CN114540551B - 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法 - Google Patents

一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114540551B
CN114540551B CN202210246590.0A CN202210246590A CN114540551B CN 114540551 B CN114540551 B CN 114540551B CN 202210246590 A CN202210246590 A CN 202210246590A CN 114540551 B CN114540551 B CN 114540551B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pathogens
detection
probe
liquid
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210246590.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114540551A (zh
Inventor
尹飞飞
薛莉颖
田秀颖
黄艺
肖美芳
王高玉
彭箬岩
杜江
杜永国
张丽媛
胡小媛
谢晓菲
贾毅博
邓宛心
黎悠悠
李子涵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hainan Medical College
Original Assignee
Hainan Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hainan Medical College filed Critical Hainan Medical College
Priority to CN202210246590.0A priority Critical patent/CN114540551B/zh
Publication of CN114540551A publication Critical patent/CN114540551A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114540551B publication Critical patent/CN114540551B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于同时检测三类病原体的引物和探针组合物和检测方法，这三类病原体包括恙虫病东方体、Q热立克次体、普氏立克次体、发热伴血小板减少综合征病毒和汉坦病毒，引物和探针组合物包括对应的5套引物和探针组合物，其核苷酸序列依次为序列表中SEQIDNO:1‑21所示，本发明提供的检测方法经过杂交条件优化，在同一个反应管中可以完成5种病原体的PCR扩增和杂交反应，反应后根据液相芯片悬浮仪自动输出数据，最低能检测到102copy/μL病毒DNA，整个检测过程简便、快速、成本低，特异性和敏感性高、适用于大量样品的高通量快速检测，具有了良好的应用前景。

Description

一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，尤其是一种同时检测这三类病原体的检测方法，特别涉及一种液相芯片检测方法。
背景技术
立克次氏体(Rickettsia)，分为立克次体科和无形体科以及全孢菌科，是介于细菌与病毒之间，而接近于细菌的一类原核生物，没有核仁及核膜，以节肢动物为传播媒介。目前，我国存在的立克次体病主要包括恙虫病、Q热、流行性斑疹伤寒等20余种，对应的病原体分别为恙虫病东方体(orientia tsutsugamushi)、Q热立克次体(又称贝纳柯克斯体或Q热柯克斯体，简称Q热)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii，简称Rick)。成人和儿童感染立克次体后仍可引起如面神经麻痹、耳聋、心脏器质性病变等严重的并发症，甚至死亡。
发热伴血小板减少综合征病毒(sever feverwiththrombocytopnia syndromevirus，简称SFTSV)，又称“新布尼亚病毒”，2011年SFTSV在我国被首次分离鉴定，属于布尼亚病毒目，白纤病毒科，班大病毒属。为单股负链RNA病毒，其基因组含有大(L)、中(M)、小(S)3个RNA环形片段。病毒感染人体引起的发热伴血小板减少综合征、发热、血小板和白细胞减少为主要临床表现，病情危重者可发生多脏器功能衰竭而死亡，目前尚无可用检测试剂或产品。
汉坦病毒(Hantaan hantavirus，Hanta)属于汉坦病毒属于布尼亚病毒目，汉坦病毒科，正汉坦病毒属。有包膜，分节段的单股负链RNA病毒，病毒组包括S、M和L三个片段，分别编码核蛋白、糖蛋白、聚合酶蛋白，主要临床表现为汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS)。
目前这三类病原体单独的实验室鉴定方法主要依靠传统的分离培养、血清学检测、免疫组化以及分子生物学中的常规PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR等，这些方法或是耗时、费力、敏感性低，或是成本较高、或是只能做单一病原体鉴定、最多2种联检等弊端。这三类病原体都属于人畜共患病病原体，有明显的地区聚集性，多发生在植被茂盛的丘陵地带和农村山区。近年来,这种三种病原体的混合感染在我国的发病率呈上升趋势,对人畜生命健康都造成了很大的经济和社会损失。因此，急需建立快速、准确、联合的诊断方法，因此，亟需建立一种快速、精确地检测并区分这三类病原体的联合检测方法，从而满足对大规模临床样品大量、高通量的检测需求。
液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，MASA)技术是整合了激光技术、流式细胞仪、数字信号处理和传统化学技术的一种新型生物分子检测技术，液相芯片技术支持单重和多重分析，可在多种测定方法中对蛋白质和核酸靶标进行高通量检测。液相芯片可广泛应用于各种免疫分析和核酸检测中，但是，目前国内液相芯片仍处于起步阶段，主要应用在科研领域，还未形成产业化。
发明内容
本发明的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷，提供一种可同时检测三类病原体的液相芯片检测产品和方法。
为达到上述目的，本发明要求保护一种引物和探针组合物，用于同时检测三类病原体，这三类病原体包括立克次体、发热伴血小板减少综合征病毒和汉坦病毒，其中，立克次体包括恙虫病东方体、Q热立克次体、普氏立克次体；该引物和探针组合物包括：根据恙虫病东方体的47-kDahtrA基因序列设计的引物47-kDa-F1、47-kDa-R1和47-kDa-R2,探针47-kDa-probe；根据Q热立克次体的IS1111基因序列设计的引物Q-F1、Q-F2、和Q-R1,探针Q-probe；根据普氏立克次体的htrA基因序列设计的引物Rick-F1、Rick-F2、和Rick-R1,探针Rick-probe；根据发热伴血小板减少综合征病毒的L片段序列设计的引物SFTSV-F1、SFTSV-R1、SFTSV-F2和SFTSV-R2,探针SFTSV-probe；根据汉坦病毒的S片段序列设计的引物Hanta-F1、Hanta-R1和Hanta-R2,探针Hanta-probe；该引物和探针组合物的核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:1-21所示。
本发明要求保护的引物和探针组合物，其中的引物和探针组合物用于液相芯片，与对应SEQ ID NO:1-21所示的序列相比,分别具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加，或者分别具有80％-99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No:1-21的序列具有相同功能。
本发明要求保护的引物和探针组合物，其中的引物为多重不对称PCR扩增引物。
本发明要求保护一种同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，包含参与反应的引物和探针组合物；该方法包括：制备检测微球：取磁珠振荡超声后，和这5套探针充分振荡偶联形成5套检测微球；制备PCR反应体系：制备25μL反应体系，包括DNA 1.0μL、PCR预混液12.5μL、上下游引物(10μM)各0.5μL、去离子水；PCR扩增反应：98℃预变性5min，98℃30s，58℃30s，72℃1min，40个循环，最后72℃延伸5min；制备杂交反应体系：检测微球各0.5μL、33μL 1.5xTMAC、12μL TE、PCR产物5μL；杂交反应：95℃变性5min，55℃-58℃杂交10-15min；微球标记：在上述杂交液中，加入10μL 50μg/mL链霉素亲和素、R-藻红蛋白偶联物，55℃反应10min；结果检测：将上述反应液转移至96孔版，使用液相芯片悬浮仪进行检测；该方法不包括疾病的诊断与治疗方法。
本发明要求保护的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，其中的磁珠选用MagPLEX磁珠。
本发明要求保护的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，杂交反应中，杂交温度为58℃，杂交时间为15min。
本发明要求保护的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，结果检测中，液相芯片悬浮仪能够检测磁珠的荧光强度值为Median值，输出的数据为每一种检测微球的平均荧光强度值，即MFI值。
本发明要求保护的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，其中还包括阴性对照，检测待测样品的MFI值为检测阴性对照的MFI值的三倍以上时，判断结果为阳性。
本发明要求保护一种同时检测三类病原体的液相芯片的试剂盒，包括5套引物和探针组合物、磁珠和同时检测三类病原体的液相芯片的杂交反应体系。
本发明要求保护的同时检测三类病原体的液相芯片的试剂盒，包括标准物质和阴性对照。
本发明还可以保护的引物和探针组合物、一种同时检测三类病原体的液相芯片检测方法、一种同时检测三类病原体的液相芯片的试剂盒，在检测恙虫病东方体、Q热立克次体、普氏立克次体、发热伴血小板减少综合征病毒和汉坦病毒这5种病原体中的应用；该应用不包括疾病的诊断和治疗方法。
本发明的有益效果：
本发明所述液相芯片技术是一种可同时针对多个目标分子进行定量、定性分析的新型芯片技术，比如本发明所述的5种病原体：恙虫病东方体、Q热立克次体、普氏立克次体、发热伴血小板减少综合征病毒和汉坦病毒；液相芯片不同于传统的固相芯片技术，无需在芯片上进行点样，而是将探针结合于微球载体上，悬浮于液态环境中对样品进行检测。该方法具有操作简便、耗时短、高通量以及准确性高的优点，适合大量样品的高通量快速检测。
本发明所述的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，不仅可以对含有本发明所述三类病原体(共5种病原体)中的任何单独一种病原体样品进行检测，也可以实现三类病原体(共5种病原体)的同时检测，还可对检测的5种病原阳性加以区分，节省了时间和成本，具有了良好的应用前景。
本发明成功建立了能同时检测5种病原体的液相芯片检测方法平台，该方法在对混合PCR产物检测过程中，没有发生两种病原体同时阳性的情况，且阴阳性数值差异明显，特异性良好；该方法同时检测5种病原体的液相芯片及检测平台的灵敏度可达102，比现有多重PCR检测方法(103)至少提高10倍；而且，本发明所述液相芯片检测方法，实现了对5种病原体的同时检测，相对于传统的多重RT-PCR(大多是2重或3重PCR)，不存在随着病原数量的增加，灵敏度下降的局限性。
本发明所述的同时检测三类病原体的液相芯片，所述检测结果通过液相芯片悬浮仪自动输出，一般依赖于人工判读；所述结果可以包括荧光强度的平均值，具有统计学意义，而且数据化的结果可以实现自动分析，易于实现检测结果报告的自动化。
本发明所述同时检测三类病原体的液相芯片检测方法操作简便，在PCR扩增后，不需要对PCR产物进行处理，可直接与微球杂交，节省了步骤和时间，简化了工艺；本发明检测过程中无需使用感染性或生物安全隐患的成分，使用安全；本检测方法耗时短(操作时间40分钟，全部检测时间3小时)，成本低，特异性强，灵敏度高，为上述五种病原体的快速检测提供了一个新的技术平台。
具体实施方式
下面结合实际应用详细描述本发明的示例性的实施例，在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，MagPLEX磁珠和MAGPIX液相悬浮芯片仪均在美国Luminex公司购买；链霉亲和素-藻红蛋白购自Invitrogen-Thermo Fisher Scientific公司。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
本发明实施的应用对象仅仅涉及采自于体外的是指采自于人体或动物体的组织、体液或排泄物等的生物样本，比如已经脱离了有生命的人体或动物体的血液样品(全血/血清/血浆)和体液样品(尿液/粪便/脑脊液/浆膜腔积液/精液/前列腺液/阴道分泌物/胃液/十二指肠引流液及胆汁/痰液)等，不是有生命的人体或动物体，而是离体的无生命的生物样本；所述检测的直接目的，不是获得疾病的诊断结果或健康状况，而仅仅是进行相关生物学信息的实验室检测或鉴定，所得检测或鉴定的结果一般称之为阴性或阳性，并且检测或鉴定过程中不包括将检测到的生物信息(比如阴性、阳性的结果)与基准数据(疾病确诊)进行比较的步骤，也不包括将检测到的生物信息直接得出疾病诊断结论的步骤，所得结果不直接用于疾病的诊断。因此，本发明不属于疾病的诊断方法，符合《专利法》对专利保护客体的基本要求。
实施例1、引物和探针的设计
根据GenBank中恙虫病东方体的47-kDa htrA基因序列、Q热(Q)的IS1111基因序列、普氏立克次体(Rick)的htrA基因序列、发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的L片段基因序列和汉坦病毒(Hanta)的S片段基因序列的保守区域，设计3套分别针对三种鸡群新发传染病病毒的引物和探针，所述引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物和探针序列详见序列表1中SEQ ID NO:1-21所示。
表1引物和探针的名称和序列
备注：本申请的发明人经过大量的研究(其中，设计了2套引物和探针序列，只筛选到本发明所述能特异性扩增阳性47-kDa、Q、Rick、SFTSV和Hanta质粒DNA的引物和探针组合物，出人意料地发现了这套引物和探针配对组合物特别适用于本发明所述的同时检测三类病原体的液相芯片的检测方法。
实施例2、三种病原体液相芯片联合检测平台的建立
2.1、标准物质的制备
本发明相关5个病原体基因片段，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成基因片段，并将病原体的目标基因片段克隆得到重组质粒，质粒提取后，用NAS-99微量分光光度计测定浓度，根据阿弗加德罗数将浓度换算为拷贝数，拷贝数(拷贝/μL)＝6.02×1023×测定浓度(ng/μl×10-9)/(DNA长度×660)＝拷贝/μl，然后用无核酶水进行梯度稀释至1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μl，分装后-20℃保存备用。
2.2、制备检测微球
①取出磁珠(MagPLEX磁珠，Luminex公司)原液恢复至室温，涡旋振荡器振荡1min并超声，取50μL磁珠到离心管中，将离心管放置在磁力架上1min,吸弃上清；
②加入50μL 0.1M MES(pH4.5，购自Sigma公司)重悬，振荡超声20s；
③往磁珠中加入1μL 100μM的核酸探针(即1μL探针的终浓度至20pmol/μL)，振荡混匀；
④用ddH2O配新鲜的EDC溶液(10mg/mL，购自Thermo Fisher Scientific公司),加入2.5μL 10mg/mL的EDC溶液，振荡混匀；室温避光30min；
⑤用ddH2O配新鲜的EDC溶液(10mg/mL),加入2.5μL 10mg/mL的EDC溶液，振荡混匀；室温避光30min；
⑥加入1mL 0.02％Tween-20(购自Sigma公司),振荡混匀；将离心管放置在磁力架上1min，吸弃上清；
⑦加入1mL 0.1％SDS(购自Sigma公司)重悬，振荡混匀；将离心管放置在磁力架上1min，吸弃上清；
⑧加入100μL TE(pH8.0，购自Sigma公司)重悬，振荡超声混匀约20s,获得用于检测的偶联微球，4℃避光保存待用。
2.3、反应体系和反应扩增反应
PCR反应体系(25μL)：PCR预混液(Multiplex PCR Plus kit，购自Qiagen公司)12.5μL，上下游引物(10μM)各0.50μL(即1μL引物的终浓度至20pmol/μL)，DNA 1.0μL(标准物质终浓度为1×102)，去离子水补足25μL。
PCR扩增反应：98℃预变性5min，98℃30s，58℃30s，72℃1min，40个循环，最后72℃延伸5min。
2.4、杂交步骤
①用涡流振荡器充分振荡已经偶联好的微球；
②1个反应体系的用量：将每种微球各0.5μL加入PCR管中，加入33μL 1.5×TMAC和12μL TE(PH为8.0)，充分混匀，加入多重反应的PCR产物5μL；
③95℃变性5min，选用一定的温度杂交一定的时间；
④每个PCR管中加入10μL 50μg/mL链霉素亲和素、R-藻红蛋白偶联物，55℃反应10min后，转移至96孔版，使用液相芯片悬浮仪进行检测；
⑤按照仪器操作说明，对仪器进行开机准备，将96孔板放入检测仓内检测；
2.5、结果判定
以阴性对照(B)作为检测本底进行杂交检测，对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内每一种检测微球的平均荧光强度值(即每个体系每种微球系统自动检测50个微球，系统自动显示的微球平均荧光强度值是50个微球的荧光强度值的平均值)，即MFI值，以及本底(阴性对照：水)荧光强度值,即为BFI值,当待检测样本的MFI值,为本次检测背景信号强度三倍以上时，即判为阳性(+)、反之为阴性(-)，即MFI(+)≥3×BFI、MFI(-)＜3×BFI。
2.6、杂交条件优化
上述杂交步骤③中，调整杂交温度以及杂交时间，完成杂交条件的优化：
优化杂交温度：固定杂交时间为10min，杂交温度平行选择2个温度(55℃、58℃)，以混合模板的PCR产物为被检测物，以Median值进行结果判断。
结果如下表2、3所示：
表2杂交温度为55℃的检测结果
样本 恙虫病东方体 Q热 普氏立克次体 SFTSV 汉坦病毒
恙虫病东方体 2325 543 141.5 234 601
Q热 187.5 2783 262 265.5 1223
普氏立克次体 633.5 273 2541 985.5 339
SFTSV 761.5 605 793 2386 543
汉坦病毒 133 355 537 632 2391
B 357 397 249.5 266 223.5
表3杂交温度为58℃的检测结果
样本 恙虫病东方体 Q热 普氏立克次体 SFTSV 汉坦病毒
恙虫病东方体 3122 644 618 836 746
Q热 666 2948 752.5 683 618
普氏立克次体 815 376 3715 813 970
SFTSV 442 627 418 3419 552
汉坦病毒 364 371 338 545 3025
B 478 421 511 342 666
注：表中B代表Blank,即PCR反应中的阴性对照(水)。
通过表2、表3的结果对比，样品(标准物质)终浓度均为1×102时，可见表2(55℃)中，普氏立克次体与SFTSV和汉坦病毒的检测结果存在一定的灰度值(793、985.5)，阴阳性判定不明显，而表3(58℃)时，阴阳数值差异明显，不存在检测灰度。
优化杂交时间：根据上一步确定最优杂交温度为58℃后，杂交时间分别平行选择2个时长(10min、15min)，以混合模板的PCR产物为被检测物，比较不同杂交时间对信号强度(Median值)的影响。
结果如下表4所示：
表4不同杂交时间(10min、15min)检测结果对比表(原表4、5)
注：表中B代表Blank,即PCR反应中的阴性对照(水)。
通过表4中不同杂交时间结果对比可见，样品(标准物质)终浓度均为1×102时，杂交时间为15min的阳性值更高、阴阳数值差异更明显，且不存在检测灰度，因此杂交时间选用15min相对更具优势。
实施例3、三种病原体液相芯片联合检测方法的性能验证
3.1、特异性
根据上述PCR反应和杂交步骤所述进行验证，所述标准物质终浓度为1×103，并根据以上验证的最优反应体系(杂交温度为58℃、杂交时间为15min)进行杂交和检测，比较每种病原体之间对信号强度(Median值)是否存在交叉影响，结果详见下表5所示。
表5特异性检测结果对比表
注：表中B代表Blank,即PCR反应中的阴性对照(水)。
通过表5可见：与表3相比，当检测样本的浓度(1×102→1×103)升高，检测值(Median值)也会相应的升高。同时，在对混合PCR产物检测过程中，没有发生两种病原体同时阳性的情况，且阴阳性数值差异明显，例如，当SFTSV为阳性时，其他的四种病原体检测都为阴性，没有同时出现两种阳性的情况，其他的病原体也是一样的。由此可见本发明所述同时检测三类病原体的液相芯片及检测平台具有良好的特异性。
3.2、灵敏性
根据上述PCR反应和杂交步骤所述进行验证，选用最优反应体系(杂交温度为58℃、杂交时间为15min)进行杂交和检测，其中，标准物质选用6个浓度梯度分别进行PCR扩增和之后的杂交，比较不同标准物质浓度最终检测结果的信号强度(Median值)的灵敏度，结果详见下表6所示。。
表6不同样品浓度的检测结果
注：表中B代表Blank,即PCR反应中的阴性对照(水),S1-S6分别代表标准物质的浓度分别为：1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106，浓度单位为：拷贝/μL。
通过表6可见：所有5种病原体的标准物质采用1×102拷贝/μL开始，均可以被检出阳性，且阴阳性差异明显，因此本发明所述同时检测三类病原体的液相芯片及检测平台的灵敏度可达102，比现有多重PCR检测方法(103)至少提高10倍。
本发明提供了一种能同时检测5种病原体的液相芯片检测方法平台，根据本发明的总体构思，成功设计出5套引物和探针组合物，并优化了杂交温度和杂交时间，操作简便、耗时短；不仅可以实现5种病原体的同时检测，还可对检测的5种病原阳性加以区分，灵敏度可达102；不存在交叉影响，特异性良好；进一步地，本发明不需要对PCR产物进行处理，工艺简化；检测过程中无需使用感染性或生物安全隐患的成分，使用安全；本发明确定了阴阳性判定标准，数据结果输出可实现数字化、自动化，具有了良好的应用前景。
本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，使得本领域技术人员将会容易理解。但是根据已经公开的所有描述，可以对那些细节进行不同的修饰或替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 海南医学院
<120> 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法
<130> 2022-03-07
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gaaggatctg cagcacaatg tggaattgyt cctggagatg 40
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ccatayctyc cccaagaaga gttaggcgaa acttcaagga c 41
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ctttgatcat tactttgttg c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tcactatcct cctttgttgg ca 22
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gcgtggtgat gaagcgtgtg gaggagcgaa cc 32
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
cgcagcacgt caaaccg 17
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ttgatcagcc gtgcggcttt tgactaaacg atcgc 35
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gaatgatcgt aacgatgcgc aggcgataga agcggct 37
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
tctatgttag cmtgtaaygg tccgggyggt atgaa 35
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
aaacaagcaa ggtacacttc ttg 23
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
tcctgytcca tacctgcacc gatttgtcac caag 34
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
cggtgctggc ggcgcattac ttggttctca attcggtaag 40
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
ttagcgtctg tagtctcgtc 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
aatgatgttt gttgttgctc ct 22
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
caggatgaca gaggagct 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
ttgaggttgg tgatgaagt 19
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
gctacagaag tgaagaagag cttgatatta gcagg 35
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
catggagtgc aacatgt 17
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
tatggtcaga tgtact 16
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
tctataggat cagtcat 17
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
tacagatagg ctcatagtga atgtaagaat aactgg 36

Claims (8)

1.一种引物和探针组合物，用于同时检测三类病原体，所述三类病原体包括立克次体、发热伴血小板减少综合征病毒和汉坦病毒，其中，所述立克次体包括恙虫病东方体、Q热立克次体、普氏立克次体；
所述引物和探针组合物包括：
根据恙虫病东方体的47-kDahtrA基因序列设计的引物47-kDa-F1、47-kDa-R1和47-kDa-R2,探针47-kDa-probe；
根据Q热立克次体的IS1111基因序列设计的引物Q-F1、Q-F2、和Q-R1,探针Q-probe；
根据普氏立克次体的htrA基因序列设计的引物Rick-F1、Rick-F2、和Rick-R1,探针Rick-probe；
根据发热伴血小板减少综合征病毒的L片段序列设计的引物SFTSV-F1、SFTSV-R1、SFTSV-F2和SFTSV-R2,探针SFTSV-probe；
根据汉坦病毒的S片段序列设计的引物Hanta-F1、Hanta-R1和Hanta-R2,探针Hanta-probe；
所述引物和探针组合物的核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:1-21所示；所述引物和探针组合物用于液相芯片，且所述引物为多重不对称PCR扩增引物。
2.一种同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，其特征在于：所述方法包含参与反应的权利要求1所述的引物和探针组合物；所述方法包括：
制备检测微球：取磁珠振荡超声后，和所述探针充分振荡偶联形成检测微球；
制备PCR反应体系：制备25μL反应体系，包括DNA 1.0μL、PCR预混液12.5μL、10μM 上下游引物各0.5μL、去离子水；
PCR扩增反应：98℃预变性5min；98℃30s，58℃30s，72℃1min，40个循环；最后72℃延伸5min；
制备杂交反应体系：检测微球各0.5μL、33μL 1.5xTMAC、12μL TE、PCR产物5μL；
杂交反应：95℃变性5min，55℃-58℃杂交10-15min；
微球标记：在上述杂交液中，加入10μL 50μg/mL链霉素亲和素、R-藻红蛋白偶联物，55℃反应10min；
结果检测：将上述反应液转移至96孔板，使用液相芯片悬浮仪进行检测；
所述检测方法不包括疾病的诊断和治疗方法。
3.根据权利要求2所述的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，其特征在于：所述磁珠选用MagPLEX磁珠。
4.根据权利要求2所述的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，其特征在于：杂交反应中，杂交温度为58℃，杂交时间为15min。
5.根据权利要求2所述的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，其特征在于：所述结果检测中，液相芯片悬浮仪能够检测磁珠的荧光强度值为Median值，输出的数据为每一种微球的平均荧光强度值，即MFI值。
6.根据权利要求2所述的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法，其特征在于：所述液相芯片检测方法还包括阴性对照，检测待测样品的MFI值为检测阴性对照的MFI值的三倍以上时，判断结果为阳性。
7.一种同时检测三类病原体的液相芯片的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的引物和探针组合物、磁珠，和同时检测三类病原体的液相芯片的杂交反应体系。
8.根据权利要求7所述的同时检测三类病原体的液相芯片的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准物质和阴性对照。
CN202210246590.0A 2022-03-14 2022-03-14 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法 Active CN114540551B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210246590.0A CN114540551B (zh) 2022-03-14 2022-03-14 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210246590.0A CN114540551B (zh) 2022-03-14 2022-03-14 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114540551A CN114540551A (zh) 2022-05-27
CN114540551B true CN114540551B (zh) 2024-04-05

Family

ID=81663236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210246590.0A Active CN114540551B (zh) 2022-03-14 2022-03-14 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114540551B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102409109A (zh) * 2011-11-25 2012-04-11 浙江省疾病预防控制中心 新型布尼亚病毒荧光定量检测试剂盒及该病毒的检测方法
CN103074452A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法
CN103131760A (zh) * 2011-12-05 2013-06-05 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 一种可以同时检测六种治病微生物的悬浮芯片检测方法
CN103173566A (zh) * 2013-03-27 2013-06-26 中国检验检疫科学研究院 一种针对鼠传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法
CN104651498A (zh) * 2015-01-23 2015-05-27 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 立克次体甄别检测基因芯片的制备和用途
CN105087824A (zh) * 2015-03-04 2015-11-25 浙江省疾病预防控制中心 出血热相关病原体鉴别基因芯片的制备和用途
CN105483232A (zh) * 2015-12-24 2016-04-13 四川国际旅行卫生保健中心 一种立克次体液相基因芯片的检测方法
CN109355409A (zh) * 2018-10-09 2019-02-19 中国农业大学 一种高通量可视化快速检测立克次体的芯片及应用
KR20210073220A (ko) * 2019-12-10 2021-06-18 주식회사 미코바이오메드 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102409109A (zh) * 2011-11-25 2012-04-11 浙江省疾病预防控制中心 新型布尼亚病毒荧光定量检测试剂盒及该病毒的检测方法
CN103131760A (zh) * 2011-12-05 2013-06-05 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 一种可以同时检测六种治病微生物的悬浮芯片检测方法
CN103074452A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法
CN103173566A (zh) * 2013-03-27 2013-06-26 中国检验检疫科学研究院 一种针对鼠传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法
CN104651498A (zh) * 2015-01-23 2015-05-27 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 立克次体甄别检测基因芯片的制备和用途
CN105087824A (zh) * 2015-03-04 2015-11-25 浙江省疾病预防控制中心 出血热相关病原体鉴别基因芯片的制备和用途
CN105483232A (zh) * 2015-12-24 2016-04-13 四川国际旅行卫生保健中心 一种立克次体液相基因芯片的检测方法
CN109355409A (zh) * 2018-10-09 2019-02-19 中国农业大学 一种高通量可视化快速检测立克次体的芯片及应用
KR20210073220A (ko) * 2019-12-10 2021-06-18 주식회사 미코바이오메드 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Detection of a Novel Rickettsia From Leptotrombidiumscutellare Mites (Acari: Trombiculidae) From Shandongof China;Yuting Huang et al.;《J Med Entomol》;第54卷(第3期);摘要、正文第544页左栏第1段-第547页左栏第1段、表1 *
Detection of Bartonella tamiae, Coxiella burnetii and rickettsiae in arthropods and tissues from wild and domestic animals in northeastern Algeria;Leulmi H et al.;《Parasites Vectors》;第9卷;第1-8页 *
Molecular investigation of tick-borne pathogens in ticks removed from tick-bitten humans in the southwestern region of the Republic of Korea;Mi Seon Bang et al.;《PLoS One》;第16卷(第6期);第1-12页 *
七种立克次体甄别检测基因芯片的研制;李灵云;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》(第02期);E060-259 *
发热伴患者中和抗体检测和病毒糖蛋白表达及螨中新立克次体的发现;黄玉婷;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》(第12期);第79-83页前言部分、第85-89页方法部分、第92页第2段-95页最后1段、图2-8 *
广东省发热伴出血症候群监测病原谱分析;张鲍欢;张欢;张欣;谈琦琪;周惠琼;孙九峰;彭志强;吴德;;中国公共卫生(第06期);第864-867页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114540551A (zh) 2022-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100937761B1 (ko) 비-병원성 또는 병원성 ｈ5 아형 인플루엔자 ａ 바이러스검출용 키트
US20080261198A1 (en) Diagnostic Primers and Method for Detecting Avian Influenza Virus Subtype H5 and H5n1
CN109337956B (zh) 基于ngs技术富集多基因茎环探针设计方法及试剂盒
CN114410836A (zh) 一种集样本处理、核酸提取及多重恒温扩增一体化的检测人细小病毒b19的试剂盒和方法
CN113249517A (zh) 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒
CN110938708B (zh) 一种基于等温扩增技术检测h7n9禽流感病毒的试剂盒及其应用
CN114540551B (zh) 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方法
CN116814857A (zh) 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法
CN112575118A (zh) 一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法
CN111334610A (zh) 一种登革病毒通用型rt-raa-lfd扩增引物及检测方法
WO2006132601A1 (en) Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1
CN110607398A (zh) 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒
CN113897356B (zh) 一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量pcr试剂盒及引物
CN113215317A (zh) 牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字pcr检测引物、探针、试剂盒及其应用
CN112063757A (zh) 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用
CN111850099A (zh) 一种用于检测鼠痘病毒的rpa试剂盒、引物、探针及方法
CN114990261B (zh) 用于检测呼吸道感染性疾病病原体的多重qPCR检测试剂
CN113249508B (zh) 用于检测b族链球菌的特异性引物、探针和应用
CN111187859B (zh) 用于检测丙型流感和丁型流感的双重TaqMan qPCR检测方法
RU2731716C1 (ru) Набор для дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота и способ дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота
CN115820818B (zh) 一种一步法核酸检测方法及其应用
CN102851395A (zh) 一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法
CN114836581B (zh) 用于检测消化道感染性疾病病原体的引物组合
CN113373266B (zh) 一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光rpa引物、试剂盒和检测方法
CN117448495A (zh) 新城疫病毒强毒核酸CRISPR-Cas13a检测系统及RPA引物对和crRNA

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant