂等工业生产过程中应用广泛,亦用于木材防腐、杀菌剂、氯代杀虫剂中间体以及粘合剂的添加剂等,是导致环境体系中氯酚类化合物分布广泛的重要原因。氯酚类化合物在环境体系中可持久性存在、具有生物累积性、较强的生物毒性,进入体内的氯酚类污染物会对生物体造成伤害——不仅会影响和改变免疫系统、神经系统和内分泌系统的正常调节功能,使肝、肾、肺等内脏发生病理改变,而一些氯酚污染物,如2-氯酚、2,4-氯酚等亦具有较强的致癌作用致畸、致突变的作用,已被美国环境保护局(US EPA)列入优先控制污染物名单。由于持久性有毒污染物对人体健康和环境的长期影响,目前已经受到各国政府和环境科学家的关注,成为国际环境科学十分热门的研究领域。因此,建立一种快速、简单、灵敏、高效的氯酚类污染物的检测方法具有重要意义。
传统的氯酚污染物检测法主要为仪器分析法,如高效液相色谱法,液相色谱-质谱联用法、液相色谱-电化学联用法(LC-ED),气相色谱法,气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等等。这些仪器分析方法虽然能够精确、快速地测定出氯酚污染物的含量,但仍存在一些不足之处,如仪器操作相对复杂,需专业技术人员培训;仪器设备昂贵、测试费用高;测试样品需进行前处理,耗时较长;难于实现原位、实时、在线检测;对实际样品检测时灵敏度偏低等。因此,开发简单、廉价、快速、灵敏的氯酚污染物检测方法势在必行。
Vasapollo研究组采用分子印迹法测定氯酚污染物的研究亦有报道,该方法虽然对目标分子具有较强的识别作用,但仍存在制备过程复杂、选择性差等问题(Vasapollo et al.,2011)。随着电化学及电化学生物传感技术的发展,采用电化学方法检测氯酚污染物已经取得了一些成果,如Peeters课题组采用裸金电极、四磺酸钴酞菁和四磺酸铜酞菁修饰的金电极对4-氯酚进行了检测,结果表明四磺酸铜酞菁修饰的金电极检测效果较好(Peeters et al.,2008)。Sun课题组采用乙炔黑修饰的玻碳电极实现了对2-氯酚的检测,与裸电极相比该修饰电极灵敏度大大提高,检测限达到了50nM(Sun and Zhang,2006)。Prabhakar课题组制备了聚吡咯—聚氯乙烯磺酸盐电化学掺杂DNA修饰的氧化铟膜传感器对3-氯酚进行检测,结果表明电化学信号在浓度0.001×10-6~55.0×10-6范围呈线性相关(Prabhakar et al.,2007)。此外,研究发现某些酶如酪氨酸酶(Adamski et al.,2010)、漆酶(Yin etal.,2010)、辣根过氧化物酶(Kazunga et al.,1999;Song et al.,2003)等对氯酚污染物具有催化氧化作用。基于此,Adamski课题组采用酪氨酸酶修饰的玻碳电极对4-氯酚进行了检测,检测限达到28纳摩尔(Adamski et al.,2010)。Liu课题组采用静电纺丝法制备了漆酶修饰的玻碳电极对2-氯酚、2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚进行了检测,检测限在纳摩尔-微摩尔之间(Liu et al.,2011)。Erhans课题组采用聚吡咯/碳纳米管/辣根过氧化酶修饰的金电极对2-氯酚、3-氯酚、4-氯酚等进行了检测,检测限达到微摩尔级(Korkut et al.,2008)。
然而,采用电化学方法检测氯酚污染物仍存在一些不足之处,如采用电化学方法对氯酚污染物进行检测时,为提高检测的灵敏度需对电极表面进行修饰,而修饰过程使检测周期变长,大大降低了分析检测的效率;同时电极修饰膜材料的性能、修饰膜的稳定性也会影响测定结果的准确性;电极修饰膜批次之间的差异、电极之间的差异等均会对测定结果产生影响。酶修饰电极虽然可以提高电极检测的灵敏性,但是电极修饰过程中蛋白酶的活性会降低,测定时电极表面的蛋白酶的活性也很容易受到测试体系中其它共存物的影响。因此,探寻一种快速、简单、准确、灵敏、高效的检测氯酚污染物的方法具有重要的意义。
研究发现,G-四联体DNA和hemin分子结合后可以形成G-四联体/hemin复合物,该复合物具有类过氧化物酶的催化活性,被称之为G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶,该G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶具有极强的催化活性,能够催化双氧水氧化鲁米诺产生化学发光(Kosman and Juskowiak 2011)。与传统的蛋白酶相比,该G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶具有催化活性高、生产成本低、易于制备及贮存、热稳定好等优点,已被广泛应用于生物传感分析领域。而我们在研究中发现,氯酚污染物会对G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶、双氧水、鲁米诺的发光体系产生抑制作用,导致化学发光信号的降低,且化学发光信号与浓度变化存在一定关系。但是,到目前为止,尚未有基于G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶对氯酚污染物进行检测等相关研究报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种利用化学发光法检测氯酚污染物的方法。
为了实现本发明目的,本发明的技术方案如下:
