CN107955810A - 一种新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以脂肪多胺型树形分子(PAMAM)和陶瓷颗粒为特征的新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法，包括裂解液LB、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液。本发明的最显著特征在于，同时添加脂肪多胺型树形分子及陶瓷颗粒，有效的提高了对蛋白、脂肪等杂质的去除，利用本发明试剂盒提取动物肝脏组织基因组核酸回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质。核酸提取从裂解、纯化到收集产物的全过程均可由仪器完成，自动化程度高，提取所使用的试剂高效安全，最大程度避免对人体的伤害。

Description

一种新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种以脂肪多胺型树形分子为特征的新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法。

背景技术

核酸即(Nucleic Acids)是遗传信息的载体，人们对基因进行重组、改造、进化分析、疾病诊断和基因治疗等都必须进行核酸的提取和纯化。因此核酸样品的提取和分离纯化是分子生物学各类实验不可缺少的一个环节。核酸的提取方法对检测过程和检测效果有很大影响。

核酸提取是分子生物学的基本方法,也是核酸诊断中最关健的方法,它是下游诊断、分析和制备的前提。随着分子检测技术的广泛应用，核酸提取技术获得长足发展。第一代化学法，如异硫氰酸胍-酚-氯仿提取法、Trizol提取法等操作繁琐、耗时、易污染，对人员技术水平要求较高；第二代为吸附柱提取法操作较简单、提取效率高、提取质量稳定。近年发展起来的第三代磁珠提取法提取效率更高，且可进行仪器自动化批量提取，在有批量提取要求的实验室中广受推崇以核酸为研究对象的生物技术，包括对核酸的提取、克隆、扩增、检测、测序等一系列技术，近年来飞速发展，这些技术目前不仅在研究单位使用，而且在社会生活中多个职能部门已经广泛应用。

然而，由于磁珠对蛋白质及脂肪也具有一定的吸附性，导致核酸提取液的纯度不佳，蛋白质和脂肪含量偏高。说明磁珠法核酸提取方法仍然有进一步增强其核酸提取效率的必要性。

树形分子是一类三维、高度有序的齐聚物，由三个结构部分组成：中心核，内层支化单元和端基支化单元。树形分子具有像树一样的外表结构，在结构上具有高度的几何对称性，精确的分子结构和大量的官能团，分子内存在空腔且分子质量具有可控性。由于合成步骤是可控制的，因而分子结构相对传统线形大分子而言是单分散性的，而且结构参数如尺寸、外形、表面化学都可以在合成过程中得到完全控制。

脂肪多胺型树形分子是树形分子中最典型的一种，其分子中有大量含N的官能团(伯胺、叔胺、酰胺等)，而且这些官能团以规则的层状支化方式存在，并且其数量随分子代数的增加以几何级数的形式增加，具有对脂肪、蛋白质有良好的吸附性能。本发明选用了脂肪多胺型树形分子中的SG-TETA2作为吸附材料。SG-TETA2能与磁珠争夺对脂肪、蛋白质的吸附，且具有更强的吸附性，从而减少了磁珠对脂肪、蛋白质的吸附，并使得磁珠能吸附更多的核酸，进一步提高磁珠法核酸提取的效率和纯度。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术不足，提供一种更高效的提取高纯度动物肝脏组织核酸的试剂盒。

本发明提供了一种以脂肪多胺型树形分子为特征的新型动物肝脏核酸提取试剂盒,其特征在于，包括裂解液LB、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液四种组分。

其中，裂解液LB包括：盐浓度≥4M的高浓度盐，10～30mg/ml脂肪多胺型树形分子，10～30mg/ml陶瓷颗粒，1～2％Triton X-100，20～60mM的pH为6.0～8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，40～80mM乙二胺四乙(EDTA)，所述高浓度盐选自下组中的任意一种：盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钾，裂解液LB终PH＝6-8。

其中，洗涤液为：盐浓度≥10mM的盐，10～30mM的pH6.0～8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，75％乙醇，所述盐选自下组中的任意一种：氯化钾、氯化钠。

其中，磁珠悬液按每0.3～0.7mg磁珠分散于100μl 20％～80％异丙醇的比例配制。优选地，磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，磁珠直径在100-1000nm之间，具有核壳结构，即超顺磁性核心及氧化硅外壳。

