CN113621366A - 一种红色荧光碳点及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及荧光纳米材料技术领域，公开了一种红色荧光碳点及其制备方法和应用，包括以下步骤：对邻苯二胺和氟化铵进行研磨，加入浓硫酸，进行煅烧；将煅烧后的物质加入甲酰胺中，去除不溶固体，保留液体；向所述液体中加入萃取溶剂，收集析出的固体；对所述固体用洗涤液洗涤数次，干燥，得到所述红色荧光碳点。采用本申请的红色荧光碳点的制备方法，方法简单，设备要求低，后续纯化方法采用萃取法，简单高效。制备得到的所述红色荧光碳点，水溶性好，毒性低，发光稳定，激发波长宽，发射波长处于深红色区。因此，特别适合用于生物组织的深层次、长时间成像。

Description

一种红色荧光碳点及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及荧光纳米材料技术领域，主要涉及一种红色荧光碳点及其制备方法和应用。
背景技术
三价铁离子（Fe3+）是人体内最重要的微量元素之一，在各种生理过程如细胞形成和代谢、氧化反应、电子转移、组织呼吸、酶催化、DNA 和 RNA 合成中起着重要的作用。铁摄入过量或不足都会对人体产生不利影响。例如，人体缺铁会导致缺铁性贫血、免疫功能下降、新陈代谢紊乱等；铁摄入过多容易导致人体肝组织损伤、血色素沉着、帕金森病和阿尔茨海默等疾病。因此，探索高效可靠检测Fe3+的方法对人类生命健康尤为重要。目前测定铁离子的方法包括分子吸收光谱法、高效液相色谱法、电化学法、原子吸收光谱法、化学滴定法等，但复杂的仪器和繁琐的样品制备程序限制了它们的实际应用。荧光分析法由于简单和灵敏度高而被广泛应用于检测Fe3+，然而，大多数报告的荧光传感器是生物不相容的，细胞毒性大，不溶于生理介质。
碳点具有较低的毒性，良好的水溶性，但是，当前的碳点发光多集中在蓝色、绿色、橙色等短波长区域。这些短波长荧光由于激发光波长短，能量较高，对生物体具有较大的光损伤；另外，短波长的荧光对组织穿透深度浅，受生物体的背景荧光干扰强，因此难以实现组织的深度清晰成像。除此之外，碳点的合成方法多采用溶剂热法，存在反应耗时长，能源消耗大的问题，而且在纯化方法上多采用透析法和色谱分离法，操作步骤繁琐、低效，难以实现规模制备。因此，开发一种高效、低成本制备、纯化碳点的方法具有一定意义。
因此，现有技术还有待于改进和发展，需要开发一种具有良好生物相容性、低细胞毒性和良好水溶性的用于检测细胞内Fe3+的新型荧光传感器。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种红色荧光碳点及其制备方法和应用，旨在提供一种新的荧光碳点，可以用于细胞内检测Fe3+，并且制备方法高效、宏量、低成本。
本申请的技术方案如下：
一种红色荧光碳点的制备方法，其中，包括以下步骤：
对邻苯二胺和氟化铵进行研磨，加入浓硫酸，进行煅烧；
将煅烧后的物质加入甲酰胺中，去除不溶固体，保留液体；
向所述液体中加入萃取溶剂，收集析出的固体；
对所述固体用洗涤液洗涤数次，干燥，得到所述红色荧光碳点。
本申请所提的红色荧光碳点的制备方法，以邻苯二胺和氟化铵作为反应前驱体，浓硫酸作为催化剂和脱水剂，纯化方式为萃取，整个制备方法简单。并且，制备得到的所述红色荧光碳点，其667 nm的发射峰接近于近红外区，用于生物样本的荧光成像可实现更弱的细胞损伤、更低的背景荧光干扰、更强的组织穿透能力，并且对Fe3+具有特异性识别性能，对Fe3+单一响应。
进一步地，所述煅烧的温度为200~350℃，所述煅烧的时间为0.5~ 10min。本申请中对煅烧的温度要求不高，可以以电热套为反应热源，对设备要求低，适合宏量、高效规模制备。
进一步地，所述邻苯二胺和所述氟化铵的摩尔比为8:1～1:8。
进一步地，在所述将煅烧后的物质加入甲酰胺的步骤后，对其进行超声波处理；
去除不溶固体的方式为离心处理，离心速度为3000-6000rpm，离心处理时间为10-30min。进一步地，在所述向所述液体中加入萃取溶剂的步骤后，对所述液体进行充分振荡；
所述萃取溶剂为二氯甲烷，所述萃取溶剂的加入量为所述液体的体积的3-5倍。
进一步地，所述洗涤液为甲醇或乙醇。
进一步地，所述干燥的温度为40-60℃，所述干燥的时间为12-24 h。
