CN106255753A

CN106255753A - 稳定化生物学样本中的核酸的组合物和方法

Info

Publication number: CN106255753A
Application number: CN201580015964.6A
Authority: CN
Inventors: H·C·比恩鲍姆; L·波扎; 赫尔南德斯 C·A·梅里诺; E·V·杜哈宁
Original assignee: DNA Genotek Inc
Current assignee: DNA Genotek Inc
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2015-03-06
Publication date: 2016-12-21
Anticipated expiration: 2035-03-06
Also published as: RU2717644C2; US20170166955A1; MX2016011495A; CA2941764C; BR112016020659A8; ES2880310T3; RU2016138077A; US11198899B2; DK3114225T3; RU2016138077A3; SG11201607364RA; EP3114225A4; WO2015131291A1; KR102392407B1; EP3114225A1; US20200239931A1; KR20160130287A; SG10201807736SA; AU2015226811B2; AU2015226811A1

Abstract

公开了用于稳定化复杂生物学样本如粪便中存在的人和微生物脱氧核糖核酸(DNA)的方法、组合物和试剂盒。具体地，公开了用于在环境温度下稳定化生物学样本中包含的DNA的水性组合物以及采用该水性组合物的相关方法和试剂盒。一方面，组合物包括存在浓度为至少约150mM的螯合剂，并且组合物具有至少约9.5的pH。

Description

稳定化生物学样本中的核酸的组合物和方法

发明领域

本申请涉及稳定化生物学样本中的核酸的领域。更具体地，本发明涉及稳定化复杂生物学样本如粪便中存在的人和微生物脱氧核糖核酸(DNA)的方法和组合物。

发明背景

粪便长久以来被归类为来自动物消化道的潜在传染性废品，其被收集以测试寄生物如蛲虫和/或其卵或检测症状性动物和人的病原性细菌和真菌。然而，近来，随着个性化药物增加和前生物素和原生物素(pre-and pro-biotics)大规模商品化，这种“废”品的诊断价值以及特别是预后价值已逐步上升。仅仅饮食习惯的变化已显示出对粪便中的小生物群(microbiota)或微生物群体(microbial community)组成的影响(Walker等，2011；Wu等，2011)，其可进而可影响健康和降低某些疾病的发病率。

胃肠(GI)道定居始于出生，并且随着时间发展的微生物群体的成形受到多种影响，包括个体的基因组成、年龄、性别、营养、抗生素使用和其它服用药物、疾病状态、生活方式、地理位置/环境、化学品暴露、外科干预和其它。由在人体健康中——具体地在食物消化、宿主能量代谢、必需维生素合成、上皮成熟、胆盐降解、药物和饮食致癌物代谢、以及保护消化道(gut)防止病原定居中——具有重要作用的约100万亿细菌组成的各种微生物群体定居于肠。

‘消化道微生物组(gut microbiome)’是被给出以描述人GI系统中的共生微生物和其共同相互作用基因组的这种庞大集合的术语。然而，对消化道小生物群和宿主生理之间的这些功能性相互作用的理解是在其婴儿期。人类微生物组项目(Human MicrobiomeProject)揭示，消化道微生物组比人基因组大约150倍，由大约介于300和1000个之间细菌物种和多于7000个菌种组成。在大多数哺乳动物中，消化道微生物组主要有四个细菌门：硬壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actionbacteria)和变形菌门(Proteobacteria)(Ley等.，2007)。一个新的工作领域涉及分析消化道微生物组与消化道寄生物、病毒、酵母、和大量真菌——如念珠菌(念珠菌)、酵母属(Saccharomyces)、曲霉(Aspergillus)、和青霉(Penicillium)——的相互作用。一些专家已经提出，单独由人基因组编码的全部信息不足以实施全部的机体生物学功能(Lee和Mazmanian，2010)，并且提到细菌和人之间的共生作为解释。在仅约10％的人细胞是实际上的人，而微生物组成剩余90％的情况下，人可被认为是微生物客体的宿主或超个体(super-organisms)。

多年来，肠微生物已被牵涉到结肠癌的发生中(Aries等.，1969；Moore和Moore，1995)。最近，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染已被确定是胃(胃部)癌、胃淋巴瘤和胃溃疡疾病的主要原因(Parsonnet等，1991)。然而，发现消化道微生物对我们的感受和行为具有比我们所知更多的影响。由于消化道和脑之间存在通信的证据越来越多，消化道已被戏称为‘第二脑’。证据表明，多种疾病，如心血管疾病、糖尿病、紧张/焦虑、孤独症、克罗恩病、过敏性肠疾病(IBD)、变应性紊乱、代谢综合征和神经系统炎症可源于消化道微生物组失调。然而，研究人员刚刚开始破译现在所谓的‘微生物组-消化道-脑轴线’，即，定居在GI道的微生物可如何影响消化道之外的生物学功能，具体地，消化道微生物组影响其宿主的免疫系统、内分泌和神经系统疾病的分子机制或串扰(crosstalk)(Grenham等，2011；Kinross等，2011)。例如，很多微生物产生神经代谢物，该神经代谢物是神经递质或神经传递调节因子，包括GABA、去甲肾上腺素、血清素、多巴胺和乙酰胆碱，其直接或通过遍布GI道存在的肠嗜铬细胞作用于消化道中的神经末梢。来自饮食纤维的碳水化合物也被微生物分解，导致神经活性化学剂(如正丁酸盐(酯)、乙酸盐(酯)、氢硫化物和丙酸盐(酯))产生。另外，微生物排出代谢物，如蛋白质、碳水化合物和其它分子，这些代谢物可留在消化道并具有在整个机体内信号传导疾病的作用。

在健康和患病个体中，除确定组成消化道微生物群体的数百种不同物种外，获得对整个细菌群的功能性的了解也是非常重要的。例如，小生物群的组成决定饮食成分作为生长基质的竞争、糖向抑制发酵产物的转化、生长基质的产生、细菌素的释放(对其它细菌物种有毒的分子)、天然免疫系统的刺激、与定居在消化道壁的微生物的竞争和消化道屏障功能、和其它。不幸的是，传统的微生物学培养技术已被证实在协助确定消化道微生物组成员的身份和功能方面大部分是不成功的，因为其依赖于适当的生长营养物和复杂条件以使整个肠微生物群在体外繁殖而受到显著限制。估测表明，整个肠微生物群中仅20-40％(Apajalahti等，2003)可通过标准培养技术来培养，因此培养类方法漏失了大部分微生物生物多样性。由于需要确保多数厌氧的体外肠微生物群的生活力，这个因素被进一步加剧(O’Sullivan，2000)。

很多培养基本身对一些细菌(具体地，不利于直接从粪便或肠材料培养的生理状态的需要附加的或选择性的试剂或细菌的细菌)有选择。而且，传统的用于识别和表征肠微生物群的形态学检查和生化测试非常劳动密集、耗时和不精确，因此限制了其对于分析多个个体的样品和比较来自不同个体的细菌物种之间的相关度的效率。因此，需要在收集时结合不依赖培养的分子工具(如16S核醣体RNA基因类方法、TaqMan探针、数字和LATE PCR、和宏基因组测序(metagenomic sequencing))捕捉和稳定化或“快照(snap-shot)”微生物组的快速方法，来克服这些限制和偏见，因而可显示这种富集生态系统的真实而详细的图片。

目前，每20个住院患者中约1个会遭到医院获得性感染(HAI)。虽然大部分类型的HAI正在衰减，但艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)——一种已知的致病生物(pathobiont)——导致的发病是逐渐增加的困扰医院和长期保健机构中的患者的问题。艰难梭状芽胞杆菌感染(CDI)被认为源于胃肠道生态失调，即，定居小生物群的破坏。抗生素治疗杀死GI道中的大部分细菌，该细菌通常控制艰难梭状芽胞杆菌。在这种改变的环境中，艰难梭状芽胞杆菌复制并产生攻击肠内层的毒素，导致从腹泻至危及生命的炎症的范围的症状和结肠内层出血。据疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control andPrevention，CDC)所言，仅艰难梭状芽胞杆菌就与美国每年14,000人的死亡有关。在医院中，排在粪便中的艰难梭状芽胞杆菌孢子主要通过保健人员的接触过污染的表面或物品的手转移至患者和表面。针对复发性艰难梭状芽胞杆菌感染的有效治疗不广泛可用。矛盾的是，艰难梭状芽胞杆菌感染的主要疗法是给予更多抗生素，其中约20％的患者在一个月内有复发，并且其中很多已经反复发作。

非常规的替代型程序，粪便小生物群移植(FMT)——其中来自一个“供体”的粪便被灌输到患者的肠中——证明在治疗复发性GI感染时远比抗生素有效。通过恢复对微生物平衡的干扰，来自健康供体的粪便的灌输呈现牵制有害细菌如艰难梭状芽胞杆菌，根除疾病——即使在是已经历反复的使人衰弱的数回发作的患者体内。在阿姆斯特丹大学(University of Amsterdam)的小型荷兰研究中，16位复发性艰难梭状芽胞杆菌感染患者中的15位通过供体粪便的十二指肠灌输被治愈，与之相比，被给予抗生素万古霉素2周方案的患者仅为27％(van Nood，Els等。(2013))。显示供体粪便的灌输导致患者GI道中的微生物多样性提高并且这种多样性经过时间持续存在。近来，Song等(2013)验证了此前的报告：复发性艰难梭状芽胞杆菌感染(RCDI)患者粪便样本的降低的小生物群多样性和富集性在FMT后恢复至与健康供体相似。在这个纵向研究中，FMT主要影响硬壁菌门和变形菌门，并且粪便小生物群在FMT后的患者体内持续改变至少16周。

重要地，造成FMT成功治疗RCDI的确切作用机制仍然未知，并且没有临床验证的参数集来限定适当的供体或理想的供体小生物群。需要在多个时间点从大量个体——健康供体和RCDI患者——在环境温度下实地收集粪便样本和快照组合物中的采样微生物组的容易而有效的手段，来绘制在群体中健康个体的GI道中发现的‘核心’微生物组，其上可覆盖RCDI患者的变化微生物组。最后，未来RCDI患者不用抗生素，而用定制原生物素(包含活细菌、经口服以将有益的细菌恢复至机体的制剂/补充剂)和前生物素(促进GI微生物群的目标选定小组的活性的不可消化食物组分，如寡糖)或合生物素(synbiotics)(原生物素和前生物素的协同组合)治疗，以使其微生物组恢复健康状态。

为规避引入不确定的潜在有害的微生物的风险，一些医院开始建立自主建库系统。患者的粪便可被存库以在未来针对可能的医院获得性“超级病菌”感染用作解毒剂。利用患者’自己的粪便进行移植在很大程度上降低了引入有害微生物的风险并且避免了无关供体粪便的耗时且高价的可传递疾病筛查。然而，不幸地，显示某些人的“生态系统”使其比别人更易染病。因此，与再引入患者自己的粪便相关的可能的缺点是其仅可提供短期益处而非治愈其有害微生物，如艰难梭状芽胞杆菌。最后，微生物组研究可导致识别‘核心’或‘楔石’细菌物种，该‘核心’或‘楔石’细菌物种有助于定义人体健康，并且从而构建由充分表征的有益的细菌“混合物”组成的个性化“细菌疗法”以代替移植“原生”粪便的这种粗糙方法。事实上，原生物素疗法现已被提出用于多种消化道相关的障碍如IBD和炎性肠综合征。从根本上，试图表征供体小生物群的所有物种、识别诊断标志物以预测疾病易感性、和最终提供‘个性化’保健的研究人员和临床医生需要确信测试的粪便样本提供体外供体微生物组的真实表现或“快照”，而非微生物群体的‘退化’或人为表现。因此，在收集时立刻捕捉和稳定或快照粪便微生物组的有效手段至关重要。

结肠直肠癌(CRC)在欧洲和美国具有最高癌症死亡率。已知CRC如果在其早期阶段被检测出来则高度可治愈(>90％)，使得早期癌症筛查是一件有价值的事。多年来已设计出多种灵敏的检查方法来检测癌症，如双重对比钡灌肠、结肠镜检查和可屈性乙状结肠镜检查。然而，这些程序相关的经济成本、基础设施和人力需求呈现巨大阻碍，更不必说对患者的不适性和侵入性。除成本外，这些检查方法的低通量性也阻碍其实施用于全国范围的初级筛查。

目前，另一筛查结肠直肠癌的方法是粪便隐血测试(FOBT)。此测试检测粪便样本中血红蛋白的存在以确定GI道是否存在出血，作为CRC的间接预测。虽然此测试不贵，但其灵敏性和阳性预测价值很低，并且假阳性结果的发生率高。因此，非常需要灵敏、可靠、成本有效、可规模化的方法用于风险性和/或症状性个体的疾病诊断以及症状性群体的常规诊断筛查。理想地，个体将在其家中的隐私场所常规地收集和稳定化其部分粪便，然后将其邮寄至测试机构以筛查CRC和其它疾病。

已公认脱落到结肠腔中并从粪便回收的肿瘤细胞的直接检测和检查是比隐血更阳性的结肠直肠癌预测。然而，指示癌症或其它疾病的“目标”或突变人类DNA通常在生物学样本中以低频率存在(例如，对于CRC，为全部人类DNA的1％)，通常相对于高本底的野生型DNA(例如，细菌DNA和来自正常结肠细胞的人类DNA)，并且暴露于内源性人类DNA酶(例如，脱氧核糖核酸酶I)和/或细菌核酸酶(例如，微球菌核酸酶)。在这种复杂样品中，存在于粪便样本中的仅有的一点“目标”人类DNA可因核酸酶和环境条件甚至在其到达实验室前被快速降解，不利地影响诊断测试的临床灵敏度。不仅核酸酶丰富，构成消化道中99％以上细菌的厌氧细菌在粪便从消化道排出时就暴露于空气。空气，特别是氧气，对于厌氧细菌是有毒的环境，在4-5分钟内杀死50％的厌氧生物并且在仅仅20分钟后杀死95-97％的厌氧生物(Brusa等，1989)。再一次，考虑到大多数粪便样本在家中而非在实验室或保健机构中收集，获得粪便中的完整微生物组和人类DNA的代表视图或“快照”是个挑战。

稳定化生物学样本中的总核酸以使其在样本处理、运输和储存过程中不降解是必要的。为最小化生物学样本中的核酸降解，标准实践是将全部样本或其部分在干冰上(-78℃)运输至集中检测机构，在此将其立即解冻和处理或维持冷冻储存(-80℃至-20℃)。确保收集的样本被立即冷冻、在运输至测试机构期间维持冷冻、和分析前在最佳条件下储存所需的成本、后勤(logistics)和基础设施提出了巨大挑战和风险，特别是在大规模的和以群体为基础的筛查应用中。提供用于分散式样本分析的‘代表性’样本并仍维持最大限度的样本完整性甚至可能更具挑战。非常需要开发一种更可靠和标准化的样本处理方法和组合物捕捉和维持每个样本核酸谱的真实表现。

对微生物组与其健康和疾病人宿主之间的关系的研究依赖于识别和经过一段时间监测微生物群体。近来的发现证明这些微生物谱可用作生物标志物，具有预后和诊断价值。在文献中更加明确，由于消化道微生物组的动态属性，随时间对大型群体反复取样对于开发这种生物标志物是至关重要的。这些研究，被称为Microbiome-Wide AssociationStudies(MWAS)，因供体服从性低、生物学样本自我收集不可靠、成本高和货运和处理程序繁琐而具有挑战。

当前的粪便取样和小生物群分析方法涉及在有可能使样本暴露于与微生物组稳定不相容的温度的条件下运输样品。在样本收集、运输、处理和分析过程中不能适当地稳定化微生物组有掩盖微生物组谱的生物学和临床意义的风险。因此，需要适当的分析前程序来确保体内微生物组谱尽可能最佳的表现。

需要在环境温度下的运输和储存过程中稳定化复杂生物学样本如粪便中的核酸(具体地人和微生物)的组合物和方法。

提供这个背景信息的目的是传达申请人认为与本发明可能相关的已知信息。不一定意图也不应被解释为承认任何前述信息构成本发明的现有技术。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于在环境温度下稳定化生物学样本中包含的核酸的组合物、方法和试剂盒。

一方面，提供在环境温度下稳定化生物学样本中包含的核酸的方法，包括如下步骤：a)获得生物学样本；b)使生物学样本与包括螯合剂的水性组合物接触以形成混合物，其中螯合剂以至少约150mM的浓度存在并且其中组合物具有至少约9.5的pH；c)均化(b)中的混合物以形成均匀的混合物；和d)在环境温度下储存均匀的混合物。

另一方面，提供用于在环境温度下稳定化生物学样本中包含的核酸的水性组合物，其包括螯合剂，其中螯合剂以至少约150mM的浓度存在，其中组合物具有至少约9.5的pH。

再另一方面，提供用于在环境温度下稳定化生物学样本中包含的核酸的试剂盒，该试剂盒包括：a)样本容器，具有可重复密封的封闭物；b)水性组合物，包括螯合剂，其中螯合剂以至少约150mM的浓度存在，其中组合物具有至少约9.5的pH，其中所述组合物任选地被包含在样本容器内；c)均化装置，任选地被包含在样本容器内；d)将生物学样本或其部分转移到样本容器中的装置；和d)使用说明书。

