CN103789307B - 一种与鸡繁殖性能相关的分子标记及其在育种中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与鸡繁殖性能相关的分子标记及其在育种中的应用，属于分子遗传学领域。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；在该序列的第315bp处有一个C→T的碱基突变，导致SspⅠ-RFLP的多态性。本发明以鸡的基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.2-3所示的引物进行扩增，得到556bp的PCR扩增产物；PCR产物被SspⅠ限制性内切酶消化后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，得到CC、CT和TT三种带型；在蛋重较小和产蛋性能较低的地方品种中，选择CC基因型个体留种。本发明检测该与繁殖性状相关的分子标记，方法简单快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及一种与鸡繁殖性能相关的分子标记及其在育种中的应用。
背景技术
骨形态发生蛋白受体(Bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB)基因的主要生物学功能包括卵泡生长发育及排卵、骨组织发育、有机体胚胎发育等。研究发现BMPR-IB基因A746G(FecB)位置的单碱基突变导致绵羊多胎性状，并在多个绵羊品种中被确认。王生宝研究表明：小尾寒羊中A746G突变BB基因型个体产羔数极显著高于其他两种基因型个体(P<0.01)，萨寒F1代中杂合型个体产羔数显著高于++型个体(P<0.05)。闫亚东研究表明：高繁殖力绵羊品种与低繁殖力绵羊品种之间，A746G位点基因型分布差异极显著(P<0.001)。方翟等(2010)研究3个绵羊品种中A746G与产羔数的关系，结果表明BB、B+和++基因型个体间产羔数差异显著(P<0.05)。除了羊物种外，在其他动物中关于BMPR-IB遗传效应的研究并不多。宋一萍在猪BMPR-IB基因编码区396bp处检测到C→T突变，BB基因型个体与AA基因型个体在总产仔数和产活仔数性状上差异显著(P<0.05)。而在鸡上，只有Zhang等发现了BMPR-IB基因2个SNP位点C35T和A287G，其中A287G位点与47W至56W的产蛋量显著相关(P<0.05)。已有的研究表明BMPR-IB对动物繁殖性能具有重要的生物学功能，而繁殖性状又是家禽生产的重要经济性状，但目前对与鸡繁殖性状有关的BMPR-IB基因多态位点的挖掘研究却鲜有报道，无法将其应用于鸡的育种。
基因表达是DNA上的遗传信息转录和翻译的过程，目前已在小鼠、牛、羊、猪、鸡等多个物种上证实BMPR-IB基因参与卵巢卵泡发育及排卵，并与原始卵泡募集以及卵泡分化有关。王峰实验结果表明BMPR-IB基因在蒙古牛的卵巢、输卵管、子宫和肾脏4个组织中均有表达。其中，在卵巢和子宫中表达水平较高，而在输卵管和肾脏中的表达水平相对较低。BMPR-IB基因在牛初级卵泡和次级卵泡早期和晚期均有表达。孙瑞珍报道在小鼠和猪的各级卵泡中均有表达，认为BMPR-IB参与成年小鼠和猪卵泡的生长和发育，与猪原始卵泡募集有关。现在对鸡BMPR-IB基因的相关表达研究还相对较少，其机制功能并不明确。
发明内容
本发明通过深入研究实验发现了鸡BMPR-IB基因233062位点处的C→T转换产生的多态位点，该多态位点位于所扩增序列（其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示）的第315bp处。本发明的目的在于克隆BMPR-IB基因233062位点作为分子标记，并将其应用于鸡的育种中。
本发明的技术方案是：一种与鸡繁殖性能相关的分子标记，其特征是，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；在该序列的第315bp处有一个C→T的碱基突变，导致SspⅠ-RFLP的多态性。
扩增上述序列的引物为：
P-233062F：5’-CCCTTCTCAGTTGCTT-3’（SEQ ID No.2）；
P-233062R：5’-CCAAGATTAGTCCCAAA-3’（SEQ ID No.3）；
本发明以鸡的基因组DNA为模板，利用上述引物进行扩增，得到556bp的PCR扩增产物（其序列如SEQ ID No.1所示），该扩增产物包含Ssp I限制性内切酶的识别序列“AAT/ATT”；该扩增产物的第315bp处的“C”不发生突变时，即“AAT/ACT”类型记做“CC”，扩增片段SspⅠ内切酶切不开；当“C”突变为“T”，即“AAT/ATT”类型记做“TT”，可以被SspⅠ内切酶切作314bp和242bp的两条短片段；PCR产物被SspⅠ限制性内切酶消化后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，即得到CC（检测到556bp的一条条带）、CT（杂合型，出现556bp、314bp和242bp的三条短片段）、TT（检测到314bp和242bp的两条短片段）三种带型。
本发明通过关联分析表明：该分子标记与开产体重、43W体重、43W蛋重和43W产蛋量均表现出显著或密切相关。基因型CC个体对应最大开产体重、43W体重，且开产体重性状与基因型TT个体间差异显著，43W体重与基因型TT个体间差异极显著。而且该基因型个体43W产蛋量最高。同时，通过对鸡BMPR-IB基因的表达分析表明：BMPR-IB基因与鸡繁殖性能相关。
本发明的分子标记可以应用于鸡的育种，具体如下：在蛋重较小和产蛋性能较低的地方品种中，选择CC基因型个体留种，用于提高产蛋量以及总产蛋重量，增加种鸡体重，提高淘汰种鸡的效率，降低生产成本。
检测该与繁殖性状相关的分子标记，不仅方法简单快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
附图说明
图1为鸡BMPR-IB基因BMP10引物的扩增结果；
图2为BR233062酶切位点的序列分析；
图3为鸡BMPR-IB基因233062位点的多态性检测电泳图；图中，1,5,6为基因型CC；4,7,8为基因型TT；2,3,9,10为基因型CT；M：MakerⅠ；
图4BMPR-IB基因在不同周龄肝脏(L)、下丘脑(H)和卵巢(O)组织中的表达；
图5BMPR-IB基因在同一周龄肝脏(L)、下丘脑(H)、卵巢(O)和输卵管(S)组织中的表达。
具体实施方式
实施例1鸡BMPR-IB基因233062位点的测序、序列比对及突变位点分析
根据已发表的红色原鸡序列(GenBank Accession No:NC_006091.2；GI：118136300)，设计一组引物BMP10（其序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示），该组引物是为研究鸡BMPR-IB基因外显子8和部分内含子8的突变而设计的。该组引物分别扩增了济宁百日鸡、汶上芦花鸡和海兰褐蛋鸡BMPR-IB基因232748bp～233303bp的一段序列，扩增片段长度约为556bp（如图1所示），PCR产物送生物公司纯化测序。BMP10F：5’-CCCTTCTCAGTTGCTT-3’；BMP10R：5’-CCAAGATTAGTCCCAAA-3’。引物位置232748bp～233303bp，退火温度47.4℃。
使用BioEdit软件比对序列同源性和核苷酸变异，在扩增的大约556bp的序列上共发现2处核苷酸变异，均为核苷酸转换，包括第315bp处（BMPR-IB基因233062处）的C→T突变，见图2。
扩增产物：（如SEQ ID No.1所示，突变点如下划线所示）：
CCCTTCTCAGTTGCTTCCTTTTCAATCTACTTTTATAGCATGTATGATGCCCTTTTTTTTCCTTCTCTTTATTTTAGTGATACAAATGAGGTAGACATCCCTCCAAACACCCGCGTAGGAACAAAACGCTATATGCCTCCTGAGGTGCTGGATGAAAGCTTGAACAGAAATCACTTTCAGTCGTACATCATGGCTGATATGTACAGCTTTGGACTCATCCTTTGGGAGATAGCCAGGAGATGTGTGTCAGGAGGTAAATGACAATCATACCTTTTTGGTAGTTGGAAATTTGCTTTTAATTGTGTCAGTGAATACTATGATTTGATTATAAGCCCTAATCTTCCATTACGTCCTTTTCCCTCAGTATTATTTTTAATGTGATAAATATGTGGATAAACCATGCATGTAATTCTCTTAATTTCTCCTTTCTAGTTGAAACTTACTTAAAAGCATCTGTCAATGCTATTGCAAAAGCAAAGATTTATACTGTATTTTAGTGGCTCGTTTGAAGGCAGCAGATGCTTGCACTGTGGAAGGAGTTTGGGACTAATCTTGG。
