CN102353790B

CN102353790B - 一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析方法

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Publication number: CN102353790B
Application number: CN201110174552.0A
Authority: CN
Inventors: 刘天才; 李明; 吴英松
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2011-06-25
Filing date: 2011-06-25
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2031-06-25
Also published as: CN102353790A

Abstract

本发明涉及生物分析化学分析领域，具体涉及一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析方法，该方法由以下步骤组成：(a)定量标准曲线制备：将HFRFA能量受体、HFRFA能量供体和甲胎蛋白标准品一起孵育，进行均相时间分辨荧光检测和分析，得到甲胎蛋白浓度与荧光值的标准曲线；(b)样品检测：将HFRFA能量受体、HFRFA能量供体和待测甲胎蛋白样品一起孵育，进行均相时间分辨荧光检测和分析，将检测样品得到的荧光值与步骤(a)得到的标准曲线比较计算待测甲胎蛋白样品浓度。本发明所述的方法具有特异性强和检测灵敏度高的优点，在临床分子诊断和食品检测等生物化学分析中具有非常重要的意义。

Description

一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析方法

技术领域

本发明属于生物分析化学、纳米生物技术领域，具体涉及生物物质的免疫测定法。

背景技术

人体甲胎蛋白（AFP）来源于胎儿的糖蛋白，分子量约为70KDa，成人的甲胎蛋白可由恶性肿瘤产生，特别是肝癌和胚胎细胞肿瘤，70-95%的原发性肝癌患者血清中AFP含量有明显升高，在肝炎和肝硬化的患者中甲胎蛋白也常有轻微的升高。

因此，对AFP的临床分子诊断显得十分重要，其中的最低灵敏度检测对及早发现肿瘤并制定治疗方案尤为重要。目前，测定AFP免疫检测方法较多，最常用的血清检测方法有：酶免疫法（EIA）、放射免疫法（RIA）、化学发光法以及时间分辨免疫荧光分析法（TRFIA）。其中，酶标法为半定量试剂，在准确性、灵敏度上存在很大的局限性，并且对于酶的活性极易受标记反应以及温度、pH值及溶液中离子浓度等因素的影响、线性范围窄、费事等缺点；放射性免疫法操作带放射性以及标志物放置时间短，试剂有效期较短等缺点；化学发光法的优点是灵敏度高、线性范围宽、分析时间短，但它的缺点：化学发光的产生通常是瞬间完成的，发光峰值很快衰减，而且成本较高；温度和pH值对发光有很大影响等，这些因素影响了该类方法的进一步使用。TRFIA以稀土离子作为标记物，具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点；但是，因为需要冲洗未标记物，操作较为繁琐，很难高通量化和微量化。

这些方法为非均相分析方法，虽然其检测性能也都能满足临床要求，但灵敏度相对依然较低。非均相分析方法一般是在一个固定的平台上反应，然后，通过冲洗的方法将游离而未参与免疫反应的标记物除去，然后检测剩余的有效标记物。伴有冲洗的方法，不仅可能破坏有效标记物，而致使灵敏度不高，不仅费事，操作也较为繁琐，很难高通量化、自动化和微量化。

而均相时间分辨荧光分析就可以克服这些缺点，分析操作简单，不需要洗涤分离游离标记物，分析速度快，易自动化等优点，在生物分析领域其应用越来越广泛。

现有均相时间分辨荧光分析（HTRFA）技术,能量供体与受体是一对一的分子相互作用形成能量转移，从而实现定性定量分析。其技术难题在于：一对一的分子能量共振能量转移(FRET)效率很低，供体的能量不能充分利用，其灵敏度受到一定的限制。导致FRET效率低下还有一个原因就是，目前这些分析方法用到的能量受体是荧光素（fluorescein）、青色素（cyanine,cy），亚历克撒染料（Alexa）,藻红蛋白(phycoerythrin，PE)或别藻红蛋白(allophycocyanin，APC)等有机染料。尽管有机染料已使用数十载，然而，众所周知，有机染料致命的缺点就是光谱的Stock位移比较短，荧光发射峰不对称且有明显拖尾，最致命的是抗光漂白性极差，使得基于荧光值分析测试方法的生物分析，尤其是HTRFA很不稳定，效率低下，间内和间外分析偏差较大。因此，有机染料并非HTRFA能量受体的最佳选择。另一方面，现有HTRFA技术得以实现归功于稀土金属螯合物的使用，一般的能量供体是稀土金属铕螯合物，要求能量受体发射近红外波（比如665nm），这需要昂贵的近红外敏感检测器件。即使使用铽螯合物，由于大多数有机染料荧光发射光谱宽而且有明显拖尾，与铽螯合物时间分辨荧光谱有较大重叠，仅适合在长波长或近红外波段进行分析，对昂贵的近红外敏感检测器要求依然存在。

因此，为弥补现有技术的不足，需改变现有技术能量配体一对一的方式，采用一个能量供体同时向数个能量受体同时进行时间分辨能量转移。更需要寻求一种具有新奇的光学特性的能量受体：其光谱的Stock位移比较宽，荧光发射峰对称且无明显拖尾，更重要的是抗光漂白性极强，而且该能量受体不依赖于昂贵的红敏检测器。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析方法，该方法特异性强和检测灵敏度高。

本发明解决上述问题采用的技术方案是，

一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析方法，该方法由以下步骤组成：

（a）定量标准曲线制备：将HTRFA能量受体、HTRFA能量供体和甲胎蛋白标准品一起孵育，进行均相时间分辨荧光检测和分析，得到甲胎蛋白浓度与荧光值的标准曲线；

（b）样品检测：将HTRFA能量受体、HTRFA能量供体和待测甲胎蛋白样品一起孵育，进行均相时间分辨荧光检测和分析，将检测样品得到的荧光值与步骤（a）得到的标准曲线比较计算待测甲胎蛋白样品浓度；

其中，

所述的HTRFA能量受体由以下方法制备得到：

（Ⅰ）将水溶性量子点、物质的量为水溶性量子点0.02倍的三辛基膦和聚苯乙烯-二乙烯基苯羧酸纳米乳胶球加入热溶胀剂中，用0.1MNaOH调整溶液pH为9，其中水溶性量子点浓度为0.25μM，聚苯乙烯-二乙烯基苯羧酸纳米乳胶球浓度为2mg/mL；在105度下反应30min，冷却到室温，离心沉淀分离得到量子点纳米乳胶球；所述的热溶胀剂由苯甲醇，乙二醇和水组成，三者之间的体积比为苯甲醇：乙二醇：水=1：1.4：0.15；

（Ⅱ）将分子量为100kDa的氨基化葡聚糖水溶胶在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐作用下与量子点纳米乳胶球偶联，透析分离，得到量子点纳米水溶胶；

（Ⅲ）在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐作用下将量子点纳米水溶胶与甲胎蛋白抗原的单克隆抗体E010偶联，得到HTRFA能量受体；

所述的HTRFA能量供体由以下方法制备得到：将稀土金属铽螯合物与待测抗原的单克隆抗体E014偶联，得到HTRFA能量供体。

本发明所述的水溶性量子点是本领域常用的水溶性量子点，可以依据本领域常用的方法制备得到。本发明推荐的制备方法是：将巯基丁二酸和油溶性量子点按照摩尔比为1000:15加入三氯甲烷中，混合均匀后加入氢氧化钠调整pH为9，室温反应2小时；反应结束后加入去离子水和丙酮，沉淀，离心，即得到水溶性量子点。

本发明所述的油溶性量子点可以是硒化镉、硫化镉或碲化镉为核的各种半导体纳米晶体，其发射波长为525nm，565nm，605nm或者635nm，其中以美国Invitrogen公司的核壳型硒化镉/硫化锌量子点为最好。

本发明所述的CPs纳米乳胶是Thermo Fisher Scientific公司的聚苯乙烯-二乙烯基苯羧酸改性胶乳。

HTRFA是稀土螯合物，其优异的时间分辨荧光性质结合量子点的抗光漂白性及其特异性光学性质，大大提高了能转移效率，克服了水溶胶表面基团对能量转移的空间障碍；同时，因为纳米水溶胶表面有多个稀土螯合物同时向量子点进行能量转移，大大提高了检测的灵敏度。

本发明所述的功能量子点纳米水溶胶的均相时间分辨分析方法是一种利用时间分辨荧光共振能量转移原理进行的免疫分析血清中的甲胎蛋白抗原的分析方法，在该分析方法中，采用双抗体夹心一步法，将能量受体与供体偶联到抗原的两个单克隆抗体上，借助抗体与抗原的免疫反应，将能量受体与供体靠近，当受体的激发波谱与供体的发射波谱有较大重叠时，即可发生时间分辨荧光共振能量转移（HTR-FRET）。根据荧光共振能量转移原理，本发明使用到的稀土铽金属螯合物与量子点之间发生能量转移的佛斯特距离（

）为:

R_{0} = \frac{900 (in 10) κ^{2} Q_{D}}{128 π^{5} N n^{4}} {&Integral;}_{0}^{\infty} F_{D} (λ) ϵ_{A} (λ) λ^{4} dλ

其中，Q_D为能量供体荧光量子产率；N为阿弗加德罗常数；n为折射率；κ²为能量供体和受体动力学运动系数，一般情况下值为2/3；F_D(λ)和ε_A(λ)分别为能量供体荧光发射谱和能量受体的摩尔激发光谱，λ为波长。本发明能量供体为稀土金属铽螯合物，其量子产率为46%，结合其时间分辨荧光发射光谱与能量受体量子点纳米乳胶球的摩尔激发光谱，计算出R₀=7.4nm；而荧光共振能量转移效率其中r为能量供体与受体的空间距离。发生时间分辨荧光能量转移效率E具有实际意义，其值应满足0.015<E<0.985。此时，能量供体与能量受体距离r应为：3.7nm<r<14.8nm，即0.5R₀<r<2R₀。因此，在空间结构上，本发明所用到的铽螯合物与量子点纳米水溶胶之间，在理论上满足时间分辨荧光能量转移的条件。

由于红色量子点纳米水溶胶（QPs，荧光发射峰605nm，量子产率为48%）的摩尔激发光谱与稀土金属铽螯合物（Lan，时间分辨荧光发射峰545nm，量子产率为46%）的发射光谱有较大重叠，QDs和Lan分别作为能量转移的受体与供体，并标记上抗甲胎蛋白的两个单克隆抗体E010和E014，形成QPs-E010和Lan-E014偶联物，因此，两单克隆抗AFP抗体E010和E014与AFP抗原发生免疫反应后，能量供体与受体被拉近，将触发时间分辨荧光能量转移。当两单克隆抗体较抗原AFP大大过量时，检测到的荧光共振能量转移信号将与抗原的量成比例关系。

为了提高检测信号的灵敏度，避免检测环境（比如检测液的体积和光源）带来的误差，本发明采用比例法，将量子点纳米水溶胶QPs-E010在605nm处的荧光强度F₆₀₅与Lan-E014在545nm处的时间分辨荧光强度F₅₄₅相比，得到R_F605/F545,再乘以比例因子10⁴而得到R。当两单克隆抗体较标准品甲胎蛋白大大过量时，在各标准点检测到的荧光能量转移信号将与抗原的量成比例关系，分别将荧光能量转移信号和抗原浓度取对数，做出双对数曲线图，二者将成线性相关性。

本发明方法具有操作简单、可重复性高等优点，创造性地制备多功能量子点纳米水溶胶。该量子点水溶胶具有水溶性好、尺寸分布均匀、量子产率高等优点，提高了分析的稳定性和灵敏度，也克服了非特异性吸附等问题，作为能量转移受体，在均相时间分辨荧光分析中得到了充分展现。以多功能量子点纳米水溶胶作为能量受体的新型均相时间分辨荧光分析方法，不仅可提高能量转移效率进而提高了灵敏度，还可以减少对昂贵红敏光子探测器的依赖，在临床分子诊断和食品检测等生物化学分析中具有非常重要的意义。

附图说明

图1是QPs纳米水溶胶功能化前后的粒径分布图；

图2是量子点纳米水溶胶的摩尔激发光谱与铽螯合物时间分辨荧光发射波谱图；

图3是标准品浓度与荧光值双对数关系曲线。

具体实施方式

实施例1

实验材料

油溶性量子点购自Invitrogen公司，其货号为Q21701MP，浓度为1uM。

能量供体LanthScreen氨基标记试剂盒购自Invitrogen公司，其货号为PV3582。

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDAC）以及三辛基氧膦等化学试剂均购自美国Sigma-Aldrich公司。

甲胎蛋白单克隆抗体E010及E014和甲胎蛋白抗原标准品（含有六个样本，标签为A、B、C、D、E、F，其浓度分别为0、2、10、50、200、800U/ml，各样本所在缓冲体系为：1.5％BSA、0.15％NaN₃的50mMTris-HCl,pH7.2缓冲液）购自中山大学达安基因公司。

聚苯乙烯-二乙烯基苯羧酸改性胶乳购自Thermo Fisher Scientific公司，其货号为8300-0520100390。胶乳的粒径205±3nm nm，质量浓度为100mg/ml,含10%乳胶球。

2-(N-啉)乙磺酸缓冲液浓度为50mM，pH为6。

1.高性能水溶性量子点的制备

1.1制备巯基丁二酸为配体的水溶性量子点，其步骤如下：取50ul油溶性量子点，加入200ul的无水甲醇，混合均匀，在3000rpm转速和4摄氏度下离心5min；弃掉上清液，加入50ul三氯甲烷和25mg巯基丁二酸，用0.1M的氢氧化钠水溶液调整pH为9；室温下反应3小时；加入100ul去离子水和1.8ml丙酮，在6000rpm转速下离心分离5min，得到水溶性量子点；将水溶性量子点溶解于0.2ml的去离子水中，待用。

1.2水溶性量子点性能

水溶性量子点使用荧光分光光度计（LS-55,Perkin-Elmer,USA）分析其发射波谱，其荧光发射峰605nm。

2.量子点纳米乳胶球的制备

2.1量子点纳米乳胶球的制备步骤如下：将2mg的三辛基氧膦和步骤1制备的水溶性量子点混合均匀后，加入2ml苯甲醇、2.8ml乙二醇、100ul去离子水和CPs纳米乳胶，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整溶液pH为9；在105℃下剧烈搅拌15分钟；冷却至室温，以12000rpm的速度离心沉淀25分钟；去上清液，将沉淀溶解于200ul的2-(N-啉)乙磺酸缓冲液中(MES,50mM，pH6)；得到量子点纳米乳胶球。

其中CPs纳米乳胶由以下方法制备：将100ul纳米乳胶球（粒径205±3nm nm，质量浓度为100mg/ml,含10%乳胶球）于14000rmp，4摄氏度离心4min；弃去上清液，将沉淀物溶解于100ul去离子水中得到CPs纳米乳胶；

2.2量子点纳米乳胶球尺寸分布如图1所示，四方形和三角形实线分别表示包被量子点前后的纳米乳胶球尺寸分布情况。

3.量子点纳米水溶胶的制备

量子点纳米乳胶球水溶胶的制备方法如下：称取10mg氨基葡聚糖溶解于100ul的缓冲液MES中，用1M盐酸调整pH为6.0；加入步骤2制备的量子点乳胶球，混合均匀；加入300uL的EDAC溶液（80mg/ml）和1.4ml的2-(N-啉)乙磺酸缓冲液中，室温下持续搅拌2小时；加1mM的乙醇胺700ul，孵育30min；在17000rmp转速下离心，弃掉上清液，将沉淀物溶解于20ul去离子水中，超声处理；重复以上步骤三次，最后得到量子点纳米水溶胶。

4.HTRFA能量受体的制备

4.1HTRFA能量受体的制备方法如下：

（a）在步骤3制备的量子点纳米水溶胶中加入2-(N-啉)乙磺酸缓冲液100ul，50mg/ml的NHS溶液230ul，50mg/ml的EDAC溶液240ul和去离子水430ul，混合均匀后室温下反应30min；离心分离，除去未反应的NHS和EDAC，使用去离子水洗涤，重悬，离心，重复三次，得到量子点水溶胶，调整溶液体积为1ml，质量浓度为1%；

（b）取500ul上述制备的量子点水溶胶，加入浓度为1mg/mL的单克隆抗体E010500ul，室温下孵育2小时后，加入1.5ul乙胺醇，再在室温下孵育30分钟；离心洗涤除去未偶联的蛋白质和乙胺醇，加入1ml的50mM的磷酸缓冲液，得到HTRFA能量受体，调整浓度为10mg/ml。

4.2HTRFA能量受体性能

HTRFA能量受体的摩尔激发光谱如图2左侧红曲线所示。

5.HTRFA能量供体的制备

使用LanthScan试剂盒，按照标准操作方法说明书，将稀土金属铽螯合物（时间分辨荧光波谱图如图2右侧绿色曲线所示，主峰位置为545nm）标记抗甲胎蛋白单克隆抗体E014得到25ug/ml的HTRFA能量供体（50mM Na₂CO₃,pH9.0溶液）；

6.标准曲线制备

（a）在96孔板上选取孔A1-A6分别加入1.5ul的HTRFA能量受体和1ulHTRFA能量供体；在以上A1-A6孔中分别加入25ul浓度分别为0、2、10、50、200、800U/ml的甲胎蛋白（1.5％BSA、0.15％NaN₃的50mMTris-HCl,pH7.2缓冲液），稀释到200ul，25℃振荡孵育2h，以上各孔均做复孔；

（b）在1420VICTOR²Multilabel Plate Reader（美国Perkin Elmer公司）上进行时间分辨荧光检测，检测条件为：延迟时间500us，门控时间1400us,采集次数2000次，激发波长340nm，带宽10nm；发射波长545nm,带宽8nm，第二发射波长605nm，带宽8nm；制作标准曲线。

得到的均相时间分辨免疫荧光值如下表所示，标准品浓度与荧光值双对数关系如图3所示,线性相关系数为0.998。回归方程Y=-3.410logX+45.10。

在进行以上检测之后的两小时内，每隔10分钟进行相同的荧光检测。所有样品的结果显示，使用基于量子点水溶胶抗光漂白性极强，HTRFA荧光值无明显变化，标准品浓度与荧光值双对数关系图几乎重叠。

7.特异性验证

用CA50、CA242、CA15-3、CA199、CA125、tPSA、人血清白蛋白等系列浓度标准品做AFP样品交叉反应检测，结果均无交叉反应。

8.检测下限

以零参考标准品（A点）作为标本重复测量20次，计算其荧光均值x及标准差SD，x+2SD所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出其灵敏度，即检测AFP的最低检测下限为0.1U/ml。

以上所述为本发明的关键技术方法所在，但本发明和发明方法不应该仅局限于该实例所公开的内容；凡是在不脱离本发明所公开的技术方法下完成的等效实验或者修改实验，都应落入本发明保护的范围。

实施例2

1.待测标本制备

待测样本分为两个，其中一个使用甲胎蛋白标准品C和D中各取25ul和55ul，混合均匀制得理论上应该为（10×25+50×55）/80=37.5U/ml，总体积为80ul,标记为G。另一个待测样本为南方医院捐赠的甲胎蛋白抗原血清，浓度未知，标记为H。

2.试验方法

2.1利用本发明方法检测

（a）采用一步夹心法，在96孔板上选取孔A1-A8分别加入1.5ul的HTRFA能量受体和1ulHTRFA能量供体；在以上A1-A8孔中分别加入25ul浓度分别为甲胎蛋白抗原标准品ABCDEF以及待测样本G和H，稀释到200ul；25℃振荡孵育2h；

（b）在1420VICTOR²Multilabel Plate Reader（美国Perkin Elmer公司）上进行时间分辨荧光检测，检测条件为：延迟时间500us，门控时间1400us,采集次数2000次，激发波长340nm，带宽10nm；发射波长545nm,带宽8nm，第二发射波长605nm，带宽8nm；

（c）由ABCDEF制作标准曲线，并由此根据G和H两待测样本的荧光值数据处理后，得到其浓度分别为37.3和89.3U/ml。

2.2利用TRFIA法检测

（a）参照市售AFP试剂盒的说明书操作，采用一步夹心法，在包被有抗AFP单克隆抗体的96孔微孔板上，每孔加入25μl AFP参考标准品或待测样G和H，再加入200μl稀释好的Eu³⁺-AFP单克隆抗体的混合物，25℃振荡孵育2h；

（b）然后，洗涤6次，每孔再加增强液稀释到200μl；

（c）25℃振荡反应5min，进行荧光检测，检测过程在1420VICTOR²Multilabel PlateReader上完成；

（d）由ABCDEF制作标准曲线，得到AFP的最低检测极限为0.3U/ml,并由此根据G和H两待测样本的荧光值数据处理后，其浓度分别为37.9和88.7U/ml。

3.对比结论

对比试验表明，与市售（某公司）的最新检测方法相比，本发明的检测下限更低，能达到0.1U/ml；对已知浓度待测样品的检测也更接近理论值，而对未知浓度的检测也有一定的差异。本发明的另一个最大的优势是省去了繁琐的洗涤过程，并且不受所谓的增强液的影响，因而其稳定性更强，更易自动化、微量化和高通量化。

Claims

1.一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析（HTRFA）方法，该方法由以下步骤组成：

其中，

所述的HTRFA能量受体由以下方法制备得到：

2.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析方法，其特征在于，所述的水溶性量子点由以下方法制备得到：将巯基丁二酸和Invitrogen公司的核/壳型硒化镉/硫化锌量子点按照摩尔比为1000:15加入三氯甲烷中，混合均匀后加入氢氧化钠调整pH为9，室温反应2小时；反应结束后加入去离子水和丙酮，沉淀，离心，即得。