CN110426519B - 基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法 - Google Patents
基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110426519B CN110426519B CN201910730194.3A CN201910730194A CN110426519B CN 110426519 B CN110426519 B CN 110426519B CN 201910730194 A CN201910730194 A CN 201910730194A CN 110426519 B CN110426519 B CN 110426519B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cea
- aptamer
- quadruplex
- input signal
- ovarian cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法,属于生物医学技术领域。本发明将蛋白‑核酸识别技术、信号放大技术和逻辑门相结合,用CEA和CA125的适配体进行靶标识别,通过G‑四链体‑血红素复合物进行信号转变和放大,建立了针对肿瘤标志物同时检测的方法。本发明构建了一种灵敏度高、特异性强的光学生物传感器,实现了对CEA和CA125的联合检测,并基于逻辑门给出卵巢癌筛查结果;将光学检测跟信号放大技术联合起来,提高检测灵敏度;检测原理的通用性使该方法还适合基于不同的蛋白识别元件实现对不同目标物的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法,属于生物医学技术领域。
背景技术
卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤,在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率占第三位,是妇科死亡率最高的肿瘤,因此早发现、早诊断、早治疗对于卵巢癌病人的康复极为重要。当早期肿瘤仅局限于卵巢时,超声检查难诊断,而血清肿瘤标志物的升高可先于影像学改变和临床症状数个月,对早期诊断具有一定临床意义。卵巢癌有多种肿瘤标志物,其中只有糖类抗原125(CA125)被临床认可并广泛应用于卵巢肿瘤中,临床上设定血清CA125的临界值为35U·mL-1,但是CA125在卵巢癌诊断中表现的特异性比较低,容易出现假阳性。为了提高了卵巢癌诊断的准确率,人们通常会将CA125和其他几种肿瘤标志物进行联合检测。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)是一种糖蛋白,它不是特异性肿瘤标志物,除了两种癌症大肠癌和消化道恶性肿瘤之外,在宫颈癌,卵巢上皮及非上皮性癌中都有不同程度的表达。健康成年人血清中CEA值小于2.5ng·mL-1,所以血清含量正常值一般就规定为小于5ng·mL-1。因此将CA125和CEA两种肿瘤标志物进行联合检测,可明显提高卵巢癌诊断的敏感性和准确度,有助于卵巢癌患者进行更有效的早期诊断和治疗,有助于降低因早期未及时发现卵巢癌而致使患者最终死亡事件的发生率。
目前人们通常使用诸如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶标记免疫分析技术、化学发光免疫分析技术、时间分辨荧光免疫分析技术等技术手段来检测患者血清中的肿瘤标志物含量,这些技术方法原理都是基于抗原抗体的结合,检测方法比较有局限性主要是因为抗体分子大而且具有免疫原性。因而,建立操作简单便携、特异性好、灵敏度高的肿瘤标志物检测方法,对癌症的理论研究和临床诊断都具有重要意义。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明将蛋白-核酸识别技术、信号放大技术和逻辑门相结合,用CEA和CA125的适配体进行靶标识别,通过G-四链体-血红素复合物进行信号转变和放大,建立了灵敏度高、准确度高的针对肿瘤标志物同时检测的方法。
本发明的第一个目的是提供一种用于卵巢癌筛查的光学生物传感器,所述的光学生物传感器为基于肿瘤标志物CEA和CA125的逻辑门,所述的逻辑门为“NOR”门和“AND”门;输入信号1为肿瘤标志物CEA,输入信号2为肿瘤标志物CA125;信号转换器为基于CEA适配体和CA125适配体的G-四链体-血红素复合物;输出信号为G-四链体-血红素复合物氧化ABTS2-的溶液吸光值;
其中,所述的信号转化器通过如下方法制备:
(1)将G-四链体序列分为可自组装的两段序列,分别与CEA适配体和CA125适配体相连;
(2)将CEA适配体、CA125适配体和TemDNA序列混合反应,形成稳定的杂交链结构,G-四链体两段序列自组装成完整G-四链体;其中,所述的TemDNA序列为与CEA适配体和CA125适配体分别部分互补的序列;
(3)再加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物,利用复合物氧化ABTS2-溶液,根据吸光值变化进行信号转化。
