CN112574989B - 一种抑制大口黑鲈弹状病毒复制的shRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制大口黑鲈弹状病毒复制的shRNA及其应用，属于生物检测技术领域，本发明提供的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示。本发明还提供一种包含编码所述的shRNA的DNA片段的重组载体，包含该重组载体的菌株，以及它们在制备抑制大口黑鲈弹状病毒G糖蛋白复制的药物中的应用。本发明提供的shRNA重组载体安全无毒，能显著抑制大口黑鲈弹状病毒G糖蛋白复制，具有广阔应用前景。

Description

一种抑制大口黑鲈弹状病毒复制的shRNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种抑制大口黑鲈弹状病毒复制的shRNA及其应用，特别是涉及一种抑制大口黑鲈弹状病毒G糖蛋白复制的shRNA及其应用。
背景技术
大口黑鲈(Micropterus salmoides)俗称加州鲈、黑鲈。隶属于鲈形目Perciforings、鲈亚目Porcoidei、太阳鱼科Cehtrachidae、黑鲈属Micropterus，原产于美国加利福尼亚州密西西比河水系，是一种肉质鲜美、抗病力强、生长迅速、易起捕的名贵肉食性鱼类。大口黑鲈的适温范围广，耐低氧能力强，喜欢栖息于沙质或沙泥质不混浊的静水环境中。
近年来，大口黑鲈在养殖过程中不断遭受着来自各种病原体如病毒、细菌、寄生虫等所引起的病害威胁。其中，大口黑鲈弹状病毒病是危害大口黑鲈的主要病害之一。大口黑鲈弹状病毒(M.salmoides rhabdovirus,MSRV)毒株属于水泡性病毒属，为线性负链单链RNA病毒，同样具有RNA依赖性RNA聚合酶蛋白L、糖蛋白G、核衣壳蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M等五种结构蛋白。大口黑鲈在感染MSRV病毒后,通常表现出嗜睡和不规则游泳的状态。同时，还伴随着身体变得消瘦弯曲；肝脏出现肿胀出血，腹部肿胀，眼球突出；肛门附近会出现肌肉出血以及长而半透明的粪便等。该病发病严重时会导致80％养殖池塘的大口黑鲈发病，死亡率在短时间内就可以达到90％，而且用抗菌药物对其无效。该病还具有典型的传染性，给我国大口黑鲈养殖造成例如巨大的经济损失。
RNA干扰在抵抗病毒入侵过程中起着十分重要的作用。基因沉默机制通常为小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA降解，或者由小RNA抑制特定mRNA翻译。通过设计干扰RNA来抑制MSRV是一种值得研究的技术手段。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种抑制大口黑鲈弹状病毒复制的shRNA及其应用，特别是提供一种抑制大口黑鲈弹状病毒G糖蛋白复制的shRNA及其应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示。
进一步地，所述shRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示，所述shRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示。
进一步地，所述shRNA的茎环结构为TTCAAGAGA，所述shRNA的转录终止序列为T6结构。
本发明提供一种重组载体，所述重组载体包括慢病毒载体及所述的shRNA，所述shRNA插入在所述慢病毒载体中。
进一步地，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID No.41所示。
进一步地，所述慢病毒载体为pSGU6/GFP/Neo载体。
进一步地，所述慢病毒载体包括BbsI酶切位点和HindⅢ酶切位点。
本发明提供一种所述重组载体的构建方法，具体包括如下步骤：先设计合成所述的shRNA，再将所述shRNA插入慢病毒载体中。
本发明提供一种重组工程菌，所述重组工程菌含有重组载体。
本发明还提供一种所述的shRNA、所述的重组载体或所述的重组工程菌在制备抑制大口黑鲈弹状病毒G糖蛋白复制的药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明的结果显示注射pSGU6/GFP/Neo-G-874组大口黑鲈鱼苗体内MSRVmRNA水平以及累计死亡率均明显低于对照载体pSGU6/GFP/Neo-NC组及病毒阳性对照组，说明pSGU6/GFP/Neo-G-874在大口黑鲈鱼苗体内发挥了抑制MSRV复制增殖的作用。
本发明的shRNA表达质粒安全无毒，能显著抑制大口黑鲈弹状病毒G糖蛋白复制，具有广阔应用前景。
附图说明
图1是siRNA分子对CO细胞中MSRV复制的影响；
图2是转染siRNA的CO细胞；其中A为荧光照片；B为明场照片；
图3是转染shRNA对CO细胞中MSRV mRNA水平的影响；
图4是转染shRNA对MSRV滴度的影响；
图5是转染shRNA对CO细胞中MSRV蛋白表达的影响；其中1～6分别为攻毒后12、24、36、48、60、72h细胞病毒液；
图6是shRNA对大口黑鲈体内MSRVmRNA表达的影响；
图7是大口黑鲈累计死亡率统计结果。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明的实施例，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1大口黑鲈弹状病毒干扰靶点的筛选
针对大口黑鲈弹状病毒(GenBank:MK397811.2)G、M、N、L基因序列，设计合成12个siRNA分子(见表1)。采用脂质体转染法将12个siRNA分子分别转染到草鱼卵巢细胞(CO)，转染步骤按照脂质体
Figure BDA0002827289790000052
3000(Thermo Scientific公司产品)说明书进行，6h后用100个TCID50的MSRV感染CO细胞，于接种病毒完成后的72h收集细胞病毒液，Trizol试剂(Takara公司)提取总RNA并反转录为cDNA，然后进行Real-time PCR检测，具体方法参照文献(袁雪梅.大口黑鲈弹状病毒的分离培养及其卵黄抗体的制备[J].渔业科学进展,2020,41(3):151-157)进行，采用
Figure BDA0002827289790000053
qPCR Mix(东洋坊(上海)生物科技有限公司产品)试剂同时扩增cDNA的MSRV及内参基因β-actin，所用扩增引物(见表2)，反应参数为:95℃1min；95℃15s，58℃30s，72℃16s，45个循环。用2-ΔΔCt方法计算各干扰组病毒mRNA表达量相对于对照组的倍数关系。结果显示(见图1)，针对大口黑鲈弹状病毒G蛋白的设计合成的siRNAG-874效果最为明显，干扰组病毒mRNA的水平仅为对照组的22.4％。
表1大口黑鲈弹状病毒各基因双链SiRNA分子序列
Figure BDA0002827289790000051
Figure BDA0002827289790000061
表2Real time PCR中所用引物
Figure BDA0002827289790000062
实施例2shRNA表达载体的构建
1、针对实施例1中筛选得到的MSRV干扰靶点，设计合成shRNA表达载体，设计路线：
shRNA模板中的茎环结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了AGCT，与HindⅢ酶切后形成的粘端互补。
2、目的基因靶序列设计见下表3：
表3
序列名称 Sence(如SEQ ID NO.31所示) Antience(如SEQ ID NO.32所示)
