CN112725530A - 检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用。针对检测菜豆荚斑驳病毒存在的问题，本发明涉及并筛选了具有高特异性的检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组，并进一步涉及了试剂盒和检测方法。本发明提供的试剂盒和方法特异性好，对南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒等都呈阴性反应；灵敏度高，实时荧光检测方法最低可以检测到5x10‑3ng/μl菜豆荚斑驳病毒RNA模板，核酸试纸条检测方法最低可以检测到5x10‑2ng/μl菜豆荚斑驳病毒RNA模板。非常适用于医疗卫生、食品安全以及进出口检疫的现场检测，易于大范围推广应用。

Description

检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种大豆种传检疫性病毒菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增快速检测试剂盒及应用
技术背景
菜豆荚斑驳病毒是(bean pod mottle virus，BPMV)是豇豆花叶病毒科(Comoviridae，豇豆花叶病毒属(Comovirus)成员。1948年，菜豆荚斑驳病毒首次被报道在菜豆上发现，后蔓延至加拿大、巴西、秘鲁、厄瓜多尔和伊朗等大豆产区。菜豆荚斑驳病毒的寄主局限于豆科植物，大豆、菜豆是其多年生寄主。菜豆荚斑驳病毒在大豆上会表现出褪绿、斑驳、坏死等症状，破坏大豆品质，造成大豆产量损失。菜豆荚斑驳病毒是危害大豆等豆科植物的重要病毒，在美国已引起大豆产量的巨大损失，我国尚无分布。鉴于菜豆荚斑驳病毒对菜豆生产的严重威胁，其被我国列为中国进境植物检疫性病毒。我国是世界第一大豆进口国，随着我国大豆进口数量不断增加，该病毒随大豆传入的风险逐步增大，为了保护我国大豆生产安全以及进出口安全，需要建立一种快速准确检测菜豆荚斑驳病毒的检测方法。
早期，菜豆荚斑驳病毒的检测方法主要有寄主生物学症状检测、电镜观察等。当前菜豆荚斑驳病毒的检测方法主要是以ELISA为主的血清学方法和以PCR及其衍生技术为主的分子生物学方法。ELISA方法检出限低，难以实现无症状植物中少量病毒的检测，且ELISA方法常常无法鉴别病毒种类，特异性差。PCR检测方法广泛应用在植物病毒检测领域，但是其需要复杂的热循环仪器，存在反应时间长等缺陷，难以满足口岸检疫的快速检测的需求。
交叉引物恒温扩增(Cross-priming isothermal amplification，CPA)是杭州优思达生物技术有限公司研发的恒温扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。根据反应体系中交叉引物数量的不同，CPA可分为单交叉引物扩增(single crossingcpa)和双交叉引物扩增(double crossing cpa)两种类型。这两种类型反应都需要一条交叉引物(CPF)、两条扩增引物(DR、MBR)、两条解开链的外围引物(BF、BR)以及具有链置换活性的DNA聚合酶Bst。其中，双交叉引物CPA具有两条交叉引物，比单交叉引物CPA多一条交叉引物。单交叉引物扩增CPA是在对双交叉引物CPA机制优化后诞生的，其能够在不到一小时的时间内扩增出4个基因组DNA拷贝，具有高度的特异性，也是目前被广泛引用的交叉引物扩增技术。CPA自诞生起，其主要应用于肺结核分枝杆菌的检测，进行肺结核病的诊断。目前优思达公司开发了结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(TB-CPA)，具有较高的灵敏度和特异度，可以在2h内完成检测并出具报告，适用于基层医院和卫生所。此外，CPA在食品安全领域也开展了研究如转基因作物检测(Huang,et al.2014)、食源性致病菌李斯特菌的检测；在动物检疫领域建立了结合试纸条的非洲猪瘟检测方法(Fraczyk,et al.2016)，在植物检疫性领域建立了李属坏死环斑病毒(PNRSV)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(GGMMV)的检测方法。
发明内容
本发明针对检测菜豆荚斑驳病毒存在的问题，提供了一种菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增快速检测试剂盒及引物，该试剂盒具有高特异性、高灵敏度、操作简单、检测快的特点。
本发明首先公开了一种检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组，所述交叉引物扩增引物组由外围置换引物BPBF、外围置换引物BPBR、扩增引物BPDR、扩增引物BPMBR、交叉引物BPCPF组成；
所述外围置换引物BPBF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述外围置换引物BPBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述扩增引物BPDR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述扩增引物BPMBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述交叉引物BPCPF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
作为本发明的优选方案，所述扩增引物BPDR的5’端有6-羧基荧光素标记，扩增引物BPMBR的5’端有生物素荧光基团标记。
更加优选的，所述外围置换引物BPBF、外围置换引物BPBR、扩增引物BPDR、扩增引物BPMBR和交叉引物BPCPF的摩尔比为：1：1：3：3：5。
本发明还提供了一种检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物恒温扩增试剂，其包括所述的交叉引物扩增引物组；
所述外围置换引物BPBF和所述外围置换引物BPBR在所述扩增试剂中的终浓度均为0.2μmol/L；
所述扩增引物BPDR和扩增引物BPMBR在所述扩增试剂中的终浓度均为0.6μmol/L；
所述交叉引物BPCPF在所述扩增试剂中的终浓度均为1μmol/L。
本发明还提供了一种检测菜豆荚斑斑驳病毒的交叉引物扩增试剂盒，其包括所述的引物组或所述的扩增试剂。
本发明还提供了所述的引物组或所述的扩增试剂或所述的试剂盒在检测待检测样品是否感染菜豆荚斑驳病毒中的应用。
本发明还进一步提供了一种检测待测样品是否感染菜豆荚斑驳病毒的方法，其包括如下步骤：
采用所述的引物组或所述的扩增试剂或所述的试剂盒对待测样品进行交叉引物扩增，
利用荧光染料和实时荧光仪器进行实时监测，观察荧光曲线；
若未出现扩增曲线，则待测样品没有菜豆荚斑驳病毒侵染；
若出现扩增曲线，则待测样品为菜豆荚斑驳病毒感染。
本发明还进一步提供了一种检测待测样品是否感染菜豆荚斑驳病毒的方法，其包括如下步骤：
采用所述的引物组或所述的扩增试剂或所述的试剂盒对待测样品进行交叉引物扩增，
用荧光标记核酸试纸条检测试剂盒扩增产物，2-5min后观察试纸条；
若在质控区出现一条条带，在检测区内无条带出现，则待测样品没有菜豆荚斑驳病毒侵染；
若出现两条条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，则待测样品为菜豆荚斑驳病毒感染。
优选的，所述交叉引物恒温扩增反应条件为60℃，时间为90min。
优选的，所述交叉引物恒温扩增的模板为RNA。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
(1)由于交叉引物扩增检测方法成本低廉，利用AMV逆转录酶和Bst DNA聚合酶在60℃实现等温扩增(无需单独反转录步骤，可直接实现RNA模板的扩增)，因此本发明提供的试剂盒使用方便且使用成本低。
(2)本发明提供的试剂盒得到的反应结果直观准确，无需进行复杂操作。实时荧光检测方法只需要在试剂盒反应体系中加入SYTO 16核酸染料，利用实时荧光仪器实时监测扩增过程，结果可以利用扩增曲线进行判定；核酸试纸条检测方法只需要对扩增引物DR标记6-羧基荧光素(FAM)基团，另一条扩增引物MBR标记生物素(Biotin)，然后再用一次性核酸试纸条对反应产物检测，可以准确直观、快速的判读。
(3)本发明提供的试剂盒特异性好，对南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒等都呈阴性反应；灵敏度高，实时荧光检测方法最低可以检测到5x10-3ng/μl菜豆荚斑驳病毒总RNA模板，核酸试纸条检测方法最低可以检测到5x10-2ng/μl菜豆荚斑驳病毒总RNA模板。
(4)本发明所述的菜豆荚斑驳病毒交叉引物扩增试剂盒可快速、灵敏的检测菜豆荚斑驳病毒。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异型好，非常适用于医疗卫生、食品安全以及进出口检疫的现场检测，易于大范围推广应用。
附图说明
图1是本发明利用实时荧光交叉引物扩增筛选检测菜豆荚斑驳病毒引物组结果图；实时荧光每60s监测一次，一个循环为1min。S1～S5依次对应BPMV引物组S1—引物组S5的实时荧光交叉引物扩增的扩增曲线，NC(Negative control，NC)为以水为模板的扩增曲线；
图2是本发明利用实时荧光交叉引物扩增方法评估S1引物组检测BPMV特异性结果图；以S1为实时荧光交叉引物扩增引物组检测SBMV、ToRSV、ArMV、TRSV和BPMV的总RNA模板和以水为模板(NC)的扩增曲线；
图3是本发明利用实时荧光交叉引物扩增评估S2引物组检测BPMV特异性结果图；以S2为实时荧光交叉引物扩增引物组检测SBMV、ToRSV、ArMV、TRSV和BPMV的总RNA模板和以水为模板(NC)的扩增曲线；
图4是本发明提供的交叉引物扩增试剂盒结合核酸试纸条检测方法特异性试验结果图；其中，编号1-5依次对应南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒和菜豆荚斑驳病毒总RNA模板的检测结果，NC为以水为模板的检测结果；
图5是本发明提供的实时荧光交叉引物扩增灵敏度试验结果图；以BPMV总RNA模板浓度为50ng/μl连续10倍梯度稀释，设立7个浓度梯度，分别为50x100～50x10-6ng/μl的BPMV总RNA，NC为以水为模板的阴性对照，进行实时荧光RT-CPA检测菜豆荚斑驳病毒灵敏度评估。稀释浓度为50x100～50x10-3ng/μl的BPMV总RNA的模板出现扩增曲线，其余浓度梯度和阴性对照都未出现扩增曲线，实时荧光RT-CPA检测菜豆荚斑驳病毒灵敏度为50x10-3ng/μl的BPMV总RNA；
图6是本发明提供的交叉引物扩增试剂盒结合核酸试纸条检测方法灵敏度试验结果图；其中，1-7依次对应菜豆荚斑驳病毒RNA模板浓度为50x100ng/μl、、50x10-1ng/μl、50x10-2ng/μl、50x10-3ng/μl、50x10-4ng/μl、50x10-5ng/μl和50x10-5ng/μl的检测结果；NC为以水为模板模板的检测结果；
图7是本发明提供的交叉引物扩增试剂盒结合实时荧光检测方法检测菜豆荚斑驳病毒盲样结果图；其中，编号1-7为美国黄大豆盲样总RNA模板的检测结果，NC为健康大豆总RNA模板的检测结果，PC(Positive control)为已知为菜豆荚斑驳病毒的阳性总RNA模板的检测结果；
图8是本发明提供的交叉引物扩增试剂盒结合核酸试纸条检测方法检测菜豆荚斑驳病毒盲样结果图；其中，编号1-7为美国黄大豆盲样总RNA模板的检测结果，NC为健康大豆总RNA模板的检测结果，PC为已知为菜豆荚斑驳病毒的阳性RNA模板的检测结果。
具体实施方式
以下将配合实施例再详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段解决技术问题并达成技术功效的实验过程能充分理解并拘以实施。
实施案例中所涉及的材料：
a.引物由上海派森诺生物有限公司合成；Bst DNA聚合酶购自New England公司；AMV逆转录酶购自Promega公司；Pfu DNA聚合酶购自全式金公司；甜菜碱购自上海生工生物工程股份有限公司；SYTOTM16 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain购自ThermoFisher公司；
Figure BDA0002905656100000051
一次性核酸检测试纸条(lateral flow dipstick，LFD)购自北京宝盈同汇生物技术有限公司(货号：JY0201)；植物总RNA提取试剂盒购Takara公司(takaraminibest universal rna extraction kit，9767)；cDNA合成试剂盒也购自Takara公司(primescriptTMII 1st strand cdna synthesis kit，6210A)。
b.菜豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus，BPMV)实验样本为带毒的烟草叶片，在特异性评估中用于对照的样本南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus，SBMV)、番茄环斑病毒(tomato ringspot virus，ToRSV)、烟草环斑病毒(tobacco ringspotvirus，TRSV)和南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus，ArMV)同样为带毒的烟草叶片，这些实验样本均由中国检验检疫科学研究院提供。
c.BPMV患病盲样样本为大豆，由中国广州海关截获并提供。
实施例1：交叉引物恒温扩增引物的设计与合成
一：序列获得
1.RNA的提取
取患有BPMV、SBMV、ToRSV、ArMV和TRSV病毒的烟草叶片各50mg，参照植物总RNA提取试剂盒操作说明，提取BPMV病毒样品及阴性对照的总RNA。
2.cDNA合成
取上述提取的5种病毒总RNA各3μl，按两步法试剂盒(primescriptTMII 1ststrand cdna synthesis kit，6210A)反转录5种病毒的cDNA。
2.CP基因引物设计合成与筛选
从GenBank中下载菜豆荚斑驳病毒基因组序列(GenBank为：GQ996950)，利用Geneious Primer基于GC含量40％～50％，TM值50％～60％，避免重复序列的引物设计原则设计多组菜豆荚斑驳病毒CP基因引物(表1)，并由上海桑尼生物科技有限公司合成。
利用PCR筛选扩增BPMV-CP基因的引物，PCR反应体系如下(20μl)：Ex Taq(0.5U，Takara RR001)，10XPCR buffer(2mM)，dNTP(0.2mM)，上游引物(0.5μM)，下游引物(0.5μM)，cDNA(800ng)；PCR反应程序如下：94℃3min；98℃10s，59℃30s，72℃120s(34个循环)；72℃8min。
2.CP扩增
利用筛选的引物和高保真酶Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA polymerase，2xTransStartFastPfu PCR Super Mix，全式金)进行PCR扩增BPMV-CP基因，反应体系如下：25μl 2xsupermix，BPF(0.5μM)，BPR2(0.5μM)，cDNA(100ng)，FNase Free ddH2O(Up to 50μl)；PCR反应程序如下：94℃3min；98℃10s，59℃30s，72℃120s(34个循环)；72℃8min。
3.序列获得(连接转化克隆)
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证后，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(SanPrepColumn DNA Gel Extraction Kit，生工)割胶回收，纯化后连A尾，10μl体系如下：Ex taq(0.5U)，10xPCR buffer(2mM)，dNTP(0.2mM)，纯化的回收物(405ng)，再连接到PMD19T载体(PMDTM19-T Vector，TakaraD102A)(10μl体系如下：5μl Solution I，0.5μl PMD19T载体，3600ng cDNA，冰上操作，于16℃下连接12h)，再将连接产物转化到感受态细胞(T-FastCompetentE.Coli，TianGen)，取转化好的菌液200μl，加入40μl X-gal(20mg/ml)和16μlIPTG(50mg/ml)涂布于氨苄抗性(ampicillin，Amp)的固体培养基，置于37℃培养箱中培养10-12h，挑白色单菌落扩摇。
扩摇后的菌液送测序(测序由上海生工生物工程股份有限公司完成)，得到BPMV-CP基因序列，经过NCBI序列比对后确定为BPMV-CP基因序列。
二：引物的设计与合成
1.特异引物设计
利用Geneious Primers 9.0软件，基于CPA引物设计原则(交叉引物由5’端的扩增引物MBR和与3’端的与靶基因互补的20-22bp左右的序列组成)，交叉引物全长在40bp左右，其余4条引物(外围置换引物BF/BR和扩增引物DR/MBR)都在18-20bp左右，各引物的CG含量需控制在40％～60％之间，以保证引物间的Tm值不会差距太大，且在引物设计时要尽量避免引物之间的二聚体对扩增结果的影响，同时尽量避免大量重复序列和突变位点)，设计了5组BPMV-CP基因序列的CPA引物(表1)，每组引物包含5条引物，包括交叉引物CPF(40bp)、外围剥离单链的引物BF/BR(19bp)以及扩增引物DR/MBR(19bp)。S1组外围置换引物BPBF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，外围置换引物BPB,1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，扩增引物BPDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，扩增引物BPMBR1的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，交叉引物BPCPF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，S2组对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10所示；S3组对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.15所示；S4组对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.20所示；S5组对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.25所示。
引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完成。
实施例2：交叉引物恒温扩增引物在检测菜豆荚斑驳病毒中的应用
一、引物筛选
以菜豆荚斑驳病毒总RNA为模板，利用实时荧光交叉引物恒温扩增筛选检测菜豆荚斑驳病毒5组引物组。结果如图(1)所示：经过实时荧光交叉引物扩增检测，确定用于检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增的两组引物组S1和S2(表1)，引物组S1包括外围置换引物(BPBF和BPBR)、两条扩增引物(BPDR和BPMBR)和1条交叉引物(BPCPF)；引物组S2包括外围置换引物(BPBF1和BPMBR1)、两条扩增引物(BPDR1和BPMDR1)和1条交叉引物(BPCPF1)。
表1菜豆荚斑驳病毒交叉引物扩增反应引物组
Figure BDA0002905656100000081
Figure BDA0002905656100000091
二、实时荧光交叉引物检测方法的建立
(1)实时荧光RT-CPA使用实时荧光仪器：CFX Connect Real-Time System(Bio-rad，America)，
(2)表2菜豆荚斑驳病毒交叉引物扩增反应体系
Figure BDA0002905656100000092
(3)结果判定：
是否出现扩增曲线，
阴性—未出现扩增曲线，未收集到荧光信号；
阳性—出现扩增曲线，收集到荧光信号；
无效—扩增曲线杂乱，且断裂的情况。
(4)实时荧光方法反应程序：
实时荧光交叉引物扩增在60℃恒温下反应90min。
三、试纸条检测方法的建立
RT-CPA-LFD使用PCR仪器(BIO-RAD T100TM Thermal Cycler，America)。RT-CPA-LFD反应体系与实时荧光RT-CPA相同，但没有SYTO 16绿色荧光核酸染色。RT-CPA-LFD体系中需要对扩增引物DR和MBR进行标记，在扩增引物DR的5’端标记6-羧基荧光素(FAM)，在另一条扩增引物MBR的5’端标记生物素(Biotin)，建立用于核酸试纸条检测的交叉引物扩增反应体系。
核酸试纸条交叉引物扩增在60℃恒温下反应90min，反应结束后将核酸试纸条插入到PCR管中2-5min即可观察结果。
核酸试纸条的结果鉴定方法如下：
阴性(-)：仅在质控区(Control band)出现一条条带，在检测区(Test band)内无红色条带出现。证明所检测的样本没有菜豆荚斑驳病毒侵染。
阳性(+)：出现两条条带。一条位于质控区(C)内，另一条位于检测区(T)内。证明所检测的样本为菜豆荚斑驳病毒侵染。
四：交叉引物扩增检测体系特异性、灵敏度分析
1.实时荧光检测方法
(1)特异性分析
利用5种大豆种传检疫性病毒(南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒和菜豆荚斑驳病毒)的总RNA为模板检测体系的特异性，同时以水为模板设置阴性对照。反应体系如表2所示，分别使用引物组S1、引物组S2进行特异性评估，使用实时荧光PCR仪对产物进行实时监测。引物组1得到的结果如图(2)所示：以菜豆荚斑驳病毒总RNA为模板的交叉引物扩增反应产物出现扩增曲线；以南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒和烟草环斑病毒总RNA为模板的交叉引物扩增反应没有出现荧光扩增曲线。结果显示引物组S1检测体系特异性良好，可特异的检测到菜豆荚斑驳病毒；引物组S2得到的结果如图(3)所示：以菜豆荚斑驳病毒总RNA和烟草环斑病毒总RNA为模板的交叉引物扩增反应产物出现扩增曲线，以南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒总RNA为模板的交叉引物扩增反应没有出现荧光扩增曲线。结果显示引物组S2检测特异性不好。最终确定引物组S1为交叉引物扩增检测菜豆荚斑驳病毒试剂盒中引物组。
(2)灵敏度分析
用RNase Free ddH2O将BPMV样品总RNA(50ng/μl)连续10倍梯度稀释，设立7个梯度，以按梯度稀释的BPMV总RNA为模板，同时设置水为模板作阴性对照，得到的结果如图(5)所示：浓度分别为50x100ng/μl、50x10-1ng/μl、50x10-2ng/μl和50x10-3ng/μl的BPMV总RNA模板都出现了扩增曲线，实时荧光CPA检测BPMV灵敏度可达50x10-3ng/μl。
2.核酸试纸条检测方法
(1)特异性分析
同样利用五种大豆种传检疫性病毒(南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒和菜豆荚斑驳病毒)的总RNA为模板检测体系的特异性，同时以水为模板设置阴性对照。反应体系如表2所示，使用一次性核酸试纸条对产物进行检测。结果如图(4)所示：以菜豆荚斑驳病毒总RNA为模板的交叉引物扩增反应产物出现两条条带，一条位于检测区(T)内，另一条位于质控区(C)内；以南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒和烟草环斑病毒总RNA为模板的交叉引物扩增反应产物，仅在质控区(C)出现一条条带，在检测区(T)内无条带出现。结果显示核酸试纸条交叉引物扩增检测体系特异性良好，可特异的检测到菜豆荚斑驳病毒。
(2)灵敏度分析
用RNase Free ddH2O将BPMV样品总RNA(50ng/μl)连续10倍梯度稀释，设立7个梯度，以按梯度稀释的BPMV总RNA为模板，同时设置水为模板作阴性对照，使用一次性核酸试纸条对产物进行检测，得到的结果如图(6)所示：浓度分别为50x100ng/μl、50x10-1ng/μl和50x10-2ng/μl的BPMV总RNA模板的交叉引物扩增反应产物出现两条条带，实时荧光CPA检测BPMV灵敏度可达50x10-2ng/μl。
实施例3交叉引物扩增检测体系盲样检测BPMV盲样检测
取由中国广州海关截获并提供的美国黄大豆盲样7颗，取由当地市场采购的健康黄大豆1颗，分别提取美国大豆盲样和正常黄大豆总RNA。以美国黄大豆盲样总RNA作为模板，健康大豆的总RNA作为阴性对照，已确定的BPMV病毒总RNA为阳性对照，按照实施例2中的两种检测方法进行检测。
二、实时荧光交叉引物扩增检测盲样
实时荧光交叉引物扩增检测BPMV盲样结果如图(7)所示：以美国黄大豆盲样编号1-7的总RNA作为模板都出现实时扩增曲线，呈阳性；BPMV病毒的总RNA模板的阳性对照(PC)出现扩增曲线，呈阳性；健康大豆RNA的模板的阴性对照(NC)没有出现荧光扩增曲线，呈阴性。
三、核酸试纸条交叉引物扩增检测盲样
核酸试纸条交叉引物扩增检测BPMV盲样结果如图(8)所示：以美国黄大豆盲样编号1-7的总RNA作为模板出现两条红色条带，呈阳性；BPMV病毒的RNA模板的阳性对照(PC)也出现两条红色条带，呈阳性；健康大豆总RNA的模板的阴性对照(NC)没有出现荧光扩增曲线，呈阴性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国计量大学
<120> 检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacagttgga ggaaccatt 19
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctttaatacg atgagtgcgg tgcgtagtga tctattggca 40
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaaatcaac acttgctct 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctttaatacg atgagtgcg 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tagcacaggc caatgctat 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acaccatctg ctctcaaga 19
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaattccaa actccatgcc agtgaattat ggaatcctgc 40
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagaacacgg gtttggatt 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaaattccaa actccatgc 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccatccagtg acacaaatg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgcaggatgt tcaggttac 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgcaggatgt tcaggttac 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccatccacct atttaacac 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttaacacttc gggaagtgc 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctatagaaa gaggcattc 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gttggagatc tcgtctttg 19
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aatctctcca aactgcaccc tctaagatga cttctcccta 40
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
attgatggtg tcatcagcc 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aatctctcca aactgcacc 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gagttgacca agctgtaag 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cctgcaacaa ctctgttgg 19
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
attgagccca tatgcacacg tgacgggtgt ccatatttgt 40
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cacctggtat tgtagacac 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
attgagccca tatgcacac 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccagaagacg agaacctga 19

Claims (10)

1.一种检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组，其特征在于，所述交叉引物扩增引物组由外围置换引物BPBF、外围置换引物BPBR、扩增引物BPDR、扩增引物BPMBR、交叉引物BPCPF组成；
所述外围置换引物BPBF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述外围置换引物BPBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述扩增引物BPDR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述扩增引物BPMBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述交叉引物BPCPF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.如权利要求1所述的检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组，其特征在于，所述扩增引物BPDR的5’端有6-羧基荧光素标记，扩增引物BPMBR的5’端有生物素荧光基团标记。
3.如权利要求1所述的检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组，其特征在于，所述外围置换引物BPBF、外围置换引物BPBR、扩增引物BPDR、扩增引物BPMBR和交叉引物BPCPF的摩尔比为：1：1：3：3：5。
4.一种检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物恒温扩增试剂，其特征在于，包括权利1-3任一项所述的交叉引物扩增引物组；
所述外围置换引物BPBF和所述外围置换引物BPBR在所述扩增试剂中的终浓度均为0.2μmol/L；
所述扩增引物BPDR和扩增引物BPMBR在所述扩增试剂中的终浓度均为0.6μmol/L；
所述交叉引物BPCPF在所述扩增试剂中的终浓度均为1μmol/L。
5.一种检测菜豆荚斑斑驳病毒的交叉引物扩增试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物组或权利要求4所述的扩增试剂。
6.权利要求1-3任一项所述的引物组或权利要求4所述的扩增试剂或权利要求5所述的试剂盒在检测待检测样品是否感染菜豆荚斑驳病毒中的应用。
7.一种检测待测样品是否感染菜豆荚斑驳病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：
采用权利要求1-3任一项所述的引物组或权利要求4所述的扩增试剂或权利要求5所述的试剂盒对待测样品进行交叉引物扩增，
利用荧光染料和实时荧光仪器进行实时监测，观察荧光曲线；
若未出现扩增曲线，则待测样品没有菜豆荚斑驳病毒侵染；
若出现扩增曲线，则待测样品为菜豆荚斑驳病毒感染。
8.一种检测待测样品是否感染菜豆荚斑驳病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：
采用权利要求1-3任一项所述的引物组或权利要求4所述的扩增试剂或权利要求5所述的试剂盒对待测样品进行交叉引物扩增，得到扩增产物；
用荧光标记核酸试纸条检测试剂盒扩增产物，2-5min后观察试纸条；
若在质控区出现一条条带，在检测区内无条带出现，则待测样品没有菜豆荚斑驳病毒侵染；
若出现两条条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，则待测样品为菜豆荚斑驳病毒感染。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述交叉引物恒温扩增反应条件为60℃，时间为90min。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述交叉引物恒温扩增的模板为RNA。
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