CN112126643A - 一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法 - Google Patents

一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法，通过磁珠法高选择性的分离外泌体中ecDNA，无需使用超速离心等复杂操作，也避免使用氯化铯等有毒试剂，能够适应自动化操作分离得到较高纯度ecDNA产物，极大地提高了实验效率，有效节省人力、时间成本。

Description

一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法。
背景技术
外泌体(exosome)是一种30-150nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成。外泌体在被发现后的很长一段时间内都没有引起研究者的注意，直到纳米分析技术的引进，以及2013年诺贝尔生物医学奖的公布，这个直径只有几十纳米的颗粒受到了前所未有的重视。
几乎所有细胞都会分泌外泌体，细胞分泌的外泌体携带了来源细胞的诸多生物学信息，因此，外泌体也被认为是重要的潜在生物标记物，可以及时的反映来源细胞的生理与病理状态。
ecDNA是近期肿瘤学领域的研究热点，国内外的相关研究还处于起步阶段。ecDNA指的是从染色体上脱落，脱离染色体以环状结构存在的DNA。研究表明ecDNA普遍存在于肿瘤细胞中，是原癌基因的载体，是肿瘤异质性的驱动力之一，会推动肿瘤的快速演化，并可能与肿瘤的耐药相关。
目前，可查询的文献报道目前关于ecDNA提取的方法主要是采用氯化铯梯度离心法进行提取，氯化铯梯度离心法亦称平衡密度梯度离心法，用超速离心机对小分子物质溶液长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。经过高速离心后DNA、RNA等物质会形成一个连续的浓度梯度，ecDNA会悬浮于某一层，进而可以收集纯化获得较高纯度的ecDNA。
但是使用氯化铯梯度离心法提取ecDNA存在诸多缺点，例如：提取实验过程中使用氯化铯以及溴化乙锭均为有毒试剂，对操作人员身体和环境可能造成危害；操作过程中离心次数较多，还需要使用超速离心机，且ecDNA分层吸取技术较难，实验整体复杂，必须由经过培训的专业人士进行操作；实验耗时久、成本高，无法进行自动化操作。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提出一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法，通过磁珠法高选择性的分离外泌体中ecDNA，无需使用超速离心等复杂操作，也避免使用氯化铯等有毒试剂，能够适应自动化操作分离得到较高纯度ecDNA产物，极大地提高了实验效率，有效节省人力、时间成本。
为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：
一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法，包括：
使用碱性洗涤磁珠法处理外泌体产物获得ecDNA产物；
所述碱性洗涤磁珠法包括使用洗涤液II对吸附有核酸的磁珠进行洗涤操作，和，使用洗涤液III对经过洗涤液II洗涤操作的磁珠进行洗涤操作；
所述洗涤液II的pH为7至12；
所述洗涤液III包含有蛋白酶。
进一步地，所述碱性洗涤磁珠法包括：
使用磁珠悬液II对外泌体裂解后的产物进行核酸吸附操作；
使用洗涤液II对吸附有核酸的磁珠进行洗涤操作；
使用洗涤液III对经过洗涤液II洗涤操作的磁珠进行洗涤操作；
使用洗脱液对经过洗涤液III洗涤操作的磁珠进行洗脱操作，使磁珠上吸附的ecDNA被洗脱。
进一步地，所述外泌体裂解包括使用裂解液对外泌体产物进行裂解操作；所述裂解液包括蛋白酶抑制剂。
进一步地，所述洗涤液II包括终浓度为0.1至100mmol/L的Tris。
进一步地，所述洗涤液II包括终浓度为20mmol/L的Tris，且所述洗涤液II的pH为10。
进一步地，所述洗涤液III包括浓度为5至20mmol/L的Tris、终浓度为0.1至5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度70至80％的乙醇。
进一步地，所述洗涤液III包括浓度为10mmol/L的Tris、终浓度为0.5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度75％的乙醇。
进一步地，所述洗脱液包括终浓度为5至20mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