优选地，洗脱液为：DEPC处理水。

优选的，脂肪多胺型树形分子为SG-TETA2。

优选的，陶瓷颗粒直径在50-100微米之间。

优选的，新型动物肝脏核酸提取试剂盒包含：(1)裂解液LB：4.5M异硫氰酸胍，15mg/ml脂肪多胺型树形分子，15mg/ml陶瓷颗粒，1.5％Triton X-100，30mM的pH为6.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，50mM乙二胺四乙酸(EDTA)，裂解液LB的最终终PH＝6.4；(2)磁珠悬液：0.5mg磁珠分散于100μl 20％异丙醇；(3)洗涤液：15mM氯化钠，20mM的pH6.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，75％乙醇；(4)洗脱液：DEPC处理水。

本发明的另一个目的是提供一种更高效的提取高纯度动物肝脏组织核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)裂解与结合：将“7N”mg生物样品，加入到包含“20N”μL本发明的上述裂解液、“20N”μL异丙醇的1.5ml离心管中，充分混匀，室温放置8～10min，使细胞裂解并释放其中的核酸、蛋白质，再加入“N”μL磁珠溶液，游离的核酸在裂解液中高浓度盐和异丙醇作用下吸附到磁珠表面，最后通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(2)清洗：在离心管内加入“50N”μL含乙醇的洗涤液，充分混匀，第一次清洗磁珠，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液，重复操作一次；

(3)洗脱：在离心管内加入“2N～10N”μl洗脱液，充分混匀，56℃加热洗脱3～5min，使核酸从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，即为提取好的核酸。

步骤(1)的特征在于：1)所述“N”，10≤“N”≤15；2)所述裂解液含有脂肪多胺型树形分子及陶瓷颗粒，增强了去除蛋白质和脂肪的能力，且对磁珠的操作没有任何影响；3)所述的生物样品为动物肝脏组织。

步骤(3)的特征在于：洗脱液的用量根据用户需要在20-150μl体积之间任选。

本发明还提供了硅胶支撑的脂肪多胺型树形分子SG-TETA2制备方法，包括：

(1)SG—TETA的合成：TETA，CPTS与甲醇混合，磁力搅拌，氮气保护下混合物回流12h，得到CPTS-TETA，蒸馏，然后加入活化硅胶，以甲苯为溶剂，机械搅拌，氮气保护下回流反应12h，洗涤，抽滤，回流萃取24h，真空干燥至少48h，得SG-TETA；

(2)SG-TETA-MA的合成：SG-TETA，重蒸MA，甲醇混合，氮气保护下50度反应3d，反应结束后，抽滤，回流萃取24h，50度真空干燥至少48h，得到SG-TETA-MA。

(3)SG-TETA2的合成：SG-TETA-MA，甲醇，TETA混合，氮气保护下50度反应5d，反应结束后，抽滤，回流萃取24h，真空干燥至少48h，得到SG-TETA2。

制备得到的SG-TETA2的分子结构和制备流程如图1所示。

本发明的有益效果在于：

1)由于加入了脂肪多胺型树形分子和陶瓷颗粒，使得利用本发明试剂盒提取的核酸回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质。使用本试剂提取70mg猪肝脏、小鼠肝脏组织，分别纯化得到了约11μg和8μg的高纯度核酸，纯度A260/280＝1.8-1.9之间。

2)本发明还发现与常规的磁珠法，或单独加入脂肪多胺型树形分子或陶瓷颗粒相比，同时加入脂肪多胺型树形分子和陶瓷颗粒，具有协同增强的分离作用，有效的提高了对蛋白、脂肪等杂质的去除；

3)本发明的DNA提取方法仅需3个步骤，分别是裂解与结合、清洗、洗脱，从裂解、纯化到收集产物的全过程均可由仪器完成，自动化程度高，实验过程中完全无需人工干预和检测，简便快捷，且提取所使用的试剂高效安全，最大程度的避免对人体的伤害。

附图说明

图1为SG-TETA2的合成流程图。

图2为3个猪肝样本的凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明通过下面的实施例进行说明。应当理解的是，具体实施例仅是对本发明作出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。

本发明中使用的术语“A260”，是指核酸的吸光度。

本发明中使用的术语“A280”，是指蛋白质的吸光度。纯净的核酸A260/A280的比值应在1.8至1.9之间。

本发明中使用的术语“A230”，是指多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。

实施例1：

1.SG-TETA2的制备。

[1]SG—TETA的合成

在250ml三口烧瓶中加入15ml CPTS(82mmol)，150ml甲醇，25ml TETA(167mrn01)，磁力搅拌，氮气保护下混合物回流12h，得到CPTS-TETA。将上述三口烧瓶中的混合物蒸馏，然后加入活化硅胶5g，以150ml甲苯为溶剂，机械搅拌，氮气保护下回流反应12h。产物依次用甲苯、乙醇洗涤，抽滤。置于索氏提取器中，用无水乙醇回流萃取24h，50度真空干燥至少48h，得SG-TETA。

[2]SG-TETA-MA的合成

称取6.69SG-TETA，置于250ml三口烧瓶中，再加入100ml甲醇，16ml(176mmol)重蒸MA，氮气保护下50度反应3d。反应结束后，抽滤，置于索氏提取器中，用无水乙醇回流萃取24h，50度真空干燥至少48h，得到SG-TETA-MA。

[3]SG-TETA2的合成

称取3g SG-TETA-MA，置于250ml三121烧瓶中，加入100ml甲醇，60ml(402mmol)TETA，氮气保护下50度反应5d。反应结束后，抽滤，置于索氏提取器中，用无水乙醇回流萃取24h，50度真空干燥至少48h，得到SG-TETA2。

2.动物肝脏组织中核酸的提取。

2.1实验目的

使用本发明的试剂盒及方法从动物肝脏组织中提取核酸，通过测定其OD值以及凝胶电泳，检测本发明提取的核酸的浓度以及纯度。样本共3组，分别为：S1、S2、S3。

(1)裂解与结合：取新鲜猪肝脏组织70mg到1.5mL的离心管中，加入200μL裂解液LB，用匀浆器充分研磨，静置15min。加入振荡混匀的10μL磁珠结合液和200μL异丙醇，振荡混匀1min，共静置9min，每隔3min振荡混匀1min。将离心管置于磁力架上进行磁分离，待所有磁珠完全吸附或2min后，小心吸弃废液。

(2)洗涤：加入500μL洗涤液，涡旋30sec，然后将样品管在磁力架上静置，保持样品管静止，待所有磁珠完全吸附后，小心吸弃废液。重复洗涤一次。

(3)洗脱：室温下开盖干燥3-5min，加入30μL无核酸酶污染纯水，缓慢抽吸混匀10～20次。将离心管置于磁力架上静置，待所有磁珠完全吸附，将洗脱液转移至新的离心管中，洗脱液即为DNA溶液。

2.2凝胶电泳及OD值测定

凝胶电泳：配制1％琼脂凝胶，上样量10μL，使用DYY-7C电泳仪，120电泳20min后，使用BOT-Ⅲ暗箱紫外分析仪观察结果；

OD值测定：使用Nano-100微量紫外分光光度计，测定样品的OD值。

2.3结果分析

从凝胶电泳图(图2，3个猪肝样本的凝胶电泳图)来看，样本S1、S2、S3提取的DNA呈弥散状，为DNA的特征。

OD值测定结果见表1：

表1：猪肝核酸溶液的纯度及浓度

使用本发明提取的样品核酸其A260/A280在1.8～1.9之间，说明纯度非常高。本发明提取的样品A260/A230均大于2.0，说明提取的核酸中杂质含量非常低。

对比例1,2,3：

1实验目的

使用常规磁珠法试剂盒，单独加入脂肪多胺型树形分子或陶瓷颗粒的试剂盒，分别与本发明的提取效果作对比。与实施例1相比，对比例1(常规磁珠法试剂盒)中的不同之处在于：裂解液中不含脂肪多胺型树形分子及陶瓷颗粒，其他试剂和操作方法相同，对比例2的不同之处在于裂解液中不含脂肪多胺型树形分子，对比例3的不同之处裂解液中不含陶瓷颗粒。样本共3组，分别为：S4-12。

2OD值测定

OD值测定：使用Nano-100微量紫外分光光度计，测定样品的OD值。

3结果分析

OD值测定结果见表2：

表2：加入不同量SPA后提取的猪肝核酸溶液的纯度及浓度

对比例1-3的A260/A280基本满足在1.8～1.9之间，也会出现低于1.8的情况，相比之下实施例1提取的核酸纯度更加稳定。对比例1与实施例1提取的样品A260/A230均大于2.0，说明提取的核酸中杂质含量都较低，但可以看到，实施例1的A260/A230更高，提取的核酸更加纯净，更能满足后续的下游实验。而在浓度方面，实施例1获得的核酸溶液更高，效果显著。同时对比例1-3与实施例1对比，发现单独加入脂肪多胺型树形分子或陶瓷颗粒的试剂盒，在核酸的纯度和浓度方向有一定提升，但是与实施例1相比，同时加入脂肪多胺型树形分子和陶瓷颗粒能取得更加突出的技术效果，推测是由于脂肪多胺型树形分子和陶瓷颗粒具有协同的增强的技术效果，这是本领域技术人员意想不到的技术效果。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims (10)

1.一种新型动物肝脏核酸提取试剂盒,其特征在于，包括裂解液LB、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液；

所述裂解液LB包括：盐浓度≥4M的高浓度盐，10～30mg/ml脂肪多胺型树形分子，10～30mg/ml陶瓷颗粒，1～2％Triton X-100，20～60mM的pH为6.0～8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，40～80mM乙二胺四乙(EDTA)，所述高浓度盐选自下组中的任意一种：盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钾，所述裂解液LB的最终PH为6-8；

所述洗涤液包括：盐浓度≥10mM的盐，10～30mM的pH6.0～8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，75％乙醇，所述盐选自下组中的任意一种：氯化钾、氯化钠；

所述磁珠悬液按每0.3～0.7mg磁珠分散于100μl 20％～80％异丙醇的比例配制。

2.根据权利要求1所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒，其中洗脱液为：DEPC处理水。

3.根据权利要求1所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒，其中脂肪多胺型树形分子为SG-TETA2。

4.根据权利要求1所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒，其中陶瓷颗粒直径在50-100微米之间。

5.根据权利要求1所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒，其中试剂盒包含：(1)裂解液LB：4.5M异硫氰酸胍，15mg/ml脂肪多胺型树形分子，15mg/ml陶瓷颗粒，1.5％Triton X-100，30mM的pH为6.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，50mM乙二胺四乙酸(EDTA)，裂解液LB的最终终PH＝6.4；(2)磁珠悬液：0.5mg磁珠分散于100μl 20％异丙醇；(3)洗涤液：15mM氯化钠，20mM的pH6.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，75％乙醇；(4)洗脱液：DEPC处理水。

6.根据权利要求1所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒，其中所述磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，磁珠直径在100-1000nm之间，具有核壳结构，即超顺磁性核心及氧化硅外壳。

7.一种高效的提取高纯度动物肝脏组织核酸的方法，其特征在于，使用如权利要求1-6任一项所述的试剂盒，包括如下步骤：

(1)裂解与结合：将“7N”mg生物样品，加入到包含“20N”μL裂解液、“20N”μL异丙醇的1.5ml离心管中，充分混匀，室温放置8～10min，使细胞裂解并释放其中的核酸、蛋白质，再加入“N”μL磁珠溶液，游离的核酸在裂解液中高浓度盐和异丙醇作用下吸附到磁珠表面，最后通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(2)清洗：在离心管内加入“50N”μL含乙醇的洗涤液，充分混匀，第一次清洗磁珠，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液，重复操作一次；

(3)洗脱：在离心管内加入“2N～10N”μl洗脱液，充分混匀，56℃加热洗脱3～5min，使核酸从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，即为提取好的核酸。

8.根据权利要求7所述的提取高纯度动物肝脏组织核酸的方法，其中步骤(1)中所述“N”满足10≤“N”≤15。

9.根据权利要求7所述的提取高纯度动物肝脏组织核酸的方法，其中步骤(3)中所使用的洗脱液的用量根据用户需要在20-150μl体积之间任选。

10.根据权利要求3所述的新型动物肝脏核酸提取试剂盒，其中所述SG-TETA2制备方法，包括

(1)SG—TETA的合成：TETA，CPTS与甲醇混合，磁力搅拌，氮气保护下混合物回流12h，得到CPTS-TETA，蒸馏，然后加入活化硅胶，以甲苯为溶剂，机械搅拌，氮气保护下回流反应12h，洗涤，抽滤，回流萃取24h，真空干燥至少48h，得SG-TETA；

(2)SG-TETA-MA的合成：SG-TETA，重蒸MA，甲醇混合，氮气保护下50度反应3d，反应结束后，抽滤，回流萃取24h，50度真空干燥至少48h，得到SG-TETA-MA；

(3)SG-TETA2的合成：SG-TETA-MA，甲醇，TETA混合，氮气保护下50度反应5d，反应结束后，抽滤，回流萃取24h，真空干燥至少48h，得到SG-TETA2。