实施例2鸡SspⅠ-RFLP检测的多态性及其与产蛋性状的关联分析
1试验材料
济宁百日鸡400只，汶上芦花鸡528只和海兰褐蛋鸡208只，均来自山东省地方鸡品种资源活体基因库。以上均为随机采样，翅静脉采血，ACD抗凝，-20℃保存。
2试验方法
2.1鸡血液DNA的提取
采用常规酚/氯仿法提取鸡血液DNA。
2.2突变位点及引物信息
鸡BMPR-IB基因233062位点是一个C→T的突变，包含Ssp I限制性内切酶的识别序列“AAT/ATT”，“C”不发生突变即“AAT/ACT”类型记做“CC”，扩增片段SspⅠ内切酶切不开；“C”突变为“T”，即“AAT/ATT”类型记做“TT”，可以被SspⅠ内切酶切作314bp和242bp的两条短片段；PCR产物被SspⅠ限制性内切酶消化后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，即得到CC、CT、TT三种带型（如图3所示）；引物采用BMP10引物，同实施例1。
PCR反应体系(总体积15μL)：2×Taq PCR MasterMix7.5μL，ddH2O5.6μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.45μL，基因组DNA(50ng/μL)1μL。
PCR程序：94℃3min，94℃20-30s，47.4℃20-30s，72℃20-30s，35个循环，72℃延伸4min。
限制性内切酶酶切反应体系(总体积15μL)：SspⅠ0.5μL(10U/μL)，10×Buffer G1μL，PCR产物8μL，ddH2O5.5μL，37℃水浴过夜。
酶切产物检测：120V，1.5%琼脂糖凝胶电泳30min，分析酶切产物基因型。
2.3关联分析
数据统计采用SAS8.1统计软件包的GLM程序进行基因型与性状（产蛋数、开产日龄）的关联分析。统计分析模型为yi=μ+Gi+ei，其中yi代表性状表型值，μ为性状群体均值，Gi代表基因型或双倍型的效应值，ei为随机残差。
不同基因型间的比较分析用最小二乘法，试验数据用最小二乘均值±标准误表示（LSM±SE），显著水平设定P<0.05。
3结果与分析
3.1BMPR-IB基因233062多态位点等位基因、基因型频率分布
233062位点在济宁百日鸡、汶上芦花鸡和海兰褐中的优势基因型均为CC，而在高产的海兰褐中全部表现为CC基因型，C在3个群体中均表现为优势等位基因。根据各品种的生产性能，推测CC可能与高繁殖性状有关。
表1BMPR-IB基因233062多态位点的基因型频率和等位基因频率
3.2BMPR-IB基因233062多态位点与产蛋性能的关联分析
在400只济宁百日鸡群体中，对BMPR-IB基因233062位点与开产蛋重等6个繁殖性状进行关联分析和多重比较，结果见表2。
233062位点对开产体重(P=0.0734)、43W体重(P=0.0179)、43W蛋重(P=0.0258)和43W产蛋量(P=0.1267)均表现出显著或密切相关。基因型CC个体对应最大开产体重、43W体重，且开产体重性状与基因型TT个体间差异显著(P<0.05)，43W体重与基因型TT个体间差异极显著(P<0.01)。而且该基因型个体43W产蛋量最高，但与其他两基因型个体间差异不显著(P>0.05)。
表2BMPR-IB基因BR233062多态位点各基因型与繁殖性能的关联分析
注：表中数值为最小二乘均值±标准误。同一性状上标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，上标不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。
综合以上分析得出，鸡BMPR-IB基因233062位点CC基因型在地方鸡种和海兰褐蛋鸡中均表现为优势基因型。尤其是233062位点分别与多个繁殖性状存在密切相关，其CC基因型个体，在所研究的6个繁殖性状中的5个性状上均拥有最高均值，且在其中3个性状上与其他基因型个体间差异显著，而且该位点在海兰褐中只表现为CC基因型，它可能与高繁殖性能相关。
实施例3鸡BMPR-IB基因的表达分析
1试验材料
同一批次入孵，相同环境下饲养，营养水平一致，19W、23W、40W济宁百日鸡各3只，均来自山东省地方鸡品种资源活体基因库。
取肝脏(Liver，L)、下丘脑(Hypothalamus，H)、输卵管(Oviduct，S)和卵巢(Ovary,O)组织。
2试验方法
2.1组织总RNA的提取
用超纯RNA提取试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取组织样本中总RNA。实验操作按产品说明书进行。
2.2反转录
用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744)进行反转录，实验操作按产品说明书进行。
2.3实时荧光定量PCR
2.3.1目的基因及内参基因的引物设计
目的基因Real Time PCR检测引物序列由康为世纪设计合成。
表3内参基因引物
2.3.2反应程序和反应体系
用UltraSYBR Mixture(with Rox)(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0956)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环。RealTime反应体系如表4所示。
表4RealTime反应体系
2.3.3建立筛选引物标准曲线
取样本SLG JB401cDNA进行梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行融解曲线分析，并以样品拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制目的基因和内参基因的标准曲线。
表5模板及引物
2.3.4仪器及分析方法
用LC-480II型荧光定量PCR仪，利用荧光定量PCR分别检测出目的基因和参照基因的Ct值后，采用2-△△CT法可计算出目的基因与参照基因的相对表达量，即：
3结果与分析
3.1BMPR-IB基因在同一组织中不同时间的表达规律
在肝脏和下丘脑组织中，刚开产比开产前表达上调，随后下调；23W与40W表达量间差异显著(P<0.05)。在卵巢组织中，BMPR-IB基因在开产前(19W)表达量最高，开产后下调(P<0.05)，19W与40W表达量间差异显著(P<0.05)，见图4。
3.2BMPR-IB基因在同一时间不同组织中的表达规律
BMPR-IB基因在19W的表达趋势为下丘脑>卵巢>肝脏，在肝脏中表达量与其他两种组织间差异显著(P<0.05)。在23W的表达趋势为输卵管>下丘脑>卵巢>肝脏，在输卵管中的表达量显著高于下丘脑和卵巢组织(P<0.05)，极显著高于肝脏组织(P<0.01)。在40W的表达趋势与23W相同，在输卵管组织中表达量最高，与其他组织中差异极显著(P<0.01)，见图5。
从上述的基因表达分析可以看出：BMPR-IB基因在鸡开产前、刚开产和产蛋高峰的输卵管、下丘脑和卵巢中的均高表达，表明BMPR-IB基因与鸡的繁殖性能相关。
Claims (2)
1.一种与鸡繁殖性能相关的分子标记在鸡育种中的应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，在该序列的第315bp处有一个C→T的碱基突变，导致SspⅠ-RFLP的多态性。
2.一种与鸡繁殖性能相关的分子标记在鸡育种中的应用方法，其特征是，以鸡的基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.2-3所示的引物进行扩增，得到556bp的PCR扩增产物；PCR产物被SspⅠ限制性内切酶消化后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，得到CC、CT和TT三种带型；所述CC型为：检测到只有556bp的一条条带；所述CT型为：检测到556bp、314 bp和242 bp三条条带，所述TT型为：检测到314 bp和242 bp的两条条带；在蛋重较小和产蛋性能较低的地方品种中，选择CC基因型个体留种；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，在该序列的第315bp处有一个C→T的碱基突变，导致SspⅠ-RFLP的多态性。
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