进一步地，所述洗脱液包括终浓度为10mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
进一步地，所述裂解液包括终浓度为1.8至5mmol/L的(NH4)2SO4、0.1至3mmol/L的NaCl、0.01至15mmol/L的PMSF和体积比为0.1至10％的Tritonx-100。
进一步地，所述裂解液包括终浓度为3mmol/L的(NH4)2SO4、0.15mmol/L的NaCl、1mmol/L的PMSF和体积比为1％的Tritonx-100。
进一步地，所述核酸吸附操作包括加入磁珠悬液II震荡混匀，室温孵育3分钟，瞬时离心3秒，吸磁后弃除上清；所述洗涤操作包括加入洗涤液震荡混匀，瞬时离心3秒，吸磁后弃除上清；所述洗脱操作包括加入洗脱液震荡混匀，50℃孵育10分钟，瞬时离心5秒，吸磁后收集上清。
进一步地，所述裂解操作包括加入裂解液震荡混匀，室温孵育5分钟。
本发明还涉及一种用于分离外泌体中ecDNA的试剂组合，所述试剂组合包括裂解液、磁珠悬液II、洗涤液II、洗涤液III和洗脱液；
所述裂解液包括终浓度为1.8至5mmol/L的(NH4)2SO4、0.1至3mmol/L的NaCl、0.01至15mmol/L的PMSF和体积比为0.1至10％的Tritonx-100；
所述磁珠悬液II包括终浓度为0.1至10mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为10至50％的甘油；
所述洗涤液II包括终浓度为0.1至100mmol/L的Tris，且所述洗涤液II的pH为7至12；
所述洗涤液III包括浓度为5至20mmol/L的Tris、终浓度为0.1至5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度70至80％的乙醇；
所述洗脱液包括终浓度为5至20mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
进一步地，
所述裂解液包括终浓度为3mmol/L的(NH4)2SO4、0.15mmol/L的NaCl、1mmol/L的PMSF和体积比为1％的Tritonx-100；
所述磁珠悬液II包括终浓度为1mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为25％的甘油；
所述洗涤液II包括终浓度为20mmol/L的Tris，且所述洗涤液II的pH为10；
所述洗涤液III包括浓度为10mmol/L的Tris、终浓度为0.5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度75％的乙醇；
所述洗脱液包括终浓度为10mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
进一步地，所述试剂组合还包括用于从样本中吸附外泌体的磁珠悬液I，和，用于对吸附有外泌体的磁珠进行洗涤操作的洗涤液I；
所述磁珠悬液I包括终浓度为0.1至10mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为10至50％的甘油；
所述洗涤液I包括终浓度为0.1至30mmol/L的KH2PO4、终浓度为0.3至28mmol/L的Na2H2PO4。
进一步地，
所述磁珠悬液I包括终浓度为3mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为25％的甘油，且所述磁珠悬液I中的硅羟基磁珠外表面包裹有特异性吸附外泌体的蛋白抗体；
所述洗涤液I包括终浓度为1mmol/L的KH2PO4、终浓度为4mmol/L的Na2H2PO4。
本发明还涉及一种用于自动化分离外泌体中ecDNA的试剂盒，所述试剂盒包括有如上所述的试剂组合中任意一种。
本发明的有益效果为：
采用本发明所述基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法，通过碱性的洗涤液II选择性的去除ecDNA之外的其它核酸，由于ecDNA与组蛋白结合因此不会受到洗涤液II影响；再通过含有蛋白酶的洗涤液III暴露ecDNA，使其能够被洗脱，进而实现以磁珠法分离获得较高纯度ecDNA，避免使用氯化铯、溴化乙锭等有害试剂，对实验人员没有潜在健康损害危险，且操作方法简便，能够适应自动化提取操作以及多组平行实验同步进行，节约实验人力、时间成本；在本发明所述方法基础上设置的试剂组合以及包含有试剂组合的试剂盒能够直接应用于现有磁珠法核酸提取仪器中，实现自动化、多组平行的提取ecDNA。
附图说明
图1为本发明基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法的流程示意图。
图2为采用本发明方法提取血浆样本中ecDNA的电泳检测图。
图3为采用本发明方法提取血清样本中ecDNA的电泳检测图。
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明的内容，将结合附图和实施例详细说明。
如图1所示为本发明基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法的流程示意图，具体包括以下步骤：
使用常规方法(例如磁珠法)从生物样本中分离获得外泌体；
使用裂解液对分离得到的外泌体进行裂解操作；
使用磁珠悬液II对外泌体裂解后的产物进行核酸吸附操作；
使用pH为7至12的洗涤液II对吸附有核酸的磁珠进行洗涤操作；
使用包含有蛋白酶的洗涤液III对经过洗涤液II洗涤操作的磁珠进行洗涤操作；
使用洗脱液对经过洗涤液III洗涤操作的磁珠进行洗脱操作，使磁珠上吸附的ecDNA被洗脱。
其中，连续使用洗涤液II和洗涤液III对附着有核酸的磁珠进行两次洗涤形成了本发明所述的碱性洗涤磁珠法的主要特征，可以高效特异性的分离ecDNA。主要作用过程在于：采用碱性洗涤液II进行洗涤，可以去除磁珠上吸附的除ecDNA之外的其他核酸，而ecDNA由于结合有组蛋白，不会被碱性洗涤液II影响，在该洗涤过程中保持吸附在磁珠上，进而可以通过应用洗涤液II的洗涤过程吸磁弃除上清后去除其他核酸；之后，使用含有蛋白酶的洗涤液III进行洗涤，蛋白酶可以分解与ecDNA结合在一起的组蛋白，使ecDNA外露，可以被洗脱，最终获得纯度较高的ecDNA。同时，为了更好的实现上述方法，可以在对外泌体进行裂解操作时采用含有蛋白酶抑制剂的裂解液，例如含有PMSF成分的裂解液，可以抑制裂解液中的蛋白酶作用，保护ecDNA上结合的组蛋白，使其不会被蛋白酶的降解作用影响，便于后续在碱性洗涤液II进行洗涤时能够将ecDNA保留在磁珠上。本发明所述方法是基于磁珠法所进行的改进，整体操作过程可以简便的应用到现有仪器、设备中进行自动化操作。
为了实现较佳的提取效果，本发明给出了较优的试剂组成，具体为：
裂解液包括终浓度为1.8至5mmol/L的(NH4)2SO4、0.1至3mmol/L的NaCl、0.01至15mmol/L的PMSF和体积比为0.1至10％的Tritonx-100，进一步优选为包括终浓度为3mmol/L的(NH4)2SO4、0.15mmol/L的NaCl、1mmol/L的PMSF和体积比为1％的Tritonx-100；
磁珠悬液II包括终浓度为0.1至10mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为10至50％的甘油，进一步优选为包括终浓度为1mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为25％的甘油；
洗涤液II包括终浓度为0.1至100mmol/L的Tris，同时需要保证pH维持在7至12的区间内；洗涤液II还可进一步优选为包括终浓度为20mmol/L的Tris，且所述洗涤液II的pH为10；
洗涤液III包括浓度为5至20mmol/L的Tris、终浓度为0.1至5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度70至80％的乙醇，进一步优选为包括浓度为10mmol/L的Tris、终浓度为0.5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度75％的乙醇；
所述洗脱液包括终浓度为5至20mmol/L的Tris、且所述洗脱液为碱性，进一步优选为包括终浓度为10mmol/L的Tris、且所述洗脱液的pH为8.5。
以上试剂组分组成仅为实现本发明所述方法的一种较优选择，并不排除任何其他试剂用于施行本发明所述方法。
为了使本领域技术人员能够更加直观的理解并实施本发明所述方法，本发明还给出了较优的实验执行实施方式，具体为：
所述裂解操作包括加入裂解液震荡混匀，室温孵育5分钟；
所述核酸吸附操作包括加入磁珠悬液II震荡混匀，室温孵育3分钟，瞬时离心3秒，吸磁后弃除上清；
所述洗涤操作包括加入洗涤液震荡混匀，瞬时离心3秒，吸磁后弃除上清；
所述洗脱操作包括加入洗脱液震荡混匀，50℃孵育10分钟，瞬时离心5秒，吸磁后收集洗脱液。
以上实验执行实施方式仅为实现本发明所述方法的一种较优选择，使用磁珠法进行核酸分离操作是本领域技术人员的公知常识，任何合适的具体操作步骤或使用任何现有仪器用于执行本发明所述方法都不需要额外的创造性劳动。
在实际应用本方法进行ecDNA提取时，一般会涉及从血浆、血清样本中提取外泌体(即本方法所述使用常规方法从生物样本中分离获得外泌体)，再分离外泌体中ecDNA的步骤，一种典型的全程使用磁珠法从血浆样本(血清样本操作步骤类似)中分离得到ecDNA的完整步骤优选的包括：
(1)取1.5mL离心管，加入血浆样本和磁珠悬液Ⅰ，震荡混匀后37℃孵育15min；
