BR112016020659B1 - Método, composição e kit para estabilização de ácido desoxirribonucleico (dna) em amostras fecais - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA ESTABILIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS. São divulgados métodos, composições e kits para estabilizar ambos o ácido desoxirribonucleico (DNA) microbiano e humano presente em amostras biológicas complexas, como fezes. Especificamente, as composições aquosas para estabilizar o DNA contido em amostras biológicas à temperatura ambiente são divulgadas, juntamente com métodos e kits associados utilizando as mesmas. Em um aspecto, as composições compreendem um agente de quelação presente em uma concentração de pelo menos cerca de 150 mM e a composição tem um pH de pelo menos cerca de 9,5.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] O presente pedido refere-se ao campo de estabilização de ácidos nucleicos em amostras biológicas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se aos métodos e composições para estabilização de ácido desoxirribonucleico humano e microbiano (DNA) presente em amostras biológicas complexas, tais como fezes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] As fezes têm sido classificadas como um produto de resíduos potencialmente infecciosos do trato digestivo do animal, que é recolhido para testar para parasitas, como vermes e/ou seus ovos ou para detectar bactérias patogênicas e fungos em animais sintomáticos e seres humanos. Recentemente, no entanto, com a ascensão na medicina personalizada e comercialização em larga escala de pré e pró-bióticos, o diagnóstico e, em particular, o valor prognóstico deste produto "resíduo" aumentou. Simplesmente uma mudança de hábito alimentar tem sido mostrada para afetar a composição da comunidade microbiota ou microbiana nas fezes (Walker et al., 2011; Wu et al., 2011) que, por sua vez, pode afetar a saúde e reduzir a incidência de certas doenças.

[003] A colonização do trato gastrointestinal (GI) começa no nascimento, e a comunidade microbiana que se desenvolve ao longo do tempo é moldada por muitas influências, incluindo a constituição genética do indivíduo, idade, sexo, nutrição, utilização de antibióticos e outros medicamentos consumidos, estado de doença, estilo de vida, localização geográfica/ambiente, exposição a substâncias químicas, intervenções cirúrgicas e muito mais. Uma comunidade microbiana diversificada coloniza o intestino consistindo de aproximadamente 100 trilhões bactérias que desempenham um papel significativo na saúde humana, em particular, a digestão dos alimentos, metabolismo energético do hospedeiro, síntese de vitaminas essenciais, maturação do epitélio, degradação de sais biliares, metabolismo de drogas e carcinógenos dietéticos, bem como proteger o intestino de colonização do patógeno.

[004] "Microbioma intestinal" é o termo que descreve esta vasta coleção de microrganismos simbióticos no sistema GI humano e seus genomas de interação coletivos. No entanto, a compreensão dessas interações funcionais entre a fisiologia microbiota intestinal e do hospedeiro está em sua infância. O Human Microbiome Project revelou que o microbioma intestinal é aproximadamente 150 vezes maior que o genoma humano, consistindo em algum lugar entre 300 e 1000 espécies bacterianas e mais de 7000 cepas. Na maioria dos mamíferos, o microbioma intestinal é dominado por quatro filos bacterianos: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria e Proteobactérias (Ley et al., 2007). Uma nova área de trabalho refere- se à análise da interação do microbioma intestinal com parasitas, vírus, leveduras e inúmeros fungos intestinais, tais como Candida, Saccharomyces, Aspergilluse Penicillium. Alguns especialistas têm sugerido que a total informação codificada pelo genoma humano sozinho não é suficiente para realizar todas as funções do corpo biológico (Lee e Mazmanian, 2010) e apontam para a simbiose entre bactérias e humanos como uma explicação. Com apenas cerca de 10 por cento das células de um ser humano, sendo na verdade humana, com micróbios que compõem os restantes 90 por cento, os seres humanos podem ser pensados como hospedeiros para nossos hóspedes micróbios ou superorganismos.

[005] Por muitas décadas, os micróbios intestinais têm sido implicados no início do câncer de cólon (Aries et al., 1969; Moore e Moore, 1995). Mais recentemente, infecção por Helicobacter pylori foi identificada como das principais causas de câncer gástrico (estômago), linfoma gástrico e doença da úlcera péptica (Parsonnet et al., 1991). Acontece, porém, que os micróbios do intestino têm mais influência sobre como nos sentimos e nos comportamos do que sabemos. Devido à crescente evidência de que existe comunicação entre o cérebro e o intestino, o intestino foi apelidado de o "segundo cérebro". A evidência sugere que inúmeras doenças, como doenças cardiovasculares, diabetes, estresse/ansiedade, autismo, doença de Crohn, Doença do Intestino Irritável (IBD), doenças alérgicas, síndrome metabólica e inflamação neurológica podem resultar de desregulação do microbioma intestinal. No entanto, os pesquisadores estão apenas começando a decifrar o que é denominado agora "eixo microbioma-intestino-cérebro", ou seja, como micro-organismos colonizando o trato gastrointestinal podem influenciar funções biológicas além do intestino, em particular, os mecanismos moleculares ou diafonia pelo qual o microbioma intestinal impacta doenças imunológicas, endócrinas e neurológicas em seu hospedeiro (Grenham et al., 2011; Kinross et al., 2011). Por exemplo, muitos micróbios produzem neurometabólitos que são neurotransmissores ou moduladores da neurotransmissão, incluindo GABA, dopamina, noradrenalina, serotonina e acetilcolina, que age diretamente nos terminais nervosos no intestino ou via células enterocromafinas presentes ao longo do trato GI. Carboidratos de fibra alimentar também são quebrados por micróbios, resultando na produção de produtos químicos neuroativos, tais como, n-butirato, acetato, sulfeto de hidrogênio e propionato. Além disso, os micróbios vertem metabólitos, tais como proteínas, carboidratos e outras moléculas, que podem deixar o intestino e desempenhar um papel na sinalização de doença por todo o corpo.

[006] Em indivíduos saudáveis e doentes, bem como a identificação de centenas de espécies diferentes que compõem a comunidade microbiana do intestino, é fundamental para compreender a funcionalidade dos consórcios de bactérias como um todo. Por exemplo, a composição da microbiota determina a concorrência para ingredientes dietéticos como substratos de crescimento, conversão de açúcar em produtos de fermentação inibitórios, produção de substratos de crescimento, liberação de bacteriocinas (moléculas tóxicas para outras espécies bacterianas), estimulação do sistema imunológico inato, competição contra micróbios colonizando a parede do intestino e função de barreira do intestino e muito mais. Infelizmente, as técnicas tradicionais de cultura microbiológica provaram-se amplamente malsucedidas em ajudar a determinar a identidade e a função dos membros do microbioma intestinal, devido a limitações significativas decorrentes de sua dependência de nutrientes de crescimento adequados e condições complexas para a microflora intestinal toda florescer in vitro. Estimativas indicam que apenas 20-40% (Apajalahti et al., 2003) da microflora intestinal total pode ser cultivada através de técnicas de cultura padrão, assim que a grande maioria da biodiversidade microbiana foi ignorada pelos métodos baseados em cultivo. Este fator é ainda mais agravado pela necessidade de assegurar a viabilidade da microflora intestinal in vitro, muitas dos quais são anaeróbias O' Sullivan, 2000).

[007] Numerosos meios de cultura inerentemente selecionam contra algumas bactérias, em particular, aqueles que exigem agentes extras ou seletivos ou bactérias num estado fisiológico que não é propício para cultivo diretamente de fezes ou material intestinal. Também, análise morfológica tradicional e provas bioquímicas para identificação e caracterização da microflora intestinal são extremamente trabalhosas, demoradas e imprecisas, limitando assim a sua eficácia para analisar amostras de um grande número de indivíduos e comparando o parentesco entre espécies bacterianas de indivíduos diferentes. Portanto, métodos rápidos para capturar e estabilizar ou "snap-shot" o microbioma no ponto de coleta, em conjunto com ferramentas moleculares independentes de cultura, tais como abordagens do RNA ribossomal 16S baseadas em gene, sondas TaqMan, PCR digital LATE e sequenciamento metagenômico, são necessários para superar essas limitações e preconceitos, portanto uma imagem verdadeira e detalhada deste rico ecossistema pode ser revelada.

[008] Hoje, aproximadamente 1 em cada 20 pacientes hospitalizados irá contrair uma infecção hospitalar (HAI). Enquanto a maioria dos tipos de IACS está em declínio, surtos causados por Clostridium difficile, um patobionte conhecido, são um crescente problema que aflige os pacientes em hospitais e instituições de saúde a longo prazo. Infecção por C. difficile (CDI) é acreditado ser resultado de disbiose gastrointestinal, ou seja, o rompimento do microbiota residente. Tratamento antibiótico mata a maioria das bactérias no trato GI que normalmente controla aC. difficile . Neste ambiente alterado, C. difficile replica e produz toxinas que atacam o revestimento do intestino, causando sintomas desde diarreia até inflamações e sangramentos fatais da mucosa do cólon. De acordo com o Centers for Disease Control and Prevention (CDC), C. difficile sozinha está ligada à morte de 14.000 pessoas por ano nos Estados Unidos. Em hospitais, C. difficile tem esporos vertidos nas fezes que são transferidos para os pacientes e superfícies principalmente através das mãos do pessoal de saúde que tocou uma superfície ou item contaminados. Um tratamento eficaz contra a infecção deC. difficile recorrente não é amplamente disponível. Paradoxalmente, o principal tratamento para a infecção deC. difficile é a administração de mais antibióticos, com cerca de 20% dos pacientes com recorrências dentro de um mês, e muitas desses têm repetidos ataques.

[009] Um procedimento pouco ortodoxo, alternativo, transplante de microbiota fecal (FMT), em que fezes de um "doador" são infundidas no intestino do paciente, está provando ser muito mais eficaz do que os antibióticos no tratamento de infecções recorrentes do GI. Restaurando as perturbações para o equilíbrio microbiano, uma infusão de fezes de doadores saudáveis parece manter as bactérias prejudiciais, tais como C. difficile, na baía, erradicando a doença, mesmo em pacientes que sofreram repetidos, ataques debilitantes. Em um pequeno estudo holandês na Universidade de Amsterdam, 15 dos 16 pacientes com infecção deC. difficile recorrente foram curados com infusão duodenal de fezes de doadores, em comparação com apenas 27% dos pacientes, dados um regime de 2 semanas do antibiótico vancomicina (van Nood, Els et al. (2013)). Foi demonstrado que a infusão de fezes de doador resultou em melhora na diversidade microbiana no trato gastrointestinal do paciente e esta diversidade persistiu ao longo do tempo. Recentemente, Song et al. confirmou (2013) relatórios anteriores que uma redução na diversidade da microbiota e riqueza em amostras fecais de pacientes de infecção C. difficile recorrente (RCDI) foi restaurada após FMT tornar-se semelhante ao de um doador saudável. Neste estudo longitudinal, FMT afetou predominantemente Firmicutes e Proteobacteria, e a microbiota fecal continuou a mudar em pacientes pós-FMT por pelo menos 16 semanas.