sh384-MSRVG-874 GCACAAATCGCCTGCATAT ATATGCAGGCGATTTGTGC
(1)sh384-MSRV G-874
合成正义序列(如SEQ ID NO.33所示)：
5'-CACCGCACAAATCGCCTGCATATTTCAAGAGAATATGCAGGCGATTTGTGCTTTTTTG-3’；
合成反义序列(如SEQ ID NO.34所示)：
5'-AGCTCAAAAAAGCACAAATCGCCTGCATATTCTCTTGAAATATGCAGGCGATTTGTGC-3’；
shRNADNA的核苷酸序列(如SEQ ID NO.35所示)：
5'-GCACAAATCGCCTGCATATTTCAAGAGAATATGCAGGCGATTTGTGCTT-3’；
(2)sh384-阴性：
合成NC正义序列(如SEQ ID NO.36所示)：
5'-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3’；
合成NC反义序列(如SEQ ID NO.37所示)：
5'-AGCTCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3’；
shNC DNA的核苷酸序列(如SEQ ID NO.38所示)：
5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATT-3’。
3、shRNADNA模板的退火
将DNAoligo分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100μM。取相应的正义链和反义链oligo溶液，按照如下配比配置退火反应体系(见表4)。
表4
Figure BDA0002827289790000071
Figure BDA0002827289790000081
在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min；85℃5min；75℃5min；70℃5min；4℃保存。退火处理后得到浓度为10μM的shRNA DNA模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200nM，用于连接反应。
4、pSGU6/GFP/Neo-shRNA载体的构建
取10μgpSGU6/GFP/Neo载体(购自上海生工生物技术有限公司)，用内切酶BpiI(BbsI)和HindIII对其进行双酶切，酶切产物经纯化后与shRNADNA模板连接，连接酶为T4DNA Ligase(美国Thermo Fisher公司产品)，连接产物转化至感受态细胞DH5α中，挑取单克隆用通用引物T7(如SEQ ID NO.39所示):5'-GTAATACGACT CACTATAGGGC-3'和T3(如SEQ IDNO.40所示):5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'进行PCR检测；检测结束后将阳性克隆送至生工生物(上海)股份有限公司进行测序分析，测序结果如SEQ ID No.41所示，经比对为含有RNA干扰靶点SiG874的序列。
实施例3shRNA表达载体体外抗病毒效果
针对干扰靶点SiG874构建真核表达载体pSGU6/GFP/Neo-G-874，采用试剂盒(Promega公司产品)提取重组质粒，转染至CO细胞后，然后对转染的细胞进行攻毒，于不同时间收集细胞病毒液，采用Real-time PCR(同实施例1)检测病毒mRNA表达量，按照实验室常规方法(徐洋.两株草鱼呼肠孤病毒江西株的分离与鉴定[J].淡水渔业，2010(03)：44-49)检测病毒TCID50，Westerin-blot检测病毒蛋白表达量，并用MTT法(袁雪梅.大口黑鲈弹状病毒的分离培养及其卵黄抗体的制备[J].渔业科学进展,2020,41(3):151-157)检测病毒感染72h时细胞存活情况。结果显示，重组真核表达载体转染CO细胞，显微镜下可见绿色荧光(见图2)，MTT法测得载体其对MSRV引起的细胞病变具有明显抑制效果(见表5)，Real-time RT-PCR测得pSGU6/GFP/Neo-G-874转染组病毒mRNA水平低于阴性对照载体(见图3)，TCID50检测结果显示pSGU6/GFP/Neo-G-874转染组病毒滴度低于阴性对照载体(见图4)，Western-blot测得pSGU6/GFP/Neo-G-874转染组病毒蛋白表达量随时间减少，对照载体转染组pSGU6/GFP/Neo-NC则相反(见图5)。
表5shRNA对CO细胞病变的抑制作用
Figure BDA0002827289790000091
实施例4RNAi在大口黑鲈体内的抗病毒活性
选择载体pSGU6/GFP/Neo-G-874和对照载体pSGU6/GFP/Neo-NC按照1μg/g鱼体重的剂量，分别注射大口黑鲈鱼苗(体长1-3cm)，24h后对注射鱼苗进行MSRV攻毒，选择攻毒后的第1、4天每组3条，解剖取肝脏，提取总RNA。应用荧光定量PCR方法检测MSRV的复制转录情况，并以看家基因β-actin作为对照(袁雪梅.大口黑鲈弹状病毒的分离培养及其卵黄抗体的制备[J].渔业科学进展,2020,41(3):151-157)。同时观察并记录大口黑鲈鱼苗的发病死亡情况。结果显示注射pSGU6/GFP/Neo-G-874组大口黑鲈鱼苗体内MSRVmRNA水平(见图6)以及累计死亡率(见图7)均明显低于对照载体pSGU6/GFP/Neo-NC组及病毒阳性对照组，说明pSGU6/GFP/Neo-G-874在大口黑鲈鱼苗体内发挥了抑制MSRV复制增殖的作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 浙江省淡水水产研究所，浙江省农业科学院
<120> 一种抑制大口黑鲈弹状病毒复制的shRNA及其应用
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccacucauc augaucgaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uucgaucaug augaguggc 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaaauguca gagucucaa 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uugagacucu gacauuugc 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uaaaggagaa gaaugaugc 19
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcaagugauc uagccuaua 19
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
uauaggcuag aucacuugc 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccagcuuacu uaggaucaa 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
uugauccuaa guaagcugg 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcugaugucu cacuguaua 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
uauacaguga gacaucagc 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agcagcatca ccagccacat c 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgtccgtcgc ttgactcaat t 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
catcctccgt ctggacttgg ct 22
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cctctgggca cctgaacctc t 21
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcacaaatcg cctgcatat 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atatgcaggc gatttgtgc 19
<210> 33
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caccgcacaa atcgcctgca tatttcaaga gaatatgcag gcgatttgtg cttttttg 58
<210> 34
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agctcaaaaa agcacaaatc gcctgcatat tctcttgaaa tatgcaggcg atttgtgc 58
<210> 35
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gcacaaatcg cctgcatatt tcaagagaat atgcaggcga tttgtgctt 49
<210> 36
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
caccgttctc cgaacgtgtc acgtcaagag attacgtgac acgttcggag aattttttg 59
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agctcaaaaa attctccgaa cgtgtcacgt aatctcttga cgtgacacgt tcggagaac 59
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gttctccgaa cgtgtcacgt caagagatta cgtgacacgt tcggagaatt 50
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aattaaccct cactaaaggg 20
<210> 41
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gcatatgcac tcaagcgggt ttcttccgcc tccaggactc ttctttcata tatgagcctt 60
tatcagggta tgtctcatga gcggatacat attgaatggt acttagaaaa aataacaata 120
ggggtttccg cgcaccattt ccccgaaaag tgccactgac gcgcctgtag cggcgcatta 180
agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 240
cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 300
gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 360
aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 420
cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 480
acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 540
tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 600
acgcttacaa tttacgcgcg taatacgact cactataggg cgaattgggt accaaggtcg 660
ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg 720
ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt 780
gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg 840
actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt 900
ggaaaggacg aaacaccgca caaatcgcct gcatatttca agagaatatg caggcgattt 960
gtgctttttt gagcttacta gttctagagc ggccgccacc gaccgggg 1008

Claims (10)

1.一种shRNA，其特征在于，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示。
2.根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于，所述shRNA的正义链的核苷酸序列如SEQID No.33所示，所述shRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示。
3.根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于，所述shRNA的茎环结构为TTCAAGAGA，所述shRNA的转录终止序列为T6结构。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括慢病毒载体及权利要求1～3任一项所述的shRNA，所述shRNA插入在所述慢病毒载体中。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ IDNo.41所示。
6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pSGU6/GFP/Neo载体。
7.根据权利要求4或6所述的重组载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括BbsI酶切位点和HindⅢ酶切位点。
8.一种权利要求4-7任一项所述重组载体的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：先设计合成权利要求1～3任一项所述的shRNA，再将所述shRNA插入慢病毒载体中。
9.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌含有如权利要求4～7任一项所述的重组载体。
10.如权利要求1～3任一项所述的shRNA、如权利要求4～7任一项所述的重组载体或如权利要求9所述的重组工程菌在制备抑制大口黑鲈弹状病毒G糖蛋白复制的药物中的应用。
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