CN107356567A - 一种从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法，包括以下步骤：S1.原位获取生物污泥样品，将其低温中高速离心，去除上清液，得到无杂质污泥；S2.用磷酸盐缓冲溶液清洗污泥，离心得到浓缩的菌体，备用；S3.取上述菌体置于磷酸盐缓冲溶液，进行细胞超声破碎；离心后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度。本发明提供的从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法能够成功提取亚铁血红素并准确测定污泥中的亚铁血红素含量，对研究厌氧氨氧化污泥生物活性的调控发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及化合物提取和测定技术领域，具体地，涉及一种从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法。
背景技术
亚铁血红素的化学结构最早由德国生物化学家Hans Fischer提出。亚铁血红素是含铁卟啉的络合物，通过铁卟啉中铁离子价的可逆变化，能够参与电子传递。分子式为C34H30FeN4O4，相对分子质量为614.48。亚铁血红素有相同的基本骨架，但侧链基团各异，因而可形成不同的血红素。
为了更加稳定地维持细胞内部血红素的浓度，几乎所有细菌、真菌和多细胞动物及植物都进化出了高度保守的八步血红素内源合成通路。这样为生命体脱离对外界环境的依赖产生了巨大的推动。虽然卟啉环合成路径稍有区别，但其起始合成原料（5-氨基乙酰丙酸）和最终产物（血红素）在不同种类的生物中保持着一致。而对于厌氧氨氧化菌内血红素的合成路径研究较少，尚不明确。
国外对HEME的研究主要在其结构与功能、合成途径、测定方法等都有较深入的研究，尤其亚铁血红素在污水生物处理过程中发挥重要作用：在厌氧氨氧化污泥中，亚铁血红素是很多不同的血红素蛋白的辅基，包括厌氧氨氧化的关键酶，联氨水解酶（HZS），联氨氧化酶（HZO），羟氨氧化还原酶（HAO）细胞色素c，细胞色素bc1复合体等；亚铁血红素浓度与厌氧氨氧化污泥的脱氮性能呈正相关关系，能直接反应厌氧氨氧化污泥的活性。
目前，亚铁血红素的传统提取方法主要以吡啶血色素分光光度法为主。由于吡啶血色素具有特征光谱，并容易被分光光度计测量。在此测定方法中，在碱性条件下，血红素结合的蛋白质的氮配位体被吡啶代替，由血色素还原物和氧化物的差异谱定量。而吡啶血色素分光光度法由于其试剂具有毒性以及对原料的收集、保存等换件具有明显的限制，不适用于常规实验测定。
因此，开发一种简单、安全无污染的亚铁血红素提取及测定方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是针对亚铁血红素提取和测定的局限性，提供一种从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法，该方法能够读取污泥颗粒中的亚铁血红素含量，在厌氧氨氧化污泥生物代谢调控机制的研究中发挥重要作用。
一种从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法，包括如下步骤：
S1.原位获取生物污泥样品，将其在0～4℃， 3000～5000g离心力条件下作用10～30min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于磷酸盐缓冲溶液中震荡均匀，在0～4℃，3000～5000g离心力条件下作用10～30min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体置于磷酸盐缓冲溶液，在800~900w功率下进行细胞超声破碎，然后在0～4℃，10000～17000g离心力条件下作用10～30min 后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度。
本发明提供的从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法能成功从污泥颗粒中提取亚铁血红素，通过采用低温中高速离心、磷酸盐缓冲溶液使提取效果稳定，并通过简单的荧光强度测试法来测定亚铁血红素的含量，测定方法无毒、简单。
优选地，步骤S2所述磷酸盐缓冲溶液浓度为10 mM，pH为7.5。
优选地，步骤S3所述细胞超声破碎时，工作/间歇时间为5s/6s。
优选地，步骤S4所述测定亚铁血红素溶液荧光强度包括如下步骤：
S41.取步骤S3得到的亚铁血红素溶液与饱和草酸溶液混合，体积比为1:10～1:12 ，震荡均匀；
S42.将S41获得的混合溶液在100～110℃下加热20～30min，冷却备用；
S43.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪测定激发波长为240～500nm及发射波长为500～700nm处的荧光强度。
优选地，步骤S41所述饱和草酸溶液浓度为2 M。
所述从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法得到的厌氧氨氧化污泥亚铁血红素。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法能成功从污泥颗粒中提取亚铁血红素，提取效果稳定，可以在生物代谢合成调控机制的研究工作中发挥重要作用，解决了目前微生物体内亚铁血红素含量低、提取困难，传统提取方法具有毒性以及相关研究较少等问题。此外，仅采用常见试剂及荧光光谱仪，就可以测定厌氧氨氧化污泥样本中的亚铁血红素荧光强度，且结果比较可靠，完全可以满足实验室中的研究需要，不仅成本低，适宜推广应用，也充分克服了目前厌氧氨氧化污泥中亚铁血红素测定没有廉价且可靠的方法的技术问题。
附图说明
图1为本发明对厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的操作示意图。
图2为亚铁血红素的分子结构示意图。
图3为吡啶血色素标准供试溶液的标准曲线。
图4为亚铁血红素浓度与荧光强度的关系；（A，B）低浓度亚铁血红素标准供试样品；（C，D）高浓度亚铁血红素标准供试样品。
图5为低浓度的亚铁血红素标准供试溶液用三维荧光光谱仪在激发波长240～500nm，发射波长500～700 nm范围内荧光强度变化情况；A～J分别表示0.1, 0.2, 0.3, 0.4,0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9,1 mg L-1。
图6为高浓度的亚铁血红素标准供试溶液用三维荧光光谱仪在激发波长240~500nm，发射波长500～700 nm范围内荧光强度变化情况；A～J分别表示5,10,15,20,25,30,40,50,100 mg L-1。
图7为吡啶血色素与荧光强度的关系，（A，B）低浓度亚铁血红素标准供试样品；（C，D）高浓度亚铁血红素标准供试样品；（E，F）不同反应器条件下厌氧氨氧化污泥中亚铁血红素样品。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步解释说明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应包括在本发明权利要求的保护范围之内。
以下实施例和对比例中，所用原料均为市售商品。
测试与表征方法
测量方法可靠性检测
（1）精密称取0.001克亚铁血红素标准品（C-2506，Sigma）置于小烧杯中，倒入蒸馏水混合均匀，润洗烧杯2～3次，移至100 mL容量瓶中，定容配制为100 mg/L标准供试溶液；将配制好的亚铁血红素标准供试溶液分别稀释为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L，配成梯度溶液；
（2）每个梯度溶液中取两次4.2 mL标准供试溶液，一组分别加入1 mL吡啶，0.5 mL氢氧化钠溶液（1M）形成氧化血色素；另一组中加入1 mL吡啶，0.5 mL氢氧化钠溶液（1M）及5 mg连二亚硫酸钠晶体形成还原血色素；最后以还原血色素与氧化血色素形成的吸光度差值进行标准曲线测定（图3）。该标准曲线用于与荧光强度替换而进行相关性对比。
（3）从梯度溶液中各取0.5 mL标准供试溶液，分别加入5 mL饱和草酸溶液（2M），100℃下加热30 min，在激发波长240～500 nm、发射波长500～700 nm范围内扫描并记录荧光强度。
标准曲线结果：结果如图4可知，亚铁血红素浓度越高，荧光强度越明显，浓度与荧光强度呈现显著相关性。且由图5、6所示，所有浓度的亚铁血红素标准品在600及660 nm处有一个明显的特征峰。以吡啶血色素吸光度值为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，得到图7，发现二者呈线性关系，且相关性较高（R2=0.97）。
以上结果说明本发明中所使用的亚铁血红素测定方法是很可靠的。在以后的检测中，均可使用荧光光谱法来衡量厌氧氨氧化污泥中的亚铁血红素含量。
实施例1
S1.原位获取生物污泥样品1g，将其在 4℃，50mL离心管，3500g离心力条件下作用15min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于10 mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）混合，震荡均匀，在 4℃，50mL离心管，3500 g离心力条件下作用15min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体1g置于50 mL烧杯中，量取25mL磷酸盐缓冲溶液（pH7.5，10 mM），使用超声波细胞破碎仪（A2800，China）在800～900 w功率、工作/间隔时间为5s/6s，进行超声破碎30 min；然后在4℃，50 mL离心管，12500g离心力条件下作用15min后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度：
S41.取0.5mL步骤S3得到的亚铁血红素，加入体积比1:10的饱和草酸溶液，所述饱和草酸溶液浓度为2 M，震荡均匀；
S42.获得混合溶液在100℃高温下加热30min，冷却备用；
S43.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪读取激发波长为240～500nm及发射波长为500～700nm处的荧光强度。
制备得到的亚铁血红素荧光强度进行统计，其激发波长为408nm，发射波长分别于600nm和660nm处具有最高荧光强度，结果如表1所示。
表1：HEME荧光强度与浓度
实施例2
S1.原位获取生物污泥样品1g，将其在 4℃，50mL离心管，5000g离心力条件下作用10min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于10 mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）混合，震荡均匀，在4℃，50mL离心管，5000 g离心力条件下作用10min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体1g置于50 mL烧杯中，量取25mL磷酸盐缓冲溶液（pH7.5，10 mM），使用超声波细胞破碎仪（A2800，China）在800～900 w功率、工作/间隔时间为5s/6s，进行超声破碎30 min；然后在4℃，50 mL离心管，17000g离心力条件下作用10min后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度：
S41.取0.5mL步骤S3得到的亚铁血红素，加入体积比1:10饱和草酸溶液，所述饱和草酸溶液浓度为2 M，震荡均匀；
S42.获得混合溶液在100℃高温下加热30min，冷却备用；
S43.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪读取激发波长为240～500nm及发射波长为500～700nm处的荧光强度。
制备得到的亚铁血红素荧光强度进行统计，其激发波长为408nm，发射波长分别于600nm和660nm处具有最高荧光强度，结果如表2所示。
表2：HEME荧光强度与浓度
实施例3
S1.原位获取生物污泥样品1g，将其在0℃，50mL离心管，3000g离心力条件下作用30min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于10 mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）混合，震荡均匀，在 0℃，50mL离心管，3000 g离心力条件下作用30min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体1g置于50 mL烧杯中，量取25mL磷酸盐缓冲溶液（pH7.5，10 mM），使用超声波细胞破碎仪（A2800，China）在800～900 w功率、工作/间隔时间为5s/6s，进行超声破碎30 min；然后在0℃，50 mL离心管，10000g离心力条件下作用30min后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度：
S41.取0.5mL步骤S3得到的亚铁血红素，加入体积比1:10饱和草酸溶液，所述饱和草酸溶液浓度为2 M，震荡均匀；
S42.获得混合溶液在100℃高温下加热30min，冷却备用；
S43.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪读取激发波长为240～500nm及发射波长为500～700nm处的荧光强度。
制备得到的亚铁血红素荧光强度进行统计，其激发波长为408nm，发射波长分别于600nm和660nm处具有最高荧光强度，结果如表3所示。
表3：HEME荧光强度与浓度
实施例4
S1.原位获取生物污泥样品1g，将其在0℃，50mL离心管，3500g离心力条件下作用30min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于10 mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）混合，震荡均匀，在 0℃，50mL离心管，3000 g离心力条件下作用30min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体1g置于50 mL烧杯中，量取25mL磷酸盐缓冲溶液（pH7.5，10 mM），使用超声波细胞破碎仪（A2800，China）在800 w功率、工作/间隔时间为5s/6s，进行超声破碎30min；然后在0℃，50 mL离心管，10000g离心力条件下作用30min后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度：
S41.取0.5mL步骤S3得到的亚铁血红素，加入体积比1:10饱和草酸溶液，所述饱和草酸溶液浓度为2 M，震荡均匀；
S42.获得混合溶液在100℃高温下加热30min，冷却备用；
S43.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪读取激发波长为240～500nm及发射波长为500～700nm处的荧光强度。
制备得到的亚铁血红素荧光强度进行统计，其激发波长为408nm，发射波长分别于600nm和660nm处具有最高荧光强度，结果如表4所示。
表4：HEME荧光强度与浓度
对比例1
S1.原位获取生物污泥样品1g，将其在 15℃，50mL离心管，3500g离心力条件下作用15min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于10 mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）等体积混合，震荡均匀，在15℃，50mL离心管，3500 g离心力条件下作用15min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体1g置于50 mL烧杯中，量取25mL磷酸盐缓冲溶液（pH7.5，10 mM），使用超声波细胞破碎仪（A2800，China）在600 w功率、工作/间隔时间为5s/6s，进行超声破碎30min；然后在4℃，50 mL离心管，12500g离心力条件下作用15min后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度：
S41.取0.5mL步骤S3得到的亚铁血红素，加入5mL饱和草酸溶液，震荡均匀；
S42.获得混合溶液在100℃高温下加热30min，冷却备用；
S43.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪读取激发波长为240~500nm及发射波长为500~700nm处的荧光强度。
制备得到的亚铁血红素荧光强度进行统计，其激发波长为408nm，发射波长分别于600nm和660nm处具有最高荧光强度，结果如表5所示。
表5：荧光强度与浓度
对比例2
S1.原位获取生物污泥样品1g，将其在 4℃，50mL离心管，8000g离心力条件下作用15min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于10 mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）等体积混合，震荡均匀，在4℃，50mL离心管，8000g离心力条件下作用15min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体1g置于50 mL烧杯中，量取25mL磷酸盐缓冲溶液（pH7.5，10 mM），使用超声波细胞破碎仪（A2800，China）在1000 w功率、工作/间隔时间为5s/6s，进行超声破碎30min；然后在4℃，50 mL离心管，12500g离心力条件下作用15min后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度：
S41.取0.5mL步骤S3得到的亚铁血红素，加入5mL饱和草酸溶液，震荡均匀；
S42.获得混合溶液在100℃高温下加热30min，冷却备用；
S43.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪读取激发波长为240~500nm及发射波长为500~700nm处的荧光强度。
制备得到的亚铁血红素荧光强度进行统计，其激发波长为404nm，发射波长分别于600nm和660nm处具有最高荧光强度，结果如表6所示。
表6：荧光强度与浓度
对比例3
S1.原位获取生物污泥样品1g，将其在 4℃，50mL离心管，3500g离心力条件下作用15min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于10 mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）等体积混合，震荡均匀，在4℃，50mL离心管，3500g离心力条件下作用15min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体1g置于50 mL烧杯中，量取25mL磷酸盐缓冲溶液（pH7.5，10 mM），使用超声波细胞破碎仪（A2800，China）在600 w功率、工作/间隔时间为5s/6s，进行超声破碎30min；然后在4℃，50 mL离心管，7000g离心力条件下作用15min后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度：
S41.取0.5mL步骤S3得到的亚铁血红素，加入5mL饱和草酸溶液，震荡均匀；
S42.获得混合溶液在100℃高温下加热30min，冷却备用；
S43.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪读取激发波长为240~500nm及发射波长为500~700nm处的荧光强度。
制备得到的亚铁血红素荧光强度进行统计，其激发波长为408nm，发射波长分别于600nm和660nm处具有最高荧光强度，结果如表7所示。
表7：荧光强度与浓度
对比例4
S1.原位获取生物污泥样品1g，将其在 4℃，50mL离心管，3500g离心力条件下作用15min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于10 mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）等体积混合，震荡均匀，在4℃，50mL离心管，3500g离心力条件下作用15min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体1g置于50 mL烧杯中，量取25mL磷酸盐缓冲溶液（pH7.5，10 mM），使用超声波细胞破碎仪（A2800，China）在800～900w功率、工作/间隔时间为5s/6s，进行超声破碎30 min；然后在15℃，50 mL离心管，3500g离心力条件下作用15min后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度：
S41.取0.5mL步骤S3得到的亚铁血红素，加入5mL饱和草酸溶液，震荡均匀；
S42.获得混合溶液在100℃高温下加热30min，冷却备用；
S43.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪读取激发波长为240~500nm及发射波长为500~700nm处的荧光强度。
制备得到的亚铁血红素荧光强度进行统计，其激发波长为408nm，发射波长分别于600nm和660nm处具有最高荧光强度，结果如表8所示。
表8：荧光强度与浓度
对比例5
S1.原位获取生物污泥样品1g，将其在 4℃，50mL离心管，3500g离心力条件下作用15min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于10 mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.5）等体积混合，震荡均匀，在4℃，50mL离心管，3500g离心力条件下作用15min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体1g置于50 mL烧杯中，量取25mL磷酸盐缓冲溶液（pH7.5，10 mM），使用超声波细胞破碎仪（A2800，China）在800~900w功率、工作/间隔时间为5s/6s，进行超声破碎30 min；然后在4℃，50 mL离心管，12500g离心力条件下作用15min后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度：
S41.取0.5mL步骤S3得到的亚铁血红素，加入5mL饱和草酸溶液，震荡均匀；
S42.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪读取激发波长为240~500nm及发射波长为500~700nm处的荧光强度。
制备得到的亚铁血红素荧光强度进行统计，其激发波长为408nm，发射波长分别于600nm和660nm处具有最高荧光强度，结果如表9所示。
表9：荧光强度与浓度
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.原位获取生物污泥样品，将其在0～4℃，3000～5000g离心力条件下作用10～30min，去除上清液得到无杂质污泥；
S2.将S1所得无杂质污泥置于磷酸盐缓冲溶液中震荡均匀，在0～4℃，3000～5000g离心力条件下作用10～30min后弃去上清液，重复操作，直至得到的上清液为无色，弃去上清液得到菌体；
S3.取S2所得菌体置于磷酸盐缓冲溶液中，在800~900w功率下进行细胞超声破碎，然后在0～4℃，10000～17000g离心力条件下作用10～30min 后过滤，得到的悬浮液体即为亚铁血红素溶液；
S4.测定亚铁血红素溶液荧光强度。
2.根据权利要求1所述从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法，其特征在于，步骤S2所述磷酸盐缓冲溶液浓度为10 mM，pH为7.5。
3.根据权利要求1所述从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法，其特征在于，步骤S3所述细胞超声破碎时，工作/间歇时间为5s/6s。
4.根据权利要求1所述从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法，其特征在于，步骤S4所述测定亚铁血红素溶液荧光强度包括如下步骤：
S41.取步骤S3得到的亚铁血红素溶液与饱和草酸溶液混合，体积比为1:10～1:12 ，震荡均匀；
S42.将S41获得的混合溶液在100~110℃下加热20~30min，冷却备用；
S43.使用不含有亚铁血红素的样品作为空白，采用三维荧光光谱仪测定激发波长为240~500nm及发射波长为500~700nm处的荧光强度。
5.根据权利要求4所述从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法，其特征在于，步骤S41所述饱和草酸溶液浓度为2 M。
6.权利要求1~3中任一项所述从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法得到的厌氧氨氧化污泥亚铁血红素。
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