一种利用化学发光法检测氯酚污染物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶与鲁米诺溶液混合均匀;可使用漩涡振荡器混匀;
(2)向待测样品用Tris-KClO4缓冲溶液稀释后,与H2O2溶液混合均匀;
(3)将步骤(1)所得的混合溶液置于微弱化学发光检测仪的化学发光检测池后,快速注射步骤(2)所得的混合溶液于化学发光检测池中,得到混和发光体系,进行化学发光信号检测。
进一步地,为了更好的实现化学发光体系检测,所述混和发光体系中:G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶的浓度为1-500nM,鲁米诺的浓度为5-500μM,H2O2溶液的浓度为1-20mM,K+的浓度为5-100mM。
进一步地,当所述混和发光体系的pH值为7-12时,可检测到明显发光信号。
作为优选,当所述混和发光体系的pH值为8-10,发光信号较强。
进一步地,所述G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶的制备方法如下:
A.将固体DNA粉末用20mM Tris-HClO4缓冲溶液溶解,用漩涡振荡器混匀,并置于85℃的水浴锅中2-20min,取出,自然冷却,静置于室温下1-12h,备用;
B.取适量上述步骤A配制的DNA溶液加到冻存管中,向其中加入Tris-KClO4溶液,孵育0.5-6h后,加入一定量的hemin,用漩涡振荡器混匀,放置1-8h,得到G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶。其中,所述hemin的浓度为1-50μM。
所述DNA粉末中的DNA为具有连续G序列的核苷酸。
更为具体地,本申请的具体实施方式中采用的DNA粉末为Tel22DNA,其核苷酸序列为:agggttaggg ttagggttag gg。
实际应用中,可使用其它具有连续G序列的DNA序列进行替换,例如:
1.PW17:GGGTAGGGCGGGTTGGG;
2.PS2.M:GTGGGTAGGGCGGGTTGG;
3.T30695:GGGTGGGTGGGTGGGT。
上述方法可对氯酚污染物进行定性检测,即判断待测样品中是否含有氯酚污染物。更进一步地,还可利用标准梯度浓度的氯酚制备混和发光体系,进行化学发光信号检测,构建标准曲线,将待测样品的检测值带入计算,对待测样品的氯酚污染物进行定量。
所述氯酚污染物含有2-氯酚、4-氯酚、2,4-二氯酚,2,4,6-三氯酚或五氯酚中的一种或多种。即当待测样品中含有2-氯酚、4-氯酚、2,4-二氯酚,2,4,6-三氯酚或五氯酚时,能够使用本发明所述方法检出。
基于上述方法,本发明提供了G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶在氯酚类污染物检测中的新应用。拓宽了G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶的应用范围。
本发明的有益效果在于:
本发明建立了以一种基于G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶-双氧水-鲁米诺化学发光体系检测氯酚污染物的生物传感方法,该化学发光法具有简单、快速、成本低、样品用量少、灵敏性高等优点。为环境体系氯酚污染物的快速检测提供了一种新的检测方法,这在完善现有氯酚污染物检测技术方面具有重要意义,同时拓宽了G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶在分析化学领域中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例4中不同体系测定的化学发光CL光谱;a代表含有鲁米诺、H2O2缓冲溶液体系;b代表含有鲁米诺、H2O2、G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶缓冲溶液体系;c代表含有鲁米诺、H2O2、五氯酚、G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶缓冲溶液体系。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1 G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶
将固体DNA粉末(Tel22DNA)用20mM Tris-HClO4缓冲溶液溶解,用漩涡振荡器混匀,并置于85℃的水浴锅中5min,取出,自然冷却,静置于室温下,取适量上述配制的DNA溶液加到冻存管中,向其中加入20mM Tris-KClO4溶液,稀释到1μmol,孵育2h后,加入1.2μmol的hemin,用漩涡振荡器混匀,放置2h,得到浓度为1μmol的G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶。
实施例2
1、将实施例1制备的G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶与鲁米诺溶液使用漩涡振荡器混合均匀;
2、将五氯酚用Tris-KClO4缓冲溶液稀释后,与H2O2溶液混合均匀;
3、将步骤1所得的混合溶液置于微弱化学发光检测仪的化学发光检测池后,快速注射步骤2所得的混合溶液于化学发光检测池中,得到混和发光体系,进行化学发光信号检测。
其中,为了验证不同浓度五氯酚对发光信号的影响,通过混合不同体积的五氯酚溶液使得混和发光体系中的五氯酚浓度分别为0nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L、10000nmol/L。同时混合发光体系中:G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶的浓度为1nM,K+的浓度为20mM,H2O2的浓度为2mM,鲁米诺的浓度为500 μM。
检测不同混合发光体系的化学发光CL强度,见表1。
表1 与不同浓度五氯酚作用后化学发光强度
实施例3
以浓度为10μM的2-氯酚、4-氯酚、2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚等代替实施实例1中的五氯酚,其它条件如鲁米诺、H2O2、G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶缓冲溶液等化学发光体系条件同实施例1,测定加入不同氯酚化合物体系化学发光强度。化学发光CL强度变化值ΔCL见表2。
表2 与不同氯酚化合物作用后化学发光强度变化
实施例4
用20mM,pH 9.0的Tris-KClO4缓冲溶液配制含100nM G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶及50 μM鲁米诺的混合溶液,记为A液;配制20mM H2O2溶液,记为B液;混合配制含20mM H2O2及80 μM五氯酚的混合溶液,记为C液;配制50 μM鲁米诺溶液,记为D液。
1、取890 μL上述缓冲溶液加入到测定池中,取A液10μL加入到测定池中,然后将测定池置于微弱化学发光检测仪中,用微量进样器取100 μL B液,快速注入测定池中,并进行化学发光测定(图1b线);按上述操作,用微量进样器取100 μL C液并进行化学发光测定(图1c线)。
2、取890 μL上述缓冲溶液加入到测定池中,取D液10μL加入到测定池中,然后将测定池置于微弱化学发光检测仪中,用微量进样器取100 μL B液,快速注入测定池中,并进行化学发光测定(图1a线)。
从图1中可以看出,当测定体系中存在鲁米诺与双氧水时只有较低的背景信号(a线);当G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶存在时化学发光信号显著增强(b线),说明G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶可以有效催化鲁米诺、双氧水体系产生化学发光;当含有五氯酚存在时,化学发光体系化学发光信号显著下降(c线),从而可以根据信号的变化实现对五氯酚的检测。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (9)

1.一种利用化学发光法检测氯酚污染物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶与鲁米诺溶液混合均匀;
(2)向待测样品用Tris-KClO4缓冲溶液稀释后,与H2O2溶液混合均匀;
(3)将步骤(1)所得的混合溶液置于微弱化学发光检测仪的化学发光检测池后,快速注射步骤(2)所得的混合溶液于化学发光检测池中,得到混和发光体系,进行化学发光信号检测。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述混和发光体系中:G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶的浓度为1-500nM,鲁米诺的浓度为5-500μM,H2O2溶液的浓度为1-20mM,K+的浓度为5-100mM。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述混和发光体系的pH值为7-12。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述混和发光体系的pH值为8-10。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶的制备方法如下:
A.将固体DNA粉末用20mM Tris-HClO4缓冲溶液溶解,用漩涡振荡器混匀,并置于85℃的水浴锅中2-20min,取出,自然冷却,静置于室温下1-12h,备用;
B.取适量上述步骤A配制的DNA溶液加到冻存管中,向其中加入Tris-KClO4溶液,孵育0.5-6h后,加入一定量的hemin,用漩涡振荡器混匀,放置1-8h,得到G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述hemin的浓度为1-50μM。
7.根据权利要求1-4任意一项所述的方法,其特征在于,利用标准梯度浓度的氯酚制备混和发光体系,进行化学发光信号检测,构建标准曲线,将待测样品的检测值带入计算,对待测样品的氯酚污染物进行定量。
8.根据权利要求1-4任意一项所述的方法,其特征在于,所述氯酚污染物含有2-氯酚、4-氯酚、2,4-二氯酚,2,4,6-三氯酚或五氯酚中的一种或多种。
9.G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶在氯酚类污染物检测中的应用。
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