进一步地,输入信号1的临界浓度为5ng·mL-1,超过5ng·mL-1定义为1,不超过5ng·mL-1定义为0;输入信号2的临界浓度为35U·mL-1,超过35U·mL-1定义为1,不超过35U·mL-1定义为0;四种输入信号形式分别为:CA125、CEA均未超过临界浓度,定义为(0,0);CEA未超过临界浓度,CA125超过临界浓度,定义为(0,1);CEA超过临界浓度,CA125未超过临界浓度,定义为(1,0);CA125、CEA均超过临界浓度,定义为(1,1)。
进一步地,所述的“NOR”门的构建方法包括如下步骤:
S1将分别连接一半G-四链体的CEA适配体和CA125适配体,以及TemDNA序列混合反应形成稳定的杂交链结构;
S2向S1体系中加入含有或不含有输入信号的样品进行孵育反应;
S3向S2体系中加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物,利用复合物氧化ABTS2-,测得溶液在420nm处紫外吸光值;
S4吸光值超过临界值0.365时,输出为“1”,两种标志物均在正常生理浓度范围内;
S5吸光值不超过临界值0.365时,输出为“0”,肿瘤标志物CEA或CA125中的一种或两种超出正常生理浓度范围。
进一步地,当输入信号为(0,0)时,输出信号为“1”,当输入信号为(0,1)、(1,0)或(1,1)时,输出信号为“0”。
进一步地,所述的“NOR”门的构建方法具体包括如下步骤:
S1将分别连接一半G-四链体的CEA适配体和CA125适配体,以及TemDNA序列用PBS缓冲液稀释至1μmol·L-1,稀释后各取15μL混合均匀,95℃下5min,25℃下反应2h形成稳定的杂交链结构;
S2向S1体系中加入2μL含有或不含有输入信号的样品,37℃孵育反应1h;
S3向S2体系中加入423.5μL working buffer和1.5μL 10μmol·L-1的血红素溶液,于25℃下反应1h,形成G-四链体-血红素复合物,向反应体系中加入10μL 0.3%的过氧化氢溶液和20μL ABTS溶液反应10min,利用复合物氧化ABTS2-,测得溶液在420nm处紫外吸光值;
S4吸光值超过临界值0.365时,输出为“1”,两种标志物均在正常生理浓度范围内;
S5吸光值不超过临界值0.365时,输出为“0”,肿瘤标志物CEA或CA125中的一种或两种超出正常生理浓度范围。
进一步地,所述的“AND”门的构建方法,包括如下步骤:
S1使用能够与适配体序列部分互补的捕获探针CEA-cDNA、CA125-cDNA将分别连接一半G-四链体的CEA适配体和CA125适配体固定在磁珠表面,形成磁珠-适配体-cDNA复合物;
S2向S1体系中加入含有或不含有输入信号的样品进行孵育反应;
S3将S2体系进行离心,取上清,灭活肿瘤标志物,释放CEA适配体和CA125适配体;
S4向S3体系中加入TemDNA序列反应形成杂交链结构;
S5向S4体系中加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物,利用复合物氧化ABTS2-,测得溶液在420nm处紫外吸光值;
S6吸光值超过临界值0.275时,输出为“1”,两种标志物均超过正常生理浓度范围内;
S7吸光值不超过临界值0.275时,输出为“0”,肿瘤标志物CEA或CA125中的一种或两种未超出正常生理浓度范围。
进一步地,当输入信号为(1,1)时,输出信号为“1”,当输入信号为(0,1)、(1,0)或(0,0)时,输出信号为“0”。
进一步地,所述的“AND”门的构建方法,具体包括如下步骤:
S1用PBS缓冲液将CEA-cDNA、CA125-cDNA、CEA适配体、CA125适配体稀释到2μmol·L-1,稀释后各取75μL混匀均匀,95℃下加热5min,室温下杂交2h形成稳定的互补双链结构,加入清洗后的磁珠,混合震荡,室温下孵育1h,离心去除上清液,用100μL PBS缓冲液重悬得到磁珠-适配体-cDNA复合物;
S2向S1体系中加入2μL含有或不含有输入信号的样品,37℃孵育反应1h;
S3将S2体系进行离心,取上清,95℃加热30min灭活肿瘤标志物,释放CEA适配体和CA125适配体;
S4向S3体系中加入1.25μL 10μmol·L-1TemDNA序列,95℃加热5min,室温2h反应形成杂交链结构;
S5向S4体系中加入349μL working buffer溶液和10μL 10μmol·L-1血红素,25℃下孵育1h,反应形成G-四链体-血红素复合物,向反应体系中加入10μL0.3%的过氧化氢溶液和20μL ABTS溶液反应10min,利用复合物氧化ABTS2-,测得溶液在420nm处紫外吸光值;
S6吸光值超过临界值0.275时,输出为“1”,两种标志物均超过正常生理浓度范围内;
S7吸光值不超过临界值0.275时,输出为“0”,肿瘤标志物CEA或CA125中的一种或两种未超出正常生理浓度范围。
