CN112831577A - 一种用于鉴别丝羽乌骨鸡与黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及应用 - Google Patents
一种用于鉴别丝羽乌骨鸡与黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别丝羽乌骨鸡与黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及应用，该引物包括：上游引物F：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；上游引物MF：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；下游引物R：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；本发明设计的用于鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡的引物，可以扩增出不同长度的丝羽乌骨鸡和黑凤鸡基因组DNA，通过凝胶电泳条带，可以非常容易的通过条带长短鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡，该方法可以100％准确的判断丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体，可用于冰鲜鸡市场上丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的鉴别或筛选。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种用于鉴别丝羽乌骨鸡与黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及应用。
背景技术
丝羽乌骨鸡是江西省泰和县特产，原产于泰和县武山北麓，根据产地又称武山鸡，因具有“丛冠、缨头、绿耳、胡须、丝毛、毛脚、五爪、乌皮、乌肉、乌骨”十大特征以及高营养价值和药用价值而闻名。丝羽乌骨鸡是著名的饮食药用鸡，全身均可入药，骨、肉及内脏均有药用价值，可以配成多种成药和方剂。
但是原种丝羽乌骨鸡，长速慢、产蛋量低，于是商业育种公司以丝羽乌骨鸡以及快长类品种为育种素材，培育了黑凤鸡。黑凤鸡又称黑乌凤鸡、黑丝毛乌鸡，其具有与丝羽乌骨鸡完全相同的十全性状，黑凤鸡屠体与丝羽乌骨鸡屠体外观并无两样，消费者无法区分。基于此，常常有不良商家以屠宰后的快长型黑凤鸡假冒优质的丝羽乌骨鸡。
目前尚没有鉴定丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的有效办法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴别丝羽乌骨鸡与黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，准确鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于鉴别丝羽乌骨鸡与黑凤鸡屠体的引物，包括：
上游引物F：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
上游引物MF：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
下游引物R：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供一种包含上述的引物的试剂盒。
本发明还提供一种上述的引物或上述的试剂盒在鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体中的应用。
本发明还提供一种上述的引物或上述的试剂盒在鉴别丝羽乌骨鸡中的应用。
本发明还提供一种上述的引物或上述的试剂盒在鉴别黑凤鸡中的应用。
本发明还提供一种用于鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)提取待测鸡种的基因组DNA；
(2)采用上述的引物对所述基因组DNA进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)所得PCR产物进行凝胶电泳分析，根据条带长短进行判定，较长条带，判定为黑凤鸡，较短条带，判定为丝羽乌骨鸡。
进一步地，所述较长条带的长度为542bp，所述较短条带的长度为310bp。
进一步地，所述较长条带的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述较短条带的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
进一步地，所述PCR扩增的扩增体系为：2×Eco Taq PCR SuperMix 10μL，引物各0.2L，模板NDA 2μL，去离子水补充至体系20μL。
进一步地，所述PCR扩增的扩增程序为：94℃5min，93℃30s、58℃30s、72℃30s，35个循环，72℃5min。
本发明公开了以下技术效果：
本发明设计的用于鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的引物，可以扩增出不同长度的丝羽乌骨鸡和黑凤鸡基因组DNA，通过凝胶电泳条带，可以非常容易的通过长短鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡，该方法可以100％准确的判断丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体，可用于市场上丝羽乌骨鸡和黑凤鸡的鉴别，打击以次充好的不良商家，并且该方法操作简单、易于实验室操作、便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景。此外，基于本发明方法开发的试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为丝羽乌骨鸡与黑凤鸡的PCR产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1 验证丝羽乌骨鸡与黑凤鸡基因组差异
步骤1：模板准备
(1)组织采集：采集6只丝羽乌骨鸡和6只黑凤鸡皮肤样本。
(2)DNA模板准备：采集50mg左右皮肤样本，放入有500μL液氮的离心管中，用组织研磨器将被采集的样品磨碎。待液氮蒸干后，加入200微升TE，1200rpm/min离心，抽取上清备用。
步骤2：目的位点分型
(1)PCR扩增
根据GenBank:DQ118701以及GenBank:DQ118702序列，设计三条特异性引物，对目的位点进行基因分型。其中R引物是F和MF引物的共同下游。F和R扩增得到542bp条带，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，MF和R引物扩增得到310bp条带，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
PCR扩增引物如表1所示：
表1 PCR扩增引物
PCR反应体系如表2所示：
表2 PCR扩增体系
PCR扩增程序如表3所示：
表3 PCR扩增程序
(2)电泳分型
利用1.5％浓度的琼脂糖凝胶对上述PCR产物进行电泳分析，之后使用凝胶成像系统对电泳结果进行成像。
(3)结果判定
结果如图1所示，1-6为丝羽乌骨鸡，7-12为黑凤鸡；根据条带长短判定，短条带(310bp)个体为丝羽乌骨鸡，长条带(542bp)个体为黑凤鸡。
实施例2 单盲检测判断方法的可靠性
本实施例采用单盲的方式，对已知品种的样本，根据分子检测结果再次判定其品种来源。
步骤1：模板准备
(1)组织采集：采集12只丝羽乌骨鸡和12只黑凤鸡皮肤样本。
(2)DNA模板准备：采集50mg左右皮肤样本，放入有500μL液氮的离心管中，用组织研磨器将被采集的样品磨碎。待液氮蒸干后，加入200微升TE，1200rpm/min离心，抽取上清备用。
步骤2：目的位点分型
(1)PCR扩增
根据GenBank:DQ118701以及GenBank:DQ118702序列，设计三条特异性引物，对目的位点进行基因分型。其中R引物是F和MF引物的共同下游。F和R扩增得到542bp条带，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，MF和R引物扩增得到310bp条带，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
PCR扩增引物如表4所示：
表4 PCR扩增引物
PCR反应体系如表5所示：
表5 PCR扩增体系
PCR扩增程序如表6所示：
表6 PCR扩增程序
(2)电泳分型
利用1.5％浓度的琼脂糖凝胶对上述PCR产物进行电泳分析，之后使用凝胶成像系统对电泳结果进行成像。
(3)品种判定
结果如表7所示，鉴别结果与待测鸡种已知品种一致率100％，说明本发明方法可100％准确鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡。
表7 分子检测鉴定黑凤鸡与丝羽乌骨鸡
| 编号 | 已知品种 | 检测结果 | 编号 | 品种 | 检测结果 |
| 1 | 黑凤鸡 | HF | 13 | 丝羽乌骨鸡 | SK |
| 2 | 丝羽乌骨鸡 | SK | 14 | 黑凤鸡 | HF |
| 3 | 黑凤鸡 | HF | 15 | 黑凤鸡 | HF |
| 4 | 丝羽乌骨鸡 | SK | 16 | 丝羽乌骨鸡 | SK |
| 5 | 丝羽乌骨鸡 | SK | 17 | 黑凤鸡 | HF |
| 6 | 丝羽乌骨鸡 | SK | 18 | 丝羽乌骨鸡 | SK |
| 7 | 黑凤鸡 | HF | 19 | 丝羽乌骨鸡 | SK |
| 8 | 黑凤鸡 | HF | 20 | 黑凤鸡 | HF |
| 9 | 丝羽乌骨鸡 | SK | 21 | 黑凤鸡 | HF |
| 10 | 黑凤鸡 | HF | 22 | 丝羽乌骨鸡 | SK |
| 11 | 丝羽乌骨鸡 | SK | 23 | 黑凤鸡 | HF |
| 12 | 黑凤鸡 | HF | 24 | 丝羽乌骨鸡 | SK |
注：“HF”表示黑凤鸡，“SK”表示丝羽乌骨鸡。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 南昌师范学院
<120> 一种用于鉴别丝羽乌骨鸡与黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accccatccc tgaagacact 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgcgtcatt ccttccttat cta 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccagagag cacagcagta at 22
<210> 4
<211> 542
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accccatccc tgaagacact caagattagg ctggattgag ctctgagcac ttgatggagc 60
tgtagatgtc ccttttcata gcaggggagc tgggctagat ggccttcaag agcatctttc 120
agctcaaacg attcagcgat tcaatgattc tatgatcatt cttgctttct attcttacag 180
ctttcacaaa accataaata gcactggaaa tagtaaaccc agttcccttc aatttcaaca 240
caaaaattgg gaaactttaa ggactggtgg aatttgctta gaattatttg taaccttcag 300
acaattttct tcacttcaat aatcattttt cactctgagc cttccagtgt tatctgttac 360
acaatctgta tacactggta ctgcattgca tcatgtaaaa ggacctctgt ttttctcctt 420
tctagcactt ggttctttcc aggacttttt aatcccctac ctcaagcaag cccatcagat 480
ctggccctgg ctggttggcg cagctgtgat cggaggcata attactgctg tgctctctgg 540
gc 542
<210> 5
<211> 310
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgcgtcatt ccttccttat ctagtagcca ccaatgagca tatggaatgt cttgcttttt 60
ccttatttgg tctttagact attcaagttg cctctggctc tatttgacta cacagtgtta 120
tctgttacac aatctgtata cactggtact gcattgcatc atgtaaaagg acctctgttt 180
ttctcctttc tagcacttgg ttctttccag gactttttaa tcccctacct caagcaagcc 240
catcagatct ggccctggct ggttggcgca gctgtgatcg gaggcataat tactgctgtg 300
ctctctgggc 310
Claims (10)
1.一种用于鉴别丝羽乌骨鸡与黑凤鸡屠体的引物，其特征在于，包括：
上游引物F：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
上游引物MF：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
下游引物R：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.包含权利要求1所述的引物的试剂盒。
3.一种权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体中的应用。
4.一种权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴别丝羽乌骨鸡中的应用。
5.一种权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴别黑凤鸡中的应用。
6.一种用于鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测鸡种的基因组DNA；
(2)采用权利要求1所述的引物对所述基因组DNA进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)所得PCR产物进行凝胶电泳分析，根据条带长短进行判定，较长条带，判定为黑凤鸡，较短条带，判定为丝羽乌骨鸡。
7.根据权利要求6所述的鉴别方法，其特征在于，所述较长条带的长度为542bp，所述较短条带的长度为310bp。
8.根据权利要求7所述的鉴别方法，其特征在于，所述较长条带的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，所述较短条带的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
9.根据权利要求6所述的鉴别方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系为：2×EcoTaq PCR SuperMix 10μL，引物各0.2L，模板NDA 2μL，去离子水补充至体系20μL。
10.根据权利要求6所述的鉴别方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增程序为：94℃5min，93℃30s、58℃30s、72℃30s，35个循环，72℃5min。
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