一种红色荧光碳点，其中，采用上述的红色荧光碳点的制备方法制备得到。
一种所述的红色荧光碳点的应用，其中，将所述红色荧光碳点用于细胞内检测Fe3 +。
进一步地，将所述红色荧光碳点用于制备细胞内检测Fe3+的荧光探针。
有益效果：本申请的采用本申请的红色荧光碳点的制备方法，方法简单，设备要求低，后续纯化方法采用萃取法，简单高效。而且，制备得到的所述红色荧光碳点，水溶性好，毒性低，发光稳定，激发波长宽，发射波长接近于近红外区。因此，特别适合用于生物组织的深层次、长时间成像。
附图说明
图1为本申请实施例1中所述红色荧光碳点水溶液在自然光下及365 nm激发光下的发光结果图。
图2为本申请实施例1中所述红色荧光碳点水溶液的激发光谱图和发射光谱图。
图3为本申请实施例1中所述红色荧光碳点水溶液在不同波长激发光下的荧光光谱图。
图4为本申请实施例1中不同金属离子对所述红色荧光碳点水溶液的荧光响应性测试结果图。
图5为本申请实施例1中不同浓度Fe3+对所述红色荧光碳点水溶液的荧光强度影响测试结果图。
图6为本申请实施例1中所述红色荧光碳点水溶液对不同浓度Fe3+荧光响应线性拟合图。
图7为本申请实施例1中所述红色荧光碳点在HeLa细胞中的激光共聚焦显微成像图。
图8为本申请实施例1中所述红色荧光碳点标记的HeLa细胞与0.2 mM Fe3+孵育4 h后的激光共聚焦显微成像图。
具体实施方式
本申请提供一种红色荧光碳点及其制备方法和应用，为使本申请的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本申请进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。此外，本申请提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
本申请提供一种红色荧光碳点的制备方法，包括以下步骤：
（1）对邻苯二胺和氟化铵进行研磨，加入浓硫酸。
在步骤（1）中，邻苯二胺和氟化铵的摩尔比为8:1～1:8，采用此摩尔比范围有利于反应物间充分接触，不会导致某一反应物过剩。邻苯二胺和氟化铵为固体，研磨时可以将邻苯二胺和氟化铵放置在玛瑙研钵中进行研磨。将邻苯二胺和氟化铵研磨至颗粒均匀，混合充分后，可以将邻苯二胺和氟化铵转移至坩埚中，再加入浓硫酸。优选地，加入浓硫酸的方式为逐滴滴加，注意要滴加均匀。研磨是为了使反应物之间充分接触，反应彻底，浓硫酸采用逐滴滴加方式也是为了进一步保证反应彻底。在此步骤中，浓硫酸的质量浓度可以为98%，用量范围是每1g邻苯二胺和氟化铵（此处是指邻苯二胺和氟化铵两者的总质量）可对应添加浓硫酸0.1-1 mL。
（2）浓硫酸滴加完毕后，进行煅烧。
在步骤（2）中，煅烧的温度为200~350℃，煅烧的时间为0.5~ 10min。
在步骤（2）中，煅烧的温度要求不高，可以将邻苯二胺和氟化铵放置在坩埚中，直接采用电热套加热，对设备要求低，适合宏量、高效规模制备。
（3）将煅烧后的物质加入甲酰胺中，去除不溶固体，保留液体。
在步骤（3）中，当将煅烧后的固体加入甲酰胺中后，优选地，对混合液进行超声波处理，加速可溶物质的溶解，提高制备效率。去除不溶固体的方法可以为对混合液进行离心处理，保留上层清液，离心速度可以为3000-6000 rpm，离心处理时间可以为10~30min。在此步骤中，采用甲酰胺作为溶剂，甲酰胺溶解能力强，可溶解大部分反应后的固体，甲酰胺可以为分析纯的甲酰胺。
（4）向液体中加入萃取溶剂，收集析出的固体。
在步骤（4）中，萃取溶剂的加入量一般为液体体积的3-5倍。在本实施例方案中，萃取溶剂可以为二氯甲烷，采用二氯甲烷的好处是能够充分将红色荧光碳点从甲酰胺中萃取出来。
优选地，在加入萃取溶剂后，对液体进行充分振荡，使固体尽快、尽可能完全地析出，提高制备效率和收率。待固体析出完全后，收集的过程可以为对液体进行离心处理，去除上层清液，收集固体。
（5）对固体用洗涤液洗涤数次，干燥，得到红色荧光碳点。
在步骤（5）中，干燥温度可以为40-60℃，干燥时间可以为12-24 h。制备得到的红色荧光碳点为蓝黑色固体。
所述洗涤液可以为甲醇或乙醇，在本申请实施例方案中，优选为乙醇，因为乙醇廉价，并且未反应的原料可以溶于乙醇但目标产物红色荧光碳点不溶于乙醇，因此采用乙醇可以达到充分洗涤的目的。
本申请所提供的红色荧光碳点的制备方法，以邻苯二胺和氟化铵作为反应前驱体，浓硫酸作为催化剂和脱水剂，可以电热套作为反应热源，有机溶剂作为萃取溶剂，最终实现红色荧光碳点的高效规模制备。邻苯二胺自有的苯环结构有利于提升碳点的共轭程度，因此常作为制备红色荧光碳点的原料。但现有技术中，以邻苯二胺为原料制备的红色荧光碳点仍存在发射波长较短的问题，发射峰多处于600-630 nm之间，很少有超过650 nm的深红色区发射峰。而本申请方案中通过引入氟化铵，一方面提供了更高程度的N掺杂，另一方面也提供了F掺杂，F的p轨道与碳点表面氧的2p轨道发生杂化，导致能级间距进一步减小，从而实现荧光发射峰更大程度的红移，本申请所制备得到的红色荧光碳点，其667 nm的发射峰接近于近红外区，用于生物样本的荧光成像可实现更弱的细胞损伤、更低的背景荧光干扰、更强的组织穿透能力，并且对Fe3+具有特异性识别性能，对Fe3+单一响应。
本申请中还提供一种红色荧光碳点，红色荧光碳点采用上述红色荧光碳点的制备方法制备得到。红色荧光碳点为蓝黑色固体，红色荧光碳点溶于水后，红色荧光碳点的水溶液在自然光下呈蓝色透明溶液，在365 nm光源激发下发出明亮的红色荧光。红色荧光碳点可以进入细胞质成像，表明红色荧光碳点的生物相容性较好。红色荧光碳点经过一段时间的孵育后经胞吞胞吐作用进入到细胞质，当细胞内含有Fe3+时，红色荧光碳点与Fe3+形成复合物，红色荧光碳点表面的羧基和氨基上的孤对电子和Fe3+的空价轨道会发生能量或者电子转移，从而导致明显的荧光猝灭。通过检测细胞内成像亮度的变化可以定性检测Fe3+，通过检测碳点荧光强度的变化，可以实现Fe3+的定量检测。
本申请中还提供红色荧光碳点的应用，将红色荧光碳点用于制备检测细胞内Fe3+的荧光探针，具有操作简单，快速高效，特异性好，检出限低等优点。由于红色荧光碳点水溶性好，毒性低，发光稳定，激发波长宽，发射波长接近于近红外区。因此，特别适合用于生物组织的深层次、长时间成像，优选地，将红色荧光碳点用于制备细胞内检测Fe3+的荧光探针。
与现有技术相比，本申请所提的红色荧光碳点的制备方法具有以下优点：
（1）制备方法简单，设备要求低，普通实验室电热套即可完成制备。后续纯化方法采用萃取法，简单高效，利于宏量制备；并且，产率高，成本低。
（2）制备得到的红色荧光碳点水溶性好，毒性低，发光稳定，激发波长宽，发射波长接近于近红外区。因此，特别适合用于生物组织的深层次、长时间成像。
（3）制备得到的红色荧光碳点，对Fe3+具有特异性识别性能，对Fe3+单一响应，检测范围较宽，0.5-80µM之间线性关系好，最低检测限为0.01µM。
以下通过具体实施例对本申请作进一步说明。
实施例1
称取0.54g（5 mmoL）邻苯二胺和0.37g（10 mmoL）氟化铵于玛瑙研钵中，充分研磨；接着逐滴加入0.5 mL的浓硫酸溶液，注意要滴加均匀；最后将坩埚放置于300℃的电热套中加热3 min后用镊子取出坩埚，待自然冷却至室温后收集黑色固体；接着将固体溶于5 mL甲酰胺中，3000 rpm离心15min后收集液体；再将液体和二氯甲烷按1:5的体积比混合，碳点固体不断析出；收集析出固体并用乙醇洗涤3次；最后将固体置于60 ℃鼓风干燥箱中干燥24 h，得到蓝黑色的红色荧光碳点粉末。其绝对荧光量子产率为11%。
取2 mg制备得到的蓝黑色的红色荧光碳点粉末溶于40 mL去离子水中，得到红色荧光碳点水溶液，进行荧光特性表征。
红色荧光碳点水溶液的可见光及365 nm光源激发下发光结果图如图1，图1中，a为红色荧光碳点水溶液在自然光下的结果图，红色荧光碳点水溶液在可见光下呈深蓝色透明溶液，b为红色荧光碳点水溶液经过紫外光源（365 nm光源）激发下的结果图，在365 nm光源激发下红色荧光碳点水溶液发出明亮的红色荧光。
测试红色荧光碳点水溶液的激发光谱（选定667 nm作为发射波长扫描得到的光谱）和发射光谱（以560 nm为激发波长扫描得到的光谱），结果如图2所示，其中Ex为激发光谱，Em为发射光谱，根据图2可以看到，红色荧光碳点的激发波长范围较宽，最佳激发波长处于634 nm处，发射峰位于667 nm处。
测试红色荧光碳点水溶液在不同波长激发光下的荧光图谱，用360nm、400nm、440nm、480nm、520nm、560nm、600nm的光源测试红色荧光碳点水溶液的荧光图谱，结果如图3所示，图3的光谱图表明，随着激发光波长的改变，红色荧光碳点的发射峰位置保持不变，只是荧光强度有所变化，说明红色荧光碳点具有激发波长独立性，荧光强度变化趋势和图2的激发光谱图变化趋势一致。
考察常见金属离子对红色荧光碳点的荧光响应性，以水为空白对照（Blank），以锂离子溶液（Li+）、钠离子溶液（Na+）、钾离子溶液（K+）、银离子溶液（Ag+）、铜离子溶液（Cu2+）、锌离子溶液（Zn2+）、镉离子溶液（Cd2+）、钙离子溶液（Ca2+）、镁离子溶液（Mg2+）、锰离子溶液（Mn2+）、铝离子溶液（Al3+）、铅离子溶液（Pb2+）、镍离子溶液（Ni2+）、二价铁离子溶液（Fe2+）、三价铁离子溶液（Fe3+）为实验组，测试发射光谱时各实验组的溶液中金属离子的终浓度均为40 µM。具体地，取0.8 mL浓度为0.1 mg/mL的红色荧光碳点溶液分别与浓度为80µM的0.8mL各金属离子溶液充分混合摇匀，静置2 min后转移至四面透光的石英皿中测试发射光谱（以560 nm为激发波长扫描得到的光谱）。金属离子对红色荧光碳点溶液的荧光响应性结果图如4，根据图4可以发现Fe3+可以明显猝灭红色荧光碳点溶液的荧光，而其它金属离子对它基本没有影响。证明Fe3+对红色荧光碳点的猝灭效果最好且其它离子干扰小，红色荧光碳点可以特异性识别检测溶液中的Fe3+。
在0.8.mL不同浓度的红色荧光碳点水溶液（此红色荧光碳点水溶液经过560 nm激发波长激发）中分别加入0.8mL的不同浓度的Fe3+溶液，观察不同浓度Fe3+对红色荧光碳点溶液的荧光强度影响，测试结果如图5所示，图5中的图谱由上至下分别为三价铁离子溶液浓度0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、80μM、100μM的测试图谱。图5的结果显示，随着Fe3+浓度的增加，红色荧光碳点水溶液的荧光强度逐渐降低。如图6所示，当Fe3+浓度在0.5-80 µM时具有良好的线性关系，拟合曲线方程为y=1.02224+ 0.00441x+3.21836E-4x2，拟合系数R2 = 0.99921，检测范围宽，检测限为0.01 µM，较低。图6中，x是Fe3+的浓度，y为F0/F的比值。
将无菌超纯水溶解的红色荧光碳点，加入HeLa细胞中，红色荧光碳点的终浓度为0.2 mg mL-1，在37℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育12 h，获取红色碳荧光点在HeLa细胞中的荧光成像图，结果如图7所示，从左至右分别为红色荧光碳点标记的HeLa细胞明场照片、561nm波长激发下的荧光成像、明场与荧光成像叠加照片，由图7可以看出，红色碳荧光点可以顺利地进入细胞质进行成像，表明红色碳荧光点的生物相容性较好。
向上述经过了561 nm波长激发过的红色荧光碳点标记的2 mL HeLa细胞中加入2μL浓度为0.2 M的Fe3+（Fe3+终浓度为0.2 mM），在37℃、5% CO2的细胞培养箱中再次孵育4 h，获取红色碳荧光点在HeLa细胞中的荧光成像图，结果如图8所示，从左至右分别为红色荧光碳点标记的HeLa细胞与Fe3+孵育后的明场照片、561 nm波长激发下的荧光成像、明场与荧光成像叠加照片，由图8可以看出，红色荧光碳点标记细胞荧光消失，Fe3+进入细胞内与红色荧光碳点形成了复合物导致了荧光的猝灭。因此，此红色荧光碳点可以用来检测细胞内Fe3+。
实施例2
除称取1.08 g邻苯二胺和0.037 g氟化铵外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为2%。
实施例3
除称取0.54 g邻苯二胺和0.074 g氟化铵外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为4%。
实施例4
除称取0.108 g邻苯二胺和0.37 g氟化铵外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为5%。
实施例5
除称取0.108 g邻苯二胺和0.74 g氟化铵外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为3%。
实施例6
除浓硫酸为0.12 mL外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为1%。
实施例7
除浓硫酸为0.77 mL外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为7%。
实施例8
除浓硫酸为1.23 mL外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为5%。
实施例9
除浓硫酸为2 mL外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为1%。
实施例10
除煅烧时间为0.5 min外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为 0%。
实施例11
除煅烧时间为1.5 min外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为5%。
实施例12
除煅烧时间为4.5 min外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为1%。
实施例13
除煅烧温度为200℃外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为1.5%。
实施例14
除煅烧温度为250℃外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为5.5%。
实施例15
除煅烧温度为350℃外，其他与实施例1相同。绝对量子产率为4.5%。
应当理解的是，本申请的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本申请所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种红色荧光碳点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
对邻苯二胺和氟化铵进行研磨，加入浓硫酸，进行煅烧；
将煅烧后的物质加入甲酰胺中，去除不溶固体，保留液体；
向所述液体中加入萃取溶剂，收集析出的固体；
对所述固体用洗涤液洗涤数次，干燥，得到所述红色荧光碳点。
2.根据权利要求1所述的红色荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述煅烧的温度为200~350℃，所述煅烧的时间为0.5~ 10min。
3.根据权利要求1所述的红色荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述邻苯二胺和所述氟化铵的摩尔比为8:1～1:8。
4.根据权利要求1所述的红色荧光碳点的制备方法，其特征在于，在所述将煅烧后的物质加入甲酰胺的步骤后，对其进行超声波处理；
所述去除不溶固体的方式为离心处理，所述离心处理的速度为3000-6000 rpm，所述离心处理的时间为10 -30min。
5.根据权利要求1所述的红色荧光碳点的制备方法，其特征在于，在所述向所述液体中加入萃取溶剂的步骤后，对所述液体进行充分振荡；
所述萃取溶剂为二氯甲烷，所述萃取溶剂的加入量为所述液体的体积的3-5倍。
6.根据权利要求1所述的红色荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述洗涤液为甲醇或乙醇。
7.根据权利要求1所述的红色荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述干燥的温度为40-60℃，所述干燥的时间为12-24 h。
8.一种红色荧光碳点，其特征在于，采用如权利要求1~7任一所述的红色荧光碳点的制备方法制备得到。
9.一种如权利要求8所述的红色荧光碳点的应用，其特征在于，将所述红色荧光碳点用于细胞内检测Fe3+。
10.根据权利要求9所述的红色荧光碳点的应用，其特征在于，将所述红色荧光碳点用于制备细胞内检测Fe3+的荧光探针。
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