CN111334293A - 黄光发射荧光探针及其制备方法、选择性检测铁离子和PPi的方法以及细胞成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄光发射荧光探针及其制备方法、选择性检测Fe3+和PPi的方法以及细胞成像方法,该制备方法为:将邻苯二胺OPD和水进行水热反应,接着进行纯化以得到黄光的氮掺杂碳量子点,即黄光发射荧光探针。该黄光发射荧光探针在Fe3+和PPi的检测中具有良好选择性和高灵敏度,且响应时间短、能够实时检测,该制备方法具有工序简单和操作简易的特点;另外,该细胞成像方法能够实现细胞内荧光强度的调节。
Description
技术领域
本发明涉及黄光发射荧光探针,具体地,涉及一种黄光发射荧光探针及其制备方法、选择性检测铁离子和PPi的方法以及细胞成像方法。
背景技术
开发阴离子传感系统已成为一个重要的研究领域。因此,基于荧光变化对PPi的检测和识别成为许多研究小组的主要关注点;一个精确的磷酸根阴离子传感系统可以为磷酸化过程提供新的解释。
近几十年来,PPi特异性荧光探针已被开发,荧光分析法由于其成本相对较低,灵敏度高,操作简便,方法可靠和检出限低而备受关注;尽管已经有各种类型的荧光化学传感器可以选择性地识别PPi,但在水溶液中只有少数荧光化学传感器可以识别PPi。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄光发射荧光探针及其制备方法、选择性检测Fe3+和PPi的方法以及细胞成像方法,该黄光发射荧光探针在Fe3+和PPi的检测中具有良好选择性和高灵敏度,且响应时间短、能够实时检测,该制备方法具有工序简单和操作简易的特点;另外,该细胞成像方法能够实现细胞内荧光强度的调节。
为了实现上述目的,本发明提供了一种黄光发射荧光探针的制备方法,该制备方法为:将邻苯二胺OPD和水进行水热反应,接着进行纯化以得到黄光的氮掺杂碳量子点,即黄光发射荧光探针。
本发明还提供了一种黄光发射荧光探针,该黄光发射荧光探针通过上述的制备方法制备而得。
本发明也提供了一种选择性检测Fe3+的方法,包括:
1)将羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES缓冲溶液、不同已知浓度的Fe3+溶液、上述的黄光发射荧光探针溶液混合、定容,得到待测已知溶液;
2)将步骤1)中的Fe3+溶液去除后,得到空白待测溶液;
3)分别测定各待测已知溶液和空白待测溶液的最大荧光强度;
4)以待测已知溶液的最大荧光强度和空白待测溶液的最大荧光强度的比值取对数为纵坐标,Fe3+的浓度为横坐标,建立荧光发射光谱曲线方程;
5)测定待检测Fe3+样本的最大荧光强度,然后根据荧光发射光谱曲线方程计算得到Fe3+的浓度。
本发明进一步提供了一种选择性检测PPi的方法,包括:
1)将不同已知浓度的焦磷酸根PPi溶液分别与羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES缓冲溶液、Fe3+溶液、上述的黄光发射荧光探针溶液混合、定容,得到待测已知溶液;
2)将步骤1)中的PPi溶液去除后,得到空白待测溶液;
3)分别测定各待测已知溶液和空白待测溶液的最大荧光强度;
4)以待测已知溶液的最大荧光强度和空白待测溶液的最大荧光强度的比值取对数为纵坐标,PPi的浓度为横坐标,建立荧光发射光谱曲线方程;
5)测定待检测PPi样本的最大荧光强度,然后根据荧光发射光谱曲线方程计算得到PPi的浓度。
本发明更进一步提供了一种基于Fe3+和PPi的开-关模式的细胞成像方法,包括:
1)将细胞置于含有上述黄光发射荧光探针的培养液中进行贴壁培养;
2)用HEPES缓冲溶液洗去培养液,得到在紫外灯下发黄光的细胞;
3)向步骤2)中的细胞培养体系中加入Fe3+离子溶液进行培养;
4)向细胞培养体系中加入PPi溶液进行培养;
5)用黄色的激发光通道拍摄上述细胞。
通过上述技术方案,本发明首先将邻苯二胺和蒸馏水混合,经水热反应,离心透析等纯化手段收集产物,得到氮掺杂碳量子点。在反应过程中,OPD是作为合成氮掺杂碳量子点的碳源和氮源。本发明所制备的氮掺杂碳量子点荧光量子产率高、分散性好、且可控制,生产成本低,重现性好,形貌均匀。
由于制备的氮掺杂碳量子点与Fe3+之间存在强的配位作用,使得碳点聚集猝灭导致氮掺杂碳量子点荧光有效猝灭。依据氮掺杂碳量子点荧光强度的变化与Fe3+浓度的线性依赖关系,再加入PPi后由于Fe3+与PPi的强结合作用强于铁与含氧基团的配位作用,使碳点与Fe3+的结合分离从而碳点荧光恢复,实现了对三价铁离子及焦磷酸根的高灵敏、高选择性的开关模式荧光传感。由于此碳点的低毒性,取碳点加入细胞中可实现细胞成像,实现了细胞内荧光开关性变亮变暗。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本发明,但并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为实施例1中制备的氮掺杂碳量子点的透射电子显微镜图;
图2为利用实施例1中制备的氮掺杂碳量子点检测Fe3+的荧光发射光谱图;
图3为利用实施例1中制备的氮掺杂碳量子点检测Fe3+的荧光强度线性图;
图4为利用实施例1中制备的氮掺杂碳量子点检测PPi的荧光发射光谱图;
图5为利用实施例1中制备的氮掺杂碳量子点检测PPi的荧光强度线性图;
图6为含氮掺杂碳量子点对Fe3+及不同物质的荧光响应柱状图;
图7为Fe3+存在下含氮掺杂碳量子点对PPi及不同物质的荧光响应柱状图;
图8为利用应用例5中制备的氮掺杂量子点细胞成像照片;
图9为利用应用例5中制备的氮掺杂碳量子点在不同浓度Fe3+存在下的细胞成像照片;
图10为利用应用例6中制备的氮掺杂碳量子点在Fe3+存在下,加入不同浓度的PPi后的细胞成像照片。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种黄光发射荧光探针的制备方法,该制备方法为:将邻苯二胺OPD和水进行水热反应,接着进行纯化以得到黄光的氮掺杂碳量子点,即黄光发射荧光探针。
在上述制备方法中,OPD的浓度可以在宽的范围内选择,但是为了进一步提高氮掺杂碳量子点的产率,优选地,水热反应的体系中,OPD的浓度为0.06-0.07mmol/L。
在上述制备方法中,水热反应的条件可以在宽的范围内选择,但是为了进一步提高氮掺杂碳量子点的产率,优选地,水热反应的条件为:温度为150-170℃,时间为7-9h。
在上述制备方法中,纯化的方式可以在宽的范围内选择,但是为了进一步提高氮掺杂碳量子点的产率,优选地,水热反应结束后,纯化包括:将体系进行离心后收集上层溶液,接着将上层溶液于900-1200Da透析袋中透析10-14h。
本发明还提供了一种黄光发射荧光探针,该黄光发射荧光探针通过上述的制备方法制备而得。
本发明也提供了一种选择性检测Fe3+的方法,包括:
1)将羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES缓冲溶液、不同已知浓度的Fe3+溶液、上述的黄光发射荧光探针溶液混合、定容,得到待测已知溶液;
2)将步骤1)中的Fe3+溶液去除后,得到空白待测溶液;
3)分别测定各待测已知溶液和空白待测溶液的最大荧光强度;
4)以待测已知溶液的最大荧光强度和空白待测溶液的最大荧光强度的比值取对数为纵坐标,Fe3+的浓度为横坐标,建立荧光发射光谱曲线方程;
5)测定待检测Fe3+样本的最大荧光强度,然后根据荧光发射光谱曲线方程计算得到Fe3+的浓度。
本发明进一步提供了一种选择性检测PPi的方法,包括:
1)将不同已知浓度的焦磷酸根PPi溶液分别与羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES缓冲溶液、Fe3+溶液、上述的黄光发射荧光探针溶液混合、定容,得到待测已知溶液;
2)将步骤1)中的PPi溶液去除后,得到空白待测溶液;
3)分别测定各待测已知溶液和空白待测溶液的最大荧光强度;
4)以待测已知溶液的最大荧光强度和空白待测溶液的最大荧光强度的比值取对数为纵坐标,PPi的浓度为横坐标,建立荧光发射光谱曲线方程;
5)测定待检测PPi样本的最大荧光强度,然后根据荧光发射光谱曲线方程计算得到PPi的浓度。
在上述选择性检测Fe3+的方法中,各物料的用量可以在宽的范围内选择,但是为了进一步提高检测精准度,优选地,在选择性检测Fe3+的方法中,HEPES缓冲溶液、黄光发射荧光探针溶液、Fe3+溶液的用量比为800μL:150-170μL:40-60μL。
在上述选择性检测PPi的方法中,各物料的用量可以在宽的范围内选择,但是为了进一步提高检测精准度,优选地,HEPES缓冲溶液、黄光发射荧光探针溶液、Fe3+溶液、PPi溶液的用量比为800μL:150-170μL:160-180μL:40-60μL,Fe3+溶液的浓度为80-100μmol/L。
在选择性检测Fe3+和PPi的方法中,HEPES缓冲溶液的浓度和pH可以在宽的范围内选择,但是为了进一步提高检测精准度,优选地,HEPES缓冲溶液满足:HEPES的浓度为0.008-0.010mol/L,pH为5.0-7.4。
在选择性检测Fe3+和PPi的方法中,最大荧光强度的检测温度可以在宽的范围内选择,但是为了进一步提高检测精准度,优选地,在选择性检测Fe3+和PPi的方法中,最大荧光强度于290-300K下检测而得。
在选择性检测Fe3+和PPi的方法中,最大荧光强度的检测波长可以在宽的范围内选择,但是为了进一步提高检测精准度,优选地,在选择性检测Fe3+和PPi的方法中,最大荧光强度的检测波长范围为450-750nm。
本发明更进一步提供了一种基于Fe3+和PPi的开-关模式的细胞成像方法,包括:
1)将细胞置于含有上述的黄光发射荧光探针的培养液中进行贴壁培养;
2)用HEPES缓冲溶液洗去培养液,得到在紫外灯下发黄光的细胞;
3)向步骤2)中的细胞培养体系中加入Fe3+离子溶液进行培养;
4)向细胞培养体系中加入PPi溶液进行培养;
5)用黄色的激发光通道拍摄上述细胞。
在上述细胞成像方法中,培养液中黄光发射荧光探针的浓度可以在宽的范围内选择,但是为了进一步便于调控细胞内的荧光强度,优选地,培养液中黄光发射荧光探针的浓度为0.7-0.9g/L。
在上述细胞成像方法中,细胞的种类可以在宽的范围内选择,但是为了进一步便于调控细胞内的荧光强度,优选地,步骤1)中,细胞为A549细胞。
在上述细胞成像方法中,贴壁培养的条件可以在宽的范围内选择,但是为了进一步便于调控细胞内的荧光强度,优选地,贴壁培养的条件为:培养温度为35-38℃,培养时间为3-5h。
在上述细胞成像方法中,步骤3)-4)中培养时间可以在宽的范围内选择,但是为了进一步便于调控细胞内的荧光强度,优选地,步骤3)-4)中培养时间各自独立地为4-10min。
在上述细胞成像方法中,HEPES、Fe3+离子溶液、PPi溶液的浓度可以在宽的范围内选择,但是为了进一步便于调控细胞内的荧光强度,优选地,HEPES缓冲溶液满足:HEPES的浓度为0.008-0.010mol/L,pH为5.0-7.4;Fe3+离子溶液中Fe3+的浓度为0.392-3.05mmol/L;PPi溶液中PPi的浓度为0.351-2.20mmol/L。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
将0.2160g邻苯二胺溶解于30mL二次蒸馏水中,超声溶解,得到均匀的混合溶液,混合溶液中OPD浓度为0.066mmol/L;将混合溶液转移至50ml不锈钢聚四氟乙烯的高温反应釜中,于160℃下水热反应8h,取出反应釜自然冷却至25℃,之后,通过离心收集产物上层溶液,用1000Da透析袋透析12h得到氮掺杂碳量子点溶液,置于避光下贮存备用。
氮掺杂碳量子点的TEM表征图如图1所示,从图中可以看出氮掺杂碳量子点尺寸大小分散较均匀,为接近球形的颗粒物,平均尺寸大小为2.6nm,和碳纳米材料尺寸分布特点相一致。
实施例2
按照实施例1的方法进行,唯一所不同的是,于150℃下水热反应9h。
实施例3
按照实施例1的方法进行,唯一所不同的是,于170℃下水热反应7h。
实施例4
按照实施例1的方法进行,唯一所不同的是,混合溶液中OPD浓度为0.06mmol/L。
实施例5
按照实施例1的方法进行,唯一所不同的是,混合溶液中OPD浓度为0.07mmol/L。
应用例1
准确量取800μL的HEPES缓冲溶液(0.01mol/L,pH=6.0),160μL纯化的氮掺杂碳量子点溶液(实施例1制得的氮掺杂碳量子点溶液)和50μL不同浓度的三价铁离子依次加入2mL离心管中,定容,振荡混匀得到待测已知溶液。随后,在25℃条件下恒温静置5min后,测定溶液的荧光发射光谱(激发波长为410nm),如图2所示。
以待测已知溶液、空白组(相对待测已知溶液,无三价铁离子存在)于573nm处荧光发射峰的荧光强度的比值取对数为纵坐标,三价铁离子浓度为横坐标,建立荧光发射光谱曲线的方程,得到温度为25℃条件下的荧光发射光谱曲线的方程为:y=0.011x(μmol/L)+0.006,相关系数为0.998,如图3所示,从图3可以看出氮掺杂碳量子点检测三价铁离子的线性检测范围为0.1-80μmol/L,检测限为6.34×10-8mol/L。
抗干扰检测:准确量取800μL的HEPES缓冲溶液(0.01mol/L,pH=6.0),160μL纯化的氮掺杂碳量子点溶液(实施例1制得的氮掺杂碳量子点溶液)和200μL不同阳离子分别依次加入2mL离心管中,定容,振荡混匀得到待测已知溶液。随后,在25℃条件下恒温静置5min后,测定溶液的荧光发射光谱(激发波长为410nm),如图6所示,由图可知,氮掺杂碳量子点对三价铁离子的检测具有优异的选择性。
应用例2
准确量取800μL的HEPES缓冲溶液(0.01mol/L,pH=6.0),160μL纯化的铜掺杂碳量子点溶液,1mM三价铁离子溶液180μL和50μL不同浓度的焦磷酸根离子依次加入2mL离心管中,定容,振荡混匀得到待测已知溶液。随后,在25℃条件下恒温静置5min后,测定反应溶液的荧光发射光谱(激发波长为410nm),如图4所示。
以待测已知溶液、空白组(有三价铁离子存在但没有焦磷酸根离子存在)于573nm处荧光发射峰的荧光强度的比值取对数为纵坐标,焦磷酸根离子浓度为横坐标,建立荧光发射光谱曲线的方程,得到温度为25℃条件下的荧光发射光谱曲线的方程为:y=0.005x(μmol/L)-0.003,相关系数为0.998,如图5所示,从图5可以看出氮掺杂碳量子点检测焦磷酸根离子的线性检测范围为0.5-120μmol/L,检测限为2.1×10-8mol/L。
抗干扰检测:准确量取800μL的HEPES缓冲溶液(0.01mol/L,pH=6.0),160μL纯化的铜掺杂碳量子点溶液,1mM三价铁离子溶液180μL和200μL不同的阴离子分别依次加入2mL离心管中,定容,振荡混匀得到待测已知溶液。随后,在25℃条件下恒温静置5min后,测定反应溶液的荧光发射光谱(激发波长为410nm),如图7所示,由图可知,氮掺杂碳量子点对焦磷酸根离子的检测具有优异的选择性。
应用例3
按照应用例1的方法进行,唯一所不同的是:HEPES缓冲溶液的浓度为0.012mol/L,pH为7.0
应用例4
按照应用例1的方法进行,唯一所不同的是:HEPES缓冲溶液的浓度为0.008mol/L,pH为5.0。
应用例5
称量0.8mg实施例1合成的碳点,溶入到10mL细胞培养液中,加入到含贴壁A549细胞的玻底培养皿里,37℃下培养4小时,后用HEPES缓冲溶液洗去培养液(此时的细胞成像照片见图8),加入不同浓度的三价铁离子,培养五分钟,后在黄色通道下拍摄得到相应的细胞荧光亮度照片,结果如图9,由图明显看到细胞亮度明显下降(由左至右,照片对应的三价铁离子的浓度依次为0.392mmol/L、1.1mmol/L、1.82mmol/L、3.05mmol/L)。
应用例6
按照应用例5的方法进行,所不同的是:加入不同浓度的三价铁离子,培养五分钟后加入不同浓度的焦磷酸根离子,再培养五分钟,在黄色通道下拍摄得到相应的荧光亮度照片图,结果如图8所示,由图明显看到细胞亮度逐渐变亮,且亮度超过原始的没加入三价铁离子浓度之前的荧光亮度(由左至右,照片对应的焦磷酸根离子的浓度依次为0.35mmol/L、1.02mmol/L、1.64mmol/L、2.2mmol/L)。
为了研究该氮掺杂碳量子点探针对三价铁离子和焦磷酸根离子检测的选择性。三价铁离子能使所制备的氮掺杂碳量子点的荧光有显著地猝灭效果。如图10所示,焦磷酸根离子会与三价铁离子结合使碳点荧光恢复甚至比原始碳点更亮,与其他干扰物质相比,其它和焦磷酸根离子相似的物质几乎不影响氮掺杂碳量子点加入三价铁离子后的荧光亮度。这一结果表明,所提出的氮掺杂碳量子点加入三价铁离子后对焦磷酸根离子荧光传感体系具有很好的选择性。
应用例3-4的检测结果与应用例1的结果基本一致;将应用例1-2、5-6中的氮掺杂碳量子点换为实施例2-5中的产物,检测结果与应用例1-2、5-6的结果基本一致。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种黄光发射荧光探针的制备方法,其特征在于,所述制备方法为:将邻苯二胺OPD和水进行水热反应,接着进行纯化以得到黄光的氮掺杂碳量子点,即黄光发射荧光探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其中,水热反应的体系中,OPD的浓度为0.06-0.07mmol/L。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其中,水热反应的条件为:温度为150-170℃,时间为7-9h。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其中,水热反应结束后,纯化包括:将体系进行离心后收集上层溶液,接着将上层溶液于900-1200Da透析袋中透析10-14h。
5.一种黄光发射荧光探针,其特征在于,所述黄光发射荧光探针通过权利要求1-4中任意一项所述的制备方法制备而得。
6.一种选择性检测Fe3+的方法,其特征在于,包括:
1)将羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES缓冲溶液、不同已知浓度的Fe3+溶液、权利要求5所述的黄光发射荧光探针溶液混合、定容,得到待测已知溶液;
2)将步骤1)中的Fe3+溶液去除后,得到空白待测溶液;
3)分别测定各待测已知溶液和空白待测溶液的最大荧光强度;
4)以待测已知溶液的最大荧光强度和空白待测溶液的最大荧光强度的比值取对数为纵坐标,Fe3+的浓度为横坐标,建立荧光发射光谱曲线方程;
5)测定待检测Fe3+样本的最大荧光强度,然后根据荧光发射光谱曲线方程计算得到Fe3+的浓度。
7.一种选择性检测PPi的方法,其特征在于,包括:
1)将不同已知浓度的焦磷酸根PPi溶液分别与羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES缓冲溶液、Fe3 +溶液、权利要求5所述的黄光发射荧光探针溶液混合、定容,得到待测已知溶液;
2)将步骤1)中的PPi溶液去除后,得到空白待测溶液;
3)分别测定各待测已知溶液和空白待测溶液的最大荧光强度;
4)以待测已知溶液的最大荧光强度和空白待测溶液的最大荧光强度的比值取对数为纵坐标,PPi的浓度为横坐标,建立荧光发射光谱曲线方程;
5)测定待检测PPi样本的最大荧光强度,然后根据荧光发射光谱曲线方程计算得到PPi的浓度。
8.根据权利要求6或7的方法,其特征在于,在选择性检测Fe3+的方法中,HEPES缓冲溶液、黄光发射荧光探针溶液、Fe3+溶液的用量比为800μL:150-170μL:40-60μL;在选择性检测PPi的方法中,HEPES缓冲溶液、黄光发射荧光探针溶液、Fe3+溶液、PPi溶液的用量比为800μL:150-170μL:160-180μL:40-60μL,Fe3+溶液的浓度为80-100μmol/L;
优选地,HEPES缓冲溶液满足:HEPES的浓度为0.008-0.010mol/L,pH为5.0-7.4;
更优选地,在选择性检测Fe3+和PPi的方法中,最大荧光强度于290-300K下检测而得;
进一步优选地,在选择性检测Fe3+和PPi的方法中,最大荧光强度的检测波长范围为450-750nm。
9.一种基于Fe3+和PPi的开-关模式的细胞成像方法,其特征在于,包括:
1)将细胞置于含有权利要求5所述的黄光发射荧光探针的培养液中进行贴壁培养;
2)用HEPES缓冲溶液洗去培养液,得到在紫外灯下发黄光的细胞;
3)向步骤2)中的细胞培养体系中加入Fe3+离子溶液进行培养;
4)向细胞培养体系中加入PPi溶液进行培养;
5)用黄色的激发光通道拍摄上述细胞。
10.根据权利要求9的细胞成像方法,其中,培养液中黄光发射荧光探针的浓度为0.7-0.9g/L;
优选地,步骤1)中,细胞为A549细胞;
更优选地,贴壁培养的条件为:培养温度为35-38℃,培养时间为3-5h;
进一步优选地,步骤3)-4)中培养时间各自独立地为4-10min;
更进一步优选地,HEPES缓冲溶液满足:HEPES的浓度为0.008-0.010mol/L,pH为5.0-7.4;Fe3+离子溶液中Fe3+的浓度为0.392mmol/L-3.050mmol/L;PPi溶液中PPi的浓度为0.351mmol/L-2.20mmol/L。
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