(2)将(1)所得混合液瞬时离心约3s，吸磁后弃除上清；
(3)向(2)中加入洗涤液I，震荡混匀，瞬时离心约3s，吸磁后弃除上清；
(4)向(3)中加入裂解液，充分震荡混匀，室温孵育5min；
(5)向(4)中加入磁珠悬液II，充分震荡混匀，室温孵育3min。瞬时离心约3s，吸磁后弃除上清；
(6)向(5)中加入洗涤液II，充分震荡混匀，瞬时离心约3s，吸磁后弃除上清；
(7)向(6)中加入洗涤液III，充分震荡混匀，瞬时离心约3s，吸磁后弃除上清；
(8)向(7)中加入洗脱液，充分震荡混匀，50℃震荡孵育10min；
(9)将(8)所得到的混合液瞬时离心约5s，吸磁后将洗脱液转移至新的离心管中备用。
采用上述步骤即可实现从血浆中分离得到较高纯度ecDNA的效果，同时上述步骤也支持采用任意适合的核酸提取仪进行自动化操作。
优选的，所述的磁珠悬液I包括终浓度为0.1至10mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为10至50％的甘油，特别是进一步优选为终浓度为3mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为25％的甘油，且所述磁珠悬液I中的硅羟基磁珠外表面包裹有特异性吸附外泌体的蛋白抗体；所述洗涤液I包括终浓度为0.1至30mmol/L的KH2PO4、终浓度为0.3至28mmol/L的Na2H2PO4，特别是进一步优选为终浓度为1mmol/L的KH2PO4、终浓度为4mmol/L的Na2H2PO4。
采用上述方法从血浆样本中分离所得ecDNA经过滚环扩增后电泳检测结果如图2所示，其中编号1、2为测试样本，3、4为阴性对照，M为2000bp的maker。从图2中可以明确得知通过本发明所述方法能够从血浆样本中分离得到ecDNA并用于检测。
类似的，采用上述方法从血清样本中分离所得ecDNA经过滚环扩增后电泳检测结果如图3所示，其中编号1、2为测试样本，3、4为阴性对照，M为2000bp的maker。从图3中可以明确得知通过本发明所述方法同样能够从血清样本中分离得到ecDNA并用于检测。
为了便于实验人员使用本发明所述方法，本发明还涉及一种对应的用于分离外泌体中ecDNA的试剂组合，优选的该试剂组合中包括有上述磁珠悬液I、洗涤液I、裂解液、磁珠悬液II、洗涤液II、洗涤液III和洗脱液，使实验人员通过使用该试剂组合即可实现从血浆或血清等样本中分离得到ecDNA的实验目的。进一步地，本发明还涉及使用上述试剂组合制备的试剂盒，该试剂盒可以用于核酸提取仪应用本发明所述方法从血浆、血清等样本中自动化的分离得到ecDNA。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (18)

1.一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法，其特征在于，包括：
使用碱性洗涤磁珠法处理外泌体产物获得ecDNA产物；
所述碱性洗涤磁珠法包括使用洗涤液II对吸附有核酸的磁珠进行洗涤操作，和，使用洗涤液III对经过洗涤液II洗涤操作的磁珠进行洗涤操作；
所述洗涤液II的pH为7至12；
所述洗涤液III包含有蛋白酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性洗涤磁珠法包括：
使用磁珠悬液II对外泌体裂解后的产物进行核酸吸附操作；
使用洗涤液II对吸附有核酸的磁珠进行洗涤操作；
使用洗涤液III对经过洗涤液II洗涤操作的磁珠进行洗涤操作；
使用洗脱液对经过洗涤液III洗涤操作的磁珠进行洗脱操作，使磁珠上吸附的ecDNA被洗脱。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述外泌体裂解包括使用裂解液对外泌体产物进行裂解操作；所述裂解液包括蛋白酶抑制剂。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤液II包括终浓度为0.1至100mmol/L的Tris。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述洗涤液II包括终浓度为20mmol/L的Tris，且所述洗涤液II的pH为10。
6.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤液III包括浓度为5至20mmol/L的Tris、终浓度为0.1至5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度70至80％的乙醇。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述洗涤液III包括浓度为10mmol/L的Tris、终浓度为0.5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度75％的乙醇。
8.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱液包括终浓度为5至20mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述洗脱液包括终浓度为10mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述裂解液包括终浓度为1.8至5mmol/L的(NH4)2SO4、0.1至3mmol/L的NaCl、0.01至15mmol/L的PMSF和体积比为0.1至10％的Tritonx-100。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述裂解液包括终浓度为3mmol/L的(NH4)2SO4、0.15mmol/L的NaCl、1mmol/L的PMSF和体积比为1％的Tritonx-100。
12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸吸附操作包括加入磁珠悬液II震荡混匀，室温孵育3分钟，瞬时离心3秒，吸磁后弃除上清；所述洗涤操作包括加入洗涤液震荡混匀，瞬时离心3秒，吸磁后弃除上清；所述洗脱操作包括加入洗脱液震荡混匀，50℃孵育10分钟，瞬时离心5秒，吸磁后收集上清。
13.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述裂解操作包括加入裂解液震荡混匀，室温孵育5分钟。
14.一种用于分离外泌体中ecDNA的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包括裂解液、磁珠悬液II、洗涤液II、洗涤液III和洗脱液；
所述裂解液包括终浓度为1.8至5mmol/L的(NH4)2SO4、0.1至3mmol/L的NaCl、0.01至15mmol/L的PMSF和体积比为0.1至10％的Tritonx-100；
所述磁珠悬液II包括终浓度为0.1至10mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为10至50％的甘油；
所述洗涤液II包括终浓度为0.1至100mmol/L的Tris，且所述洗涤液II的pH为7至12；
所述洗涤液III包括浓度为5至20mmol/L的Tris、终浓度为0.1至5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度70至80％的乙醇；
所述洗脱液包括终浓度为5至20mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
15.如权利要求14所述的试剂组合，其特征在于，
所述裂解液包括终浓度为3mmol/L的(NH4)2SO4、0.15mmol/L的NaCl、1mmol/L的PMSF和体积比为1％的Tritonx-100；
所述磁珠悬液II包括终浓度为1mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为25％的甘油；
所述洗涤液II包括终浓度为20mmol/L的Tris，且所述洗涤液II的pH为10；
所述洗涤液III包括浓度为10mmol/L的Tris、终浓度为0.5mg/mL的蛋白酶K、体积百分比浓度75％的乙醇；
所述洗脱液包括终浓度为10mmol/L的Tris，且所述洗脱液的pH为8.5。
16.如权利要求14或15所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合还包括用于从样本中吸附外泌体的磁珠悬液I，和，用于对吸附有外泌体的磁珠进行洗涤操作的洗涤液I；
所述磁珠悬液I包括终浓度为0.1至10mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为10至50％的甘油；
所述洗涤液I包括终浓度为0.1至30mmol/L的KH2PO4、终浓度为0.3至28mmol/L的Na2H2PO4。
17.如权利要求16所述的试剂组合，其特征在于，
所述磁珠悬液I包括终浓度为3mg/ml的硅羟基磁珠、体积百分比为25％的甘油，且所述磁珠悬液I中的硅羟基磁珠外表面包裹有特异性吸附外泌体的蛋白抗体；
所述洗涤液I包括终浓度为1mmol/L的KH2PO4、终浓度为4mmol/L的Na2H2PO4。
18.一种用于自动化分离外泌体中ecDNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有如权利要求14至17任一项所述的试剂组合。
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