在一个实施方式中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。

在另一实施方式中，生物学样本选自粪便样本、土壤样本、污水样本、废水样本、或水样本。在另一实施方式中，生物学样本是粪便样本。在另一实施方式中，粪便样本源自哺乳动物。在再另一实施方式中，哺乳动物是人。

在另一实施方式中，螯合剂选自1,2-环己二胺四乙酸(CDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA)、四氮杂环十四烷四乙酸(TETA)、去铁胺(desferioximine)、或其螯合剂类似物。在另一实施方式中，螯合剂是CDTA。

在另一实施方式中，螯合剂的浓度是约150mM至约500mM、或约250mM至约350mM。在再另一实施方式中，螯合剂的浓度是约300mM。

在再另一实施方式中，组合物的pH为约9.5至约11.5、或约10.5至约11.5。在另一实施方式中，组合物的pH为约11。

在还再另一实施方式中，组合物进一步包括至少一种能够在9.5至11.5的pH范围内缓冲的缓冲剂。在另一实施方式中，缓冲剂是β-丙氨酸。

在再另一实施方式中，组合物进一步包括水溶性有机溶剂，如C₁-C₆烷醇。在另一实施方式中，水溶性有机溶剂是乙醇。在再另一实施方式中，乙醇在组合物中以小于约30体积％的浓度存在。在还再另一实施方式中，乙醇在组合物中以小于约24体积％的浓度存在。

在另一实施方式中，组合物进一步包括洗涤剂，如十二烷基硫酸钠。在再另一实施方式中，组合物进一步包括消泡剂，如Antifoam A。在还再另一实施方式中，组合物进一步包括抗微生物剂，如三氯生(Triclosan)或Proclin。

在再另一实施方式中，核酸是微生物DNA。

在再另一实施方式中，核酸是微生物DNA，并且该方法稳定化生物学样本的微生物组谱。在再另一实施方式中，该方法使生物学样本的微生物组谱在室温下稳定至少7天、至少14天、至少30天、或至少60天；在约37℃至约50℃的温度下至少7天、或至少14天；和/或在-20℃下至少30天。

在再另一实施方式中，核酸是微生物DNA，并且组合物/试剂盒用于稳定化生物学样本的微生物组谱。

在再另一实施方式中，核酸是人类DNA。在再另一实施方式中，方法使人类DNA稳定：在室温下至少7天，至少14天，至少30天、或至少60天；在约37℃至约50℃的温度下至少7天、或至少14天；和/或在-20℃下至少30天。

在还再另一实施方式中，方法包括利用均化装置均化生物学样本和水性组合物的混合物。

在另一实施方式中，上述方法和试剂盒的均化装置是至少一个混合球。在再另一实施方式中，至少一个混合球是不锈钢混合球或碳化钨混合球。在再另一实施方式中，至少一个混合球是直径为约5.6-11.1mm并且密度为至少约7.6g/cm³的不锈钢混合球。在还再另一实施方式中，不锈钢混合球的直径为约7.1–8.7mm，并且样本容器是内径为约12.9mm的圆底管。

在另一实施方式中，方法包括在包含至少一个混合球的样本容器中形成生物学样本和水性组合物的混合物，密封样本容器，和在存在至少一个混合球的情况下通过振荡混合物来均化混合物。在再另一实施方式中，振荡提供手动完成。

在其它实施方式中，稳定化核酸包括在环境温度下储存期间保全(preserve)生物学样本中包含的核酸的相对丰度。

在再另一实施方式中，提供在环境温度下稳定化粪便样本中包含的DNA的方法，包括如下步骤：a)获得来自哺乳动物的粪便样本；b)使粪便样本接触pH为约10.5至约11.5的水性组合物，并且其中组合物包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：数量为约250mM至约350mM的CDTA；数量为约30mM至约70mM的β-丙氨酸；按体积计约21.5％至约23.5％数量的乙醇；约0至约1％(w/v)数量的十二烷基硫酸钠；和约0至约0.2％(v/v)数量的Antifoam A；c)均化(b)中的混合物以形成均匀的混合物；和d)在环境温度下储存均匀的混合物。在再另一实施方式中，水性组合物的pH为约11，并且包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：约300mM数量的CDTA；约50mM数量的β-丙氨酸；约23.5体积％数量的乙醇；约0.5％(w/v)数量的十二烷基硫酸钠；和约0.1％(v/v)数量的Antifoam A。在再另一实施方式中，方法包括在圆底管中形成粪便样本和水性组合物的混合物，该圆底管的内径为约12.9mm并且包含直径为约5.6-11.1mm并且密度为至少约7.6g/cm³的至少一个不锈钢混合球；密封圆底管；和在存在至少一个不锈钢混合球的情况下通过手动振荡混合物来均化混合物。在另一实施方式中，DNA是微生物DNA，并且方法稳定化粪便样本的微生物组谱。

在再另一实施方式中，提供用于在环境温度下稳定化粪便样本中包含的DNA的水性组合物，其中粪便样本源自哺乳动物，其中组合物的pH为约10.5至约11.5，并且包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：数量为约250mM至约350mM的CDTA；数量为约30mM至约70mM的β-丙氨酸；数量为按体积计约21.5％至约23.5％的乙醇；数量为约0至约1％(w/v)的十二烷基硫酸钠；和数量为约0至约0.2％(v/v)的Antifoam A。在再另一实施方式中，水性组合物的pH为约11，并且包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：数量为约300mM的CDTA；数量为约50mM的β-丙氨酸；数量为约23.5体积％的乙醇；数量为约0.5％(w/v)的十二烷基硫酸钠；和数量为约0.1％(v/v)的Antifoam A。在另一实施方式中，DNA是微生物DNA，并且组合物用于稳定化粪便样本的微生物组谱。

在还再另一实施方式中，提供用于在环境温度下稳定化生物学样本中包含的核酸的试剂盒，试剂盒包括：a)样本容器，具有可重复密封的封闭物；b)水性组合物，具有约10.5至约11.5的pH，并且包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：数量为约250mM至约350mM的CDTA；数量为约30mM至约70mM的β-丙氨酸；数量为按体积计约21.5％至约23.5％的乙醇；数量为约0至约1％(w/v)的十二烷基硫酸钠；和数量为约0至约0.2％(v/v)的Antifoam A，其中所述组合物任选地被包含在样本容器内；c)均化装置，任选地被包含在样本容器内；d)将生物学样本或其部分转移到样本容器中的装置；和d)使用说明书。在另一实施方式中，水性组合物的pH为约11，并且包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：数量为约300mM的CDTA；数量为约50mM的β-丙氨酸；数量为约23.5体积％的乙醇；数量为约0.5％(w/v)的十二烷基硫酸钠；和数量为约0.1％(v/v)的Antifoam A。在再另一实施方式中，核酸是微生物DNA，并且试剂盒用于稳定化生物学样本的微生物组谱。在还再另一实施方式中，均化装置是直径为约5.6-11.1mm并且密度为至少约7.6g/cm³的至少一个不锈钢混合球，和样本容器是内径为约12.9mm的圆底管。

附图说明

为更好地理解本发明及其其它方面和进一步特征，参考下列描述，下列描述结合附图使用，其中：

图1图形显示来自2个供体的粪便样本的微生物组谱差异(PCR-DGGE分析)；

图2显示琼脂糖凝胶，显示T＝0和之后14天时在室温下的粪便样本中的高分子量DNA在下列中的性质：1)包含不同浓度的CDTA(150-500mM)的组合物，2)包含不同浓度的EDTA(150-500mM)的组合物，和3)无稳定化溶液储存的粪便(未稳定化)；

图3图形显示微生物组谱稳定性对样本均化和本发明组合物的pH的依赖性；

图4显示在不同组合物中在室温下储存14天的粪便样本的DGGE分析；

图5显示在不同组合物中在室温下储存4天的粪便样本的DGGE分析；

图6显示琼脂糖凝胶，显示在组合物中在室温下在不同pH值下储存9天的粪便样本中的高分子量DNA的性质；

图7显示琼脂糖凝胶，显示在本发明组合物中用(A)多个玻璃珠和(B)不锈钢球混合粪便样本的结果；

图8显示琼脂糖凝胶，显示在本发明组合物中在室温下储存后的DNA性质：(A)第0天，(B)第6天，(C)第7天，(D)第14天，(E)1个月，和(F)2个月；

图9显示储存在本发明组合物中的相同供体的样品的三份粪便样本等份的DGGE凝胶；

图10显示储存在本发明组合物中的粪便样本的微生物组谱的代表性DGGE凝胶和相似度％(凝胶底部)：(A)在室温下14天，和(B)在室温下7天和2个月；

图11A和11B显示在37℃下储存在本发明组合物中的来自2个供体的粪便样本的琼脂糖凝胶；

图12A和12B显示在37℃下储存在本发明组合物中的来自2个供体的粪便样本的DGGE分析；

图13A-E显示在-20℃、室温和50℃下储存在本发明组合物中的来自3个供体的粪便样本的琼脂糖凝胶；

图14A-D显示在50℃和-20℃下储存在本发明组合物中的来自3个供体的粪便样本的琼脂糖凝胶电泳；

图15A-B显示在50℃下储存在本发明组合物中14天的来自2个供体的粪便样本的DGGE分析；

图16A-B显示在-20℃下储存在本发明组合物中11天的来自2个供体的粪便样本的DGGE分析；

图17显示在本发明组合物中并且暴露于5个冷冻/解冻循环的粪便样本的琼脂糖凝胶；

图18显示在本发明组合物中并且暴露于5个冷冻/解冻循环的粪便样本的DGGE分析；

图19显示主坐标分析(PCoA)，显示经过不同温度和时间(3和14天)储存在稳定化溶液中的样本在OTU丰度方面呈现高水平的相似度；和

图20显示有和无稳定化溶液经过不同温度和时间(3和14天)储存的样本的科水平丰度比例。

图21显示新制样本和104B pH 11稳定化样本之内和之间的Bray-Curtis相异度距离。Mann-Whitney检验显示在所有条件下相当的相异度，未观察到统计学差异。

图22示例104B pH 11稳定化样本保全丰富度。丰富度通过分配存在/不存在个体OTU来评估和利用Shannon-指数来比较。Mann-Whitney检验显示新制样本和104B pH 11样本之间无显著差异。

图23示例104B pH 11样本赋予高度可再现的微生物组谱。对Bray-Curtis距离进行的Mann-Whitney检验显示在三份样本中相当的相异度。

图24显示与新制样本相比时，未稳定化粪便样本和104B pH 11(在23℃下14天)和冷冻(在-80℃下14天)粪便样本之间的Bray-Curtis相异度距离。显著相异度利用Mann-Whitney来评估(*P≤0.05)。

图25显示代表性供体微生物组加权Unifrac相似度％的树状图。针对每个条件进行从三个生物复制品的提取。与新制样本的低相似度％表明微生物组谱随时间而变。

图26示例经历模拟运输条件的104B pH 11样本的DNA完整性。代表性供体样本在23℃下储存14天，在50℃下1天，在37℃下3天或暴露于多个冷冻-解冻循环。新制样本也在-80℃下储存14天作为对照。

图27示例暴露于模拟货运条件的104B pH 11样本的Bray-Curtis相异度距离。Mann-Whitney检验显示储存在不同温度下的104B pH 11样本和储存在-80℃下那些样本之间无差异。与配对-80℃样本相比时，在维持在37℃下或经历冷冻-解冻(F/T)条件的未稳定化样本中观察到显著相异度(分别P≤0.05和P≤0.01)。

图28显示用包含不同CDTA浓度的本发明组合物和用不包含CDTA的组合物在40℃下处理5天的来自2个供体的粪便样本的细菌群体谱的DGGE分析。

图29显示用本发明组合物“104B pH 11”或TEN缓冲剂在环境温度下处理21天的来自2个供体的粪便样本的细菌群体谱的DGGE分析。

具体实施方式

应注意，本文描述的用于稳定化核酸的组合物的作用是在环境温度下在诸如粪便样本的生物学样本中长期稳定化核酸和‘快照’总DNA谱。在利用本文描述的组合物稳定化粪便样本包含的核酸后，在后续步骤中利用市售提取试剂盒进行诸如DNA的核酸的提取和分离。优选地，本文描述的用于稳定化核酸的组合物不包含离液盐(例如，胍盐，如硫氰酸胍(GuSCN)或盐酸胍(GuHCl))、尿素、固定剂(例如，福尔马林、多聚甲醛等)、还原剂、聚阳离子(如聚赖氨酸或聚丙烯酰胺)、苯酚或氯仿。不需要酶如蛋白酶(例如，蛋白酶K)、溶酶体等来实施利用本文描述的组合物进行的粪便样本包含的核酸的稳定化，因此优选不被包括在本文描述的组合物中。因此，本发明的稳定化核酸的组合物和方法避免了高成本和/或有毒化合物的使用，高成本和/或有毒化合物通常需要特殊的储存和运输条件。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域技术人员的普遍理解具有相同含义。

说明书和权利要求书中采用的单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文明确另外说明。

本文使用的术语“包括”将被理解意为后续列举是非排他性的，并且可包括或可不包括任何其它另外的适当的项，例如，如适当，一种或多种其它特征、组分和/或成分。

本文使用的术语“样本”将被理解意为任何这样的样品：可能包含目标物质，具体地核酸，和任选地蛋白质或其它目标生物分子。术语“样本”可包括溶液，如水溶液、细胞、组织、活检、粉末、或其中一种或多种的组合。样本可以是生物学样本，如唾液、痰、口腔拭子样品、血清、血浆、血液、血沉棕黄层、咽部、鼻部/鼻咽部或鼻窦拭子或分泌物、喉部拭子或刮出物、尿液、粘液、粪便/大便/排泄物、直肠拭子、损伤拭子、食糜、呕吐物、胃液、胰液、胃肠(GI)道液或固体、精液/精子、尿道拭子和分泌物、脑脊液、哺乳期或经期产物、卵黄、羊水、房水、玻璃体液、宫颈分泌物或拭子、阴道液/分泌物/拭子或刮出物、骨髓样本和抽取物(aspirates)、胸膜液和渗出液、汗液、脓、眼泪、淋巴液、支气管或肺灌洗液或抽取物、腹膜渗出液、细胞培养物和细胞悬浮液、结缔组织、上皮、上皮拭子和涂片、粘膜、肌肉组织、胎盘组织、活检、渗出物、器官组织、神经组织、毛发、皮肤、或指甲，其中前述的样本可得自例如脊椎动物，包括哺乳动物。哺乳动物可以是例如人、非人灵长类、家畜(如牛、山羊、或绵羊)、以及狗、猫、马等。

在一个实施方式中，生物学样本是粪便样本，并且对象是是哺乳动物。在另一实施方式中，生物学样本是粪便样本，并且对象是人。

其它类型的生物学样本包括植物、植物提取物、藻类、土壤样本、污水、废水、水、环境样本、食品、家畜饲料、鱼饲料、动物饲料、被污染或可能传染性的表面或设备(例如，肉类加工表面)的拭子、医院、疗养院、门诊设施、医疗机构的‘触摸’表面的拭子、或类似物。在再其它实施方式中，生物学样本选自土壤样本、污水样本、废水样本、或水样本，其中任一种可被粪便污染。

本文使用的术语“微生物”(microorganism或microbe)将被理解意为任何微观的生物体和孢子，包括所有原核生物，即真细菌和古细菌，和各种形式的真核生物，包括原生动物门、真菌(例如，酵母)、藻类和动物如轮虫和涡虫。例如，利用16S rRNA基因测序在人粪便中最常检测到的细菌群包括硬壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门(Spirochaetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、δ变形菌门(Deltaproteobacteria)、ε变形菌门(Epsilonproteobacteria)、α变形菌门(Alphaproteobacteria)、β变形菌门(Betaproteobacteria)、γ变形菌门(Gammaproteobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)、真核生物(Eukarya)、脱硫弧菌属(Desulfothiovibrio)、Tm7、蓝藻门(Cyanobacteria)、放线菌门、疣微菌门(Verrucomicrobia)和粘胶球形菌门(Lentisphaerae)。

本文使用的术语“病毒”或“病毒体”将被理解意为仅在其它生物体的活细胞内复制的任何小型感染剂。病毒可感染从动物和植物至细菌和古细菌的所有类型的生命形式，并且几乎在每一种生态系统中生存。当前已知21族病毒在人体内引起疾病：腺病毒科、疱疹病毒科(Herpesviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、小RNA病毒科(Picomaviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(和丁型肝炎，当前未分配)。病毒的遗传物质可以是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

通过本文描述的组合物稳定化的核酸可以是DNA或RNA，包括mRNA或病毒RNA。在一个实施方式中，核酸是DNA。在另一实施方式中，DNA是人源、病毒源和微生物源的。在再另一实施方式中，通过本文描述的组合物稳定化的核酸包括人类DNA和微生物DNA。

本文使用的术语“环境温度”意指生物学样本(例如，粪便样本)和本文描述的核酸稳定化组合物的混合物从收集时开始，在运输期间(可涉及相对极端温度——尽管通常时间较短(例如，<5天))，以及在分析前长期储存期间可遭遇的温度范围。在一个实施方式中，温度是约-20℃至约60℃范围内的环境温度。在另一实施方式中，环境温度是室温并且在约15℃至约30℃范围内。

为稳定化粪便样本中包含的核酸，使粪便样本与本文描述的水性组合物接触形成混合物的步骤应在粪便排泄后尽快进行，并且混合物均化以形成均匀混合物应尽快进行，优选立即进行。