进一步地,所述的CEA适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述的CA125适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述的与CEA适配体和CA125适配体分别部分互补的序列TemDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地,所述的CEA-cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述的CA125-cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地,所述的捕获探针CEA-cDNA和CA125-cDNA上修饰有生物素,所述的磁珠上修饰有链霉亲和素。
本发明的第二个目的是提供一种用于卵巢癌筛查的试剂盒,所述的试剂盒中包含构建所述的光学生物传感器的试剂。
本发明的有益效果是:
本发明构建了一种灵敏度高、特异性强的光学生物传感器,实现了对CEA和CA125的联合检测,并基于逻辑门给出卵巢癌筛查结果;将光学检测跟信号放大技术联合起来,提高检测灵敏度;检测原理的通用性使该方法还适合基于不同的蛋白识别元件实现对不同目标物的检测。
附图说明
图1为基于癌胚抗原和糖类抗原125的联合检测和“NOR”逻辑门运算筛查卵巢癌的实验原理;
图2为基于癌胚抗原和糖类抗原125的联合检测和“AND”逻辑门运算筛查卵巢癌的实验原理;
图3为“NOR”逻辑门运算筛查卵巢癌的检测结果;
图4为“AND”逻辑门运算筛查卵巢癌的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
基于癌胚抗原和糖类抗原125的联合检测和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法,在该方法体系中构建了两种类型的逻辑门:“NOR”门和“AND”门。
在“NOR”门中,设计了三个特殊的DNA序列:CEA-apt、CA125-apt和TemDNA。CEA-apt的5’端包含一半的G-四链体形成序列,3’端为CEA的适配体序列;CA125-apt的5’端是CA125的适配体序列,3’端是G-四链体形成序列的另一半;TemDNA是与CEA-apt和CA125-apt分别部分互补的模板序列。室温下CEA-apt、CA125-apt和TemDNA会形成稳定的杂交链结构,其中CA125-apt的3’端与CEA-apt的5’端靠近并自组装形成完整的G-四链体结构。G-四链体结构与血红素结合后可形成具有过氧化物酶活性的G-四链体-血红素复合物,在H2O2存在时氧化ABTS2-,使溶液从无色变为绿色,通过紫外分光光度计可测得波长420nm下溶液的吸光值,设定其输出为“1”。当反应体系中肿瘤标志物CEA或者CA125的任何一种或两种超出正常生理浓度范围时,它们会特异性地竞争结合各自的适配体DNA,导致CEA-apt或/和CA125-apt从TemDNA上脱落下来,杂交链和G-四链体结构遭到破坏,G-四链体-血红素复合物减少,当催化反应后吸光值小于设定的固定值时,输出为“0”。只有当两种卵巢癌标志物都不超过正常生理浓度范围的情况下,G-四链体结构才不会遭到破坏,此时输出为“1”,可基本排除卵巢癌的可能性。具体原理如图1所示。
在“AND”门中,基于“NOR”门的三条特殊的DNA序列,额外设计了两条生物素(Biotin)修饰的能够与适配体序列部分互补的捕获探针CEA-cDNA和CA125-cDNA。通过捕获探针与适配体序列的杂交将CEA-apt和CA125-apt固定在修饰有链霉亲和素的磁珠表面,形成磁珠-apt-cDNA复合物。当体系中CEA和CA125同时存在时,会特异地将各自的适配体序列CEA-apt和CA125-apt从磁珠上置换下来,通过磁性分离去除磁珠后,溶液再经高温变性除去CEA和CA125,得到单链的CEA-apt和CA125-apt,此时加入TemDNA,CEA-apt、CA125-apt和TemDNA会形成稳定的含有G-四链体的杂交链结构,与血红素结合后在H2O2存在时可氧化ABTS2-,使溶液从无色变为绿色,通过紫外分光光度计测得波长420nm下溶液的吸光值,设定其输出为“1”。在该逻辑门中,只有当CEA和CA125同时超出正常生理浓度时,才会形成具有过氧化物酶活性的G-四链体-血红素复合物,输出为“1”;当反应体系中只存有其中一种标志物或两者均不存在(或不超标)时,均不会形成G-四链体结构(或G-四链体结构含量低),检测到的吸光值小于固定值时,设定输出为“0”。输出为“1”可初步推断卵巢癌的存在。具体原理如图2所示。
实施例1:“NOR”逻辑门
(1)杂交链的形成:用PBS缓冲液(2mmol·L-1KH2PO4,10mmol·L-1Na2HPO4,2.7mmol·L-1KCl,137mmol·L-1NaCl,pH7.4)将TemDNA、CEA-apt、CA125-apt稀释到1μmol·L-1,稀释后各取15μL混合均匀,95℃下5min,25℃下反应2h形成稳定的杂交链结构;
其中CEA-apt序列如SEQ ID NO.1(5’-GGGTTGGGTTTATACCAGCTTATTCAATT-3’)所示;CA125-apt序列如SEQ ID NO.2(5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAATTTGGGTAGGG-3’)所示;TemDNA序列如SEQ ID NO.3(5’-TTGAATAAGCTGGTATTTTGAGCGTTTATTCTTGTCTC CCTATAGTGAGTCGTA-3’)所示;
(2)DNA-标志物蛋白孵育:向步骤(1)反应体系中加入2μL不同浓度的CEA和CA125样品,37℃孵育1h;
(3)G-四链体-血红素复合物的形成:向步骤(2)体系中加入423.5μL workingbuffer(150mmol·L-1NH4Cl,50mmol·L-1Tris,20mmol·L-1KCl,0.03%TritonX-100,pH7.5)和1.5μL 10μmol·L-1的血红素溶液,于25℃下反应1h;
(4)吸光值检测:向步骤(3)体系中加入10μL 0.3%的过氧化氢溶液(10μL30%的过氧化氢溶液,990μL超纯水)和20μL ABTS溶液(1mL DMSO,0.27434g ABTS)反应10min,然后利用紫外分光光度计检测420nm处的吸光值,检测前用working buffer溶液进行校准;
(5)人血清中CEA和CA125的检测:将不同浓度CEA和CA125添加至人血清中制备得到人工添加CEA和CA125的血清,在与标准品相同的条件下进行检测。
实施例2:“AND”逻辑门
(1)apt-cDNA互补双链的形成:用PBS缓冲液将CEA-cDNA、CA125-cDNA、CEA-apt、CA125-apt稀释到2μmol·L-1,稀释后各取75μL混匀均匀,95℃下加热5min,室温下杂交2h形成稳定的互补双链结构;
其中CEA-apt序列如SEQ ID NO.1(5’-GGGTTGGGTTTATACCAGCTTATTCAATT-3’)所示;CA125-apt序列如SEQ ID NO.2(5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAATTTGGGTAGGG-3’)所示;CEA-cDNA序列如SEQ ID NO.4(5’-Biotin-AAAAAAAAAAAAAAAATTAATTGAATAAGCT-3’)所示;CA125-cDNA序列如SEQ ID NO.5(5’-TGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTATTAAAAAAAAAAAAAAAA-Biotin-3’)所示;
(2)磁珠-apt-cDNA复合物的构建:将磁珠瓶放到漩涡振荡器上振荡20s,重悬修饰有链霉亲和素的磁珠。取100μL磁珠溶液转移至新的离心管中,将离心管置于磁性分离器上,静置1min(此操作后续简称为磁性分离),用移液器吸去上清液,从磁性分离器上取下离心管。用PBS将磁珠冲洗磁珠三次。将步骤(1)形成好的互补双链加入到清洗好的磁珠中,混合充分振荡,室温下孵育1h后,磁性分离,去上清,用PBS冲洗磁珠三次,以除去未结合的DNA序列,然后用100μL PBS重悬磁珠得到磁珠-apt-cDNA复合物;
(3)DNA-标志物蛋白孵育:向步骤(2)得到的100μL磁珠-apt-cDNA复合物中加入不同浓度的肿瘤标志物CA125和CEA,混合充分振荡,37℃孵育1h;
(4)适配体的分离:将步骤(3)的体系12000rpm离心2min,取上清95℃加热30min灭活肿瘤标志物从而将CA125-apt和CEA-apt释放出来;
(5)G-四链体-血红素复合物的形成:向步骤(4)的反应体系中加入1.25μL 10μMTemDNA,95℃加热5min,室温2h以形成杂交链结构。然后加入349μLworking buffer溶液和10μL 10μmol·L-1的血红素,25℃下孵育1h以使杂交链结构中的G-四链体形成具有过氧化物酶活性的G-四链体-血红素复合物;
(6)吸光值检测:向步骤(5)体系中加入10μL 0.3%的过氧化氢溶液和20μLABTS溶液反应10min,然后利用紫外分光光度计检测420nm处的吸光值,检测前用working buffer溶液进行校准;
(7)人血清中CEA和CA125的检测:将不同浓度CEA和CA125添加至人血清中制备得到人工添加CEA和CA125的血清,在与标准品相同的条件下进行检测。
实施例3:“NOR”逻辑门运算筛查卵巢癌的检测结果
肿瘤标志物的检测分为5组,A(0,0)、P(0,0)、(0,1)、(1,0)、(1,1)。五组含有着不同浓度的CEA和CA125。其中A(0,0)组无CEA和CA125;P(0,0)组含有5ng·mL-1CEA和35U·mL-1CA125,即正常生理指标下的CEA和CA125含量;(1,0)组含有40ng·mL-1CEA和35U·mL- 1CA125,即病理CEA含量和正常生理CA125含量;(0,1)组含有5ng·mL-1CEA和100U·mL- 1CA125,即正常生理CEA含量和病理CA125含量;(1,1)组含有40ng·mL-1CEA和100U·mL- 1CA125,即CEA和CA125含量均为病理含量。形成稳定的杂交链结构后,按照上述5组所述的CEA和CA125的浓度分别加入到检测溶液中,经过DNA-标志物蛋白孵育和G-四链体-血红素复合物的形成,最终利用紫外分光光度计检测溶液在420nm处的吸光值,检测结果如图3所示。随着CEA和CA125浓度的升高,吸光值降低,病理条件下的吸光值与生理条件有明显差异,并设定临界值为0.365,作为卵巢癌生物标志物诊断的依据,即根据该NOR逻辑门测定,吸光值高于0.365时,表明两种标志物均在正常生理浓度范围内,可基本排除卵巢癌的风险。
实施例4:“AND”逻辑门运算筛查卵巢癌的检测结果
将apt-cDNA互补双链固定在磁珠表面后,加入A(0,0)、P(0,0)、(0,1)、(1,0)、(1,1)五组浓度的CEA和CA125,37℃孵育1h,然后磁性分离得到CEA和CA125结合的CEA-apt和CA125-apt,加热蛋白变性使得CEA-apt和CA125-apt游离在溶液中,然后经过G-四链体-血红素复合物的形成,最终利用紫外分光光度计检测溶液在420nm处的吸光值,检测结果如图4所示。随着CEA和CA125浓度的升高,吸光值上升,(1,1)组的吸光值与其余四组存在着明显差异,并设定临界值为0.275,作为卵巢癌生物标志物诊断的依据,即根据该AND逻辑门测定,吸光值高于0.275时,表明两种标志物均超过生理浓度范围,可基本判定具有患卵巢癌的风险。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法
<141> 2019-08-08
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 1
gggttgggtt tataccagct tattcaatt 29
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 2
taatacgact cactataggg agacaagaat aaacgctcaa tttgggtagg g 51
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 3
ttgaataagc tggtattttg agcgtttatt cttgtctccc tatagtgagt cgta 54
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 4
aaaaaaaaaa aaaaaattaa ttgaataagc t 31
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 5
tgtctcccta tagtgagtcg tattattaaa aaaaaaaaaa aaa 43
Claims (9)
1.一种用于卵巢癌筛查的光学生物传感器,其特征在于,所述的光学生物传感器为基于肿瘤标志物CEA和CA125的逻辑门,所述的逻辑门为“NOR”门和“AND”门;输入信号1为肿瘤标志物CEA,输入信号2为肿瘤标志物CA125;信号转换器为基于CEA适配体和CA125适配体的G-四链体-血红素复合物;输出信号为G-四链体-血红素复合物氧化ABTS2-的溶液吸光值;
其中,所述的信号转化器通过如下方法制备:
(1)将G-四链体序列分为可自组装的两段序列,分别与CEA适配体和CA125适配体相连;
(2)将CEA适配体、CA125适配体和TemDNA序列混合反应,形成稳定的杂交链结构,G-四链体两段序列自组装成完整G-四链体;其中,所述的TemDNA序列为与CEA适配体和CA125适配体分别部分互补的序列;
(3)再加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物,利用复合物氧化ABTS2-溶液,根据吸光值变化进行信号转化;
所述的CEA适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述的CA125适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述的与CEA适配体和CA125适配体分别部分互补的序列TemDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的光学生物传感器,其特征在于,输入信号1的临界浓度为5ng·mL-1,超过5ng·mL-1定义为1,不超过5ng·mL-1定义为0;输入信号2的临界浓度为35U·mL-1,超过35U·mL-1定义为1,不超过35U·mL-1定义为0;四种输入信号形式分别为:CA125、CEA均未超过临界浓度,定义为(0,0);CEA未超过临界浓度,CA125超过临界浓度,定义为(0,1);CEA超过临界浓度,CA125未超过临界浓度,定义为(1,0);CA125、CEA均超过临界浓度,定义为(1,1)。
3.根据权利要求2所述的光学生物传感器,其特征在于,所述的“NOR”门的构建方法包括如下步骤:
S1将分别连接一半G-四链体的CEA适配体和CA125适配体,以及TemDNA序列混合反应形成稳定的杂交链结构;
S2向S1体系中加入含有或不含有输入信号的样品进行孵育反应;
S3向S2体系中加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物,利用复合物氧化ABTS2-,测得溶液在420nm处紫外吸光值;
S4吸光值超过临界值0.365时,输出为“1”,两种标志物均在正常生理浓度范围内;
S5吸光值不超过临界值0.365时,输出为“0”,肿瘤标志物CEA或CA125中的一种或两种超出正常生理浓度范围。
4.根据权利要求3所述的光学生物传感器,其特征在于,当输入信号为(0,0)时,输出信号为“1”,当输入信号为(0,1)、(1,0)或(1,1)时,输出信号为“0”。
5.根据权利要求2所述的光学生物传感器,其特征在于,所述的“AND”门的构建方法,包括如下步骤:
S1使用能够与适配体序列部分互补的捕获探针CEA-cDNA、CA125-cDNA将分别连接一半G-四链体的CEA适配体和CA125适配体固定在磁珠表面,形成磁珠-适配体-cDNA复合物;
S2向S1体系中加入含有或不含有输入信号的样品进行孵育反应;
S3将S2体系进行离心,取上清,灭活肿瘤标志物,释放CEA适配体和CA125适配体;
S4向S3体系中加入TemDNA序列反应形成杂交链结构;
S5向S4体系中加入血红素反应形成G-四链体-血红素复合物,利用复合物氧化ABTS2-,测得溶液在420nm处紫外吸光值;
S6吸光值超过临界值0.275时,输出为“1”,两种标志物均超过正常生理浓度范围内;
S7吸光值不超过临界值0.275时,输出为“0”,肿瘤标志物CEA或CA125中的一种或两种未超出正常生理浓度范围。
6.根据权利要求5所述的光学生物传感器,其特征在于,当输入信号为(1,1)时,输出信号为“1”,当输入信号为(0,1)、(1,0)或(0,0)时,输出信号为“0”。
7.根据权利要求5所述的光学生物传感器,其特征在于,所述的CEA-cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述的CA125-cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
8.根据权利要求5所述的光学生物传感器,其特征在于,所述的捕获探针CEA-cDNA和CA125-cDNA上修饰有生物素,所述的磁珠上修饰有链霉亲和素。
9.一种用于卵巢癌筛查的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中包含构建权利要求1-8任一项所述的光学生物传感器的试剂。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910730194.3A CN110426519B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | 基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法 |
PCT/CN2019/100197 WO2021022574A1 (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-12 | 基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910730194.3A CN110426519B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | 基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110426519A CN110426519A (zh) | 2019-11-08 |
CN110426519B true CN110426519B (zh) | 2020-06-05 |
Family
ID=68415126
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910730194.3A Active CN110426519B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | 基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110426519B (zh) |
WO (1) | WO2021022574A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114624442B (zh) * | 2022-05-16 | 2022-08-12 | 南京颐兰贝生物科技有限责任公司 | 一种基于适配体信号放大的化学发光检测癌胚抗原试剂及其制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101408508A (zh) * | 2008-11-07 | 2009-04-15 | 浙江大学 | 5-(2-甲氧基-苯氧基)-2,2’-联嘧啶基-4,6-二酚的用途和使用方法 |
WO2013161964A1 (ja) * | 2012-04-27 | 2013-10-31 | キリンホールディングス株式会社 | リガンドを高感度に検出する核酸分子並びに該核酸分子のスクリーニング方法および該核酸分子の感度の最適化方法 |
CN105018474A (zh) * | 2014-08-22 | 2015-11-04 | 江苏省原子医学研究所 | 一种基于g-四链体-氯血红素dna酶的探针及其应用 |
CN109295167A (zh) * | 2018-11-09 | 2019-02-01 | 江南大学 | 基于雄激素受体识别元件和g-四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体的电化学方法 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9279806B2 (en) * | 2005-04-22 | 2016-03-08 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Water-soluble AIE luminogens for monitoring and retardation of fibrillation of amyloid proteins |
US20130065257A1 (en) * | 2010-03-16 | 2013-03-14 | Joseph Wang | Enzyme-logic biosensing |
KR101185973B1 (ko) * | 2010-08-23 | 2012-09-25 | 한국과학기술원 | 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 금속이온의 검출방법 및 이를 이용한 논리게이트 |
WO2013096817A2 (en) * | 2011-12-23 | 2013-06-27 | Abbott Point Of Care Inc | Integrated test device for optical detection of microarrays |
US20140066490A1 (en) * | 2012-08-14 | 2014-03-06 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | System and method for modifying deoxyribozymes |
US9476090B2 (en) * | 2013-05-21 | 2016-10-25 | Stc.Unm | Signal propagation biomolecules, devices and methods |
CN105866079B (zh) * | 2016-03-31 | 2019-07-05 | 同济大学 | 基于荧光染料nmm、g-四链体dna、冠醚和金属离子相互作用的分子逻辑门构建方法 |
CN106525940B (zh) * | 2016-11-28 | 2018-11-30 | 江南大学 | 基于g-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标dna浓度的电化学方法 |
CN107153875B (zh) * | 2017-04-11 | 2020-09-01 | 青岛科技大学 | 一种基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法 |
CN108486233B (zh) * | 2018-03-23 | 2021-03-30 | 江南大学 | 一种可视化检测转基因食品的方法 |
CN109680045A (zh) * | 2019-01-24 | 2019-04-26 | 台州学院 | 一种基于磁纳米球的可重置分子逻辑门的合成及应用 |
-
2019
- 2019-08-08 CN CN201910730194.3A patent/CN110426519B/zh active Active
- 2019-08-12 WO PCT/CN2019/100197 patent/WO2021022574A1/zh active Application Filing
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101408508A (zh) * | 2008-11-07 | 2009-04-15 | 浙江大学 | 5-(2-甲氧基-苯氧基)-2,2’-联嘧啶基-4,6-二酚的用途和使用方法 |
WO2013161964A1 (ja) * | 2012-04-27 | 2013-10-31 | キリンホールディングス株式会社 | リガンドを高感度に検出する核酸分子並びに該核酸分子のスクリーニング方法および該核酸分子の感度の最適化方法 |
CN105018474A (zh) * | 2014-08-22 | 2015-11-04 | 江苏省原子医学研究所 | 一种基于g-四链体-氯血红素dna酶的探针及其应用 |
CN109295167A (zh) * | 2018-11-09 | 2019-02-01 | 江南大学 | 基于雄激素受体识别元件和g-四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体的电化学方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Concatenated logic circuits based on a three-way DNA junction: a keypad-lock security system with visible readout and an automatic reset function.;Chen J et al.,;《Angew Chem Int Ed Engl.》;20150107;第54卷(第2期);全文 * |
Sensing of UO22+ and design of logic gates by the application of supramolecular constructs of ion-dependent DNAzymes.;Moshe M et al.,;《Nano Lett.》;20090331;第9卷(第3期);第1197-1199页 * |
基于氯化血红素对G-四链体/盐酸小檗碱复合物的竞争作用构建DNA逻辑门;高建帮;《西南大学学报(自然科学版)》;20161130;第38卷(第11期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110426519A (zh) | 2019-11-08 |
WO2021022574A1 (zh) | 2021-02-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mickert et al. | Measurement of sub-femtomolar concentrations of prostate-specific antigen through single-molecule counting with an upconversion-linked immunosorbent assay | |
KR101029343B1 (ko) | 면역분석 기반의 항원 검출용 키트 및 항원 검출 방법 | |
Liao et al. | An ultrasensitive ELISA method for the detection of procalcitonin based on magnetic beads and enzyme-antibody labeled gold nanoparticles | |
Powers et al. | Protein analytical assays for diagnosing, monitoring, and choosing treatment for cancer patients | |
JP2010512516A (ja) | 分析物の効率的かつ正確な検出のための材料および方法 | |
CN102353790B (zh) | 一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析方法 | |
CN111778315B (zh) | 基于发夹锁定脱氧核酶探针的金纳米颗粒传感器及其检测muc1的应用 | |
CN108802360B (zh) | 一种血清中可交换铜和铜蓝蛋白一步同时检测用试剂盒、制备方法及应用 | |
US9482616B2 (en) | Methods, kits and systems for signal amplification for bioassays using zinc nanoparticles | |
CN103513027A (zh) | 新型超灵敏性elisa方法的建立 | |
CN110426519B (zh) | 基于卵巢癌标志物和逻辑门运算筛查卵巢癌的方法 | |
CN110632040B (zh) | 一种血清中前列腺特异性抗原的分析方法 | |
WO2023116586A1 (zh) | Si-FITC比率型荧光纳米探针的合成方法及其在新冠病毒抗原检测中的应用 | |
CN114487421B (zh) | 一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用 | |
Liu et al. | Rapid FRET-based homogeneous immunoassay of procalcitonin using matched carbon dots labels | |
CN112098648B (zh) | 一种检测肝癌患者血清生物标志物的方法 | |
CN114739976A (zh) | 一种sers探针生物传感器及其制备方法和使用方法 | |
Jaradat et al. | Helicobacter pylori detection methods in complex samples: a mini-review | |
CN113834935A (zh) | 一种对癌胚抗原的检测方法 | |
CN111198271B (zh) | 一种用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒 | |
CN106093391A (zh) | 一种基于单线态氧通道发光量子点传感器 | |
CN113092754B (zh) | 一种基于免疫荧光和二维可视化多模式分析HIV p24抗原的检测产品及其应用 | |
CN107831152B (zh) | 三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法 | |
CN116990499B (zh) | MBs-ssDNA-hCG探针、试剂盒及其在检测IAP中的应用 | |
CN116930497B (zh) | 检测外泌体HER2膜蛋白和mRNA的试剂盒及其应用和检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |