CN104745727B - 一种基于双重信号扩增的探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于双重信号扩增的探针，所述探针包括第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹。本发明的探针检测成本低、检测简单快捷，具有高灵敏度、低背景噪声，以及良好的特异性。可适用于多种DNA分子的检测。

Description

一种基于双重信号扩增的探针及其应用

技术领域

本发明属于分子生物信息学领域，具体涉及一种基于双重信号扩增的探针及其检测DNA分子的方法。

背景技术

DNA检测(也称为基因检测)在由病毒引起的传染病的诊断、监测和治疗方面是非常重要的，例如肝炎病毒、疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头状瘤病毒以及与基因突变相关联的其他疾病。以HIV为例，传统的确定HIV感染的方法是血液检测，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶免疫测定(EIA)和韦斯顿吸墨试验。这些检测方法虽然很灵敏，但需要很长的时间来产生抗体，因此相当的耗时。有别于血液检测，DNA检测是直接检测病毒本身而不需要HIV抗体的，因此，一旦病人感染上HIV病毒就可以被实时检测出来。目前，在DNA检测中，聚合酶链反应(PCR)依然是一个金标准，但是，聚合酶链反应需要蛋白酶和热循环来触发扩增，因此，具有高成本、耗时长、选择性低、受限于耐热酶和实验室设备等缺点。

脱氧核酶(DNA酶)属于催化核酸的一类物质，通过体外选择被分离出来，具有对特定底物的高催化活性、较好的热稳定性，可以多次变性复性而不丢失催化活性、将DNA功能和结构信息编入模板序列的灵活性，以及属于核酸低的非特异结合性等优点，是生物应用中理想的信号扩增的生物催化剂。在DNA酶领域，G-四链体-氯血红素DNA酶的发现引起了广泛的关注。G-四链体序列可以结合辅助因子--氯化血红素，形成仿过氧化物酶DNA酶，进而将H₂O₂介导的2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS^2-)催化氧化成绿色的ABTS^·-，或提高鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光。基于该原理，G-四链体-氯血红素DNA酶已被开发出了许多比色、化学发光或荧光的传感平台。

例如，中国专利文献CN102827836A公开了一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法，上述探针为基于靶分子设计的具有粘性末端的DNA一对发夹序列，实质是杂交链式反应的发夹序列与G-四链体序列相结合的产物。当反应体系中不存在靶分子时，两个发夹序列保持亚稳态的发夹结构；当反应体系中存在靶分子时，靶分子便可与第一个发夹序列特异性结合，破坏其二级结构并释放剩余的G-四链体序列，第一个发夹释放的自由的G-四链体序列可与第二个发夹序列杂交，破坏第二个发夹并释放出与靶分子具有相同作用的核酸序列，也可与第一个发夹的靶分子特异性识别部分特异性结合，从而导致两个发夹级联杂交，如此周而复始，最终形成类似双链DNA的大分子聚合物，被释放的大量自由的G-四链体序列即可与氯化血红素(hemin)结合，催化氧化H₂O₂介导的ABTS，从而检测靶分子。但是上述探针检测靶分子时，存在背景噪声较大、灵敏度较差的问题。具体而言，在反应体系中，发夹结构与未形成发夹结构的直链是保持动态平衡的，直链未形成闭合的环而被保护，导致G-四链体序列并不全是靶分子打开第一个发夹而释放、进而与第二个发夹杂交形成的，也有部分是直链的序列与第二个发夹直接杂交，从而形成自由的G-四链体序列的，因此无法实现较为灵敏的检测。

鉴于此，目前亟待提出一种操作简单、成本低同时具有高灵敏度的检测DNA的探针。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是现有技术中的DNA分子检测探针的高成本、耗时长、选择性低、受限于检测条件的问题，进而提供一种检测成本低、检测简单快捷的DNA分子检测探针。

本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针灵敏度低、背景噪声大，进而提供一种高灵敏度、低背景噪声的基于双重信号扩增的探针。

本发明的基于双重信号扩增的探针，所述探针包括第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹、第四发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区。

所述第一发夹包括：可特异性识别目标DNA的识别区、使所述第一发夹与第二发夹形成双链体的第一碱基互补区；

所述第二发夹包括：与所述第一发夹的所述识别区部分杂交的第二碱基互补区、与所述第一发夹的所述第一碱基互补区部分杂交的第三碱基互补区，以及与所述第三发夹部分杂交的第四碱基互补区；

所述第三发夹包括：与所述第二发夹的所述第四碱基互补区部分杂交的第五碱基互补区、与所述第四发夹部分杂交的第六碱基互补区，以及第一G-四链体序列区；

所述第四发夹包括：与所述第三发夹的所述第五碱基互补区部分杂交的第七碱基互补区、与所述第三发夹的所述第六碱基互补区部分杂交的第八碱基互补区，以及第二G-四链体序列区。

发夹结构是指，DNA单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而形成的结构。本发明中，所述第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹的环状区是指，在发夹结构中，未形成双链结构的、回折的部分。所述茎干区是指，形成双链结构的部分。

进一步地，所述第一G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区以及G-四链体序列的1/4段序列区组成；所述第二G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区以及G-四链体序列的1/4段序列区组成。

进一步地，所述第三发夹的一端部为所述第一G-四链体序列区的所述G-四链体序列的3/4段序列区、并依次连接有所述第六碱基互补区、第五碱基互补区、以及设置在另一端的所述第一G-四链体序列区的所述G-四链体序列的1/4段序列；

所述第四发夹的一端部为所述第二G-四链体序列区的所述G-四链体序列的3/4段序列区、并依次连接有第七碱基互补区、第八碱基互补区、以及设置在另一端的所述第二G-四链体序列区的所述G-四链体序列的1/4段序列。

所述第三发夹的第一G-四链体序列区的G-四链体序列的3/4段序列区具有如SEQID No.1所示的序列结构，序列SEQ ID No.1为：5’-AGG GCG GGT GGG T-3’；G-四链体序列的1/4段序列区具有如SEQ ID No.2所示的序列结构，序列SEQ ID No.2为：5’-T GGG T-3’；

所述第四发夹的第二G-四链体序列区的G-四链体序列的3/4段序列区具有如SEQID No.3所示的序列结构，序列SEQ ID No.3为：5’-TGG GT-3’；G-四链体序列的1/4段序列区具有如SEQ ID No.4所示的序列结构，序列SEQ ID No.4为：5’-TGG GTA GGG CGG G-3’。

所述第三发夹的G-四链体序列的3/4段序列区位于发夹结构的茎干区，并与所述第五碱基互补区部分杂交；

所述第四发夹的G-四链体序列的3/4段序列区位于发夹结构的茎干区，并与所述第八碱基互补区部分杂交。

所述第一发夹具有如SEQ ID No.5所示的序列结构，序列SEQ ID No.5为：5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGAAGAAGGTGTACTGCTAGAGATTT-3’；所述第二发夹具有如SEQ IDNo.6所示的序列结构，序列SEQ ID No.6为：5’-TAG CAG TAC ACC TTC TTC TAC TGC TAGAGA TTTAGA AGA AGG TGT TTA AGT A-3’；所述第三发夹具有如SEQ ID No.7所示的序列结构，序列SEQ ID No.7为：5’-AGG GCG GGT GGG TGT TTA AGT TGG AGA ATT GTA CTT AAACAC CTT CTTCTT GGG T-3’；所述第四发夹具有如SEQ ID No.8所示的序列结构，序列SEQID No.8为：5’-TGG GTC AAT TCT CCA ACT TAA ACT AGA AGA AGG TGT TTA AGT TGG GTAGGG CGG G-3’。

本发明的检测DNA分子的方法，为利用本发明所述的基于双重信号扩增的探针进行荧光检测。

所述方法包括以下步骤：将所述的基于双重信号扩增的探针置于待测溶液中，25-40℃下培育1-3h，然后向其中加入氯化血红素培育，并加入2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐以及过氧化氢混匀反应，观察或检测混合液的发光或变色情况。

本发明所述的基于双重信号扩增的探针在检测DNA分子领域的用途。

进一步地，所述DNA分子为HIV病毒DNA。

本发明所述的基于双重信号扩增的探针的原理如下：反应体系中，四个发夹结构(第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹)彼此共存，保持稳定的发夹构象，呈现低背景。当所述第一发夹的识别区与目标DNA结合后，第一发夹打开，第一碱基互补区以单链形式被释放出来，进而与第二发夹的第三碱基互补区杂交，由于复合物第一发夹-第二发夹比复合物第一发夹-目标DNA更稳定，因此目标DNA被第二发夹通过类似DNA分支迁移的过程替换，分离出来的目标DNA又可以与新的第一发夹结合，从而引发目标DNA的循环扩增；留下的第一发夹-第二发夹双链体的触发第三发夹打开，第一发夹-第二发夹双链体的第四碱基互补区与第三发夹的第五碱基互补区进行杂交，生成复合物第一发夹-第二发夹-第三发夹，第三发夹的打开释放出第六碱基互补区以及第一G-四链体序列区的3/4段序列区，第六碱基互补区与第四发夹的第八碱基互补区杂交，打开第四发夹，生成复合物第一发夹-第二发夹-第三发夹-第四发夹，该复合物暴露的第七碱基互补区继续与第三发夹的第五碱基互补区发生链式杂交反应，由此两个裂分的G-四链体片段自组装为一个完整的G-四链体结构；在自动的十字交叉打开第三发夹、第四发夹的过程中，链杂交反应不断重复，产生大量的裂分G-四链体结构，在氯化血红素存在下，形成具有催化活性的仿过氧化物酶的G-四链体-氯血红素DNA酶，通过H₂O₂将ABTS^2-催化氧化成绿色的ABTS^·-。

本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明的基于双重信号扩增的探针，巧妙的设计出所述第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹，经目标DNA触发，形成两个独立的循环反应，使检测目标DNA时发生双重信号扩增，显著的增强了信号，大大提高了检测目标DNA的灵敏度，检测限可降低至76fM，能够区分完全匹配的目标DNA和错配的DNA，具有优越的特异性，可满足多种DNA序列的检测要求；

(2)本发明所述第三发夹与第四发夹在两端部连接3/4或1/4的G-四链体序列，并将端部的3/4的G-四链体序列与茎干区部分杂交，使部分G-四链体序列被保护，有效的阻止了G-四链体-氯血红素DNA酶的自组装，即使在反应体系中存在直链的、未被保护G-四链体序列，不完整的3/4或1/4的G-四链体序列也很难形成G-四链体结构，在反应体系中不存在目标DNA时，保持发夹结构，所述第三发夹、第四发夹也无法与第一发夹、第二发夹发生反应，在该应体系中四种发夹结构均保持稳定的状态，不产生信号；只有当目标DNA存在时，才会触发所述第一发夹打开，进而打开所述第二发夹、所述第三发夹，从而形成G-四链体-氯血红素DNA酶、产生信号。有效的防止了假阳性信号的产生，大大减小了背景噪声，极大的提升了检测的灵敏度；

因此，上述探针不仅具有良好的特异性，并且检测DNA分子的整个反应可以在等温、均一的溶液中进行，大大的简化了检测DNA分子、乃至微量DNA、DNA是否存在基因突变等的检测操作，无需加入过多的外源试剂、无需复杂耗时的热循环反应，操作简单、方便；

与此同时，相较于现有技术中常用的生物探针需进行荧光素、淬灭剂等的化学修饰、标记或者需要使用蛋白质酶导致的生产成本较高，本发明的探针无需标记、修饰，也不涉及蛋白质酶，其制备成本低，四个发夹结构的合成、制备也较为简单。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为实施例1的基于双重信号扩增的探针的检测原理示意图；其中，图中附图标记表示为：Ⅰ-识别区；Ⅱ-第一碱基互补区；Ⅰ’-第二碱基互补区；Ⅱ’-第三碱基互补区；Ⅲ-第四碱基互补区；Ⅲ’-第五碱基互补区；Ⅳ-第六碱基互补区；Ⅲ”-第七碱基互补区；Ⅳ’-第八碱基互补区；Ⅴ-第一G-四链体序列区的3/4段序列区；Ⅵ-第一G-四链体序列区的1/4段序列区；Ⅴ’-第二G-四链体序列区的3/4段序列区；Ⅵ’-第二G-四链体序列区的1/4段序列区。

图2为实施例2中检测的吸收强度与目标DNA浓度之间的变化关系图；

图3为实施例2中检测的吸收强度与目标DNA浓度之间的指数曲线图；

图4；实施例3的测定法的原理图；

图5为实施例3中对传感系统的比色反应进行检测的结果示意图；

图6为实施例4中的吸光度检测结果图；

图7为实施例5中的吸光度检测结果图；

图8为实施例6中的吸光度检测结果图；

图9为实施例7中的吸光度检测结果图。

具体实施方式

实施例1：用于检测HIV病毒DNA分子的基于双重信号扩增的探针的设计

本实施例中，所述的基于双重信号扩增的探针包括：第一发夹H1、第二发夹H2、第三发夹H3、第四发夹H4；所述第一发夹H1、第二发夹H2以及第三发夹H3、第四发夹H4均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区；各组成序列如下表所示。待检测的目标DNA分子为HIV病毒DNA分子，具有如下序列：

5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’。

表1基于双重信号扩增的探针序列

所述第一发夹H1包括：可特异性识别目标DNA的识别区Ⅰ、使所述第一发夹与第二发夹形成双链体的第一碱基互补区Ⅱ；

所述第二发夹H2包括：与所述第一发夹的所述识别区Ⅰ部分杂交的第二碱基互补区Ⅰ’、与所述第一发夹的所述第一碱基互补区Ⅱ部分杂交的第三碱基互补区Ⅱ’，以及与所述第三发夹部分杂交的第四碱基互补区Ⅲ；

所述第三发夹H3包括：与所述第二发夹的所述第四碱基互补区Ⅲ部分杂交的第五碱基互补区Ⅲ’、与所述第四发夹部分杂交的第六碱基互补区Ⅳ，以及第一G-四链体序列区；所述第一G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ)以及G-四链体序列的1/4段序列区(Ⅵ)组成；

所述第四发夹H4包括：与所述第三发夹的所述第五碱基互补区Ⅲ’部分杂交的第七碱基互补区Ⅲ”、与所述第三发夹的所述第六碱基互补区Ⅳ部分杂交的第八碱基互补区Ⅳ’，以及第二G-四链体序列区；所述第二G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ’)以及G-四链体序列的1/4段序列区(Ⅵ’)组成。

其检测原理如图1所示为：

第一扩增反应：

(1)反应体系中，所述第一发夹H1的识别区Ⅰ识别目标DNA,(以下简称T)，并与之结合，使所述第一发夹H1打开，形成复合物H1-T，识别区Ⅰ的剩余部分第一碱基互补区Ⅱ以单链形式被释放出来；

(2)被释放的所述识别区Ⅰ的剩余部分第一碱基互补区Ⅱ与第二发夹H2的第三碱基互补区Ⅱ’杂交；

(3)由于复合物H1-H2比复合物H1-T更稳定，因此目标DNA被第二发夹通过类似DNA分支迁移的过程替换；

(4)分离出来的目标DNA又可以与新的第一发夹结合，从而引发目标DNA的循环扩增；因此，每份目标DNA可以触发第一发夹H1和第二发夹H2之间的多个自组装反应；

第二扩增反应：

(5)H1-H2双链体可作为引物触发第三发夹H3和第四发夹H4间的链式杂交反应，可与所述第三发夹H3的第四碱基互补区Ⅲ杂交，打开所述第三发夹，释放出第六碱基互补区Ⅳ以及受保护的第一G-四链体序列区的3/4段序列区Ⅴ，形成结构a；

(6)结构a中释放出的第六碱基互补区Ⅳ与第四发夹的第八碱基互补区Ⅳ’杂交，打开了第四发夹，释放出第七碱基互补区Ⅲ”，以及受保护的第二G-四链体序列区的3/4段序列区Ⅴ’，形成结构b；

(7)结构b中被释放出的第七碱基互补区Ⅲ”则可自由地结合新的第三发夹H3，进行十字交叉杂交反应，从而使第三发夹H3的两个裂分G-四链体片段(第一G-四链体序列区的3/4段序列区Ⅴ与1/4段序列区Ⅵ)自组装成一个完整的G-四链体结构；

(8)在第三发夹H3与第四发夹H4自发十字交叉打开的过程中，链式杂交反应连续不断地反复发生，并释放处更多的G-四链体序列；

(9)被释放的G-四链体可与氯化血红素相互作用，形成具有催化活性的仿过氧化物酶的G-四链体-氯血红素DNA酶，通过H₂O₂将ABTS^2-催化氧化成绿色的ABTS^·-。

本实施例中使用的寡核苷酸购于南京金斯瑞生物科技有限公司(Genscript公司)，为PAGE纯，用20mM(M代表mol/L,下同)的Tris-HCl缓冲液(200mMNaCl,2mM MgCl₂,20mMKCl，pH＝7.4)稀释成100μM的储备液，人工合成上述第一发夹H1、第二发夹H2、第三发夹H3、第四发夹H4。

实施例2：基于双重信号扩增的探针对不同浓度的目标DNA分子的检测

本实施例中使用的氯化血红素、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、过氧化氢购买于Aladdin试剂公司(上海，中国)，其它化学试剂购买于国药集团化学试剂有限公司(上海，中国)，上述材料的各市售型号的产品之间效果并无差异。配制溶液均使用电阻率为18MΩcm的Milli-Q纯化系统(比尔里卡，马萨诸塞州，美国)制备的重蒸水。

对实施例1中的目标DNA的检测包括以下步骤：

首先，取所述第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹的溶液，加热至95℃，保持5min，再缓慢降至室温，备用。取10ml二甲亚砜(DMSO)以及6.5mg氯化血红素，配制1mM的氯化血红素溶液，并在-20℃下储存于暗处，备用。配制4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液待用，该缓冲液包括：25mM的HEPES，200mM的NaCl，20mM的KCl，1v％的DMSO，pH值为7.4。

配制Tris-HCl缓冲液待用，该缓冲液包括：20mM的Tris-HCl，100mM的NaCl，25mM的KCl，2mM的MgCl₂，pH值为7.4。取目标DNA用上述Tris-HCl缓冲液稀释至目标DNA分子的浓度为0.1pM(即pmol/L，下同)、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、1μM的溶液，以及未加入目标DNA的缓冲液，作为待测溶液。

分别取实施例1中的浓度为0.25μM的所述第一发夹溶液、浓度为0.25μM的所述第二发夹溶液、浓度为1.25μM的所述第三发夹溶液、浓度为1.25μM的所述第四发夹溶液各20μL，置于体积为10μL的待测溶液中，将反应混合液在37℃下培育90min，再向其中加入80μL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液进行稀释，继续向其中加入10μL浓度为10μM的氯化血红素溶液，室温培育60min，最后加入10μL浓度为40mM的ABTS溶液以及10μL浓度为40mM的H₂O₂，培育5min，即可测定。

取上述混合液作为样品，置于SpectraMax M5e多功能酶标仪上进行吸光度的检测，溶液的吸收光谱测定波长范围为390-480nm，步径2nm。吸收光谱的测定结果如图2、3所示。图2显示的是吸收强度与目标DNA浓度之间的变化关系。图2中，曲线a为目标DNA浓度为0的混合液、曲线b为目标DNA浓度为0.1pM的混合液、曲线c为目标DNA浓度为1pM的混合液，依次类推，10pM(曲线d)、100pM(曲线e)、1nM(曲线f)、10nM(曲线g)、100nM(曲线h)、1μM(曲线i)。

由图2显示的检测结果可知，对不同浓度的目标DNA进行吸收光谱检测，随着目标DNA浓度的增加，产生了大量的裂分G-四链体/氯化血红素DNA酶，导致了相应的吸收强度的增加。图3显示的是吸收强度与目标DNA浓度(0.1pM到1μΜ)之间的指数曲线。值得注意的是，在对数图上(图3中的插图)，吸收强度和目标DNA的浓度间呈现出很好的线性关系，浓度从0.1pM到1μΜ跨越7个数量级。线性回归方程为A＝0.49467+0.07316log₁₀C，线性相关系数为0.9946，A和C分别代表吸收强度和目标DNA的浓度。该传感系统的检测限为76fM，此检测限比之前报道的基于二次循环扩增策略的HIV病毒的DNA分子检测方法的检测限(0.67pM)(Zhou et al.,2014)高出一个数量级。另外，我们的方法与基于荧光聚合酶链反应(Jangamn et al.,2013)或电化学酶联免疫吸附试验(Bhhmji et al.,2013)相比，在HIV的诊断上更加经济方便。该传感系统如此高的灵敏性主要归功于基于目标催化发夹自组装耦合杂交链式反应的双重信号扩增策略的高扩增效果。

因此，本发明的方法不仅操作简单，且具有优越的灵敏度。

实施例3：基于双重信号扩增的探针的信号扩增验证实验

本实施例中，设计了2个DNA序列G1、G2，以代替实施例1中的第三发夹H3、第四发夹H4。

所述DNA序列G1的序列为：

所述DNA序列G2的序列为：

S1为3/4的G-四链体序列，S2为1/4的G-四链体序列。

其检测原理如图4所示为：

在识别目标DNA后，第一发夹H1被打开，被打开的第一发夹H1和第二发夹H2进行杂交，使目标DNA被第二发夹H2通过DNA分支迁移过程从第一发夹H1上替换下来。被替换下来的目标DNA能够参与下一轮的发夹自组装过程。同时，新形成的H1-H2双链体拉近了所述DNA序列G1、G2中的裂分G-四链体片段间的距离，使其自组装成一个完整的裂分G-四链体结构，进而结合辅因子氯化血红素产生比色信号。

为了突出放大效果，分别采用实施例1中的探针以及本实施例中的探针对浓度为1μΜ的目标DNA分子(与实施例1中的目标DNA分子相同)进行分析。

本实施例中，按照实施例2中的方法配制以下溶液，并依次编号a、b、c、d：

样品a：浓度为25nM的第一发夹H1溶液、浓度为25nM的所述第二发夹H2溶液、浓度为100nM的所述DNA序列G1溶液、浓度为100nM的所述DNA序列G2溶液；

样品b：浓度为25nM的第一发夹H1溶液、浓度为25nM的所述第二发夹H2溶液、浓度为100nM的所述第三发夹溶液、浓度为100nM的所述第四发夹溶液；

样品c：浓度为25nM的第一发夹H1溶液、浓度为25nM的所述第二发夹H2溶液、浓度为100nM的所述DNA序列G1溶液、浓度为100nM的所述DNA序列G2溶液，目标DNA的浓度为1μM的溶液；

样品d：浓度为25nM的第一发夹H1溶液、浓度为25nM的所述第二发夹H2溶液、浓度为100nM的所述第三发夹溶液、浓度为100nM的所述第四发夹溶液，目标DNA的浓度为1μM的溶液；

将上述各溶液置于37℃下培育60min，然后分别取等量的样品溶液加入等量、等浓度的氯化血红素溶液(500nM)、ABTS溶液(2mM)以及H₂O₂(2mM)，进行反应。采用与实施例2中相同的方法对样品a、b、c、d进行吸光度的检测。

其检测结果如图5所示，在没有目标DNA的情况下，两个传感系统表现出几乎相同的比色响应(曲线a,b)。当目标DNA引入到体系中后，基于典型的目标催化发夹自组装策略的本实施例的探针，可以观察到一个明显的比色信号增强(曲线c)。相比较，在同一浓度下，基于双重信号扩增策略的实施例1的探针，对于目标DNA的比色响应明显高于典型的目标催化发夹自组装策略(曲线d)。这些结果强烈表明本发明的基于双重信号扩增的探针能有效地用于目标DNA的放大检测。

实施例4：基于双重信号扩增的探针的第一发夹、第二发夹浓度平行实验

本实施例采用与实施例2相同的方法进行目标DNA分子的检测，区别仅在于，分别将实施例2中的第一发夹H1、第二发夹H2的浓度0.25μM替换为12.5nM、25nM、50nM、75nM、100nM(所述第一发夹H1、第二发夹H2的浓度均相等)。

取等量的第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹溶液加入等量、等浓度的氯化血红素溶液(500nM)、ABTS溶液(2mM)以及H₂O₂(2mM)，进行反应，进而对浓度为1μM的目标DNA分子溶液进行检测。

反应结束后，其吸光度检测结果如图6所示(误差线代表三次平行测试的标准偏差)。由图6中可以看出，当第一发夹H1与第二发夹H2的浓度为25nM时，表现出最好的信号背景比。

实施例5：基于双重信号扩增的探针的第三发夹、第四发夹浓度比平行实验

本实施例采用与实施例2相同的方法进行目标DNA的检测，区别仅在于，将实施例2中的第一发夹H1、第二发夹H2的浓度0.25μM替换为25nM(所述第一发夹H1、第二发夹H2的浓度相等)，并将实施例中的第三发夹、第四发夹的浓度1.25μM分别替换为50nM、75nM、100nM、125nM、150nM(所述第三发夹H3、第四发夹H4的浓度均相等)，即第三发夹、第四发夹的浓度与第一发夹、第二发夹浓度比为1：2、1:3、1:4、1:5、1:6。

取等量的第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹溶液加入等量、等浓度的氯化血红素溶液(500nM)、ABTS溶液(2mM)以及H₂O₂(2mM)，进行反应，进而对浓度为1μM的目标DNA分子溶液进行检测。

反应结束后，其吸光度检测结果如图7所示(误差线代表三次平行测试的标准偏差)。由图7中可以看出，当第一发夹H1、第二发夹H2的浓度与第三发夹H3、第四发夹H4的浓度比1:5时，传感系统的性能表现最佳，明显优于其他四组。

实施例6：基于双重信号扩增的探针的反应时间平行实验

本实施例采用与实施例2相同的方法进行目标DNA的检测，区别仅在于，将实施例2中的第一发夹H1、第二发夹H2的浓度0.25μM替换为25nM(所述第一发夹H1、第二发夹H2的浓度相等)，并将实施例中的第三发夹H3、第四发夹H4的浓度1.25μM替换为125nM(所述第三发夹H3、第四发夹H4的浓度相等)。

取等量的第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹溶液，并将浓度为1μM的目标DNA分子溶液加入其中，将上述混合液在37℃下分别培育30min、60min、90min、120min，再向其中加入等量、等浓度的氯化血红素溶液(500nM)、ABTS溶液(2mM)以及H₂O₂(2mM)，进行反应，检测其吸光度。

反应结束后，其吸光度检测结果如图8所示(误差线代表三次平行测试的标准偏差)。由图8中可以看出，随着反应时间的增加，比色信号逐步增强，90min后达到饱和。这与理论事实相符，即更长的反应时间无疑会导致大量的裂分G-四链体结构的形成从而增强比色信号。通过权衡灵敏度和总的检测时间，扩增反应时间优选为90min。

实施例7：基于双重信号扩增的探针的特异性测试

本实施例中，通过将本发明的探针暴露于不同的DNA序列中来验证本发明的基于双重信号扩增的探针的特异性，具体如下：

取实施例1中所述的基于双重信号扩增的探针进行目标DNA的检测，简称T，作为对比，分别有单个碱基错配的DNA，简称T1；两个碱基错配的DNA，简称T2；三个碱基错配的DNA，简称T3。各DNA的序列如表2所示。

表2待检测DNA序列

Name	Sequences(5'-3')
		T	ACTGCTAGAGATTTTCCACAT
T1	ACTGCT AGAGCTTTTCCACAT
		T2	ACTGCTCGAGCTTTTCCACAT
T3	ACTGCTCGAGCTTTTCCTCAT

将上述序列的DNA配制为浓度为1μM的溶液，并设置一组待测溶液中仅含有缓冲液，不含DNA的空白实验。按照与实施例6中相同的方法进行检测，培育时间为90min。

各组实验的吸收度检测结果如图9所示(误差线代表三次平行测试的标准偏差)。由图9可以看出，完全匹配的目标DNA所产生的比色信号要比错配DNA所产生的信号强。单个碱基错配DNA(T1)，两个碱基错配DNA(T2)和三个碱基错配DNA(T3)的吸收强度分别只有完全匹配DNA的46.6％，37.8％和32.4％。因此，该方法表现出了良好的区别完全匹配的目标DNA与错配的DNA的性能，具有良好的特异性，并拥有潜力进行单核苷酸多态性(SNP)的分析。

综上所述，本发明的基于双重信号扩增的探针具有超高灵敏度，可满足多种DNA的检测要求，并具有良好的特异性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省原子医学研究所

<120> 一种基于双重信号扩增的探针及其应用

<130> 1

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agggcgggtg ggt 13

<210> 2

<211> 5

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgggt 5

<210> 3

<211> 5

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgggt 5

<210> 4

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgggtagggc ggg 13

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgtggaaaa tctctagcag tagaagaagg tgtactgcta gagattt 47

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tagcagtaca ccttcttcta ctgctagaga tttagaagaa ggtgtttaag ta 52

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agggcgggtg ggtgtttaag ttggagaatt gtacttaaac accttcttct tgggt 55

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgggtcaatt ctccaactta aactagaaga aggtgtttaa gttgggtagg gcggg 55

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

actgctagag attttccaca t 21

Claims (7)

1.一种基于双重信号扩增的探针，其特征在于，所述探针包括第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹、第四发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区；

所述第一发夹包括：可特异性识别目标DNA的识别区(Ⅰ)、使所述第一发夹与第二发夹形成双链体的第一碱基互补区(Ⅱ)；

所述第二发夹包括：与所述第一发夹的所述识别区(Ⅰ)部分杂交的第二碱基互补区(Ⅰ’)、与所述第一发夹的所述第一碱基互补区(Ⅱ)部分杂交的第三碱基互补区(Ⅱ’)，以及与所述第三发夹部分杂交的第四碱基互补区(Ⅲ)；

所述第三发夹包括：与所述第二发夹的所述第四碱基互补区(Ⅲ)部分杂交的第五碱基互补区(Ⅲ’)、与所述第四发夹部分杂交的第六碱基互补区(Ⅳ)，以及第一G-四链体序列区；

所述第四发夹包括：与所述第三发夹的所述第五碱基互补区(Ⅲ’)部分杂交的第七碱基互补区(Ⅲ”)、与所述第三发夹的所述第六碱基互补区(Ⅳ)部分杂交的第八碱基互补区(Ⅳ’)，以及第二G-四链体序列区；所述第一G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ)以及G-四链体序列的1/4段序列区(Ⅵ)组成；所述第二G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ’)以及G-四链体序列的1/4段序列区(Ⅵ’)组成；

所述第三发夹的一端部为所述第一G-四链体序列区的所述G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ)、并依次连接有所述第六碱基互补区(Ⅳ)、第五碱基互补区(Ⅲ’)、以及设置在另一端的所述第一G-四链体序列区的所述G-四链体序列的1/4段序列(Ⅵ)；

所述第四发夹的一端部为所述第二G-四链体序列区的所述G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ’)、并依次连接有第七碱基互补区(Ⅲ”)、第八碱基互补区(Ⅳ’)、以及设置在另一端的所述第二G-四链体序列区的所述G-四链体序列的1/4段序列(Ⅵ’)。

2.根据权利要求1所述的基于双重信号扩增的探针，其特征在于，所述第三发夹的第一G-四链体序列区的G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ)的序列结构如SEQ ID No.1所示，G-四链体序列的1/4段序列区(Ⅵ)的序列结构如SEQ ID No.2所示；

所述第四发夹的第二G-四链体序列区的G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ’)的序列结构如SEQ ID No.3所示的序列结构，G-四链体序列的1/4段序列区(Ⅵ’)的序列结构如SEQID No.4所示。

3.根据权利要求2所述的基于双重信号扩增的探针，其特征在于，

所述第三发夹的G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ)位于发夹结构的茎干区，并与所述第五碱基互补区(Ⅲ’)部分杂交；

所述第四发夹的G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ’)位于发夹结构的茎干区，并与所述第八碱基互补区(Ⅳ’)部分杂交。

4.根据权利要求3所述的基于双重信号扩增的探针，其特征在于，所述第一发夹的序列结构如SEQ ID No.5所示，所述第二发夹的序列结构如SEQ ID No.6所示，所述第三发夹的序列结构如SEQ ID No.7所示，所述第四发夹的序列结构如SEQ ID No.8所示。

5.一种检测DNA分子的方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一所述的基于双重信号扩增的探针进行荧光检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-4中任一所述的基于双重信号扩增的探针置于待测溶液中，25-40℃下培育1-3h，然后向其中加入氯化血红素培育，并加入2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐以及过氧化氢混匀反应，观察或检测混合液的发光或变色情况。

7.权利要求1-4中任一所述的基于双重信号扩增的探针在检测DNA分子领域的用途。