总体上，诸如唾液、血液、痰、粪便/大便、和尿液的生物学样本中的DNA和RNA的化学稳定化通过使用缓冲剂维持适当的pH，以及使用螯合剂防止金属氧化还原循环或金属离子结合至核酸磷酸骨架现象来实现。本文使用的术语“螯合剂”将被理解意为这样的化学品：将与特定金属离子(例如，Ca²⁺和Mg²⁺)一起形成可溶的稳定络合物，隔离离子以使其通常无法与其它组分如脱氧核糖核酸酶(DNA酶)或核酸内切酶(例如，I、II和III型限制性核酸内切酶)和核酸外切酶(例如，3’至5’核酸外切酶)——GI道中丰富的酶——发生反应。GI道中DNA酶的主要来源是胰腺以及寄居微生物的分泌物。在本发明组合物中，螯合剂(一种或多种)参与生物学样本中的DNA酶抑制和微生物生长。螯合剂可以是例如乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羟乙基)乙二胺四乙酸(HEDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-环己二胺四乙酸(CDTA)、N,N-双(羧甲基)甘氨酸、三乙烯四胺(TETA)、四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA)、去铁胺、无水枸橼酸盐(酯)、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵(ammonium bicitrate)、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、和柠檬酸锂。这些螯合剂可单独使用或其两种或更多种组合使用。在优选实施方式中，期望单独或组合使用的、强于EDTA的螯合剂(即，在结合至金属时解离常数高于EDTA的螯合剂)，包括但不限于，CDTA、DTPA、DOTA、TETA和去铁胺或其螯合剂类似物，其数量为约150mM至约600mM，优选地数量为约150mM至约500mM，还更优选数量为约250mM至约350mM，最优选数量为约300mM。最期望本发明组合物中的螯合剂是CDTA。

EDTA是在工业、实验室、化妆品、药物和一些食品中广泛使用的化学品。其应用性是基于其能够‘螯合’金属离子——具体地二价和更高价。CDTA较不常用于这些领域，但其与EDTA都具有螯合金属离子的能力。重要的是，两种螯合剂对于不同金属离子的亲和力显著相异。K₁——以对数尺度表达的亲和力度量——显示在表1(下文)中。列举的前5种螯合剂具有不同数量和构型的附接至氮基团的羧酸酯(R-COO^-)基团。在表1中，OPT作为仅基于氮基团的螯合剂显示，以进行比较。

表1中CDTA和EDTA的比较显示其差别很大。log K₁数值差异为2.3(Mg²⁺)；2.6(Ca² ⁺)；2.4(Mn²⁺)；约3(Fe³⁺)；3.6(Co²⁺)；0.8(Cu²⁺)；2.9(Zn²⁺)。也就是说，CDTA比EDTA更紧密200至4,000倍地结合大多数金属。

表1.螯合剂对于不同金属离子的亲和力

在存在同等浓度的CDTA或EDTA的情况下，CDTA的这种较强络合金属的能力的一个结果是任何游离金属离子的浓度更低。然而，更重要地，可络合至诸如核酸或蛋白质的生物分子的金属离子数量将显著较低。已知溶液中的核酸结合金属离子，而移除这种金属有可能提高其化学稳定性。这可对于可通过从诸如双分子氧、超氧阴离子和过氧化氢的物种获得或失去电子以不同氧化状态存在的过渡金属如Mn、Fe、Co和Cu尤其重要。最后，CDTA较强的络合金属的能力在研发抑制生物学样本中的核酸降解的组合物中非常有益，该生物学样本是已知天然包含大量需要Ca²⁺和Mg²⁺来稳定化其活性构象的DNA酶的生物学样本，如粪便。

表2：CDTA和EDTA的pK值

CDTA和EDTA之间的其它差异在于实验室或研究环境中的实际后果。可能由于EDTA的k₁和k₂pK_a值较低(参见上表2)，制备pH 7.0的二钠形式(始于酸形式)明显更困难。可制备比EDTA更浓的CDTA溶液。最后，与EDTA二钠形式的有限溶解度相比，CDTA的二钠形式易溶于乙醇。这些差异致使CDTA从制造角度来说是最佳的螯合剂选择。

总体上，可利用一种或多种适当的缓冲剂将本发明组合物的pH维持在期望的碱性范围内；其中使组合物缓冲以将生物学样本的pH维持在适当的pH，并且所述组合物在环境温度下稳定化所述核酸。根据一个实施方式，组合物包括25℃下的pK_a值(对数酸解离常数)在8.0至12.5范围内的一种、两种或更多种缓冲剂(提供的非限制性实例，参见表3)以使pH维持在约9.5至约11.5的优选范围内。酸解离常数，K_a，是溶液中的酸强度的定量度量。K_a值越大，溶液中的分子解离越多，从而酸越强。由于K_a值跨越多个量级，实践中更常使用酸解离常数的对数度量，pK_a。pK_a值越大，任何给定pH下的解离程度越小，即，酸越弱。

在活生物体中，酸-碱稳态和酶动力学取决于细胞和机体中存在的多种酸和碱的pK_a值。在化学方面，制备缓冲溶液需要了解pK_a值，并且了解pK_a值是定量了解酸或碱和金属离子之间的相互作用形成络合物的前提。本领域技术人员将理解，给定化合物/缓冲剂只有在其浓度充足和溶液pH接近(在约1个pH单位内)其pK_a时才可缓冲溶液的pH。在一个实施方式中，本发明组合物的pH在约9.5至约11.5范围内。在优选实施方式中，组合物的pH在约10.5至约11.5范围内，优选pH为约11。缓冲剂(一种或多种)的数量可例如在约1mM和约1M之间。

根据某些实施方式，组合物包括β-丙氨酸作为主要缓冲剂，以维持pH在约9.5至约11.5的期望范围内。为将pH维持在约11，可从表3选择pK_a在10-12范围内的缓冲剂。值得注意，羧酸酯(盐)螯合剂，如CDTA和EDTA，也可贡献在此范围内的缓冲能力。然而，CDTA和EDTA的pK_a(k₄)值(表2)存在显著差别。EDTA的pK_a(k₄)较低(表2)使其可能有效协助使本发明组合物维持在期望pH范围的下限。然而，CDTA的pK_a(k₄)值越高，其越适于增强β-丙氨酸(或表3列出的其它缓冲剂)的缓冲能力——在期望范围的上限(即，pH 11)。

表3.本发明组合物的适当缓冲剂

β-丙氨酸是特别适于本申请组合物的缓冲剂。在一个实施方式中，组合物的pH为约10.5至约11.5，并且β-丙氨酸的存在量为约10mM至约100mM、或约30mM至约70mM，最优选存在量为约50mM。

本文使用的术语“水溶性”或“水混溶性有机溶剂”将被理解意为溶解溶质(化学上不同的液体、固体或气体)的任何含碳物质或化合物，通常是液体。水溶性有机溶剂可以是，例如，一种或多种短链(例如，C₁-C₆)烷醇(可以是直链的或支链的)，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、正丁醇、戊醇、己醇、或其任意组合。在本发明组合物的一个实施方式中，优选醇是乙醇。在另一实施方式中，水溶性有机溶剂(例如，乙醇)在组合物中存在的浓度小于约30体积％，优选小于约24体积％，如约21.5％至约23.5体积％，最优选约23.5体积％。在其它实施方式中，水混溶性有机溶剂可以不存在。

本领域公知，变性大多数蛋白质需要多于30％的乙醇。从溶液析出DNA需要超过60％的乙醇或50％的异丙醇。纯乙醇或甲醇在组织学、病理学和细胞生物学中常用作固定剂以终止生化反应。一些蛋白质可通过添加20-50％(vol./vol.)范围内的水混溶性有机溶剂如乙醇和丙酮而析出。乙醇造成蛋白质脱水或水活性降低，然后蛋白质之间静电吸引、聚集和不溶。虽然不希望被理论束缚，发明人认为本发明组合物中相对小百分比的水混溶性有机溶剂具有极少至不具有固定剂特性，相反，促进生物样本(例如，粪便)的混合和分散并提高本发明组合物可包括的其它化学化合物的溶解度。另外，关于可燃性液体的货运/运输，期望溶液中的有机溶剂如乙醇维持在24体积％以下以豁免危险物品运输(TDG)规定(美国(UN)编号1170)；否则，>24％乙醇的溶液被归类为第3类(可燃性液体)，强制特殊包装，增加运输复杂性和成本。

本文使用的术语“洗涤剂”或“表面活性剂”将被理解意为任何这样的两性有机化合物：可中断蛋白质中的非共价键，使其变性，和致使分子丧失其天然二级、三级和/或四级结构。适当的洗涤剂可例如是阴离子型洗涤剂(如，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基硫酸铵)、阳离子型洗涤剂(季铵盐，如，例如，西曲溴铵/十六烷基三甲基溴化铵/十六烷基-三甲基-溴化铵或CTAB、十六烷基三甲基氯铵(CTAC)、西吡氯铵(CPC)、苯扎氯铵(BAC))、两性离子型表面活性剂(例如，甜菜碱、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨]-1-丙磺酸酯(盐)(CHAPS)、卵磷脂)或非离子型洗涤剂(如，例如，吐温、Triton X、或Brij)。然而，CTAB在作用于DNA时不太理想。洗涤剂可抑制DNA酶的作用——通过破坏这些酶的复合结构，促进生物学样本在本发明组合物中的分散，和有助于增溶多种化学物种。在本发明组合物的某些实施方式中，洗涤剂是SDS。在其它实施方式中，洗涤剂(例如，SDS)在水性组合物中的存在量可以为约0-4％(w/v)，优选约0-1％(w/v)，最优选约0.5％(w/v)。

本文使用的术语“消泡剂”将被理解意为减少或阻碍泡沫形成的化学添加剂。发明人观察到在包含本发明组合物某些实施方式(包括洗涤剂)的管中快速和充分分散一些生物学样本(具体地，粪便)所需的剧烈振荡期间泡沫形成。在使用和不使用均化装置的情况下，所述泡沫阻碍，并且在一些样本中阻止，完全混合。消泡剂，如Antifoam A浓缩物(Sigma-Aldrich；目录号A-5633)，作为一种活性硅酮聚合物，显著减少所述生物学样本和本发明组合物混合期间的泡沫形成。因此，为最小化泡沫形成，消泡剂应优选被包括在包含洗涤剂的组合物中。可单独使用或两种或更多种组合使用的适当消泡剂的其它实例包括不可溶性油、聚二甲基硅氧烷类和其它硅酮类、某些醇、硬脂酸酯和二醇。在其它实施方式中，消泡剂(例如，Antifoam A)在水性组合物中的存在量可以约0-1％(v/v)，优选约0-0.2％(v/v)。

本文使用的术语“抗微生物剂”将被理解意为与其不存在情况下的生物体生长速率相比降低生物体生长速率的物质或物质群。生物体生长速率的降低可以是至少5％，更期望至少10％，还更期望至少20％、50％、或75％，最期望90％或更多。该定义还扩展至影响生物体的生活力、毒力或致病力的物质。抗微生物剂可以是天然(例如，源自细菌)、合成、或重组的。抗微生物剂可以是抑菌性，杀菌性、或两者兼之的。抗微生物剂是抑菌性的——如果其抑制细胞分裂，而不影响被抑制细胞的生活力。抗微生物剂是杀菌性的——如果其导致细胞死亡。细胞死亡通常通过在液体生长介质(例如，不存在混浊)中或在固体表面上(例如，琼脂上不存在菌落形成)不存在细胞生长来检测。本领域技术人员已知在给定浓度下具有抑菌性的物质或物质群可在更高浓度下具有杀菌性。本领域已知的常见抗微生物剂包括某些醇、三氯生或Irgasan、和Proclin 950。任选地，本发明组合物可包括抗微生物剂，如三氯生。在其它实施方式中，抗微生物剂(例如，三氯生)在水性组合物中的存在量可以为约0-2％(w/v)，优选约0-0.5％(w/v)。

本文描述的组合物，在与生物学样本(具体地，粪便样本)混合时，使其中包含的核酸在环境温度下稳定，使得核酸在长期储存均匀混合物后被稳定。

在一个实施方式中，生物学样本是得自人对象的粪便样本，并且核酸是DNA。

本领域技术人员将理解，样本中存在高分子量DNA可给出样本中的DNA在储存条件下稳定的总体指示。这可通过琼脂糖凝胶电泳评估，琼脂糖凝胶电泳可提供高分子量DNA的品质的指示(例如，干净带vs拖尾)以及高分子量DNA数量的定量度量(通过密度计量学分析)。

除稳定化高分子量DNA外，本文描述的组合物还在与生物学样本(具体地，粪便样本)混合时使其中包含的核酸在环境温度下稳定，使得微生物和/或人核酸的相对丰度在长期储存均匀混合物后维持。本领域技术人员已知的多种技术可用于确定微生物和/或人核酸的相对丰度是否得到维持，例如利用核酸扩增或杂交的技术。可用于评估微生物和/或人核酸的相对丰度是否在均匀混合物长期储存后被维持的另一技术是PCR-DGGE分析，下文进一步详细描述。还可采用目标16S谱(确定运算分类单位(operational taxonomic units)的相对丰度(OTU’s))以及基因组DNA的全宏基因组鸟枪法测序(WMS；确定微生物基因/核酸的相对丰度)。

在一个示例性实施方式中，人类DNA的稳定化具体地可通过如下评估：确定根据本文描述的方法并且与组合物一起培育了时间(t_储存)的得自生物学样本(如粪便样本)的DNA是否保留支持目标人基因PCR扩增成可测产物的能力，更具体地PCR产物的扩增水平是否与在时间零时从相同均匀混合物或其它对照混合物提取和纯化的DNA相似。如下文实施例中进一步描述，在T＝0和T＝t_储存时从根据本文描述的方法并且与组合物一起培育的粪便样本纯化的人类DNA可利用靶向人基因的引物在实时定量PCR(qPCR)中被扩增，并且来自T＝0和T＝t_储存纯化DNA等份的Ct值变化(ΔCt)可提供人类DNA稳定性的定量度量。ΔCt值小于约2指示人类DNA在整个储存时期被赋予稳定性。ΔCt值小于约1指示优越的稳定化。

在一个实施方式中，根据本文描述的方法并且与组合物一起培育的粪便样本中包含的人类DNA被赋予在室温下稳定至少7天、至少14天、至少21天、至少30天、或至少60天。在另一实施方式中，根据本文描述的方法并且与组合物一起培育的粪便样本中包含的人类DNA被赋予在升高的温度下(如37℃或50℃)稳定至少7天、或至少14天。在再另一实施方式中，根据本文描述的方法并且与组合物一起培育的粪便样本中包含的人类DNA被赋予在-20℃下稳定至少一个月(即，30天)。

在另一实施方式中，核酸是微生物DNA，并且方法稳定化生物学样本(例如，粪便样本)的微生物组谱。如本文所用，术语"微生物组谱"总体上意指限定环境内的所有微生物群体和生物分子和其相对数量。

如下文进一步详细描述，微生物组谱的稳定性可例如通过如下确定：利用靶向细菌16S rRNA基因的引物对和变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，对从生物学样本和本文所述组合物的均匀混合物(在该均匀混合物在环境温度下储存具体时间(t_储存)后)提取和纯化的DNA实施PCR。本领域技术人员将理解，可靶向具有可变区和不可变区的其它细菌基因，条件是目标物种之间存在差异。然后将所得PCR-DGGE谱与通过在时间零时以相同方式对从生物学样本和组合物的相同均匀混合物或其它对照混合物提取和纯化的DNA实施PCR-DGGE分析而得到的谱进行比较。在一个实施方式中，如果在环境温度下(t_储存)后的PCR-DGGE谱呈现与T＝0时的PCR-DGGE谱至少75％的相似度(最优选与T＝0时的PCR-DGGE谱至少82％的相似度)，可认为生物学样本如粪便样本的微生物组谱已在环境温度下被稳定化一定时间(t_储存)。

在另一实施方式中，微生物组谱的稳定性可例如通过如下确定：由从生物学样本和本文所述组合物的均匀混合物(该均匀混合物在环境温度下储存具体时间后)提取和纯化的DNA扩增和测序细菌16S rRNA基因(如V4高变区)的可变区。然后将所得测序信息与通过对在时间零时从相同均匀混合物提取和纯化的DNA或其它对照以相同方式实施扩增和测序细菌16S rRNA基因的可变区而得到的信息进行比较。本领域技术人员已知的对获得的测序数据进行生物信息学分析的不同形式可用于评估微生物组在储存条件下的稳定性，如实施例中进一步详细描述。

在一个实施方式中，根据本文描述的方法并且与组合物一起培育的粪便样本的微生物组谱被赋予在室温下稳定至少7天、至少14天、至少21天、至少30天、或至少60天。在另一实施方式中，根据本文描述的方法并且与组合物一起培育的粪便样本的微生物组谱被赋予在升高的温度下(如37℃或50℃)稳定至少7天、或至少14天。在再另一实施方式中，根据本文描述的方法并且与组合物一起培育的粪便样本的微生物组谱被赋予在-20℃下稳定至少一个月(即，30天)。

发明人惊讶地发现，缓冲至碱性pH(pH≥9.5，优选pH 11)的非常高浓度的不常使用的螯合剂CDTA可用于快速且有效地捕捉和在环境温度下长期稳定生物学样本中的核酸和‘快照’总DNA谱。

具体地，发明人惊讶地发现，缓冲至较强碱性pH(约pH 10.5-11.5，优选约pH 11)的组合物显示微生物组DNA的稳定性相对于缓冲至较低pH值的稳定化组合物提高。这是无法预料的，并且事实上鉴于以下是预想不到的。公知在较高pH下会促进胞嘧啶脱氨。还已知DNA在较高pH下更容易变性。DNA中的脱嘌呤位点(低频率发生)也更容易被断开。因此，令人惊讶地，基于琼脂糖凝胶电泳、细菌16S rRNA基因测序和DGGE，发明人观察到DNA/微生物组谱呈现在较高pH值下更加稳定。

不被理论束缚，认为稳定性显著提高的原因不是纯“化学”的。也就是说，较强碱性pH显示微生物组DNA稳定性提高可能是多种原因的结合，下文提出其中一些。

观察到CDTA在本文描述的组合物中对于DNA/微生物组稳定化而言作用远优于EDTA。EDTA和CDTA的4个pKa显示在上表2中。基于这些值，这意味着在碱性pH下，随着pH接近11，CDTA将具有3个负电荷，而EDTA将具有4个负电荷。再一次，不被理论束缚，认为CDTA与EDTA相比性能显著更优的原因可能是由于负电荷较少。

微生物组研究的目的是稳定化和最终从所有细胞等比例释放DNA，优选地从100％的细胞释放100％的DNA。释放的DNA的‘谱’的稳定性可在较高pH下较优，因为这可更接近实现此目的。换句话说，与pH 9.5相比，在pH 11下更高程度的细菌DNA可被稳定化和最终被释放。

在DNA被释放后，其需要受到保护以免被粪便样本中的DNA酶降解。一些DNA酶需要金属离子作为辅因子；其他则不需。再一次，不被理论束缚，较高pH可更有效抑制第二类DNA酶，是可能的。

粪便中的未知因子(例如，抑制剂)可结合至DNA，并且将其隔离或阻止PCR扩增。较高pH可减少这些可能性中的任一者或两者，是可能的。

最后，在将粪便样本收集到稳定化组合物中后必须防止细菌生长。否则，DNA/微生物组的‘谱’会改变。较高pH可比较低pH(9.5)更有效抑制一些微生物物种的生长。

对于复杂的、高变的固体和半固体样本类型如粪便，还需要提供在收集时立即混合样本与组合物的机械或物理装置。新收集生物学样本在本发明组合物中的快速均化和完全瓦解(disruption)确保样本中的总DNA谱的代表性快照在环境温度下长期稳定。如下文实施例所示，如果本发明组合物被添加到收集的固体粪便样本，但未充分混合，则DNA的品质相对于混合均匀的那些样本受损。因此，为稳定化DNA使得其代表体内(T＝0)状态，适当混合样本是至关重要的。例如，从这种样本提取然后经过琼脂糖凝胶电泳的DNA，可显示来自一些供体的样本中的高分子量DNA被降解。而且，如下文实施例所示，根据细菌16S rRNAPCR和DGGE分析所测，来自一些供体的粪便样本的不充分混合导致微生物组谱发生不利变化。

在很多实例中，生物学样本收集(具体地粪便收集)最好由供体在其自己家里的隐私场所完成。在这种设定下，供体更加轻松，并且如果被提供以说明书和包含稳定化化学剂或溶液的适当生物学样本收集装置或试剂盒，供体可立即收集和稳定化新鲜生物学样本。以这种方式收集样本有助于确保最佳品质核酸用于后续提取和分析，并且DNA谱尽可能接近地匹配体内状态。然而，为在家里或远程地区收集场地收集和稳定化生物学样本，供体必须被提供以简单、安全和直观，但高度有效的装置，从而自己手动或物理混合其收集的样本与稳定化溶液。优选地，这种混合装置成本低并且不需要电力、设备或专门培训。

生物学样本(例如，粪便)中的DNA在暴露于空气后可快速降解——如果不与稳定化溶液混合或在收集时不立即在干冰上冷冻时。与均匀液体生物学样本(如血液和尿液)的混合不是大问题；然而，在有限量溶液和时间内瓦解固体和半固体的非均匀生物学样本(如粪便)可能非常有问题。通过多种混合手段(例如，玻璃/二氧化硅颗粒(≤1mm；2.65g/cm³)、玻璃/二氧化硅小球(2-4mm；2.65g/cm³)、弹珠(marbles)(12.7mm)、氧化铝小球(7.9mm；3.95g/cm³)和氮化硅小球(7.1-7.9mm；3.21g/cm³))的大量实验，发明人发现，在包含本发明组合物的标准市售实验或运输管(例如，10mL圆底管(92x 15.3mm)，目录号60.610；Sarstedt)中收集的所有粪便样本类型(1-7，基于布里斯托大便分类法(Bristol Stoolscale))的充分瓦解和均化可通过如下实现：手动与管中的内含物——尺寸小于管内径(例如，12.9mm)的至少一个大型(5.6-11.1mm，优选7.9mm)致密(7.6-15.63g/cm³)金属小球——混合。

发明人确定的标准市售实验管的均化装置的最佳选择包括：1)管的形状(例如，管内底部或基底)匹配均化装置的形状(例如，圆底管用于作为至少一个混合球如不锈钢混合球的均化装置)以防止固体材料压实和/或陷入管或容器中难以触及的区域；2)对于均化装置(例如，碳化钨(15.63g/cm³)，不锈钢(7.6-8.0g/cm³)可能的最致密材料的选择；3)外径略小于管或容器内径的均化装置的选择(例如，当均化装置是混合球时，混合球的直径为约4-6mm，优选约4-5mm，最优选约5mm，小于混合管的内径)；和4)样本上方具有‘顶部空间’并且具有稳定化溶液以允许均化装置在手动振荡期间获得动量的管或容器的选择。应注意，混合球可具有规则或不规则形状(例如，可具有结点、尖状物等，无需是完美球形)，并且如上所述，优选密度是至少5.0g/cm³，最优选至少7.6g/cm³。

如果均化装置/球相对于管过小，则样本绕过均化装置/球，而不在稳定化溶液中分散。相比之下，如果均化装置/球(例如，>11.1mm)相对于管(12.9mm内径)过大，则样本不被分散或在均化装置/球和管壁之间‘被挤压’，均化装置/球得不到充分动量，样本在管一端或两端变得密实。理想地，当均化装置外径(例如，7.9mm碳化钨或不锈钢球)正好与管内垂直壁(例如，内径为12.9mm的10mL上述Sarstedt管)相差约5mm(球任一侧2.5mm)时，均化装置有效充当均化器，快速分解或瓦解收集到本发明组合物(例如，2mL)中的固体和半固体粪便样本(例如，400mg；类型1-7)，以形成均匀液体样本，该均匀液体样本可容易移液或在实验室中操作和处理。这种均化装置确保收集的生物学样本(甚至固体粪便)快速和充分瓦解，并且在这样做时迅速暴露于本发明组合物。重要地，发明人确定，与管/容器相比，均化装置的密度——不止其直径——对于仅通过手动振荡管以适时方式(20-30秒)实现样本充分瓦解而言至关重要。由于粪便(例如，类型4)通常具有粘性、韧性，在利用球形均化装置时，此样本的充分均化在平底或锥底管中难以实现。因此，圆底管用于球形均化装置表现最佳。

本发明提供新型通用方法和组合物，用于在环境温度下稳定化总DNA(具体地复杂的非均匀的生物学样本中)以备后续用于人和动物医学诊断和临床研究(例如，疾病和感染诊断、微生物在人健康中的作用、研究微生物进化的群体基因组学、毒力、药物抗性和流行病学)、食物安全性(食物/肉类加工厂)、土壤和废水取样(环境检测)、生物安全或生物防御(生物武器)、动物饲料检测、植物和动物科学/工业，等)。研究人员和临床医生的新的并且快速扩张的关注点是肠小生物群或消化道微生物组。健康供体粪便中的微生物谱如何区别于患病个体？人消化道微生物组的操纵可有益于健康？基于研究、环境、和经济原因，对多种家畜(尤其被饲养提供肉类和乳制品的那些动物)的瘤胃中的数千种不同微生物的分析也存在浓厚兴趣。

本发明简化和加快了生物学样本收集和制备，提供高品质样本用于人、动物和微生物DNA的后续检测，而无需在运输或储存期间维持冷链。本发明可用于a)具有高通量或自动系统的中心实验室或测试机构，b)具有最低程度实验室基础设施和设备的农村或流动诊所，和c)无电力的远程位置。另外，生病和潜在传染性个体不必前去诊所或医院以提供生物学样本，最小化传染性疾病的传播，促进发病(outbreak)控制和监视，和能够实现患者治疗响应的快速评估和监测。

本文描述的封闭的收集和均化系统/试剂盒制造成本低并且不需要购买另外的实验室设备(例如，涡流器)。最重要地，手动振荡包含本发明组合物、一个或多个均化小球、和甚至硬质的粪便(1-2类，布里斯托大便分类法)样本的封盖管可实现样本在数秒内充分瓦解，产生均匀的混合物。供体自行收集减少了感染的传播和与其它供体样本潜在交叉污染。显然，这种样本收集和均化过程可由无实验室或临床经验的业外人士在其自己家里的隐私场所进行，很大程度上提高了供体参与性和依从性。对于下游测试结果质量重要的是，本发明能够实现“新制”生物学样本被安全收集和稳定化，大幅减少在原生物学样本或未处理生物学样本运送到测试机构期间和/或在可变储存条件期间观察到的降解。

至关重要地，本发明向研究人员和临床医生提供迫切需要的稳定化的代表性生物学样本，从该生物学样本中可提取无偏DNA。无偏DNA输入——即消化道微生物组在样本收集时的代表性快照——将增强下游分析的品质和准确度，实现对象间和对象内差异以及研究间差异的更准确比较性评估，以研究健康和疾病人肠微生物群体变异。完整、无偏、富集的高分子量DNA对于宏基因组文库构建和完整遗传途径表征至关重要——通过基于序列或基于功能筛选的方法。另外，生物学样本中DNA的过度降解降低鸟枪法测序的效率。

仅在最近几年，关于新制粪便中的细菌群体，对从粪便提取的DNA的种系发生组成给予了大量关注。通常的做法是——主要出于实际的原因——在收集后冷冻粪便样本，和在高度可变的时间后，提取DNA用于下游分析，如测序或定量PCR(qPCR)。然而，至关重要地，已公开的研究之间和之内呈现相当的如下变化性：1)排便和‘新制’粪便冷冻之间的时间；2)运输条件和持续时间；3)分析前冷冻粪便的时长；4)用于解冻冷冻粪便的时长和温度；和5)分离和处理第一等份的DNA前距收集的可变时间。在这些研究中，T＝0表示这些被收集、冷冻和通常储存的样本被解冻以备处理的时间，而非排便时间。

然而，在人小生物群的宏基因组研究中，研究明确显示，粪便样本的储存条件可不利地影响推断的群体组成。例如，Bahl等(2012)利用靶向大细菌群的16S rRNA基因的qPCR和6种不同引物对证明：提取前在-20℃下冷冻53±5天的粪便样本影响最主要的两门(即硬壁菌门和拟杆菌门，消化道微生物学中常用的生物标志物)之间的比例。具体地，硬壁菌门与拟杆菌门的16S rRNA基因之比在冷冻过的粪便样本中——与未冷冻过的相同样本相比——明显较高。迫切需要一定手段来捕捉或快照被收集的粪便样本中的原始或体内微生物群落的至少三个关键方面，稳定化i)每种微生物的丰度，ii)整个群体的丰富度，和iii)总微生物DNA谱。

来自复杂粪便样本的总基因组细菌DNA的有效且无偏的稳定化(和提取)是对消化道内细菌群体的分子基础研究的至关重要的第一步骤，例如，生成代表供体体内状态的微生物组谱。具体地，微生物群体的研究需要在收集后立即捕捉小生物群谱的“快照”。很明显现场收集粪便样本是不实际，成本高和不可规模扩大的(not scalable)(McInnes&Cutting，2010)。本领域还公知，与样本收集相关的问题导致结果不符和再现性低。此外，固体样本的处理提出自动化挑战，增加成本和限制纵向研究的尺寸。

为消除所有实验室研究之间和之内的强偏差，需要开发和实施标准化的或通用的方法，用于在运输和长期储存期间经历不利的通常极端的温度之前、在收集时收集和稳定化生物学样本。本发明的在样本收集时使液体至硬质固体范围的生物学样本(具体地，类型多样、复杂、非均匀的样本)在有效DNA稳定化组合物中均化的方法确保整个样本中DNA最大限度的完整性，尽可能接近地代表体内状态。

当前，很多研究招募供体以收集粪便样本，并且在运输期间不提供稳定化手段或需要使用冰袋。人类微生物组项目(Human Microbiome Project，HMP)——国家卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)路线图(Roadmap)发起的项目——发起了表征人类微生物组和分析其在人健康和疾病中的作用的研究。所有参与HMP核心微生物组取样研究的成员必须遵守概述自GI道样品收集(参见第7.3.3章)等的程序手册(McInnes&Cutting，2010)。对象被提供以粪便收集试剂盒并被要求在将样品返回诊所前的24小时时间内收集粪便样品。HMP试剂盒包括类似于大黄油盒的两个粪便收集容器(一个备份)、热安全货运容器(硬纸板箱中的大苯乙烯泡沫塑料箱)、用于运输样品(在约4℃下)的8-10个冷藏包(polar pack)、说明书、标签、和其它包装材料。在收集样品前，对象必须将凝胶包装置于其冷冻装置中至少12小时。将粪便直接置于收集容器中，加盖，并将整个容器密封在Ziplock袋中，然后封装在被8-10个冷冻凝胶包装完全包围的苯乙烯泡沫塑料箱中。将苯乙烯泡沫塑料箱封闭，密封在硬纸板箱中，对象将该庞大包装物运输至临床实验室。

现有的对新制样品封装在冰或干冰上、密封在庞大苯乙烯泡沫塑料和硬纸板容器/冷却器中进行货运的冷链要求是非常高成本的，甚至抑制研究人员进行需要中等到大量供体的研究。简单地，使用美国境内的UPS次日送达服务，市售粪便收集容器在硬纸板货运箱或外包装(16x13x14英寸)内、苯乙烯泡沫塑料容器中、由冷冻冰袋包围的货运的成本为每个约$175。该估价未考虑粪便收集容器和任何货运材料的成本。而且，很多测试机构要求生物学样本在干冰上进行货运，这使该货运估价又增加可观的考虑成本。一旦实验室收到这些大型货运容器，工作人员必须立即拆封并迅速处理生物学样本或将收集容器置于大型储存冷冻装置，直到可进行批量处理。相比之下，本发明降低了大部分的当前货运成本和不便，并且最重要地，确保收集的生物学样本中的DNA在环境温度下收集时被稳定化。从供体角度而言，在其家里的隐私场所收集生物学样本，将小部分样品转移至已包含稳定化溶液的常见管或容器，将管加盖，并手动振荡混合，将管密封在生物危害袋中，并在气泡封袋或小盒子里以目前成本的一小部分邮寄至测试机构。

实施例

材料和方法

以下通常的材料和方法用于下文实施例，除非其中指定不同条件。

粪便样本收集

给予每一位健康供体下列收集用品：a)粪便收集容器(坐在马桶上)；b)约400mg容量粪便收集注射器(即，尖端截断、活塞调节至400mg收集体积的3mL注射器)；c)包含本发明组合物(2mL)和各种均化装置(例如，7.9mm不锈钢球轴承，420/440SS Grade25，AimarkTravers LTD、或下文注明的其它装置)的圆底Sarstedt管(10mL圆底管(92x 15.3mm)，目录号60.610；Sarstedt)；和d)粪便收集说明书。在收集之前和之后将管称重，确定粪便样本实际收集量。要求每一位供体将注射器尖端用粪便填充至标示体积(400mg)并将粪便样本转移至管。为样本充分均化，将管手动振荡20-30秒。

由本发明组合物中粪便样本进行DNA提取

除非另外说明，将400mg粪便转移至包含2mL本发明组合物(下文在实施例中指明)和7.9mm不锈钢球轴承的Sarstedt管(10mL圆底管(92x 15.3mm)，目录号60.610；Sarstedt)。利用若干市售DNA分离试剂盒容易从250μL等份的收集和储存在本发明组合物中的粪便样本提取DNA。发现本发明组合物中的粪便样本可与DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories，Inc.，目录号12888-100)、PowerFecal^TM DNA分离试剂盒(MO BIOLaboratories，Inc.，目录号12830-50)、结合珠跳动(bead-beating)的Zymo ResearchFecal DNA MiniPrep(Zymo Research，目录号D6010)、QIAamp DNA粪便微型试剂盒(Qiagen，目录号51504)和PSP Spin Feces DNA Plus试剂盒(Invitek，目录号1038110200)兼容。

按照DNA分离试剂盒说明书，执行下列程序[注意：删除65℃加热步骤]：

1.向提供的PowerBead管，加入750μL小珠溶液和本发明组合物中的250μL粪便样本。将管温和地涡流混合。

2.加入60μL溶液C1，并将管倒置几次或短暂涡流。

3.将PowerBead管固定在涡流器适配器上，并以最大速度涡流10分钟。

4.将PowerBead管在10,000x g下离心30秒。

5.将上清液转移至干净的2mL收集管(已提供)。

6.加入250μL溶液C2，并将管涡流5秒，然后在4℃下培育5分钟。

7.将收集管在13,000x g下在室温离心1分钟。

8.避免成粒，将上至但不多于600μL的上清液转移至干净的2mL管。

9.加入200μL溶液C3，并将管短暂涡流，然后在4℃下培育5分钟。

10.将管在13,000x g下在室温离心1分钟。

11.避免成粒，将上至但不多于750μL的上清液转移到干净的2mL管中。

12.在使用前混合溶液C4。将1200μL的溶液C4加入上清液，并将管涡流5秒。

13.将675μL上清液加载到旋转过滤器上并在13,000x g下离心1分钟。丢弃通过流，并再将675μL上清液加入旋转过滤器并在13,000x g下离心1分钟。将其余上清液加载到旋转过滤器上并在13,000x g下离心1分钟。

14.将500μL溶液C5添加到旋转过滤器上并在13,000x g下在室温离心30秒。丢弃通过流。

15.在13,000x g下在室温再次离心1分钟。

16.将旋转过滤器小心地置于干净的2mL收集管(已提供)中。

17.将100μL溶液C6添加到白色过滤膜的中央。

18.将管在13,000x g下在室温离心30秒。

19.冷冻储存DNA(-20至-80℃)。

纯化样本中DNA浓度的确定

A.DNA浓度的吸光度测定

260nm下的吸光度测量(A_260nm)常被用于定量DNA。在260nm下1.0的吸光度对应于50ng/μL浓度的纯双链DNA。利用NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Fisher ScientificInc.)确定在各种条件下经过或不经本发明组合物处理的纯化粪便样本的DNA收率。将2μL体积的各DNA样本置于底座上并经220nm至350nm扫描，并测量在230nm、260nm和280nm下的吸光度。通过NanoDrop 2000c软件报告样本DNA浓度(ng/μL)、A₂₆₀/A₂₈₀比和A₂₆₀/A₂₃₀比。通过样本浓度乘以各自的DNA洗脱体积，计算每份样本的总DNA收率。

B.DNA浓度的荧光法测定

采用A_260nm的缺点包括(i)分析的不灵敏性和(ii)非DNA组分如RNA的干扰，特别是在非高度纯化的样本中。

利用荧光染料(200x；Invitrogen，目录号P7581)定量纯化样本的DNA收率；利用Lambda DNA(Invitrogen，目录号25250-010)生成标准曲线[一式三份；0-50ng/μL]。是荧光双链DNA结合染料(485nm激发/535nm放射)，其能够灵敏地定量亚纳克数量的双链DNA(dsDNA)。在黑色平底96孔微平板(Greiner Bio-One，目录号655209)中处理三等份各纯化样本和Lambda DNA标准品，并利用Infinite M200微平板读取器(TECAN)测量荧光。

储存在稳定化组合物中的样本中的DNA的完整性

基于通过PicoGreen(上述)确定的浓度，将等份的各纯化样本稀释至10ng/μL。为评估DNA完整性，将约80ng各稀释的纯化粪便样本在100伏特下通过电泳在1％琼脂糖凝胶上分离30分钟。将凝胶在室温下在蒸馏水中的1μg/mL溴化乙锭(EtBr)中染色15分钟，冲洗并在UV透射器上利用DigiDoc-IT^TM成像系统(UVP LLC)照相。当凝胶上的染色带清晰并且与DNA梯相比>23Kb时，确定DNA被稳定化并且完整。1Kb⁺DNA梯(Life Technologies，目录号10787-018)或Lambda DNA/Hind III片段(Life Technologies，目录号15612-013)用作尺寸参考。

a.制备1％琼脂糖凝胶(80mL 1xTAC+0.8g琼脂糖)。

b.向8μL的10ng/μL纯化样本添加2μL的5x加载缓冲剂。

c.向制备的1％琼脂糖凝胶的孔中加载10μL制备样本(步骤b)；5μL Lambda DNA/Hind III片段和/或5μL 1Kb DNA梯。

d.使凝胶在100V下运行30分钟。

e.将凝胶在EtBr(500μL 1mg/mL EtBr+500mL水)中染色15分钟。

f.使凝胶在水中脱色5分钟。

g.在UV下拍摄图像。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)

为准确并且可再现地评价各种微生物组(粪便、唾液、痰、皮肤等)在本发明组合物中的稳定性，采用被称为变性梯度凝胶电泳(DGGE)的新方法。这种方法基于如下思路：如果获取了细菌16S rRNA基因的可变区(在本例中为V3区)并利用PCR和侧翼保守区引物将其扩增，则扩增子将具有细菌物种独特的熔点(甚至核苷酸差异将影响熔融，因此提供不同谱)。

当这种方法应用于包含多个细菌物种的样本时，利用保守引物的扩增将产生扩增子阵列，其中全部扩增子都具有大致相同的长度，但在非保守区中具有不同的核苷酸组成。接下来，使这些扩增子在包含梯度变性溶液(尿素和甲酰胺)的凝胶上运行。扩增子将在凝胶上的不同阶段变性——取决于其核苷酸组成，因此提供样本中存在的所有物种的解析(resolution)。

为不使DNA扩增子变性成单链形式，将～30核苷酸CG夹加入正向引物，其阻止扩增子在可变区变性后在凝胶上迁移。总体上，凝胶上40％-60％变性梯度提供了良好的带解析度，同时捕捉大部分消化道物种。为促进扩增子变性并且使凝胶在整个运行过程中维持同等温度，使凝胶在恒定60℃下运行。

利用Syngene GeneTools软件(4.03.00版，Syngene)分析DGGE凝胶图像。利用半径为30像素的滚盘法(rolling disc method)减去图像背景。手动检测和设置泳道。将Rf起始和结束位置和角度设置成手动，以在凝胶中针对“微笑(smiling)”进行调节。自动检测每个泳道的待分析带；峰检测设置在默认情况(最小宽度7像素，最小峰高度3，和最小峰体积1％)下。设定公差为1％，利用匹配参数菜单下的"谱"类型匹配谱。谱比较产生自动生成的相似度矩阵，其中相似度值在0至100范围内。一般来说，关于相似度％，这意指两个谱之间的任何变化，通常是带强度差异。因此，相似度％提供了物种丰度差异的度量。当谱之间不存在带时，比起该带强度只是减少时，对相似度％的影响更高。

图1所示DGGE凝胶示例了两个不同供体的粪便样本的微生物组谱可呈现怎样的差异；第一粪便样本(供体A)和第二(供体B)样本之间仅存在22％相似度。

PCR-DGGE按照下文描述的程序进行。

用于DGGE的PCR扩增(利用正向引物上具有5’夹的16S引物)

a.将2μL的10ng/μL DNA加入12条-PCR管。

b.制备Master Mix(98μL/反应ion)：76.7μL水、10μL 10xPCR缓冲剂、4μL 50mMMgCl₂、2.5μL 10mM dNTPs、2μL 10pmol反向引物(PPUN518R，5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')、2μL 10pmol正向引物(PRBA338F，5'-CGCCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')、和0.8μL 5U/μLTaq。

c.将98μL主混合物加入各管。

d.在常规PCR机器上运行PCR：92℃下2分钟，1个循环；在92℃下60秒，在55℃下30秒，在72℃下60秒，28个循环；然后在72℃下6分钟，1个循环。

PCR扩增子的DGGE

a.制备40％和60％变性溶液中的8％丙烯酰胺/Bis凝胶的原液：

b.按照DCode系统(Bio-Rad)的说明书，组装玻璃板和间隔器。

c.为利用40％和60％变性溶液制备和灌注具有平行梯度的8％丙烯酰胺/Bis凝胶，采用下列程序：

·将20mL 40％和60％变性溶液量入2个单独的烧杯，该烧杯分别标记“低密度”和“高密度”；

·将200μL 10％过硫酸铵(APS)加入各溶液；

·将20μL TEMED加入各溶液；

·通过旋流充分混合溶液；

·将各溶液装入单独的20mL注射器；

·将注射器附接至凝胶加载设备，其中指定的“低密度”或“高密度”顶部装料；

·注意：带有1.0mm间隔器的16x 16cm凝胶的体积调节设置为18.5mL；

·将Y型管附接至各注射器，管另一端具有针；

·将针置于玻璃板之间；

·通过转动转轮使得梯度有时间平稳起来，缓慢并且一致地灌注凝胶；

·使凝胶聚合几小时；

·用水冲洗Y型管。

d.利用1xTAE缓冲剂，将凝胶运行系统预热至55℃。

e.将8μL Fermentas 6x加载燃料加入至42μL PCR产物。

f.使凝胶在200V下运行5分钟，然后开启再循环泵，从而使样本脱离孔并进入凝胶。

g.在再循环泵开启的情况下，使凝胶在70V下运行14小时。

h.将凝胶在1x Sybr Gold中染色30分钟(250mL 1xTAE+25μL 10,000xSybrGold)。

i.使凝胶在1xTAE中脱色5分钟。

j.在UV下拍摄图像。

利用通用引物(V3区)进行16S rRNA PCR，然后利用DCode通用突变检测系统(DCode Universal Mutation Detection System)(Bio-Rad)进行DGGE。

16S rRNA测序

实施16S rRNA测序文库制备、测序和生物信息学分析。利用(250个循环)进行V4高变区配对末端扩增子测序。利用QIIME和自定义脚本，对序列进行品质过滤。将配对末端读取结果组合，并针对Greengenes参考数据库进行检索，通过UCLUST以97％聚类。在数据标准化后，利用对OTU(运算分类单位)丰度数据的加权Unifrac(利用样本之间的分类丰度差异——利用配对标准化，通过差异之和除以全部丰度之和)和未加权Unifrac关联(incidence)数据(仅考虑分类存在/不存在)，测量样本-与-样本的差距。

来自储存在本发明组合物中的纯化粪便样本的人类DNA的扩增

在实时或定量PCR(qPCR)中，利用靶向单拷贝人胸苷酸合成酶基因(TYMS位点；NM001071.2)的引物，评价收集到本发明组合物(下文详述)并且在总DNA提取(MoBioPowerSoil或PowerFecalDNA分离试剂盒)前在室温下储存2周的粪便样本中的人类DNA的稳定性。关于各反应，在包含下列的25μL体积中扩增50ng纯化DNA：1x PCR缓冲剂(20mM Tris，50mM KCl)、2mM MgCl₂、200μM dNTPs(Invitrogen)、50μg/mL BSA(Sigma Aldrich)、1μMSYTO9染料(Invitrogen)、各0.4μM的引物hTSm143F(5’-GCCCTCTGCCAGTTCTA-3’)和hTSm143R(5’-TTCAGGCCCGTGATGT-3’；Invitrogen)、1U Taq聚合酶(Invitrogen)。TS143靶的扩增条件为：在95℃下5分钟，1个循环；在95℃下20秒，在55℃下20秒，在72℃下30秒，35个循环；然后在72℃下10分钟，1个循环。熔融曲线程序包括下列和由下列组成：1个循环，在95℃下30秒——升温速率为4.4℃/秒(无采集)，在72℃下10分钟——升温速率为2.2℃/秒(无采集)，在95℃下——升温速率为0.11℃/秒(连续采集)。将三份DNA样本在CorbettRotorgene RG-6000中运行，并利用Rotorgene 6000系列软件1.7计算各样本的C_t值。C_t值意指扩增曲线跨过检测阈值时的分数循环数。通过设置阈值线和计算各样本曲线的交叉点，建立各样本C_t值。阈值线在运行的指数阶段设置，显著高于背景水平以避免噪声并且低于后续循环中的信号平稳期发生水平。总体上，C_t值与样本中的DNA数量成反比.，ΔC_t表示在不同时间(例如，样本收集后T＝0和T＝14天)取自相同样本的两等份产生的C_t值差异。

实施例1-用于稳定化粪便样本中的DNA的组合物中不同螯合剂的比较

由于粪便中有大量核酸酶(大部分是细菌来源)，发明人在研发本发明组合物的过程中采用不同螯合剂及其浓度进行了实验。

本实施例描述的组合物包含23.5％乙醇、0.5％SDS和0.1％Antifoam A，以及不同量的EDTA或CDTA，通过50mMβ-丙氨酸缓冲至pH 11。在本实施例和后续实施例中，乙醇和Antifoam A的百分比以(％v/v)表示，并且其它组分(SDS，三氯生)的百分比以(％w/v)表示。

参考图2，由健康供体收集粪便，并将400mg样本在不同稳定化溶液中均化或在不存在稳定化缓冲剂(未稳定化)的情况下在室温下(RT，19-23℃)储存14天，然后利用市售试剂盒(PowerSoil或PowerFecalDNA分离试剂盒，MoBio)进行DNA提取。比较纯化DNA在T＝0和T＝14天时的品质或完整性，琼脂糖凝胶清楚显示未经处理的粪便中的高分子量DNA在RT储存期间显著降解(对照，琼脂糖凝胶的最后两个泳道)，在凝胶上形成拖尾。来自相同供体粪便的样本(400mg)还被均化在下列中：1)本发明组合物，包括递增量的CDTA(150、300、500mM)；和2)本发明组合物，其中用EDTA(150、300、500mM)替代CDTA。

令人惊讶地，在关于粪便样本的所有测试浓度(150、300、500mM)下，无论在新收集的样本中(T＝0)还是RT暴露14天后，对于稳定化高分子量DNA而言，CDTA的表现都显著优于EDTA(图2)。事实上，EDTA意想不到地在超过150mM的浓度下不利于稳定化(和提取)高分子量DNA，但CDTA不是。

另外，较高浓度(150、300和500mM)的EDTA和CDTA的比较(表4)证实了如下惊人的发现：对于稳定化微生物组谱而言，CDTA优于EDTA——通过细菌16S rRNA基因的PCR和扩增子的DGGE分析示例，如上文材料和方法章节所述。在RT下14和30天后，来自在具有CDTA的本发明组合物中储存的粪便样本的DNA维持与在T＝0时处理的对照样本高百分比的相似度。相比之下，来自在代用EDTA的本发明组合物中储存的相同粪便的DNA的微生物组谱显示，与对照样本(在T＝0时处理；表4)相比，相异度随着在RT下时间过去而增加，。

表4.在螯合剂浓度递增的组合物中储存的粪便的微生物组稳定性。

因此，CDTA在其稳定化完整、高品质、高分子量DNA和快照复杂非均匀粪便中的微生物组谱的能力方面令人惊讶地胜过EDTA。因此，解离常数高于EDTA的螯合剂如CDTA提供DNA在生物学样本(如粪便样本)中最佳的稳定化，并且特别优选用于本文描述的组合物。这种在样本收集时稳定化样本的能力将有助于消除当前在各实验室研究之间和之内可见的强烈偏差。

实施例2-pH和螯合剂在本发明组合物中的粪便样本稳定性中的作用

考察粪便样本混合、pH和螯合剂浓度之间的复杂关系对于微生物组谱稳定性的影响——通过细菌16S rRNA基因的PCR和扩增子的DGGE分析示例。

在四个实验的第一个实验中，健康供体收集粪便，并将400mg粪便转移到四个管中，每个管包含一个7.9mm不锈钢球和2mL组合物“104B pH 9.5”(300mM CDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％Antifoam A，pH 9.5)或“104B pH 11”(300mM CDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％Antifoam A，pH 11)。使管中的样本维持静置(不混合)或通过手动振荡均化(混合)，然后在环境温度条件下送回实验室。在样本收集3-4小时内，将250μL等份从各管取出用于DNA提取(T＝0)，然后使样本应激(stressed)——在30℃下储存24小时，然后在-20℃下储存11天(T＝11)，然后由第二等份进行DNA提取。定量纯化的DNA，然后利用DGGE分离16S rRNA基因PCR扩增子而作为细菌群体谱或指纹进行解析。分别利用SyngeneGeneTools软件计算，与针对各组合物在T＝0时的对照样本相比，样本(DGGE凝胶上的泳道)之间的相似度百分比(参见材料和方法)。

图3示例在本发明组合物的pH从9.5增加至11时‘第11天不混合’样本和‘第0天混合’样本之间的提高的相似度百分比或微生物组谱稳定性，表明pH 11与pH 9.5相比提供额外的DNA稳定性。而且，采用当前均化装置——致密的钢球——的管中的‘第11天混合’样本，在两种测试pH值下，并且尤其在pH 11下，总是导致微生物组谱稳定性相对于‘第11天不混合’样本提高。

在第二个实验中，涉及pH和CDTA浓度之间的关系。将健康供体粪便等份(400mg)转移到管中，该管包含7.9mm不锈钢金属球和2mL下列三种组合物中的一种：1)104B pH9.5(如上)；2)50mM CDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％Antifoam A，pH 11.5；和3)50mM CDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％Antifoam A，pH 9.5。通过手动混合使样本均化，并将其在环境温度条件下送回实验室，其中收集T＝0等份(250μL)并提取DNA。其余样本在室温下储存4和14天，并且在每个时间点取出等份并提取DNA。

琼脂糖凝胶电泳表明，pH 9.5下的300mM CDTA组合物(104B pH 9.5)使高分子量DNA稳定至少14天，并且显示高分子量DNA的稳定化优于pH 9.5或11.5下包含50mM CDTA组成的其它两种组合物(数据未显示)。然而，完整高分子量DNA的存在并不一定表明实现了微生物组快照。在不存在有效稳定化溶液的情况下，细菌物种可复制或死亡，而没有改变DNA总量以及其品质。因此，通过细菌16S rRNA基因的PCR和扩增子的DGGE分析考察样本的微生物组谱，如上文材料和方法章节所述。

参考图4和表5，DGGE分析揭示，pH 9.5的300mM CDTA组合物呈现微生物组谱(与t＝0对照相比，94-96％相似度)在室温下至少14天的优越稳定化。pH 9.5的300mM CDTA组合物在稳定化微生物组谱方面的有效性令人惊讶地优于pH 9.5的50mM CDTA组合物，pH 9.5的50mM CDTA组合物在室温下14天后与t＝0对照相比呈现仅15％相似度。具有50mM CDTA的pH 11.5组合物看起来在一定程度上‘挽救’在具有50mM CDTA的pH9.5组合物中所见到的每个微生物组谱的显著DNA降解。

因此，稳定化粪便样本的微生物组谱需要高浓度CDTA和显著碱性pH的组合。

表5：在室温下在各种组合物中储存14天的粪便样本的微生物组谱分析。

在第三个实验中，进一步涉及本发明组合物的pH和CDTA浓度之间的关系。将健康供体粪便等份(400mg)转移到包含7.9mm不锈钢金属球和2mL以下两种组合物其中之一的管中：1)300mM CDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％Antifoam A，pH 9.5；和2)50mM CDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％Antifoam A，pH7.4。将样本通过手动混合均化并在对T＝0等份(250μL)进行收集和DNA提取的环境条件下送回实验室。其余样本在室温下储存4天，然后取出并处理第二等份。

琼脂糖凝胶电泳揭示，在RT下经过4天后，pH 9.5的300mM CDTA组合物致使粪便中的完整高分子量DNA稳定化的程度高于pH 7.4的50mM CDTA组合物，并且DGGE分析指示，这种组合物还呈现较优的粪便微生物组谱稳定化(分别相对于T＝0的97％相似度vs相对于T＝0的10％相似度，参见图5和表6)。与pH 7.4组合物一起均化的粪便的微生物组谱稳定性(在RT下4天后相对于T＝0的10％相似度)也显著低于与pH 9.5的50mM CDTA组合物一起均化的粪便的微生物组谱稳定性(在RT下4天后相对于T＝0的91％相似度，如上所述)。

表6：在室温下在各种组合物中储存4天的粪便样本的微生物组谱分析。

在第四个实验中，涉及在本发明组合物的固定高浓度的CDTA下pH之间的关系。将健康供体粪便等份(400mg)转移到包含7.9mm不锈钢金属球和2mL以下两种组合物其中之一的管中：1)300mM CDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％Antifoam A，pH 7.4；和2)300mM CDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％Antifoam A，pH 9.5。将样本通过手动混合均化，并在T＝0、24小时和9天时对等份(250μL)进行收集和DNA提取的环境条件下送回实验室。

琼脂糖凝胶电泳证明，相比于与近中性pH条件(pH 7.4)的组合物混合的粪便样本，与pH 9.5的组合物混合的粪便样本呈现较优的高分子量DNA稳定化——即使在存在高(300mM)浓度的CDTA时(参见图6)。

结合实施例1所示结果，这些实验表明，在室温储存期间保全完整高分子量DNA和稳定微生物组谱的最佳条件存在于在组合物的pH高于或等于9.5，优选为约pH 10.5-11.5或约pH 11，和CDTA浓度高于50mM，优选为至少约150mM，最优选约300mM之时。

实施例3–与玻璃珠和不锈钢小球混合后粪便的稳定化

将健康供体粪便以400mg等份转移到四个管中，该管包含：1)2mL稳定化溶液104BpH 9.5(如上限定)和四个4mm玻璃珠加十个2mm玻璃珠；2)2mL稳定化溶液104B pH11(如上限定)和四个4mm玻璃珠加十个2mm玻璃珠；3)2mL稳定化溶液104B pH 9.5和一个6mm不锈钢球；4)2mL稳定化溶液104B pH 11和一个6mm不锈钢球。四个管全部由供体手动振荡直到混合，并在环境条件下带回实验室。在样本收集3-4小时内，对DNA进行提取、定量，并将80ng各纯化样本在琼脂糖凝胶上运行(参见材料和方法以及图7)。在取出等份前对玻璃珠样本进行涡流，和对含钢球样本进行振荡。

本实施例证明了使用不锈钢混合球对于在室温下稳定化新收集的粪便中的完整高分子量DNA(>23Kb)的益处。在比较琼脂糖凝胶上高分子量DNA的品质时，证实在包含pH9.5和11的本发明组合物和一个高密度不锈钢球实验管中混合粪便样本(图7B)优于与两种尺寸的多个小玻璃珠混合(图7A)。粪便与多个玻璃珠和本发明组合物(104B pH9.5)的手动混合比与不锈钢球混合明显耗费更多时间，并且后者证明在保全完整高分子量DNA方面的效果较优。关于还更碱性(pH 11)的组合物，令人惊讶地观察到与玻璃珠混合的样本的DNA完整性提高，表明混合/均化装置和稳定化溶液的pH都是至关重要的。

实施例4–本发明组合物的体积限度

粪便是非均匀的生物学样本，其表观或硬度可根据消化系统的状态、饮食和总体健康状况而显著相异。正常情况下，大便是半固体，有粘液覆层。布里斯托大便分类法或图表是一种医学辅助手段，其被设计以将人类粪便形式分成范围从类型1(独立的硬块，如坚果般)至类型7(完全液体，无固体块，超过90％的水)的七个种类。总体上，粪便由约70-80％水、20-30％的固体物质组成，但该百分比根据样本类型(1-7)或粪便在肠中的停留时间而相异。粪便之间在硬度和水含量方面的相异度对于粪便收集和与稳定化溶液的一致充分混合提出了显著挑战。类型1-3样本尤其难以在不过度稀释用于下游分析的样本(因此，DNA)的情况下在稳定化溶液中充分分散而产生均匀液体。而且，类型1-3样本比其它样本类型更容易缓慢吸收液体，例如，稳定化溶液，产生浓稠半固体悬浮液，该浓稠半固体悬浮液在实验室中可能难以移液。类型4-7样本的较高水含量和较软坚固性使得这些样本容易混合在稳定化溶液中和移液。在处理期间，用于从粪便样本提取DNA的方法(或商品试剂盒)可带来相异性。

考虑到粪便的非均匀性，下列比例实验中对本发明组合物稳定化完整高分子量全DNA的强壮性(robustness)进行了比较。在两个独立的实验中，三个健康供体将粪便样本(400mg)收集到包含7.9mm不锈钢球和各种体积的104B pH 11稳定化溶液(上文限定)的管中，以实现下列粪便：稳定化溶液比例——1：3、1：4、1：5、1：6、1：8和1：10。注意，在凝胶上显示了“实际比例”和目标“比例”，因为很难用粗糙的工具重复收集精确400mg的粪便。在样本收集之前和之后对管进行称重，确定单位体积组合物的粪便确切收集量。将管手动振荡，并在T＝0时(图8A)和在室温下6天(图8B)、7天(图8C)、14天(图8D)、1个月(图8E)和2个月(图8F)后取出250μL等份。在一些情况下，提取两个等份，证明复本的再现性(图8A，C-F)。提取DNA，并将80ng在1％琼脂糖凝胶上运行(图8A-F)。在星号(*)标记的泳道中，鉴于事实上一些样本的DNA浓度在纯化后小于10ng/μL，加载小于80ng的DNA。DGGE凝胶(图10A和10B)也在这些实验中进行，并且分析相似度百分比以确定这些样本中的微生物组谱的稳定性。

本实施例证明，宽范围的粪便：稳定化溶液比例导致从T＝0至在室温下储存至少2个月的样本中高分子量DNA完整的结果(图8A-F)。少到0.8mL至多达5.4mL本发明组合物成功地使400mg粪便中包含的DNA和微生物组谱在这些条件下稳定至少2个月(图8A-F和10A-B)。这种宽‘工作’范围有便于研究人员，因为供体可转移高度差异数量的粪便样本到包含固定体积的稳定化溶液的管中，而样本将在室温下稳定至少2个月。利用DGGE分析的三个样本等份(图9)证明，取自相同粪便样品的等份之间微生物组谱非常一致(≥97％)。另外，比例实验样本的DGGE凝胶分析显示，在宽范围的粪便：本发明组合物稳定化溶液(1：1.8至1：10.6)中，微生物组谱在室温下被长期高度稳定(在7天时≥88％；在14天时≥91％；在2个月时≥79％)(图10A和10B)。

因此，优选的粪便：稳定化溶液比例可在如下范围内：约1：1至1：20，优选1：1至1：10，更优选1：3至1：8，最优选粪便：稳定化溶液之比为约1：5。

本文描述的组合物允许研究人员对其如何收集大量粪便样本进行变革。其不再需要因在干冰上货运样本或在冷冻装置中储存数百至数千粪便样本数月的成本和后勤而限制研究。收集到包含本发明组合物的管中的样本可在环境温度下在气泡封袋中货运并且在实验室中在室温下储存，以备在研究人员方便时批量处理。

实施例5–本发明组合物中并且在极端温度下的样本稳定化

本文描述的各种组合物在‘环境’温度下有效并且快速地稳定化人类健康供体粪便中的高分子量DNA和微生物组谱。如上所述，‘环境’意为在生物学样本收集、运输、储存和处理期间观察到的一般的暴露温度。根据生物学样本在世界上被收集/运输/储存的地点，温度可容易在-20℃至50℃变动——有时在短时间内。本领域已知未处理生物学样本随着这些温度(特别是升高的温度)降解。需要稳健的通用的生物学样本稳定化溶液来维持收集样本中的DNA尽可能接近体内状态，即，防止存在的完整高分子量DNA降解和/或防止部分降解的核酸(如粪便样本中的人DNA)进一步降解，和稳定化粪便样本的微生物组谱。

表7.测试组合物。

利用复杂的非均匀的可变的粪便样本，在宽范围的环境温度(例如，-20℃、室温(一般19-23℃)、37℃和50℃)，对发明人研发的6种DNA稳定化组合物(表7)的性能进行了测试和比较。在第一个实验中，2个健康供体每个人将400mg粪便转移到包含2mL不同组合物(表7)和一个7.9mm不锈钢球的6个管中。将管手动振荡以均化粪便样本，立即取出一个等份(250μL)进行DNA提取(T＝0)，然后将管在37℃下储存7和21天。

图11A和11B证明，当粪便样本在37℃下储存时，所有测试组合物均使完整高分子量DNA稳定至少3周。在37℃下21天后，从在CBS、CBSA1和CBSA2组合物中储存的大便样本回收的DNA的浓度低于其它组合物中的样本，导致供体A和B的琼脂糖凝胶上的带较暗(图11A和11B)。令人惊讶地，DGGE分析(图12A和12B)显示这些样本的微生物组谱在37℃(粪便细菌生长最佳温度)下第一周也是稳定的，并且在21天时间点前开始变化。除缓冲至pH 11的300mM CDTA外，乙醇也呈现有益于稳定化或回收高分子量DNA和微生物组谱。

在第二个实验中，3个健康供体每个人将400mg粪便转移到包含2mL 104B和一个7.9mm不锈钢球的3个管中。将管手动振荡以均化粪便样本，立即取出一个等份(250μL)进行DNA提取(T＝0)，然后将管在50℃下储存3和5天，在室温下储存1个月，和在-20℃下储存1个月(图13A-E)。图13A-E证明，104B使高分子量DNA在50℃下稳定5天(图13B-C)，在室温下稳定1个月(图13D)，和在-20℃下稳定1个月(图13E)。每个供体收集的三份粪便样本都包含完整高分子量DNA，而不论测试温度或时间。

在第三个实验中，3个健康供体每个人将400mg粪便转移到3个管中；2个管每管包含2mL 104B和CBE(表7)和一个7.9mm不锈钢球；第三个管是空的(无)。手动振荡有稳定化溶液的管以均化粪便样本，从每个管立即取出一个等份(250μL或250mg)进行DNA提取(T＝0)，然后将管在50℃下储存5天和14天或在-20℃下储存11天(图14A-D)。图14A-C证明，104B和CBE都使完整高分子量DNA在50℃下维持至少2周，而对照(无)样本显示随时间降解的迹象。令人惊讶地，DGGE分析(图15A和15B)显示这些样本的微生物组谱在50℃(对于生物分子如DNA而言的极端温度)下也稳定2周。值得注意的是，在50℃下储存5天而非14天的样本的相似度百分比较高，表明长期暴露于这种极端温度可导致DNA本身一定程度的化学不稳定性。

图14D显示，104B和CBE都使-20℃冷冻(和随后解冻)样本中的高分子量DNA维持至少11天。然而，在不存在稳定化溶液的情况下，粪便显示在-20℃下DNA降解的特征迹象。在供体A(无)样本中，大部分高分子量DNA降解并且呈现在琼脂糖凝胶上拖尾。相比之下，供体B和C样本中仍可检测到少量高分子量DNA，表明供体差异性。无稳定化溶液的样本的DGGE分析确认微生物组谱在-20℃下不稳定；供体A和C相对于对照T＝0的相似度％分别为52％和69％。相比之下，根据相对于对照(无)样本的高相似度百分比(图16A和16B)显示，微生物组谱在104B和CBE中在-20℃下稳定11天。

结合这些实施例证明，104B和CBE都使在极端温度下长时间储存的粪便样本中的DNA稳定。

实施例6–关于在本发明组合物中培育的粪便样本的冷冻/解冻循环的稳定性

如上所述，本领域已知，在储存或库存目的的粪便暴露于仅一轮冷冻和解冻时微生物组谱就会发生变化。这种降解对所有在零下温度运输和/或储存的收集样本增添了不必要的偏差。在本实施例中，从3个健康供体收集粪便，并且将400mg样本转移至空管和包含2mL本发明组合物(“104B pH 9.5”；如上限定)和玻璃珠(四个4mm和十个2mm小球)的管。将包含稳定化溶液和玻璃珠的管剧烈涡流直到充分混合。在第0天取出250mg或μL等份进行DNA提取后，将样本管储存在-20℃冷冻装置中，并在十天的过程中，在冷冻装置和室温之间循环五次——每个温度24小时。将样本管在50℃解冻3小时——工业标准方法。

第0天等份的琼脂糖凝胶分析证明，每个供体的粪便在被收集到本发明组合物中时均包含高分子量DNA(图17)。令人惊讶地，冷冻/解冻(F/T)5个循环后，DNA仍然完整(图17)。DGGE分析确认本发明组合物中的样本的微生物组谱在5个F/T循环后保持稳定在94％(图18)。与之形成鲜明对比，未受保护样本显示微生物组谱显著降解。仅一个F/T个循环后，谱与-20℃暴露前第0天‘新收集’样本谱仅52％相似。因此，本发明组合物不仅经过多轮冷冻和解冻保全完整的高分子量DNA，其还稳定化微生物组谱，显著减少与这些储存条件有关的偏差。

实施例7–收集在本发明组合物中的粪便样本的均化

如上所述，发明人以可在标准市售10mL实验室管和/或运输管(92mm x 15.3mm，内径约12.9mm)中用于充分和可靠均化所有类型(1-7，布里斯托大便分类法)的粪便样本的多种不同材料进行了实验。确定混合应手动并且在相对短时间内(180秒内完成)以确保供体服从和坚持提供稳定化的生物学样本。本领域技术人员将知道如何选择适于比本实施例所用更大或更小的容器的均化装置(参见详细描述)。

将标准一次性3mL注射器改装以将小体积量的粪便收集和转移到包含本发明组合物(“104B pH 11”；上文限定)和均化装置的上述收集管中。注射器针的锥形末端或配件切除，暴露直径均匀的筒体。将活塞预先设置到有助于在其被推入包含粪便的容器中时收集一致量粪便的位置，例如400mg。在注射器筒体中钻有供空气在粪便样本收集过程中逸出的小通气孔。将加载了样本的注射器转移至管口处，并压下活塞，将400mg样本置于包含2mL稳定化溶液和均化装置(例如，均化球，下文详述)的管中。将管加盖，并手动振荡约20-40秒——坚硬类型1样本(参见下文)更久(1-3分钟)。在存在均化装置的情况下前后运动剧烈振荡样本后，粪便样本被分散在稳定化溶液中。

当所选容器是实验室或运输管/小瓶时，适当尺寸、形状和密度的均化“球”或“球形物”对于在本发明组合物中充分分散非均匀的复杂样本至关重要。在收集时彻底均化收集样本也对于最佳稳定化人和微生物DNA至关重要(如存在完整高分子量DNA以及微生物组谱稳定化所证明，如细菌16S rRNA基因的PCR和扩增子的DGGE分析示例)。如上所述，对于球形均化装置而言，运输管/小瓶的底部应当也是圆润的——反映均化装置的形状，从而防止固体物质被压实在管中的死角中。例如，通过球形均化装置使粪便样本(具体地，类型1-3)最佳均化通过圆锥底或平底管很难实现。球形均化装置无法直接接触圆锥形表面和垂直管壁与底部相交的90度角，导致粪便物压实在这些死角/死区中。

下列表8-10示例发明人测试找到标准实验室/运输管(例如，目录号60.610，Sarstedt)的最佳均化装置的不同市售材料中的一些。

表8.不同材料、直径和数量的小球的混合时间(秒)。

ND，未测定；X，>180秒

表9.不同直径的不锈钢球的混合时间(秒)。

ND，未测定；X，>180秒

表10.不同直径和数量的不锈钢球的混合时间(秒)。

ND，未测定；X，>180秒

样本类型1和2的粪便密度很高并且包含极少的水，导致其在无均化装置的情况下不可穿透而不能在合理时间内(<3分钟)在本发明组合物中手动分散。对于较软的粪便(类型3-6)而言，仍需要均化装置并且手动混合管的持续时间随样本类型升高而显著减少(表8-10)。均化装置对于用本发明组合物分散样本类型7或腹泻物不是必需的。在这种情况下，“均化器”的目的是在不使用电离或电池的情况下使非均匀的固体或半固体样本充分瓦解和分散遍布稳定化溶液。

均化装置的重要特征包括1)材料密度、2)相对于生物学样本容器内径的尺寸、和3)相对于容器的形状。玻璃(约2.0-4.5g/cm³)/聚(甲基丙烯酸甲酯)或PMMA(约1.2g/cm³)/二氧化硅(约1.6-2.0g/cm³)/氧化锆(约6.02g/cm³)/乙酸纤维素(约1.3g/cm³)/聚乙烯(约0.9-1.3g/cm³)颗粒(<1.2mm)和小球(≤4mm)的尺寸和密度不足以在内径为12.9mm的标准实验室管中充当类型1-4粪便的均化器(表8)。重要地，甚至由氧化铝(3.95g/cm³)制成的7.9mm大球或7.1-7.9mm氮化硅(3.21g/cm³)和12.7mm玻璃弹珠也不能在少于180秒内在2mL本发明组合物中分散类型1-3的粪便样本(400mg)(表8)。令人惊讶地，甚至在管振荡180秒后，本发明组合物中的固体物质仍然完整。这些实验结果引导测试更高密度的材料，即，密度>3.95g/cm³。不幸的是，密度在3.95g/cm³和7.6g/cm³之间的球是购买不到的，因此无法进行关于粪便样本的测试。

接下来，关于圆底管内2mL本发明组合物中的400mg粪便样本，测试不锈钢球(7.6-7.9g/cm³，表9和10)和碳化钨球(15.63g/cm³，表8)。令人惊讶地，通过7.1-7.9mm碳化钨和7.1-8.7mm不锈钢球，甚至坚硬的坚果状类型1粪便样本也分别在≤140和≤180秒内被均化。通过7.1-7.9mm碳化钨和7.1-8.7mm不锈钢球，类型2样本分别在≤40秒和≤80秒内被均化。碳化钨(7.1-7.9mm)和不锈钢球(7.1-8.7mm)分别使类型3样本在≤30和≤80秒内，使类型4样本在≤15和≤55秒内，使类型5样本在≤15和50秒内，和使类型6样本在≤10和≤22秒内均化。

类似地，无法找到或测试密度在7.9g/cm³至15.63g/cm³之间的小球；然而，本领域技术人员预期这种均化装置在7.1-8.7mm尺寸范围内必定在少于180秒内将粪便样本扰散。仅仅出于成本和来源容易考虑，不锈钢球比碳化钨球更优选，并且最佳直径为直径7.1-8.7mm。相同尺寸的第二球的添加总体上证实有益于减少混合时间(表8和9)。在一些实例中，多于一种尺寸的小球的组合有益于减少均化粪便样本所需的时间(表10)。

鉴于7.1-8.7mm球在12.9mm内径的管中表现最好，球任一侧约2.1-2.9mm的间隙(clearance)提供在管中短时间内均化样本的最佳配合。当不锈钢球直径≤5.6mm或≥9.5mm时，硬质类型(1-4)粪便样本的混合时间增加。因此，鉴于坚固性范围从固体至液体的粪便样本的这些结果，7.9mm不锈钢球被优选用作本文描述的实施例中的均化装置，除非另外说明。

实施例8–利用本发明组合物稳定化消化道小生物群谱

消化道小生物群的分析已得到研究人员越来越多的关注，研究微生物在人类健康中的有益和有害作用。对于消化道小生物群的任何分析，都必须准确捕捉表示体内状态的小生物群谱的“快照”(即，确保运算分类单位[OTU]的相对丰度从收集时到样本处理和分析时保持不变)；因此，收集时的样本稳定化是这种研究的重中之重。当前的大便样本收集和小生物群分析方法涉及样本在环境温度下、4℃或冷冻运输。然而，这些方法有可能使样本暴露于与微生物组稳定化不相容的温度，并且冷冻大便样品此前已显示使硬壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌属(Bacteroides)的比例发生改变(Bahl等，(2012)FEMS MicrobiolLetters 329：193-197)。

在本实施例中，利用灵敏的商业可得方法，V4高变区16S rRNA测序，来评估微生物组的稳定性。关于本研究，四个供体每个人收集一个大便样品，并将等量样本(400mg)置于三个无稳定化溶液的管中和六个有稳定化溶液(300mM CDTA、0.5％SDS、23.5％乙醇、0.1％Antifoam A、0.2％三氯生，pH 9.5)和.9mm不锈钢混合球的管中。供体将样本在去除T＝0等份(250μL或250mg)并利用PowerFecal^TM DNA分离试剂盒(MoBio Laboratories)进行DNA提取的环境温度下运送至实验室。将每种稳定化条件每个供体一个样本储存在每一种测试温度(-20℃、4℃、23℃、37℃——仅稳定化溶液中)下3和14天，然后进行DNA提取。使一个处于稳定化溶液中样本暴露于五个冷冻-解冻循环。

在指示时间点，提取来自等份的DNA，并送去进行16S rRNA测序文库制备、测序和生物信息分析。利用进行V4高变区配对末端扩增子测序(250个循环)。

图19和20展示指示完全保存在稳定化溶液中的样本具有高相似度的OTU丰度的数据。

在图19中，基于加权unifrac相异度值的主坐标分析(PCoA)在两个供体(B和D)中证实，经各种温度(-20℃、4℃、环境温度、37℃)和时间(3和14天)储存在稳定化溶液中的样本在OTU丰度方面均呈现高水平的相似度——如通过PcoA制图上的紧密聚类显示(储存在稳定化缓冲剂中的样本具有如下样本识别编号：4–9作为第一个数字，例如，D4和B4，并且分组到每个供体的“有稳定剂”圈中)。相比之下，无稳定化溶液储存的样本(样本具有如下识别编号：0–3作为第一个数字，例如，D3-1和B3-1，并且分组到每个供体的“无稳定化”圈中)证实OTU丰度的相似度减少——通过样本之间较大距离显示。重要地，当评估存在或不存在OTU时，四个供体全部都存在稳定化样本和无稳定化溶液样本之间的统计学显著差异(分别p＝0.002，0.002，0.002和0.009，Unifrac测量)。在无稳定化溶液储存在-20℃下的样本(PcoA制图上的样本B2-1、B2-2、D2-1和D2-2)中观察到最大谱变化，其与在-20℃下储存在稳定化溶液中的样本显著不同(p＝0.028，加权Unifrac测量)；从而证明在新型稳定化溶液中储存样本可防止在非稳定化冷冻样本中观察到的微生物谱变化(图19)。

在图20中，科水平(family-level)的比例丰度证实了在无本发明稳定化溶液的情况下在不同温度储存一段时间(3和14天)的样本的组成变化。具体地，在供体D的无稳定化溶液样本中观察到，与基线相比，毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)增加并且拟杆菌科(Bacteroidaceae)减少。相比之下，经不同温度和时间与稳定化溶液一起储存的样本与基线样本相比维持样本的微生物组成。

该数据表明，为将消化道小生物群的变化可靠地关联至目标表型，拥有在收集时稳定化谱的可再现方式是非常重要的，这在当前的基于温度的稳定化方法是不能有效实现的。此处证明的稳定化化学具有在各种运输温度下维持体内消化道小生物群谱的能力(即，OTU紧密聚类)，允许研究人员提高数据可靠性和研究间对比。这种稳定化化学还将增加无监督自行收集的便利性，和独一无二地能够实现目前后勤困难的大群体研究。

实施例9–人DNA在本发明组合物中的稳定化

关于粪便样本收集、DNA提取和定量、和人DNA扩增的进一步详细内容参见材料和方法章节。

向三个健康供体提供以在家收集粪便样本的说明书和材料。在排便到洗手间附属的大容器中后，将约400mg粪便立即转移到包含2mL本发明组合物(“104B pH 11”；上文限定)和一个7.9mm不锈钢球的10mL圆底管中。在管加盖后，供体将密封管振荡约20秒以在组合物中均化样本。供体大概在收集3-4小时内将均化样本在环境温度下送回实验室。在实验室中，T＝0等份(250μL)从每个管中被移除，并且剩余物在室温(RT)下储存14天，此时抽出第二个等份(250μL)。

利用DNA分离试剂盒从每个等份纯化DNA；利用荧光染料和荧光法(参见材料和方法)定量DNA收率。利用靶向单拷贝人胸苷酸合成酶基因的引物在实时或定量PCR(qPCR)中扩增从T＝0和T＝14天粪便样本纯化的人DNA。C_t变化值(ΔC_t)，即取自相同样本的T＝0和T＝14天纯化等份得到的三份C_t值的差异，显示在下表11中。对于每个供体，T＝0和T＝14天的纯化样本中检测到的人DNA量相同。通过立即处理或RT储存2周的粪便样本的DNA的小于一个循环差异，本实施例证明三个供体的人DNA在本发明组合物中全部稳定。

表11.在室温下储存14天或在T＝0时处理的粪便样本中的人DNA的Ct值变化。

	ΔCt(C₁₄-C₀)
		供体A	0.94
供体B	0.11
		供体C	0.77

实施例10–本发明组合物使微生物组谱在室温下和在模拟运输件下稳定14天

本发明组合物能够容易自行收集粪便和稳定化粪便的微生物DNA用于消化道微生物组表征。其独一无二地能够在收集时获得微生物谱的快照，并且使其在室温下维持14天。

在本实施例中，向六个健康供体提供以在家收集粪便样本的说明书和材料。在排便到洗手间附属的大容器中后，将约400mg粪便立即转移至包含2mL本发明组合物(“104BpH11”；上文限定)和一个7.9mm不锈钢球的10mL圆底管。在管加盖后，供体将密封管振荡约20秒以在组合物中均化样本。6个供体每个人从同批粪便样本收集3个样本(总共n＝18)到本发明组合物中。另外，每个供体从同批粪便样本收集400mg等份的新制粪便，并按照人类微生物组项目(Human Microbiome Project)标准程序(Manual of Procedures-HumanMicrobiome Project，2010)将其在冰冻冷包装的苯乙烯泡沫塑料箱中的空白10mL管中运输。

在收集3小时内进行基线DNA提取。关于基线分析，将0.25mL等份从104B pH11样本取出，并利用DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories，Inc.)进行提取。每个0.25mL样本包含约50mg粪便和200μL稳定化液体，104B pH 11。从新制未稳定化样本提取等量粪便(约50mg)。将其余104B pH 11和新制未稳定化样本分成等份并在室温(23±3℃)下储存14天或暴露于模拟运输条件(50℃1天，37℃3天或3个冷冻-解冻循环，其中一个循环由在-20℃下至少3小时和在30℃下至少3小时组成)。另外，将每个供体的一个等份的新制大便储存在-80℃下作为对照。在保持在室温下、模拟运输条件或-80℃14天后，利用PowerFecalDNA分离试剂盒从全部样本进行第二等份的提取。

利用Quant-iT^TM 试剂(Life Technologies)确定DNA浓度和收率。通过在0.8％琼脂糖凝胶上运行约50ng纯化DNA和用溴化乙锭染色，评价DNA随着时间的完整性和稳定性。利用Lambda Hind III梯确定纯化DNA的大小。

通过Metanome，Microbiome Discovery Service进行16S rRNA测序文库制备、测序和生物信息学。利用进行V4高变区配对末端扩增子测序。利用QIIME和自定义脚本，对序列进行品质过滤。将配对末端读取结果组合并与Greengenes数据库进行比较，通过UCLUST以96％聚类。在数据标准化后，利用对操作分类单位(OTU)丰度数据(利用样本之间的分类丰度差异，利用配对标准化——通过差异总和除以全部丰度总和)进行加权UniFrac，测量样本与样本的距离。利用配对标准化——通过差异总和除以全部检测的OTU丰度总和，测量Bray-Curtis距离。在所有Bray-Curtis测量中，在收集后立即提取的供体匹配的新制样本用作配对比较的一方。通过如下进行每种稳定化方法的Shannon指数(SI)分析：测量每种OTU相对于OTU总数的比例，然后乘以该比例的自然对数。所有OTU的所得乘积总和产生每个样本的SI。利用Mann-Whitney检验比较样本收集方法。

结果

本发明组合物维持收集时微生物组谱的中立性(不变性，neutrality)。

微生物组研究要求生成的谱代表体内供体中存在的微生物群体；因此，收集和稳定化方法应不对微生物组引入变化。化学稳定化缓冲剂的使用可通过促进一些微生物生长同时使得其它微生物衰退潜在地改变样本的微生物组成。在理想条件下，稳定化液体应是中立的(即，其应不对微生物组引入任何偏差)。新制的与104B pH 11-稳定化的t＝0样本的16S rRNA微生物组谱比较显示，本发明组合物维持中立谱并且不引入偏差(图21)。

通过不同统计学方法(例如，加权UniFrac)的相对OTU丰度研究提供了对微生物群体有价值的描述；然而，其可能因通过最小化低丰度微生物的贡献而阻碍了对微生物群体的理解。微生物组谱的恰当研究需要保全微生物群体的“丰富度”。丰富度被定义为样本中存在的微生物物种(OTU)计数，并且高度受环境条件(包括温度、pH、氧浓度和化学组成变化)影响。这些和其它因素可引起细菌生长或衰退，从而改变样本中检测到的OTU数。

在收集后立即对来自6个供体的新制的和104B pH 11稳定化的样本进行提取。将在104B pH 11样本中识别的微生物OTU与相应新制样本中存在的OTU进行比较。通过将OTU丰度数据转换成存在/不存在呼叫(calls)，计算多样性Shannon指数(SI)。SI值的Mann-Whitney检验显示104B pH 11样本和新制样本之间无显著差异，表明104B pH 11对样本丰富度无影响(图22)。

粪便样本收集的差异性来源

Bray-Curtis分析显示新制和104B pH 11t＝0样本复本内的系统相异度。为理解这种相异度的来源，评价在粪便样本收集和处理期间引入的差异性。通过生成从同批样本内的不同位点收集的三个新制样本和三个104B pH 11样本的微生物组谱，评估生物差异性。利用104B pH 11收集的样本研究技术差异性，因为这种收集系统提供均化的液体样本，减少处理期间的实验误差。对来自相同管的复本DNA提取物的谱(提取差异性)和来自相同DNA的复本PCR/测序的谱(测序差异性)进行比较。生成复本小组内的Bray Curtis相异度距离，并显示在图23中。

在新制样本和104B pH 11收集样本(Bray-Curtis距离分别为0.14±0.01和0.11±0.01)的生物学复本中观察到相似度差异性。分析显示，技术和生物差异性对16S rRNA微生物组谱引入一定相异度(Bray-Curtis距离生物差异度0.11；提取差异度0.09和测序差异度0.08)。总之，观察到的相异度来源可通过技术或生物差异性来解释，并且104B pH 11不引入任何偏差。

104B pH 11在室温下有效保全微生物组谱至少14天

除维持谱中立性外，微生物组研究还要求微生物群体结构经过时间后准确保全。我们评价了104B pH 11在23℃储存14天期间稳定化样本的能力。

对配对104B pH 11-稳定化样本和新制样本在时间零(T0)进行提取，并且在室温(23℃)下储存14天后再次进行提取。还将新制样本在-80℃下储存14天作为对照。利用Bray-Curtis距离评价样本相似度。Mann-Whitney分析显示，与相应新制本样相比，23℃14天的104B pH 11样本和-80℃样本之间无显著差异(图24)。相比之下，与-80℃对照或在室温下104B pH 11储存相比，未稳定化样本显示显著相异度。

为理解复本再现性，利用新制样本、104B pH 11收集样本(T0和T14天)和未稳定化样本(T14天)进行加权Unifrac的聚类分析。所得树状图(图25)显示，新制样本和104B pH11稳定化样本之间紧密聚类——甚至是14天后(96％相似度)。未稳定化样本与从新制谱高度分离聚类在一起(～63％相似度)。因此，恰当的稳定化对于经过时间的谱聚类具有巨大影响。

104B pH 11在模拟运输条件下有效保全微生物组谱

样本通常在从收集地点运输至处理实验室期间暴露于不期望的条件。为模拟标准货运条件，使未稳定化样本和104B pH 11稳定化样本暴露于50℃1天，37℃3天或多次冷冻-解冻(F/T)循环。104B pH 11保全高分子量DNA带，而未稳定化样本显示不同程度的降解，特别在暴露于50℃或冷冻-解冻循环时(图26)。

最后，16S rRNA分析确认，104B pH 11保全微生物群体结构——甚至在极端温度下。Mann-Whitney检验——比较经过普通货运温度的104B pH 11样本和保持在–80℃的配对样本的Bray-Curtis距离——显示无显著差异。相反，保持在37℃下或经过冷冻-解冻循环的未稳定化样本，与保持-80℃的样本相比，显示显著差异(图27)。

结论

稳定化，在宏基因组学背景中，是多维属性，包括：经过时间测量的a)中立性(捕捉无偏差谱的能力)，b)再现性(从中可取出高度一致等份的均匀样本材料)，和c)完整性(分子量)。基于严格控制的实验和严谨的分析，104B pH 11有效稳定化经过现实货运和处理条件的人类粪便中的消化道小生物群。这对于MWAS的成本有效规模扩大以及优化数据品质以备生物标志物发现和发展具有极大重要性。

实施例11–对升高温度下螯合剂在样本稳定化中的作用的进一步研究

样本中的微生物谱的稳定性对温度升高也敏感。在这些条件下，有害核酸酶不仅有可能被活化，而且一些物种可开始增殖。为抑制DNA酶作用以及抑制细菌生长，螯合剂(CDTA)的存在在这种情况下尤其有益。

在本实验中，健康供体收集粪便并转移400mg粪便到管中，该管包含一个7.9mm不锈钢球和2mL具有不同最终浓度的螯合剂CDTA的本发明组合物：a)300mM CDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％Antifoam A，pH 11(“104B pH11”)；b)150mM CDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％Antifoam A，pH 11、或c)50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％Antifoam A，pH 11(无螯合剂)。通过手动振荡使样本均化(混合)，然后在室温条件下送回实验室。在样本收集24小时内，从各管取出250μL等份进行DNA提取(T＝0)。然后将收集的样本在40℃下储存5天(T＝5)，然后进行第二等份的DNA提取。定量纯化的DNA，然后利用DGGE分离16S rRNA基因PCR扩增子而作为细菌群体谱或指纹进行解析。利用Syngene GeneTools软件(参见材料和方法)，分别计算样本(DGGE凝胶上的泳道)之间的相似度百分比(与各组合物T＝0的对照样本相比)。

图28证明，在升高的温度下，CDTA存在浓度为150mM或300mM时本发明组合物的‘第5天’和‘第0天’样本之间的相似度百分比或微生物组谱稳定性与无CDTA的组合物相比较优。这表明，为在升高的温度下维持微生物谱稳定性，本发明组合物中需有螯合剂。关于具有300mM和150mM CDTA的组合物，当粪便样本储存在40℃时，‘第5天’的微生物谱与‘第0天’相比分别为96％和95％相似。相比之下，当粪便样本储存在40℃时，与‘第0天’相比，无CDTA的组合物中‘第5天’的微生物谱为71％。

实施例12–本发明组合物中的样本稳定化优于现有技术组合物

患者样本中的核酸在其从患者排出后容易降解。这种降解可降低核酸完整性分析(基于完整核酸的存在将样本评为病性(例如，癌性))的有效性。AP Shuber和DH Whitney(US 2008/0124714)描述了用于稳定化组织和机体流体样本中核酸的方法，其中稳定化溶液包括缓冲剂、盐和螯合剂(例如，“TEN缓冲剂”)。

在本实验中，健康供体收集粪便并将400mg粪便转移到包含一个7.9mm不锈钢球和2mL本发明组合物(组合物1；300mM CDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％Antifoam A，pH 11(“104B pH 11”))的管中，或ii)将约400mg粪便转移到包含2mL“TEN缓冲剂”(组合物2；10mM Tris-HCl、1mM EDTA、150mM NaCl，pH 8，US2008/0124714)的管中。将两管中的样本均通过手动振荡均化(混合)，然后在室温条件下送回实验室。在样本收集24小时内，从各管取出250μL等份进行DNA提取(T＝0)，然后在室温条件下储存21天(T＝21)，然后从第二等份进行DNA提取。将纯化的DNA定量，然后利用DGGE分离16S rRNA基因PCR扩增子而作为细菌群体谱或指纹进行解析。利用Syngene GeneTools软件(参见材料和方法)，分别计算样本(DGGE凝胶上的泳道)之间的相似度百分比(与各组合物T＝0的对照样本相比)。

图29示例，与TEN缓冲剂组合物相比，本发明组合物的‘第21天’和‘第0天’样本之间较优的相似度百分比或微生物组谱稳定性，表明本发明组合物，相对于本领域其它已知组合物，提高了DNA稳定性。当粪便样本储存在本发明“104B pH 11”组合物中时，‘第21天’的供体A和B微生物谱与‘第0天’相比分别为82％和94％相似。相比之下，当粪便样本储存在US 2008/0124714的组合物中时，‘第21天’的供体A和B微生物谱与‘第0天’相比分别为70％和50％相似。

US2008/0124714还在第[0059]段的材料和方法章节谈及由0.5M Tris、0.15MEDTA和10mM NaCl(pH 9.0)组成的“稳定化缓冲剂”。然而，注意到，在后来的实施例中具体谈及的唯一稳定化缓冲剂/溶液是上述“TEN缓冲剂”，并且关于稳定化溶液，权利要求书和说明书的教导也针对的是围绕“TEN缓冲剂”的实施方式。由此，并不清楚“稳定化缓冲剂”是否被测试或其在US2008/0124714教导的方法中是否发挥作用。然而，比较性研究已被进行，比较在实施例1描述的相同条件下上述US2008/0124714的“稳定化缓冲剂”相对于本发明组合物(包含150mM CDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％Antifoam A，pH 11)的性能。

在用组成和时间评估微生物组稳定性期间，利用细菌16S rRNA基因的PCR进行的扩增和扩增子的DGGE分析显示，pH 11的具有150mM CDTA的本发明组合物在30天培育后比US 2008/0124714的pH 9.0的包含150mM EDTA的“稳定化缓冲剂”(79％)维持更高的相似度百分比(86％)——相对于对照(T＝0)。

因此，本申请的组合物相对于US 2008/0124714公开的组合物提供更优的、粪便样本中的微生物组谱的稳定化。

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本说明书提及的所有出版物、专利和专利申请均表示本发明所属领域技术人员的水平，并且通过引用并入本文中，达到如同具体而且分别地指出各所述出版物、专利或专利申请通过引用并入的相同程度。

本发明经此描述，可以多种方式变型是显而易见的。这种变型不被认为脱离本发明的精神和范围，并且对于本领域技术人员而言显而易见的这种改动全部意图囊括在所附权利要求的范围内。权利要求的范围不应受限于以描述为目的的优选实施方式，而应根据整体描述被给予最宽泛的解释。

Claims

1.在环境温度下稳定化生物学样本中包含的核酸的方法，包括如下步骤：

a)获得生物学样本；

b)使所述生物学样本与包括螯合剂的水性组合物接触以形成混合物，其中所述螯合剂以至少约150mM的浓度存在，并且其中所述组合物具有至少约9.5的pH；

c)均化(b)所述的混合物以形成均匀的混合物；和

d)在环境温度下储存所述均匀的混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物学样本选自粪便样本、土壤样本、污水样本、废水样本、或水样本。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述生物学样本是获自哺乳动物的粪便样本。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述螯合剂选自1,2-环己二胺四乙酸(CDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA)、四氮杂环十四烷四乙酸(TETA)、去铁胺、或其螯合剂类似物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述螯合剂是CDTA。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述螯合剂的浓度为约150mM至约500mM、或约250mM至约350mM。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述螯合剂的浓度为约300mM。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述组合物的pH为约9.5至约11.5、或约10.5至约11.5。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述组合物的pH为约11。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括至少一种能够在pH范围9.5至11.5内缓冲的缓冲剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述缓冲剂是β-丙氨酸。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括水溶性有机溶剂，如C₁-C₆烷醇。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述水溶性有机溶剂是乙醇。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述乙醇在所述组合物中以小于约30体积％的浓度存在。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述乙醇在所述组合物中以小于约24体积％的浓度存在。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括洗涤剂，如十二烷基硫酸钠。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括消泡剂，如Antifoam A。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中利用均化装置均化所述混合物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述均化装置是至少一个混合球。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法包括在包含所述至少一个混合球的样本容器中形成所述生物学样本和所述组合物的混合物，密封所述样本容器，和在所述至少一个混合球存在的情况下通过振荡所述混合物来均化所述混合物。

23.根据权利要求所述的方法22，其中所述振荡通过手动完成。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述至少一个混合球是不锈钢混合球或碳化钨混合球。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一个混合球是直径为约5.6-11.1mm并且密度为至少约7.6g/cm³的不锈钢混合球。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述不锈钢混合球的直径为约7.1–8.7mm，并且所述样本容器是内径为约12.9mm的圆底管。

27.根据权利要求5-26中任一项所述的方法，其中所述核酸是人DNA。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法致使所述人DNA：

在室温下稳定至少7天、至少14天、至少30天、或至少60天；

在约37℃至约50℃的温度下稳定至少7天、或至少14天；和/或

在-20℃下稳定至少30天。

29.根据权利要求3-26中任一项所述的方法，其中所述核酸是微生物DNA，并且所述方法稳定化所述生物学样本的微生物组谱。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法致使所述生物学样本的所述微生物组谱在室温下稳定至少7天、至少14天、至少30天、或至少60天；

在约37℃至约50℃的温度下稳定至少7天、或至少14天；和/或

在-20℃下稳定至少30天。

31.用于在环境温度下稳定化生物学样本中包含的核酸的水性组合物，其包括螯合剂，其中所述螯合剂以至少约150mM的浓度存在，其中所述组合物具有至少约9.5的pH。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。

33.根据权利要求31或32所述的组合物，其中所述生物学样本选自粪便样本、土壤样本、污水样本、废水样本、或水样本。

34.根据权利要求31-33中任一项所述的组合物，其中所述生物学样本是获自哺乳动物的粪便样本。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述哺乳动物是人。

36.根据权利要求31-35中任一项所述的组合物，其中所述螯合剂选自CDTA、DTPA、DOTA、TETA、去铁胺、或其螯合剂类似物。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述螯合剂是CDTA。

38.根据权利要求31-37中任一项所述的组合物，其中所述螯合剂的浓度为约150mM至约500mM、或约250mM至约350mM。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述螯合剂的浓度为约300mM。

40.根据权利要求31-39中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH为约9.5至约11.5、或约10.5至约11.5。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述组合物的pH为约11。

42.根据权利要求31-41中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括至少一种能够在pH范围9.5至11.5内缓冲的缓冲剂。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述缓冲剂是β-丙氨酸。

44.根据权利要求31-43中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括水溶性有机溶剂，如C₁-C₆烷醇。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述水溶性有机溶剂是乙醇。

46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述乙醇在组合物中以小于约30体积％的浓度存在。

47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述乙醇在组合物中以小于约24体积％的浓度存在。

48.根据权利要求31-47中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括洗涤剂，如十二烷基硫酸钠。

49.根据权利要求31-48中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括消泡剂，如Antifoam A。

50.根据权利要求35-49中任一项所述的组合物，其中所述核酸是人DNA。

51.根据权利要求33-49中任一项所述的组合物，其中所述核酸是微生物DNA，并且所述组合物用于稳定化所述生物学样本的微生物组谱。

52.用于在环境温度下稳定化生物学样本中包含的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)样本容器，其具有可重复密封的封闭物；

b)水性组合物，其包括螯合剂，其中所述螯合剂以至少约150mM的浓度存在，其中所述组合物具有至少约9.5的pH，其中所述组合物任选地被包含在所述样本容器内；

c)均化装置，其任选地被包含在所述样本容器内；

d)将所述生物学样本或其部分转移到所述样本容器中的装置；和

d)使用说明书。

53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。

54.根据权利要求52或53所述的试剂盒，其中所述生物学样本选自粪便样本、土壤样本、污水样本、废水样本、或水样本。

55.根据权利要求52-54中任一项所述的试剂盒，其中所述生物学样本是获自哺乳动物的粪便样本。

56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述哺乳动物是人。

57.根据权利要求52-56中任一项所述的试剂盒，其中所述螯合剂选自CDTA、DTPA、DOTA、TETA、去铁胺、或其螯合剂类似物。

58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述螯合剂是CDTA。

59.根据权利要求52-58中任一项所述的试剂盒，其中所述螯合剂的浓度为约150mM至约500mM、或约250mM至约350mM。

60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述螯合剂的浓度为约300mM。

61.根据权利要求52-60中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物的pH为约9.5至约11.5、或约10.5至约11.5。

62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述组合物的pH为约11。

63.根据权利要求52-62中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物进一步包括至少一种能够在pH范围9.5至11.5内缓冲的缓冲剂。

64.根据权利要求63所述的试剂盒，其中所述缓冲剂是β-丙氨酸。

65.根据权利要求52-64中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物进一步包括水溶性有机溶剂，如C₁-C₆烷醇。

66.根据权利要求65所述的试剂盒，其中所述水溶性有机溶剂是乙醇。

67.根据权利要求66所述的试剂盒，其中所述乙醇在组合物中以小于约30体积％的浓度存在。

68.根据权利要求67所述的试剂盒，其中所述乙醇在组合物中以小于约24体积％的浓度存在。

69.根据权利要求52-68中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物进一步包括洗涤剂，如十二烷基硫酸钠。

70.根据权利要求52-69中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物进一步包括消泡剂，如Antifoam A。

71.根据权利要求56-70中任一项所述的试剂盒，其中所述核酸是人DNA。

72.根据权利要求54-70中任一项所述的试剂盒，其中所述核酸是微生物DNA，并且所述试剂盒用于稳定化所述生物学样本的微生物组谱。

73.根据权利要求52-72中任一项所述的试剂盒，其中所述均化装置是至少一个混合球。

74.根据权利要求73所述的试剂盒，其中所述至少一个混合球是不锈钢混合球或碳化钨混合球。

75.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述至少一个混合球是直径为约5.6-11.1mm并且密度为至少约7.6g/cm³的不锈钢混合球。

76.根据权利要求75所述的试剂盒，其中所述不锈钢混合球的直径为约7.1–8.7mm，并且所述样本容器是内径为约12.9mm的圆底管。

77.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸是DNA，所述生物学样本是获自哺乳动物的粪便样本，所述组合物的pH为约10.5至约11.5，并且所述组合物包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：

数量为约250mM至约350mM的CDTA；

数量为约30mM至约70mM的β-丙氨酸；

数量为按体积计约21.5％至约23.5％的乙醇；

数量为约0至约1％(w/v)的十二烷基硫酸钠；和

数量为约0至约0.2％(v/v)的Antifoam A。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述组合物的pH为约11，并且包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：

数量为约300mM的CDTA；

数量为约50mM的β-丙氨酸；

数量为约23.5体积％的乙醇；

数量为约0.5％(w/v)的十二烷基硫酸钠；和

数量为约0.1％(v/v)的Antifoam A。

79.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述方法包括在圆底管中形成所述粪便样本和所述组合物的混合物，所述圆底管的内径为约12.9mm并且包含直径为约5.6-11.1mm并且密度为至少约7.6g/cm³的至少一个不锈钢混合球；密封所述圆底管；和在所述至少一个不锈钢混合球存在的情况下，通过手动振荡所述混合物，均化所述混合物。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述核酸是微生物DNA，并且所述方法稳定化所述粪便样本的微生物组谱，其中所述粪便样本的所述微生物组谱被致使：

在室温下稳定至少7天、至少14天、至少30天、或至少60天；

在约37℃至约50℃的温度下稳定至少7天、或至少14天；和/或

在-20℃下稳定至少30天。

81.根据权利要求31所述的组合物，其中所述核酸是DNA，所述生物学样本是获自哺乳动物的粪便样本，所述组合物的pH为约10.5至约11.5，并且所述组合物包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：

数量为约250mM至约350mM的CDTA；

数量为约30mM至约70mM的β-丙氨酸；

数量为按体积计约21.5％至约23.5％的乙醇；

数量为约0至约1％(w/v)的十二烷基硫酸钠；和

数量为约0至约0.2％(v/v)的Antifoam A。

82.根据权利要求81所述的组合物，其中所述组合物的pH为约11，并且包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：

数量为约300mM的CDTA；

数量为约50mM的β-丙氨酸；

数量为约23.5体积％的乙醇；

数量为约0.5％(w/v)的十二烷基硫酸钠；和

数量为约0.1％(v/v)的Antifoam A。

83.根据权利要求81或82所述的组合物，其中所述组合物用于稳定化所述粪便样本的微生物组谱。

84.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述核酸是DNA，所述生物学样本是获自哺乳动物的粪便样本，所述组合物的pH为约10.5至约11.5，并且所述组合物包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：

数量为约250mM至约350mM的CDTA；

数量为约30mM至约70mM的β-丙氨酸；

数量为按体积计约21.5％至约23.5％的乙醇；

数量为约0至约1％(w/v)的十二烷基硫酸钠；和

数量为约0至约0.2％(v/v)的Antifoam A。

85.根据权利要求84所述的试剂盒，其中所述组合物的pH为约11，并且包括下列、主要由下列组成、或由下列组成：

数量为约300mM的CDTA；

数量为约50mM的β-丙氨酸；

数量为约23.5体积％的乙醇；

数量为约0.5％(w/v)的十二烷基硫酸钠；和

数量为约0.1％(v/v)的Antifoam A。

86.根据权利要求85所述的试剂盒，其中所述核酸是微生物DNA，并且所述试剂盒用于稳定化生物学样本的微生物组谱。

87.根据权利要求86所述的试剂盒，其中所述均化装置是直径为约5.6-11.1mm并且密度为至少约7.6g/cm³的至少一个不锈钢混合球，并且所述样本容器是内径为约12.9mm的圆底管。