[0010] Importantemente, o mecanismo exato de ação responsável pelo sucesso da FMT para tratar RCDI permanece desconhecido e não há nenhum conjunto clinicamente validado de parâmetros para definir um doador adequado ou doador de microbiota ideal. Um meio fácil e eficaz para recolher amostras de fezes no campo e snap shot do microbioma amostrado em uma composição à temperatura ambiente de um grande número de indivíduos, tanto os doadores saudáveis e pacientes de RCDI, em vários pontos de tempo é necessário mapear o microbioma 'núcleo' encontrado no trato GI de indivíduos saudáveis em uma população, sobre a qual pode ser sobreposto o microbioma em mudança dos pacientes RCDI. Em última análise, pacientes em RCDI no futuro serão tratados, não com antibióticos, mas com probióticos personalizados (preparação/suplemento contendo bactérias vivas que é tomado por via oral para restaurar as bactérias benéficas para o corpo) e prebióticos (componentes alimentares não digeríveis, como oligossacarídeos, que promovem a atividade dos grupos-alvo selecionados da microflora GI) ou simbióticos (combinações sinérgicas de probióticos e prebióticos) para retornar seu microbioma a um estado saudável.

[0011] Para evitar o risco de introdução de micróbios potencialmente prejudiciais não identificados, alguns hospitais estão começando a construir sistemas autobancários. Fezes do paciente podem ser depositadas para utilização no futuro como um antídoto contra possíveis infecções hospitalares "superinsetos." Utilizar as fezes do próprio paciente para transplante grandemente reduz o risco de introdução de micróbios nocivos e evita triagem demorada e dispendiosa de fezes de doadores não relacionados para doenças transmissíveis. Infelizmente, parece que o "ecossistema" de certas pessoas, no entanto, torna-os mais suscetíveis à doença do que outros. Portanto, uma possível desvantagem associada com reintroduzir fezes do próprio paciente é que pode apenas fornecer benefícios a curto prazo e não curá-lo de micróbios prejudiciais, tais como C. difficile. Em tempo, pesquisa de microbioma pode levar à identificação do 'núcleo' ou espécies bacterianas 'chave', que ajudam a definir a saúde humana e então desenvolver "bacterioterapia" personalizada, consistindo de "coquetéis" bacterianos benéficos inteiramente caracterizados, para suplantar este método bruto de transplante de fezes "cruas". De fato, terapias de probióticos agora têm sido propostas para uma grande variedade de distúrbios relacionados ao intestino como IBD e síndrome inflamatória do intestino. Fundamentalmente, pesquisadores e clínicos tentando caracterizar todas as espécies de microbiota do doador, identificam marcadores de diagnósticos para prever a susceptibilidade à doença e, finalmente, fornecem cuidados de saúde 'personalizados', precisam estar confiantes de que as amostras fecais sendo testadas fornecem uma representação verdadeira ou "snap-shot" do microbioma in vivo, do doador, não uma representação 'reduzida' ou artificial da comunidade microbiana. Portanto, um meio eficaz para capturar e estabilizar imediatamente ou snap shot do microbioma de fezes no ponto de coleta é fundamental.

[0012] Câncer colorretal (CRC) tem as maiores taxas de mortalidade de câncer na Europa e Estados Unidos. É conhecido que o CRC é altamente curável (>;90%) se detectado em seus estágios iniciais, tornando um bem valioso de rastreio do câncer precoce. Um número de métodos de exame sensível foi planejado ao longo dos anos para detectar o câncer, como enema baritado de duplo contraste, colonoscopia e sigmoidoscopia flexível. No entanto, os requisitos de custos, infraestrutura e recursos humanos financeiros associados com estes procedimentos apresentam obstáculos formidáveis, sem mencionar serem desconfortáveis e invasivos para o paciente. Para além das despesas, a natureza de baixa produtividade desses métodos de exame impede sua aplicação para a seleção principal em todo o país.

[0013] Neste momento, outro método para a triagem para o câncer colorretal é o teste de sangue oculto fecal (FOBT). Este teste detecta a presença de hemoglobina em amostras de fezes para determinar a presença ou ausência de sangramento no trato gastrointestinal, como um preditor indireto do CRC. Enquanto este teste não é caro, sua sensibilidade e valor preditivo positivo é muito baixa e a incidência de falsos positivos é alta. Portanto, um método sensível, confiável, econômico, escalável está em grande necessidade tanto para diagnóstico da doença em indivíduos em situação de risco e/ou sintomáticos, bem como para a rotina de diagnóstica de triagem da população assintomática. Idealmente, um indivíduo que rotineiramente coleta e estabiliza uma porção de suas fezes na privacidade da sua casa e em seguida enviá-lo para uma instalação de testes para ser triado para CRC e outras doenças.

[0014] Já é aceito que a detecção direta e a análise das células tumorais sobram no lúmen do cólon e recuperaram de fezes é um preditor mais positivo de câncer colorretal do que sangue oculto. No entanto, o DNA humano mutante ou "alvo", indicativo de câncer ou outras doenças, geralmente está presente na amostra biológica com pouca frequência (por exemplo, 1% do DNA humano total para CRC), muitas vezes contra um fundo elevado do DNA tipo-selvagem (DNA, por exemplo, bacteriano e DNA humano a partir de células normais do cólon) e expostos a DNases humanas endógenas (por exemplo, desoxirribonuclease I) e/ou nucleases bacterianas (por exemplo, nuclease Micrococcal). Neste complexo espécime, o pouco DNA humano "alvo" que existe em uma amostra fecal pode ser rapidamente degradado por nucleases e condições ambientais antes de chegar até o laboratório, um impacto negativo sobre a sensibilidade clínica de testes de diagnóstico. Além da abundância de nucleases, bactérias anaeróbicas, que constituem mais de 99% das bactérias no intestino, tornam-se expostas ao ar assim que fezes são eliminadas do trato digestivo. Ar, oxigênio, especificamente, é um ambiente tóxico para as bactérias anaeróbicas matando 50% dentro de 4-5 minutos e 95-97% de anaeróbias depois de 20 minutos (Brusa et al., 1989). Novamente, adquirindo uma visão representativa ou "snap-shot" do microbioma inteiro e DNA humano nas fezes é um desafio, considerando que a maioria das amostras fecais é recolhida em casa, não em uma instalação de laboratório ou de saúde.

[0015] É fundamental para estabilizar o total de ácidos nucleicos em amostras biológicas, tal que ele não degrade durante o armazenamento, transporte e manuseio de amostras. Para minimizar a degradação dos ácidos nucleicos em amostras biológicas, é prática padrão transportar amostras inteiras ou porções das mesmas em gelo seco (-78°C) para instalações de testes centralizadas onde ele é descongelado e processado imediatamente ou mantido congelado em armazenamento (-80 ° C a-20 ° C). Os custos, logística e infraestrutura necessária para garantir que as amostras coletadas são congeladas imediatamente, mantidas congeladas durante o transporte para instalações de teste e armazenado sob condições ideais antes da análise, coloca grandes desafios e riscos, especialmente em aplicações de triagem em larga escala e de base populacional. Pode ser ainda mais desafiador fornecer amostras 'representativas' para análise de amostra descentralizada e ainda manter a integridade da amostra máxima. É altamente desejável desenvolver um método de manipulação de amostra mais robusto e padronizado e composição que captura e mantém uma verdadeira representação do perfil de ácido nucleico de cada amostra.

[0016] O estudo da relação entre o microbioma e seu hospedeiro humano na saúde e na doença baseia-se na identificação e monitoramento de comunidades microbianas durante um período de tempo. Descobertas recentes demonstram a utilidade destes perfis microbianos como biomarcadores com valor diagnóstico e prognóstico. Torna-se evidente na literatura que, devido à natureza dinâmica do microbioma intestinal, amostragem repetida de grandes populações ao longo do tempo é essencial para o desenvolvimento de tais biomarcadores. Estes estudos, conhecidos como estudos de associação de Microbiome-Wide (MWAS) são desafiados por baixa conformidade de doador, autocoleta de amostras biológicas não confiáveis, altos custos de transporte e procedimentos de manipulação.

[0017] Métodos atuais para amostragem de fezes e análise de microbiota envolvem o transporte de espécimes em condições que têm o potencial para expor amostras a temperaturas incompatíveis com estabilização de microbioma. Falha para estabilizar corretamente o microbioma durante a coleta de amostra, transporte, processamento e análise de riscos, obscurecendo o significado biológico e clínico do perfil de microbioma. Consequentemente, procedimentos pré- analíticos adequados são necessários para assegurar a melhor representação possível do perfil do microbioma in vivo.

[0018] Há uma necessidade de composições e métodos para estabilização de ácidos nucleicos, DNA em especial tanto humano e microbiano, em amostras biológicas complexas, como fezes, durante o transporte e armazenamento à temperatura ambiente.

[0019] Estas informações de fundamento são fornecidas com a finalidade de tornar conhecidas as informações acreditadas pelo depositante de ser de relevância possível à presente invenção. Nenhuma admissão é pretendida necessariamente, nem deve ser interpretado, que algumas das informações precedentes constituem o estado da técnica contra a presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0020] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma composição, método e kit para estabilização de ácidos nucleicos, contidos em uma amostra biológica à temperatura ambiente.

[0021] Em um aspecto, é fornecido um método de estabilização do ácido nucleico contido em uma amostra biológica à temperatura ambiente, compreendendo as etapas de: a) obtenção de uma amostra biológica; b) entrar em contato com a amostra biológica com uma composição aquosa, composta por um agente quelante, no qual o agente quelante está presente em uma concentração de pelo menos cerca de 150 mM, e em que a composição tem um pH de pelo menos cerca de 9.5, para formar uma mistura; c) homogeneizando a mistura de (b) para formar uma mistura homogênea; e d) armazenar à temperatura ambiente, a mistura homogênea.

[0022] Em outro aspecto, é fornecida uma composição aquosa para estabilização de ácidos nucleicos contidos em uma amostra biológica à temperatura ambiente, compreendendo um agente quelante, no qual o agente quelante está presente em uma concentração de pelo menos cerca de 150 mM, em que a composição tem um pH de pelo menos cerca de 9.5.

[0023] Ainda em outro aspecto, é fornecido um kit para estabilização de ácidos nucleicos, contidos em uma amostra biológica à temperatura ambiente, o kit composto por: a) um recipiente de amostra tendo um fecho resselável; b) uma composição aquosa, composta por um agente quelante, no qual o agente quelante está presente em uma concentração de pelo menos cerca de 150 mM, em que a composição tem um pH de pelo menos cerca de 9.5, em que a dita composição está opcionalmente contida dentro do recipiente da amostra; c) um meio de homogeneização, opcionalmente, contido dentro do recipiente da amostra; d) um meio para transferir a amostra biológica, ou uma parte dela, dentro do recipiente da amostra; e d) instruções de utilização.

[0024] Em uma modalidade, o ácido nucleico é ácido desoxirribonucleico (DNA).

[0025] Em outra modalidade, a amostra biológica é selecionada a partir de uma amostra fecal, uma amostra de solo, uma amostra de água de esgoto, uma amostra das águas residuais ou uma amostra de água. Em outra modalidade, a amostra biológica é uma amostra fecal. Em outra modalidade, a amostra fecal é obtida de um mamífero. Em outra modalidade, o mamífero é um ser humano.

[0026] Em outra modalidade, o agente quelante é selecionado de ácido 1,2-ciclo-hexanodiamina tetra-acético (CDTA), ácido dietilenotriamina penta-acético (DTPA), ácido tetra-azaciclododecanotetra-acético (DOTA), ácido tetra-azaciclotetradecanotetra-acético (TETA), desferioximina ou respectivos análogos quelantes dos mesmos. Em outra modalidade, o agente quelante é CDTA.

[0027] Em outra modalidade, a concentração do agente quelante é de cerca de 150 mM para cerca de 500 mM, ou cerca de 250 mm a cerca de 350 mM. Em ainda outra modalidade, a concentração do agente quelante é cerca de 300 mM.

[0028] Em outra modalidade, a composição tem um pH de cerca de 9,5 a cerca de 11,5 ou de cerca de 10,5 para cerca de 11,5. Em outra modalidade, a composição tem um pH de cerca de 11.

[0029] Em ainda outra modalidade, a composição compreende ainda pelo menos um agente de tamponamento capaz de tamponar na faixa de pH 9,5 a 11,5. Em outra modalidade, o agente de tamponamento é beta-alanina.

[0030] Em ainda outra modalidade, a composição compreende ainda um solvente orgânico solúvel em água, tal como um alcanol C1C6. Em outra modalidade, o solvente orgânico solúvel em água é etanol. Em outra modalidade, o etanol está presente na composição em uma concentração de menos de cerca de 30% em volume. Em ainda outra modalidade, o etanol está presente na composição em uma concentração de menos de cerca de 24% em volume.

[0031] Em outra encarnação, a composição compreende ainda um detergente, tais como dodecilsulfato de sódio. Em outra modalidade, a composição mais compreende um agente antiespuma, tais como Antiespuma A. Ainda em outra modalidade, a composição compreende ainda um agente antimicrobiano, como Triclosan ou Proclin.

[0032] Em outra modalidade, o ácido nucleico é o DNA microbiano.

[0033] Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico é o DNA microbiano e o método estabiliza um perfil de microbioma da amostra biológica. Em outra modalidade, o método processa o perfil de microbioma da amostra biológica estável por pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 30 dias ou pelo menos 60 dias à temperatura ambiente; pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias a uma temperatura de cerca de 37°C para cerca de 50°C; e/ou pelo menos 30 dias a -20°C.

[0034] Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico é o DNA microbiano e a composição/kit é para estabilização de um perfil de microbioma da amostra biológica.

[0035] Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico é o DNA humano. Em outra modalidade, o método processa o DNA humano estável a: pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 30 dias ou pelo menos 60 dias à temperatura ambiente; pelo menos 7 dias, ou pelo menos de 14 dias a uma temperatura de cerca de 37°C a cerca de 50°C; e/ou pelo menos 30 dias a -20°C.

[0036] Em ainda outra modalidade, o método compreende homogeneizar a mistura da amostra biológica e a composição aquosa utilizando um meio de homogeneização.

[0037] Em outra modalidade, os meios de homogeneização do método acima descritos e o kit é pelo menos uma bola de mistura. Em outra modalidade, pelo menos uma bola de mistura é uma bola de mistura de aço inoxidável ou uma bola de mistura de carboneto de tungstênio. Em ainda outra modalidade, pelo menos uma bola de mistura é uma bola de mistura de aço inoxidável com um diâmetro de cerca de 5,6-11,1 mm e uma densidade de, pelo menos cerca de 7,6 g/cm3. Em ainda outra modalidade, a bola de mistura de aço inoxidável tem um diâmetro de cerca de 7,1 - 8,7 mm e o recipiente da amostra é um tubo de fundo redondo com um diâmetro interno de cerca de 12,9 mm.

[0038] Em outra modalidade, o método compreende a formação da mistura da amostra biológica e a composição aquosa em um recipiente de amostra contendo pelo menos uma bola de mistura, selando o recipiente de amostra e homogeneizando a mistura, agitando a mistura na presença de pelo menos uma bola de mistura. Em ainda outra modalidade, a agitação é feita à mão.

[0039] Em outras modalidades, estabilizar o ácido nucleico compreende preservar a abundância relativa do ácido nucleico contido na amostra biológica durante o armazenamento à temperatura ambiente.

[0040] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método de estabilização do DNA contido numa amostra fecal à temperatura ambiente que compreende as etapas de: a) obter uma amostra fecal a partir de um mamífero; b) contatar a amostra fecal com uma composição aquosa tendo um pH de cerca de 10,5 a cerca de 11,5 e em que a composição compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de: CDTA numa quantidade de desde cerca de 250 mM a cerca de 350 mM; β-alanina numa quantidade de desde cerca de 30 mM a cerca de 70 mM; etanol numa quantidade compreendida entre cerca de 21,5% a cerca de 23,5% em volume; dodecil sulfato de sódio numa quantidade de desde cerca de 0 a cerca de 1% (w/v); e antiespuma A numa quantidade de desde cerca de 0 a cerca de 0,2% (v/v); c) homogeneizar a mistura de (b) para formar uma mistura homogênea; e d) armazenamento da mistura homogênea à temperatura ambiente. Em ainda outra modalidade, a composição aquosa tem um pH de cerca de 11, e compreende, consiste essencialmente de, ou consiste em: CDTA numa quantidade de cerca de 300 mM; β-alanina numa quantidade de cerca de 50 mM; etanol numa quantidade de cerca de 23,5% em volume; dodecil sulfato de sódio numa quantidade de cerca de 0,5% (w/v); e antiespuma A numa quantidade de cerca de 0,1% (v/v). Ainda em outra modalidade, o método compreende a formação da mistura da amostra fecal e a composição aquosa num tubo de fundo redondo tendo um diâmetro interno de cerca de 12,9 milímetros e contendo, pelo menos, uma bola de mistura de aço inoxidável com um diâmetro de cerca de 5,6-11,1 mm e uma densidade de pelo menos cerca de 7,6 g/cm3, selando o tubo de fundo redondo, e homogeneizando a mistura por agitação da mistura à mão na presença de, pelo menos, uma bola de mistura de aço inoxidável. Numa outra modalidade, o DNA é DNA microbiano, e o método estabiliza um perfil de microbioma da amostra fecal.

[0041] Ainda em outra modalidade, fornece-se uma composição aquosa para estabilizar o DNA contido numa amostra fecal, à temperatura ambiente, em que a amostra fecal é obtida a partir de um mamífero, em que a composição tem um pH de cerca de 10,5 a cerca de 11,5, e compreende , consiste essencialmente de, ou consiste de: CDTA numa quantidade de desde cerca de 250 mM a cerca de 350 mM; β-alanina numa quantidade de desde cerca de 30 mM a cerca de 70 mM; etanol numa quantidade compreendida entre cerca de 21,5% a cerca de 23,5% em volume; dodecil sulfato de sódio numa quantidade de desde cerca de 0 a cerca de 1% (w/v); e antiespuma A numa quantidade de desde cerca de 0 a cerca de 0,2% (v/v). Em ainda outra modalidade, a composição aquosa tem um pH de cerca de 11, e compreende, consiste essencialmente de, ou consiste em: CDTA numa quantidade de cerca de 300 mM; β-alanina numa quantidade de cerca de 50 mM; etanol numa quantidade de cerca de 23,5% em volume; dodecil sulfato de sódio numa quantidade de cerca de 0,5% (w/v); e antiespuma A numa quantidade de cerca de 0,1% (v/v). Numa outra modalidade, o DNA é DNA microbiano, e a composição é para estabilizar um perfil de microbioma da amostra fecal.

[0042] Em ainda outra modalidade, é fornecido um kit para estabilização de ácidos nucleicos contidos em uma amostra biológica à temperatura ambiente, o kit composto por: a) um recipiente de amostra ter um fecho resselável; b) uma composição aquosa tendo um pH de cerca de 10,5 para cerca de 11,5 e compreendendo, essencialmente constituídos de ou consistindo de: CDTA em uma quantidade de cerca de 250 mm de cerca de 350 mM; B-alanina, numa quantidade de cerca de 30 mm para cerca de 70 mM; etanol numa quantidade de cerca de 21,5% para cerca de 23,5% em volume; dodecil sulfato de sódio em um montante de sobre 0 a cerca de 1% (w/v); e antiespuma A em uma quantidade de cerca de 0 a aproximadamente 0,2% (v/v), em que a dita composição opcionalmente está contida dentro do recipiente da amostra; c) um meio de homogeneização, opcionalmente, contido dentro do recipiente da amostra; d) um meio para transferir a amostra biológica, ou uma parte dela, dentro do recipiente da amostra; e d) instruções de utilização. Em outra modalidade, a composição aquosa tem um pH de cerca de 11 e compreende, essencialmente consiste de ou consiste em: CDTA numa quantidade de cerca de 300 mM; β-alanina numa quantidade de cerca de 50 mM; etanol numa quantidade de cerca de 23,5% em volume; dodecil sulfato de sódio numa quantidade de cerca de 0,5% (w/v); e antiespuma A numa quantidade de cerca de 0,1% (v/v). Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico é DNA microbiano e o kit é para estabilizar um perfil de microbioma da amostra biológica. Ainda numa outra modalidade, o meio de homogeneização é, pelo menos, uma bola de mistura de aço inoxidável com um diâmetro de cerca de 5,6-11,1 mm, e uma densidade de pelo menos cerca de 7,6 g/cm 3, e o recipiente da amostra é de um tubo de fundo redondo possuindo um diâmetro interno de cerca de 12,9 milímetros.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0043] Para uma compreensão melhor da presente invenção, bem como outros aspectos e características adicionais disso, a referência é realizada à seguinte descrição que deve ser utilizada em conjunto com as figuras anexas, em que:

[0044] A Figura 1 retrata graficamente as diferenças no perfil de microbioma de amostras fecais de 2 doadores (análise de PCR- DGGE);

[0045] A Figura 2 mostra um gel agarose demonstrando a qualidade de DNA de alto peso molecular em amostras fecais em T=0 e após 14 dias à temperatura ambiente em 1) composições contendo diferentes concentrações de CDTA (150-500 mM), 2) composições contendo diferentes concentrações de EDTA (150-500 mM), e 3) fezes armazenadas sem solução de estabilização (instabilizadas);

[0046] A Figura 3 mostra graficamente a dependência da estabilidade do perfil de microbioma na homogeneização da amostra e o pH da composição atual;

[0047] A Figura 4 mostra a análise DGGE de amostras fecais, armazenadas em várias composições por 14 dias à temperatura ambiente;

[0048] A Figura 5 mostra a análise de amostras de fezes DGGE armazenadas em diferentes composições durante 4 dias à temperatura ambiente;

[0049] A Figura 6 mostra um gel de agarose, demonstrando a qualidade de DNA de alto peso molecular em amostras fecais armazenadas em composições em valores de pH diferentes durante 9 dias à temperatura ambiente;

[0050] A Figura 7 mostra um gel de agarose, demonstrando o resultado da mistura de amostras fecais com (A) múltiplas contas de vidro e (B) bola de aço inoxidável na presente composição;

[0051] A Figura 8 mostra o gel de agarose mostrando qualidade de DNA mediante armazenamento na composição presente à temperatura ambiente em (A) dia 0, (B) dia 6, (C) dia 7, (D) dia 14, (E) um mês e (F) 2 meses;

[0052] A Figura 9 mostra géis DGGE de alíquotas de amostra fecal triplicadas de amostra do mesmo doador armazenadas na presente composição;

[0053] A Figura 10 mostra um representante DGGE gel e % de similaridade (parte inferior do gel) perfil de microbioma de amostras fecais armazenadas na presente composição em (A) 14 dias à temperatura ambiente e (B) 7 dias e 2 meses à temperatura ambiente;

[0054] As Figuras 11A e 11B mostram géis de agarose de amostras fecais de 2 doadores armazenados a 37° C nas presentes composições;

[0055] As Figuras 12A e 12B mostram análise DGGE de amostras fecais de 2 doadores armazenados a 37° C nas presentes composições;

[0056] As Figuras 13A-E mostram os géis de agarose de amostras fecais de 3 doadores armazenados na presente composição a -20°C, temperatura ambiente, e 50°C;

[0057] As Figuras 14A-D mostram eletroforese em gel de agarose de amostras fecais de 3 doadores armazenados nas presentes composições a 50°C e -20°C;

[0058] As Figuras 15A-B mostra análise DGGE das amostras de fezes a partir de 2 dadores armazenadas nas presentes composições a 50°C durante 14 dias;

[0059] As Figuras 16A-B mostram análise DGGE de amostras fecais de 2 doadores armazenadas na presente composição, a -20°C, durante 11 dias;

[0060] A Figura 17 mostra o gel de agarose de amostras fecais na presente composição e expostos a 5 ciclos de congelamento/descongelamento;

[0061] A Figura 18 mostra a análise DGGE de amostras fecais na presente composição e expostos a 5 ciclos de congelamento/descongelamento;

[0062] A Figura 19 mostra análise de coordenada principal (PCoA) que demonstra que as amostras armazenadas em solução de estabilização sobre várias temperaturas e tempo (3 e 14 dias) apresentam um elevado nível de similaridade em abundância de OTU; e

[0063] A Figura 20 mostra a abundância proporcional de nível família das amostras armazenadas com e sem solução de estabilização sobre várias temperaturas e tempo (3 e 14 dias).

[0064] A Figura 21 mostra as distâncias de dissimilaridade de Bray-Curtis dentro e entre amostras estabilizadas frescas e 104B pH 11. Teste de Mann-Whitney mostrou dissimilaridade comparável em todas as condições, nenhuma diferença estatística foi observada.

[0065] A Figura 22 ilustra que amostras estabilizadas 104B pH 11 preservam riqueza. Riqueza foi avaliada atribuindo presença/ausência de OTUs individuais e comparados utilizando o índice de Shannon. Teste de Mann-Whitney mostrou que não há diferenças significativas entre amostras frescas e 104B pH 11.

[0066] A Figura 23 ilustra que amostras 104B pH 11 processam perfis de microbioma altamente reprodutíveis. Os testes de Mann- Whitney em distâncias de Bray-Curtis mostraram dissimilaridade comparável em amostras triplicadas.

[0067] A Figura 24 mostra dissimilaridade de distância de Bray- Curtis entre amostras fecais instabilizadas e 104B pH 11 (14 dias a 23°C) e congeladas (14 dias a -80°C) quando comparadas com amostras frescas. Diferença significativa foi avaliada utilizando Mann- Whitney (*P< 0,05).

[0068] A Figura 25 mostra uma dendrograma de microbioma ponderado Unifrac% de similaridade de um doador representativo. Extrações de três réplicas biológicas foram realizadas para cada condição. Baixa % de similaridade para amostra fresca indica mudanças no perfil de microbioma ao longo do tempo.

[0069] A Figura 26 ilustra a integridade de DNA de amostras 104B pH 11 submetidas a condições de transporte simulado. Amostras representativas dos doadores foram armazenadas a 23°C durante 14 dias, 50° C por 1 dia, 37° C, durante 3 dias ou expostas a múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Amostras frescas também foram armazenadas a -80°C por 14 dias como um controle.

[0070] A Figura 27 ilustra a dissimilaridade da distância de Bray- Curtis das amostras 104B pH 11 expostas a condições simuladas de transporte. Teste de Mann-Whitney não mostrou nenhuma diferença entre amostras armazenadas 104B pH 11 em diferentes temperaturas e aquelas armazenadas a -80°C. Diferença significativa foi observada em amostras instabilizadas mantidas a 37°C ou sujeitas a condições de congelamento-descongelamento (F/T) quando comparadas com amostras pareadas a -80°C (P< 0,05 e P<0,01, respectivamente).

[0071] A Figura 28 mostra a análise DGGE do perfil de comunidade bacteriana de uma amostra fecal de 2 doadores tratados com a presente composição contendo concentrações variadas de CDTA e com uma composição que não contém CDTA, por 5 dias a 40°C.

[0072] A Figura 29 mostra análise DGGE dos perfis de amostras fecais de 2 doadores de comunidade bacteriana tratada com a presente composição "04B pH 11" ou tampão TEN durante 21 dias à temperatura ambiente.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0073] Deve-se notar que o papel das composições para estabilização de ácidos nucleicos aqui descritos é estabilizar o ácido nucleico e perfis de DNA totais "snap-shot" em amostras biológicas, tais como amostras fecais, à temperatura ambiente por períodos prolongados de tempo. Extração e isolamento de ácidos nucleicos, tais como DNA, é realizado em etapas subsequentes usando kits de extração comercialmente disponível seguinte à estabilização dos ácidos nucleicos contidos em amostras fecais utilizando as composições descritas neste documento. De preferência, as composições para estabilização de ácidos nucleicos aqui descritos não contêm sais caotrópicos (por exemplo, sais guanidínios tais como tiocianato de guanidínio (GuSCN) ou cloridrato de guanidínio (GuHCl)), ureia, fixador (formalina, paraformaldeído, etc.), agentes redutores, policátions (como polilisina ou poliacrilamida), fenol ou clorofórmio. Enzimas como proteases (por exemplo, proteinase K), lisozima, etc. não são necessárias para a estabilização do efeito dos ácidos nucleicos contidos em amostras fecais utilizando as composições descritas neste documento e, portanto, de preferência não estão incluídas nas composições aqui descritas. Assim, as presentes composições e métodos de estabilização do ácido nucleico evitam a utilização de compostos caros e/ou tóxicos, que muitas vezes exigem condições especiais de armazenamento e transporte.

[0074] A menos que definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que compreendido geralmente por alguém versado na técnica a qual esta invenção pertence.

[0075] Como utilizado no relatório descritivo e nas reivindicações, as formas singulares de "um", "uma" e "o", "a" incluem as referências plurais a menos que o contexto dite claramente de outra maneira.

[0076] O termo "compreende" conforme utilizado neste documento será compreendido para significar que a seguinte lista é não exaustiva e pode ou não pode incluir quaisquer outros artigos adequados adicionais, por exemplo, uma ou mais características adicionais, componente (s) e/ou ingrediente (s) como apropriado.

[0077] O termo "amostra" como utilizado aqui será entendido como significando qualquer espécime que potencialmente contém uma substância de interesse, em particular um ácido nucleico e, opcionalmente, uma proteína ou outras biomoléculas de interesse. O termo "amostra" pode abranger uma solução, como uma solução aquosa, célula, tecido, biópsia, pó ou população de uma ou mais do mesmo. A amostra pode ser uma amostra biológica, tais como saliva, escarro, amostra de esfregaço bucal, soro, plasma, sangue, creme leucocitário, faríngeo, nasal/esfregaços ou secreções faríngeas ou do seio nasal, raspagens ou esfregaços faríngeos, urina, muco, fezes/fezes/excremento, esfregaços retais, esfregaço de lesão, quimo, vômito, sucos gástricos, suco pancreático, fluidos de trato gastrointestinais (GI) ou sólidos, sêmen/esperma, esfregaço uretral e secreções, cerebral fluido espinhal, produtos de amamentação ou menstruação, ovo, gema, humor aquoso, líquido amniótico, humor vítreo, secreções ou esfregaços cervicais, fluido/secreções/esfregaços ou raspagens vaginais, amostras de medula óssea e aspirados, líquido e efusões pleurais, suor, pus, lágrimas, linfa, lavagem ou aspirados pulmonares ou bronquiais, efusões peritoneais, culturas de células e suspensões celulares, tecido conjuntivo, epitélio, esfregaço e manchas epiteliais, membrana da mucosa, tecido de músculo, tecido placentário, biópsias, exsudados, tecido de órgão, tecido nervoso, cabelo, pele ou unhas, em que as amostras dos acima mencionados podem ser obtidas por exemplo, um vertebrado, incluindo um mamífero. Um mamífero pode ser, por exemplo, um humano, um primata não humano, gado (tal como vaca, cabra ou ovelha), bem como um cão, gato, cavalo, etc.

[0078] Em uma modalidade, a amostra biológica é uma amostra fecal e o objeto é um mamífero. Em outra modalidade, a amostra biológica é uma amostra fecal e o objeto é um ser humano.

[0079] Outros tipos de amostras biológicas incluem plantas, extratos vegetais, algas, amostras de solo, de esgoto, de águas residuais, água, amostras ambientais, gêneros alimentícios, alimentos para animais, alimento para peixes, alimentação animal, esfregaços de superfícies contaminadas ou potencialmente infecciosas ou equipamentos (por exemplo, superfícies de processamento de carne), esfregaços de 'toque' de superfícies de hospitais, lares de idosos, instalações de ambulatório, instituições médicas, ou semelhantes. Em outras modalidades, ainda, a amostra biológica é selecionada de uma amostra de solo, uma amostra de água de esgoto, uma amostra das águas residuais ou uma amostra de água, que podem estar contaminadas com fezes.

[0080] O termo "microrganismo" ou "micróbio" como utilizado aqui,será entendido que quaisquer organismos microscópicos e esporos, incluindo todos os procariontes, ou seja, a eubacteria e archaeabacteria e várias formas de Eukaryota, compreendendo os protozoários, fungos (por exemplo, leveduras),

[0081] Algas, animais como rotíferos e planária. Por exemplo, os grupos de bactérias que são mais frequentemente detectados em fezes humanas utilizando sequenciamento de gene 16S rRNA incluem Firmicutes Bacteroidetes, Spirochaetes, Fusobacteria, Proteobactérias Delta, Proteobactérias Ípsilon, Proteobactérias Alfa,Betaproteobacteria, FiloProteobacteria, Euryarchaeota, Eukarya, Desulfothiovibrio, Tm7, Cianobactérias, Actinobacteria,Verrucomicrobia eLentisphaerae.

[0082] O termo "vírus" ou "vírions" como utilizados aqui sera entendido como significando qualquer agente infeccioso pequeno que replica somente dentro de células vivas de outros organismos. Vírus podem infectar todos os tipos de formas de vida, de animais e plantas às bactérias e archaea e viver em quase todos os ecossistemas. Atualmente, existem 21 famílias de vírus que podem causar doença em humanos: Adenovírus, Herpesviridae, Papillomaviridae,Polyomaviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae,Astroviridae, Caliciviridae, Picomaviridae, Coronavírus, Flaviviridae, por Togaviridae, Hepeviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae,Rhabdoviridae, Reoviridae (e Hepatite D, atualmente não atribuído). O material genético de um vírus pode ser ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA).

[0083] O ácido nucleico a ser estabilizado pelas composições aqui descritas pode ser DNA ou RNA, incluindo mRNA ou RNA viral. Em uma modalidade, o ácido nucleico é o DNA. Em outra modalidade, o DNA é de origem humana, viral e microbiana. Em outra modalidade, o ácido nucleico a ser estabilizado pelas composições aqui descritas compreende o DNA humano e DNA microbiano.

[0084] O termo "temperatura ambiente" como utilizado neste documento refere-se a uma gama de temperaturas que podem ser encontradas pela mistura de uma amostra biológica (por exemplo, amostra fecal) e o ácido nucleico estabilizando composições aqui descritas do ponto de coleta, durante o transporte (que pode envolver temperaturas relativamente extremas, embora geralmente por períodos mais curtos de tempo (por exemplo, <; 5 dias)), bem como durante o armazenamento prolongado antes da análise. Em uma modalidade, a temperatura é temperatura ambiente variando de cerca de -20°C a cerca de 60°C. Em outra modalidade, a temperatura ambiente é a temperatura ambiente e varia de cerca de 15°C a cerca de 30°C.

[0085] A etapa de entrar em contato com a amostra fecal com as composições aquosas aqui descritas para formar uma mistura deve ser efetuada logo que possível após evacuação de fezes e a homogeneização da mistura para formar uma mistura homogênea deve ser efetuada logo que possível, de preferência imediatamente, a fim de estabilizar os ácidos nucleicos contidos dentro da amostra fecal.

[0086] Em geral, a estabilização química de DNA e RNA em uma amostra biológica, tais como saliva, sangue, escarro, fezes/fezes e urina, é conseguido através da utilização de tampões para manter um pH adequado, bem como a utilização de agentes para evitar o fenômeno de ciclização de metal redox ou a ligação de íons metálicos ao fosfato dos ácidos nucleicos. O termo "quelante" ou "agente quelante" como utilizado aqui será compreendido como significando um produto químico que irá formar um complexo solúvel, estável com certos íons metálicos (por exemplo, Ca2+ e Mg2+), sequestrando os íons para que eles normalmente não possam reagir com outros componentes, tais como desoxirribonucleases (DNase) ou as endonucleases (por exemplo, tipo I, II e III as endonucleases de restrição) e se exonucleases (por exemplo, 3' 5' exonuclease) ,enzimas que são abundantes no trato GI. A principal fonte de DNase no trato GI são secreções do pâncreas, bem como os microorganismos residentes. Na presente composição, agente (s) quelante (s) participam na inibição da DNase e crescimento microbiano em amostras biológicas. Um quelante pode ser, por exemplo, ácido etilenodiaminotetra-acético de etileno glicol (EGTA), ácido de etilenodiaminotriacético(2-hidroxietil) (HEDTA), ácido penta-acético dietileno triamina (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminotriacético (EDTA), ácido 1,2-ciclo-hexanodiaminotetra- acético (CDTA), N, N-bis (carboximetil) glicina, trietilenotetraamina (TETA), ácido tetra-azaciclododecanotetra-acético (DOTA), desferioximina, citrato de anidro, citrato de sódio, citrato de cálcio, citrato de amônia, bicitrato de amônia, ácido cítrico, citrato de diamônia, citrato de amônia férrico e citrato de lítio. Estes agentes quelantes podem ser utilizados isoladamente ou em combinação de dois ou mais dos mesmos. Em uma modalidade preferida, desejáveis são quelantes mais fortes do que EDTA (i.e., quelantes com uma constante de dissociação maior do que EDTA quando ligado a um metal), utilizados isoladamente ou em combinação, que incluem, mas não estão limitados a, CDTA, DTPA, DOTA, TETA e desferioximina ou análogos de quelante dos mesmos, em um montante de cerca de 150 mM a 600 mM, de preferência em um montante de cerca de 150 mM a cerca de 500 mM , ainda mais, de preferência em um montante de cerca de 250 mM a cerca de 350 mM e mais, de preferência em um montante de cerca de 300 mM. Mais desejavelmente, o agente quelante na composição do presente é CDTA.

[0087] EDTA é um produto químico que é amplamente utilizado na indústria, laboratórios, cosméticos, medicina e em alguns produtos alimentares. Sua utilidade é baseada na sua capacidade de 'quelar' íons metálicos, particularmente valências bivalentes e superiores. CDTA é menos comumente utilizado nestes campos, mas compartilha uma habilidade de quelar íons metálicos com EDTA. Importante, a afinidade de ambos quelantes de diferentes íons metálicos varia consideravelmente. K1, uma medida da afinidade expressa em uma escala logarítmica é mostrada na Tabela 1 (abaixo). Os 5 primeiros quelantes listados têm diferentes números e configurações de carboxilato (R-COO-) grupos ligados a grupos de nitrogênio. Na tabela 1, OPT é apresentado por comparação como um quelante com base apenas em grupos de nitrogênio.

[0088] Uma comparação de CDTA e EDTA na Tabela 1 mostra que eles são muito diferentes. As diferenças nos valores de log K1 são 2,3 (Mg2+); 2,6 (Ca2+); 2,4 (Mn2+); aproximadamente 3 (Fe3+); 3,6 (Co2+); 0,8 (Cu2+); 2,9 (Zn2+). Ou seja, CDTA vincula a maioria dos metais de 200 a 4.000 vezes mais fortemente do que o EDTA.Tabela 1. Afinidade de quelantes de diferentes íons metálicos

[0089] Uma das consequências desta habilidade mais forte de CDTA para metais complexos é que a concentração de qualquer íon metálico livre será menor na presença de concentrações iguais de CDTA ou EDTA. Mais importante, no entanto, a quantidade de íon metálico que pode ser complexado a biomoléculas, tais como ácidos nucleicos ou proteínas, será sensivelmente inferior. Ácidos nucleicos em solução são conhecidos para ligar a íons metálicos e remover tais metais é susceptível de melhorar sua estabilidade química. Isto pode ser particularmente importante para os metais de transição como Mn, Fe, Co e Cu, que pode existir em estados de oxidação diferentes por ganhar ou perder elétrons de espécies, tais como oxigênio bimolecular, ânion superóxido e peróxido de hidrogênio. Finalmente, a mais forte capacidade de CDTA de complexar metal é altamente benéfica em composições desenvolvidas para suprimir a degradação dos ácidos nucleicos em amostras biológicas, tais como fezes, conhecido naturalmente por conter grandes quantidades de DNase que exigem Ca2+ e Mg2+ para estabilizar sua conformação ativa.Tabela 2: valores de pK para CDTA e EDTA

[0090] Existem outras diferenças entre CDTA e EDTA que têm consequências práticas em um ambiente de laboratório ou pesquisa.Possivelmente devido ao baixo k1 e k2 pKa valores de EDTA (ver Tabela 2 acima), é consideravelmente mais difícil preparar o formulário dissódico em pH 7.0 (começando com a forma de ácido). Mais soluções concentradas de CDTA do que de EDTA podem ser preparadas. Finalmente, a forma dissódica de CDTA é altamente solúvel em etanol, em comparação com a solubilidade limitada do formulário de EDTA dissódico. Estas diferenças fazem CDTA a melhor escolha de quelante de uma perspectiva de fabricação.

[0091] Em geral, o pH da presente composição pode ser mantido na faixa alcalina desejada utilizando um ou mais tampões adequados; em que a composição é armazenada em tampão para manter o pH da amostra biológica em um pH adequado, e a dita composição estabiliza o dito ácido nucleico à temperatura ambiente. Em conformidade com uma modalidade, a composição compreende um, dois ou mais agentes de tamponamento (exemplos não limitativos fornecidos, ver Tabela 3) com valores pKa, constantes de dissociação ácida logarítmica, a 25°C, variando de 8,0 para 12,5 para manter o pH dentro da faixa preferencial de cerca de 9,5 a cerca de 11,5. Uma constante de dissociação ácida, Ka, é uma medida quantitativa da força de um ácido em solução. Quanto maior o valor de Ka, mais dissociação das moléculas em solução e, portanto, mais forte o ácido. Devido as muitas ordens de magnitude medidas por valores de Ka, uma medida da constante de dissociação ácida logarítmica, pKa, é mais comumente utilizada na prática. Quanto maior o valor de pKa, quanto menor for o grau de dissociação em qualquer pH dado, ou seja, mais fraco o ácido.

[0092] Em organismos vivos, a homeostase do ácido-base e a cinética enzimática são dependentes de valores de pKa de muitos ácidos e bases presentes na célula e no organismo. Em química, conhecimento de valores de pKa é necessário para a preparação de soluções tampão e é também um pré-requisito para uma compreensão quantitativa da interação entre ácidos ou bases e íons metálicos para formar complexos. Um versado na técnica vai entender que um determinado composto/tampão pode tamponar o pH de uma solução apenas quando sua concentração é suficiente e quando o pH da solução é próximo (dentro de cerca de uma unidade de pH) a sua pKa. Em uma modalidade, o pH da presente composição está na gama de cerca de 9,5 a cerca de 11,5. Em uma modalidade preferencial, o pH da composição está na gama de cerca de 10,5 para cerca de 11,5, e de preferência o pH é de cerca de 11. A quantidade de agentes de tamponamento pode ser entre cerca de 1 mM e cerca de 1 M, por exemplo.

[0093] Em conformidade com determinadas modalidades, a composição compreende beta-alanina como o principal agente de tamponamento para manter o pH dentro do intervalo desejado de cerca de 9,5 a cerca de 11,5. Para manter o pH em cerca de 11, um tampão pode ser selecionado da Tabela 3 com um pKa na gama de 10-12. É interessante notar que os agentes quelantes de carboxilato, tais como o CDTA e EDTA, também pode contribuir para a capacidade de tamponamento nesta gama. No entanto, os valores de pKa (k4) do CDTA e EDTA (Tabela 2) diferem significativamente. O baixo valor de pKa (k4) de EDTA (Tabela 2) torna potencialmente útil para ajudar a manter a presente composição na extremidade inferior da gama de pH desejada. No entanto, o maior valor de pKa (k4) de CDTA torna mais adequado para reforçar a capacidade de tamponamento da beta- alanina (ou outros tampões listados na Tabela 3) na extremidade superior da faixa desejada (ou seja, pH 11).Tabela 3. Tampões adequados da presente composição

[0094] β-alanina é um tampão particularmente adequado para as composições do presente pedido. Em uma modalidade, o pH da composição é de cerca de 10,5 a cerca de 11,5, e a β-alanina está presente em uma quantidade de cerca de 10 mm a cerca de 100 mM, ou cerca de 30 mM a cerca de 70 mM e mais, de preferência em uma quantidade de cerca de 50 mM.

[0095] O termo "solúvel em água" ou "solvente orgânico miscível em água" como usado neste documento será entendido como se referindo a uma substância ou contendo carbono ou composto, geralmente um líquido, que se dissolve um soluto, um líquido sólido ou gás quimicamente diferente. Um solvente orgânico solúvel em água pode ser, por exemplo, um ou mais alcanóis de cadeia curta (por exemplo, C1- C6) que podem ser de cadeia linear ou ramificada, como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, n-butanol, pentanol, hexanol ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade da presente composição, o álcool preferencial é etanol. Em outra modalidade, o solvente orgânico solúvel em água (por exemplo, etanol) está presente na composição em uma concentração inferior a cerca de 30% em volume, preferencialmente inferior a cerca de 24% em volume, como de cerca de 21,5% a cerca de 23,5% em volume, mais preferencialmente cerca de 23,5% em volume. Em outras modalidades, o solvente orgânico miscível em água pode estar ausente.

[0096] Geralmente, na técnica, sabe-se que mais de 30% de etanol é necessário para desnaturar a maioria das proteínas. Mais de 60% de etanol ou 50% de isopropanol é necessário para precipitar o DNA da solução. Etanol ou metanol absoluto é comumente usado como um fixador em histologia, patologia e biologia celular para finalizar as reações bioquímicas. Algumas proteínas podem ser precipitadas pela adição de solventes orgânicos miscíveis em água, como etanol e acetona, com variação de 20 a 50% (vol./vol.). O etanol provoca a desidratação de proteínas ou uma redução na atividade da água, seguida pela atração eletrostática entre proteínas, agregação e insolubilização. Embora não desejem estar vinculados pela teoria, os inventores acreditam que a porcentagem relativamente pequena de solventes orgânicos miscíveis em água na presente composição tem pouca ou nenhuma propriedade do fixador, mas facilita a mistura e a dispersão da amostra biológica (por exemplo, fecal) e melhora a solubilidade de outros compostos químicos que podem ser incluídos na presente composição. Além disso, para transferência/transporte de líquidos inflamáveis, é desejável manter solventes orgânicos, como etanol, abaixo de 24% em volume em soluções para isenção dos regulamentos de Transporte de Mercadorias Perigosas (Nações Unidas (ONU) número 1170); caso contrário uma solução com > 24% de etanol é classificada como classe 3 (líquidos inflamáveis), embalagem especiais é obrigatória e a complexidade do transporte e os custos aumentam.

[0097] O termo "detergente" ou "surfactante" usado neste documento entendido como se referindo a qualquer composto orgânico que é anfifílico, pode romper ligações não covalentes em proteínas, desnaturando-as e fazendo que as moléculas percam suas estruturas secundárias, terciárias e/ou quaternários nativas. Um detergente adequado pode ser, por exemplo, um detergente aniônico, (como, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), dodecil sulfato de lítio, lauril sulfato de sódio (SLS), lauril sulfato de amônio), um detergente catiônico (sais quaternários de amônio como, por exemplo, brometo de cetrimônio/brometo de cetiltrimetilamônio/brometo de hexadecil-trimetil-amônio ou CTAB, cloreto de cetiltrimetilamônio (CTAC), cloreto de cetilpiridínio (CPC), cloreto de benzalcônio (BAC)), surfactante zwitteriônico (por exemplo, betaínas 3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-1-propano sulfonato (CHAPS), lecitina) ou um detergente não-iônico (como, por exemplo, Tween, Triton X ou Brij). CTAB, no entanto, é menos ideal quando se trabalha com DNA. Os detergentes podem inibir a ação de DNase destruindo a estrutura complexa dessas enzimas, facilitar a dispersão da amostra biológica na presente composição e ajudar a solubilizar uma variedade de espécies químicas. Em determinadas modalidades da composição, o detergente é SDS. Em outras modalidades, o detergente (p.ex., SDS) pode estar presente na composição aquosa em uma quantidade de cerca de 0-4% (p/v), preferencialmente cerca de 0-1% (p/v), mais preferencialmente cerca de 0,5% (p/v).

[0098] O termo "agente antiespuma" ou "antiespumante" usado neste documento será entendido como se referindo a um aditivo químico que reduz ou impede a formação de espuma. Os inventores observaram que a formação de espuma durante a agitação vigorosa precisava dispersar rápida e inteiramente algumas amostras biológicas, em particulares fezes, em um tubo contendo certas modalidades da presente composição, compreendendo um detergente. A referida espuma prejudicou e, em algumas amostras, impediu a mistura completa, com e sem um meio de homogeneização. Agentes antiespumantes, como Concentrado Antiespumante A (Sigma-Aldrich; Cat. N° A-5633), um polímero de silicone ativo, reduziu significativamente a formação de espuma durante a referida mistura de amostra biológica e a presente composição. Assim, o agente antiespumante deve, preferencialmente, ser incluído em composições contendo detergente para minimizar a formação de espuma. Outros exemplos de agentes antiespumantes apropriados que podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com dois ou mais incluem óleos insolúveis, polidimetilsiloxanos e outros silicones, certos álcoois, estearatos e glicóis. Em outras modalidades, o agente antiespumante (p.ex. Antiespumante A) pode estar presente na composição aquosa em uma quantidade de cerca de 0-1% (v/v), preferencialmente cerca de 0-0,2% (v/v).

[0099] O termo "agente antimicrobiano" usado neste documento será entendido como se referindo a uma substância ou grupo de substâncias que reduz a taxa de crescimento de um organismo, em comparação com a taxa de crescimento do organismo na sua ausência. Uma redução na taxa de crescimento de um organismo pode ser pelo menos 5%, mais desejavelmente, pelo menos, 10%, ainda mais desejável pelo menos 20%, 50% ou 75% e mais desejavelmente, em 90% ou mais. A definição também se estende a substâncias que afetam a viabilidade, virulência ou patogenicidade de um organismo. Um agente antimicrobiano pode ser natural (por exemplo, derivado de bactérias), sintético ou recombinante. Um agente antimicrobiano pode ser bacteriostático, bactericida, ou ambos. Um agente antimicrobiano é bacteriostático se inibir a divisão celular, sem afetar a viabilidade da célula inibida. Um agente antimicrobiano é bactericida se causar morte celular. A morte celular é comumente detectada pela ausência do crescimento de células em um meio de crescimento líquido (por exemplo, ausência de turbidez) ou em uma superfície sólida (por exemplo, ausência de formação de colônia em ágar). Aqueles versados na técnica sabem que uma substância ou um grupo de substâncias que é bacteriostático em uma dada concentração pode ser bactericida em uma concentração mais elevada. Agentes antimicrobianos comuns conhecidos na técnica incluem certos álcoois, Triclosan ou Irgasan e Proclin 950. Opcionalmente, a presente composição pode incluir agente antimicrobiano como Triclosan. Em outras modalidades, o agente antimicrobiano (p.ex. Triclosan) pode estar presente na composição aquosa em uma quantidade de cerca de 0-2% (p/v), preferencialmente cerca de 0-0,5% (p/v).

[00100] As composições descritas neste documento, quando misturadas com uma amostra biológica, em particular uma amostra fecal, estabilizam os ácidos nucleicos ali contidos em temperatura ambiente de modo que os ácidos nucleicos sejam estabilizados no armazenamento da mistura homogeneizada por longos períodos de tempo.

[00101] Em uma modalidade, a amostra biológica é uma amostra fecal obtida de um sujeito humano e o ácido nucleico é o DNA.

[00102] Aqueles versados na técnica irão apreciar que a presença de DNA de peso molecular alto em uma amostra pode dar uma indicação geral de estabilização do DNA na amostra nas condições de armazenamento. Isto pode ser avaliado pela eletroforese em gel de agarose, que pode fornecer uma indicação da qualidade do DNA de peso molecular elevado (por exemplo, banda ondulada versus manchas) bem como uma medida quantitativa da quantidade de DNA de peso molecular elevado (por análise de densitometria).

[00103] Além de estabilizar o DNA de peso molecular elevado, as composições descritas neste documento, quando misturadas com uma amostra biológica, em particular uma amostra fecal, estabilizam ácidos nucleicos ali contidos em temperatura ambiente, de modo que a abundância relativa de ácidos nucleicos microbianos e/ou humanos seja mantida no armazenamento da mistura homogeneizada por longos períodos de tempo. Um número de técnicas conhecidas pelos versados na técnica pode ser usado para determinar se a abundância relativa de ácidos nucleicos microbianos e/ou humanos é mantida, por exemplo, técnicas que utilizam a amplificação ou hibridização de ácidos nucleicos. Outra técnica que pode ser usada para avaliar se a abundância relativa de ácidos nucleicos microbianos e/ou humanos é mantida no armazenamento da mistura homogeneizada por longos períodos de tempo é a análise de PCR-DGGE, descrita com mais detalhes abaixo. Os perfis 16S perfis direcionados (para determinar a abundância relativa de unidades taxonômicas operacionais (OTUs)) bem como o sequenciamento shotgun metagenômico completo de DNA genômico (WMS; para determinar a abundância relativa de genes microbianos/ácidos nucleicos ácidos) também podem ser usados.

[00104] Em uma modalidade exemplar, a estabilização do DNA humano em particular pode ser avaliada determinando se o DNA obtido das amostras biológicas, como amostras fecais, incubado com as composições e de acordo com os métodos descritos neste documento por um período de tempo (tarmazenamento) mantém a capacidade de suporte de amplificação por PCR de um gene humano alvo em um produto detectável e, mais particularmente, se o nível de amplificação do produto de PCR é similar ao do DNA extraído e purificado da mesma mistura homogênea ou de outra mistura de controle no tempo zero. Como descrito ainda nos Exemplos abaixo, o DNA humano purificado de amostras fecais incubadas com as composições e de acordo com os métodos aqui descritos T=0 e T=tarmazenamento pode ser amplificado em tempo real, por PCR quantitativa (qPCR) usando iniciadores que direcionam um gene humano e a alteração nos valores de Ct (ΔCt) resultantes de T=0 e T=tarmazenamento alíquotas de DNA purificadas pode fornecer uma medida quantitativa da estabilidade do DNA humano. Um valor de Ct inferior a cerca de 2 indica que o DNA humano ficou estável durante o período de tempo do armazenamento. Um valor de Ct inferior a cerca de 1 é indicativo de estabilização excelente.

[00105] Em uma modalidade, o DNA humano contido em uma amostra fecal incubada com as composições e de acordo com os métodos aqui descritos ficou estável em temperatura ambiente por pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 21 dias, pelo menos 30 dias ou pelo menos 60 dias. Em outra modalidade, o DNA humano contido em uma amostra fecal incubada com as composições e de acordo com os métodos aqui descritos ficou estável em temperaturas elevadas, tais como 37°C ou 50°C por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias. Ainda em outra modalidade, o DNA humano contido em uma amostra fecal incubada com as composições e de acordo com os métodos aqui descritos ficou estável em -20°C por pelo menos um mês (isto é, 30 dias).

[00106] Em outra modalidade, o ácido nucleico é o DNA microbiano e o método estabiliza um perfil de microbioma da amostra biológica (por exemplo, amostra fecal). Como usado neste documento, o termo "perfil de microbioma" se refere, geralmente, à comunidade microbiana total e às biomoléculas em um ambiente definido e seus valores relativos.

[00107] Como descrito com mais detalhes abaixo, a estabilidade de um perfil de microbioma pode ser determinada, por exemplo, pela realização de PCR em DNA que foi extraído e purificado a partir de misturas homogêneas da amostra biológica e composições aqui descritas após armazenamento de misturas homogêneas em temperatura ambiente por um período de tempo específico (tarmazenamento), usando pares de iniciador que direcionam genes de rRNA 16S bacteriano e análise de Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação (DGGE). Aqueles versados na técnica apreciarão que outros genes bacterianos com regiões variáveis e não variáveis podem ser direcionados, desde que haja diferença entre as espécies de interesse. O perfil de PCR-DGGE é então comparado com aquele obtido pela realização das análises de PCR-DGGE da mesma maneira no DNA que foi extraído e purificado a partir da mesma mistura homogênea ou de outra mistura de controle da amostra biológica e composições no tempo zero. Em uma modalidade, um perfil de microbioma de uma amostra biológica como uma amostra fecal pode ser considerado como tendo sido estabilizado em temperatura ambiente por um determinado período de tempo (tarmazenamento) se o perfil de PCR-DGGE após (tarmazenamento) em temperatura ambiente exibir pelo menos 75% de similaridade com o perfil de PCR-DGGE em T=0 e mais preferencialmente pelo menos 82% de semelhança com o perfil em T=0.

[00108] Em outra modalidade, a estabilidade de um perfil de microbioma pode ser determinada, por exemplo, pela amplificação e sequenciamento de uma região variável do gene 16S rRNA bacteriano (como a região hipervariável V4) do DNA que foi extraído e purificado a partir de misturas homogêneas da amostra biológica e composições descritas neste documento após armazenamento das misturas homogêneas em temperatura ambiente por um determinado period de tempo. As informações do sequenciamento resultante são então comparadas àquelas obtidas pela realização de amplificação e sequenciamento da região variável do gene 16S rRNA bacteriano da mesma maneira no DNA que foi extraído e purificado a partir da mesma mistura homogênea no tempo zero ou outro controle. Várias formas de análise de bioinformática dos dados de sequenciamento obtidos conhecidos pelos versados na técnica podem ser usadas para avaliar a estabilidade do microbioma em condições de armazenamento, como mais detalhado nos Exemplos.

[00109] Em uma modalidade, o perfil de microbioma de uma amostra fecal incubada com as composições e de acordo com os métodos aqui descritos ficou estável em temperatura ambiente por pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 21 dias, pelo menos 30 dias ou pelo menos 60 dias. Em outra modalidade, o perfil de microbioma de uma amostra fecal incubada com as composições e de acordo com os métodos aqui descritos ficou estável em temperaturas elevadas, tais como 37°C ou 50°C por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias. Ainda em outra modalidade, o perfil de microbioma de uma amostra fecal incubada com as composições e de acordo com os métodos aqui descritos ficou estável em -20°C por pelo menos um mês (isto é, 30 dias).

[00110] Os inventores constataram surpreendentemente que concentrações extraordinariamente altas de um agente quelante menos comumente usado, CDTA, tamponou para pH alcalino (pH >9.5, preferencialmente pH 11), podem ser usadas capturar e estabilizar com rapidez e eficácia o ácido nucleico e perfis de DNA totais "snapshot" em amostras biológicas em temperatura ambiente por períodos prolongados.

[00111] Em particular, os inventores verificaram surpreendentemente que composições tamponadas para um pH alcalino mais forte pH cerca pH 10,5-11,5, preferencialmente cerca pH 11) mostraram uma estabilidade aprimorada do DNA de microbioma em relação à estabilização de composições tamponadas para valores de pH mais baixos. Isto não poderia ter sido previsto e, de fato, foi inesperado, tendo em conta o disposto a seguir. É geralmente conhecido que com pH mais elevado, a desaminação da citosina será acelerada. DNA é conhecido também por desnaturar mais rapidamente em um pH mais elevado. Sítios apurínicos no DNA (que ocorrem com baixa frequência) também serão clivados mais prontamente. Assim, é surpreendente que os inventores observaram que os perfis de DNA/microbioma parecem ser mais estáveis, com base na eletroforese em gel de agarose, sequenciamento de gene 16S rRNA bacteriano e DGGE com valores de pH mais elevados.

[00112] Sem estar vinculado pela teoria, acredita-se que a razão para a estabilidade aprimorada aparente não é puramente "química". Ou seja, o pH alcalino mais forte mostra uma estabilidade aprimorada do DNA de microbioma para talvez uma combinação de razões, sendo que algumas delas são sugeridas abaixo.

[00113] Observa-se que o CDTA funciona muito melhor do que EDTA nas composições aqui descritas para a estabilização do DNA/microbioma. Os 4 pKas para EDTA e CDTA são mostrados na Tabela 2 acima. Com base nesses valores, isto significa que, em pH alcalino, CDTA terá 3 cargas negativas, enquanto que EDTA terá 4 cargas negativas já que o pH se aproxima de 11. Novamente, sem estar vinculado pela teoria, acredita-se que, talvez, a razão para um desempenho muito melhor do CDTA, em comparação com EDTA, se deve à carga negativa mais baixa.

[00114] O objetivo em um estudo de Microbioma é estabilizar e, eventualmente, liberar DNA de todas as células em igual proporção, preferencialmente 100% do DNA de 100% das células. A estabilidade do "perfil" do DNA liberado pode ser melhor com o pH mais elevado porque pode se aproximar mais de alcançar este objetivo. Em outras palavras, a maior extensão de DNA bacteriano pode ser estabilizado e eventualmente liberado com pH 11 em comparação com pH 9,5.

[00115] Uma vez que o DNA é liberado, ele precisa ser protegido da degradação pela DNase nas amostras fecais. Algumas DNases requerem íons metálicos como cofatores; outras não. Novamente, sem estar vinculado pela teoria, é possível que o pH mais elevado possa ser mais eficaz na inibição da segunda classe de DNase.

[00116] Fatores desconhecido (por exemplo, inibidores) nas fezes podem se ligar ao DNA e sequestrá-lo ou bloquear a amplificação por PCR. É possível que o pH mais elevado pode aliviar uma ou ambas possibilidades.

[00117] Finalmente, o crescimento de bactérias deve ser evitado após a coleta das amostras de fezes em composições de estabilização. Caso contrário, o 'Perfil' de DNA/microbioma mudará. O pH mais elevado pode ser mais eficaz em inibir o crescimento de algumas espécies microbianas do que o pH mais baixo (9,5).

[00118] Para tipos de amostras complexas, altamente variáveis, sólidas e semissólidos, como as fezes, é necessário fornecer também um meio físico ou mecânico de misturar imediatamente as amostras com a composição no ponto de coleta. A rápida homogeneização e o rompimento completo da amostra biológica recém-coletada na presente composição garante a estabilização de um snap-shot representante de perfis de DNA total na amostra por períodos de tempo prolongados em temperatura ambiente. Como ilustrado nos Exemplos abaixo, se a presente composição for adicionada a uma amostra de fezes sólidas coletadas, mas não adequadamente misturadas, a qualidade do DNA é comprometida em relação às amostras que são misturadas até a homogeneidade. A mistura adequada das amostras é, portanto, fundamental para estabilizar o DNA de modo que seja representativo do estado in vivo (T=0). Por exemplo, o DNA extraído dessas amostras, seguido por eletroforese em gel de agarose, pode mostrar degradação de DNA de peso molecular elevado em amostras de alguns doadores. Além disso, como visto nos Exemplos abaixo, a mistura inadequada das amostras de fezes de alguns doadores resulta em alterações prejudiciais do perfil de microbioma, medido com PCR de 16S rRNA bacteriano e análise de DGGE.

[00119] Em muitos casos, a coleta de amostra biológica, em particular coleta de fezes, é melhor realizada por doadores na privacidade do seu próprio lar. Neste cenário, o doador é mais confortável e, se for fornecida instruções e um dispositivo de coleta de amostra biológica apropriado ou kit contendo uma química ou solução de estabilização, o doador pode coletar imediatamente e estabilizar as amostras biológicas frescas. A coleta de amostras dessa maneira ajuda a garantir melhor qualidade de ácido nucleico para extração posterior e análise, com os perfis de DNA correspondendo ao máximo ao estado in vivo. No entanto, para coletar e estabilizar uma amostra biológica em casa ou em local de coleta de campo remoto deve ser apresentado ao doador um meio simples, seguro e intuitivo, mas altamente eficaz de misturar manual ou fisicamente sua amostra coletada com solução de estabilização própria. De preferência, este meio de mistura é barato e não requer eletricidade, equipamentos ou treinamento especializado.

[00120] O DNA pode se degradar rapidamente em amostras biológicas (por exemplo, fezes) após a exposição ao ar, se não for misturado com uma solução de estabilização, ou quando não for imediatamente congelado em gelo seco no ponto de coleta. Com amostras biológicas líquidas e homogêneas, como sangue e urina, a mistura não é uma questão importante; no entanto, o rompimento de amostras biológicas homogêneas sólidas e semissólidas, como fezes, em uma quantidade limitada de solução e tempo podem ser extremamente problemáticos. Através de muita experimentação com vários meios de mistura (por exemplo, partículas de vidro/sílica (< 1 mm; 2,65 g/cm3), grânulos de vidro/sílica (2-4mm; 2,65 g/cm3),mármores (12,7 mm), esferas de óxido de alumina (7,9 mm; 3,95 g/cm3) e esferas de nitreto de silício (7,1-7,9 mm; 3,21 g/cm3), os inventores verificaram que completa ruptura e homogeneização de todos os tipos de amostras de fezes (1-7 na Escala Fecal de Bristol), colhidas de forma padrão, comercialmente disponíveis em tubos de laboratório ou de transporte (por exemplo, tubo Sarstedt de fundo redondo de 10 mL (92 x 15.3 mm), Cat. N° 60.610) contendo a presente composição pode ser obtido por simples mistura a mão com a inclusão no tubo de pelo menos uma esfera de metal grande (5,611,1 mm, preferencialmente 7,9 mm), densa (7,6-15,63 g/cm3) menor que o diâmetro interno do tubo (por exemplo, 12,9 mm).

[00121] Os inventores determinaram a seleção ideal de um meio de homogeneização para um tubo de laboratório padrão comercialmente disponível, que inclui: 1) correspondência entre o formato do tubo (por exemplo, fundo ou base dentro do tubo) e o formato do meio de homogeneização (por exemplo, tubo de fundo redondo para um meio de homogeneização que é pelo menos uma esfera de mistura, como uma esfera de mistura de aço inoxidável) para evitar a compactação e/ou um aprisionamento de material sólido duro para alcançar áreas do tubo ou recipiente; 2) seleção do material mais denso possível para o meio de homogeneização (p.ex. carboneto de tungstênio (15,63 g/cm3), aço inoxidável (7,6-8,0 g/cm3); 3) seleção de um meio de homogeneização com diâmetro externo ligeiramente menor do que o diâmetro interno do tubo ou recipiente (por exemplo, quando o meio de homogeneização é uma esfera de mistura, a esfera de mistura teria um diâmetro de cerca de 4-6 mm, preferencialmente cerca de 4-5 mm e, mais preferencialmente, cerca de 5 mm menor que o diâmetro interno do tubo de mistura); e 4) seleção de um tubo ou recipiente com "espaço livre" acima da amostra e solução de estabilização para permitir que o meio de homogeneização ganhe impulso durante a agitação com a mão. Deve ser observado que a esfera de mistura pode ter formato regular ou irregular (por exemplo, poderia ter protuberâncias, picos, etc. e não precisa ser perfeitamente esférica) e, como mencionado acima, tem preferencialmente uma densidade de pelo menos 5,0 g/cm3, mais preferencialmente pelo menos 7,6 g/cm3.

[00122] Se o meio de homogeneização/esfera for muito pequeno em relação ao tubo, a amostra passa ao redor do meio de homogeneização/esfera sem se dispersar na solução de estabilização. Em contraste, se o meio de homogeneização/esfera for muito grande (por exemplo, > 11,1 mm) em relação ao tubo (12,9 mm de diâmetro interno), a amostra não se dispersa nem é "esmagada" entre o meio de homogeneização/esfera e as paredes do tubo, o meio de homogeneização/esfera não ganha impulso suficiente e amostra fica compactada em uma ou ambas as extremidades do tubo. Idealmente, quando o diâmetro externo do meio de homogeneização (por exemplo, esfera de 7,9 mm de carboneto de tungstênio ou aço inoxidável) libera as paredes verticais internas do tubo (por exemplo, tubo Sarstedt de 10 mL com diâmetro interno de 12,9 mm, acima) de cerca de 5 mm (2,5 mm em ambos os lados da esfera), o meio de homogeneização funciona efetivamente como um homogeneizador, quebrando e rompendo rapidamente a amostra de fezes sólidas e semissólidas (p.ex. 400 mg; tipo 1-7), coletadas na presente composição (por exemplo, 2 mL), para formar uma amostra de líquido homogêneo que pode ser rapidamente pipetada ou manipulada e processada no laboratório. Este meio de homogeneização garante que a amostra biológica coletada, até mesmo fezes sólidas, seja rápida e completamente rompida e, ao fazê-lo, seja rapidamente exposta à presente composição. É importante observar que os inventores determinaram que a densidade do meio de homogeneização, não apenas o seu diâmetro, em comparação com o tubo/recipiente, foi fundamental para conseguir a ruptura completa da amostra em tempo hábil (20-30 segundos) agitando simplesmente o tubo com a mão. Devido à natureza maleável e frequentemente pegajosa das fezes (por exemplo, tipo 4), foi difícil conseguir a homogeneização completa desta amostra em tubos de fundo plano ou fundo cônico utilizando um meio de homogeneização esférico. Portanto, um tubo de fundo redondo para um meio de homogeneização esférico tem melhor desempenho.

[00123] A presente invenção apresenta um método novo e universalmente aplicável e composição para estabilizar o DNA total em amostras biológicas não-homogêneas particularmente complexas em temperatura ambiente para uso posterior em diagnósticos médicos em humano e animal e pesquisa clínica (por exemplo, diagnóstico de doença e infecção, papel dos micróbios na saúde humana, genômica populacional para estudar a evolução do micro-organismo, virulência, resistência a drogas e epidemiologia), segurança alimentar (plantas de processamento de alimentos/carnes), amostragem de águas residuais e solo (ambiente de teste), biossegurança ou biodefesa (armas biológicas), teste de alimentação de animais, ciência/indústria vegetal e animal etc.). Um foco novo e em rápida expansão de ambos os pesquisadores e clínicos é microbiota intestinal ou microbioma intestinal. Como o perfil de micróbios nas fezes de doadores saudáveis difere do dos indivíduos doentes? A manipulação da microbioma intestinal humana pode trazer benefícios à saúde? Por razões de pesquisa, ambientais e econômicas, há também um imenso interesse na análise de milhares de micro-organismos diferentes no rúmen de muitos gados, especialmente aqueles animais que são criados com carne e produtos lácteos.

[00124] A presente invenção simplifica e agiliza a coleta e o preparo de amostra biológica, fornecendo amostras de qualidade para a detecção posterior de DNA humano, animal e microbiano sem a necessidade de manter a cadeia a frio durante o transporte ou armazenamento. A invenção pode ser usada em a) laboratórios centrais ou centros de teste com sistemas de alta produtividade ou automatizados, b) clínicas rurais ou móveis com infraestrutura laboratorial mínima e equipamentos e c) locais remotos sem eletricidade. Além disso, indivíduos doentes e potencialmente infecciosos não precisam se deslocar para clínicas ou hospitais para fornecer uma amostra biológica, minimizando a propagação de doenças infecciosas, facilitando o controle e a fiscalização do surto e permitindo a avaliação e monitoramento rápidos da resposta do paciente ao tratamento.

[00125] O sistema/kit de coleta e homogeneização fechado aqui descrito é barato para fabricar e não é necessário comprar nenhum equipamento de laboratório adicional (por exemplo, vórtice). O mais importante é que a agitação manual do tubo tampado contendo a presente composição, um ou mais esferas de homogeneização e ainda amostra de fezes duras (tipo 1-2, Escala Fecal de Bristol) pode conseguir uma ruptura completa da amostra em segundos, resultando em uma mistura homogênea. A autocoleta pelo doador reduz a propagação de infecção e a contaminação cruzada potencial com amostras de outros doadores. Notavelmente, este processo de coleta e homogeneização da amostra pode ser realizado por pessoa leiga, sem nenhuma experiência laboratorial nem clínica, na privacidade do seu lar, melhorando consideravelmente a conformidade e a participação do doador. Importante para a qualidade dos resultados dos testes a jusante, a presente invenção permite a coleta segura e a estabilização de amostras biológicas "frescas", reduzindo drasticamente a degradação observada durante o trânsito de amostras biológicas brutas ou não tratadas para centros de testes e/ou em condições de armazenamento variáveis.

[00126] Fundamentalmente, a presente invenção fornecerá aos pesquisadores e clínicos amostras biológicas representativas que precisem ser desesperadamente estabilizadas das DNA imparcial pode ser extraído. A entrada de DNA imparcial, isto é, snapshot representativo da microbioma intestinal no ponto de coleta da amostra, melhorará a qualidade e a precisão das análises a jusante, permitirá avaliações comparativas mais precisas de diferenças entre e intra sujeitos, bem como diferenças entre estudos para estudar as variações nas comunidades microbianas intestinais humanas, na saúde e na doença. O DNA intacto, imparcial, rico, de peso molecular elevado é fundamental para a construção da biblioteca de metagenômica e a caracterização de vias genéticas intactas por abordagens baseadas em sequência ou baseadas em triagem funcional. Além disso, a degradação excessiva do DNA em amostras biológicas reduz a eficiência do sequenciamento shotgun.

[00127] Apenas nos últimos anos que foi dada significativa atenção à composição filogenética de DNA extraído de fezes, em relação à comunidade bacteriana, em fezes frescas. É prática comum, principalmente por razões práticas, congelar amostras de fezes após a coleta e, após um período de tempo altamente variável, extrair o DNA para análise a jusante, como sequenciamento ou PCR quantitativa (qPCR). Fundamentalmente, no entanto, entre e em estudos publicados parece existir variabilidade considerável em: 1) período de tempo entre a defecação e o congelamento de fezes "frescas"; 2) condições e duração do transporte; 3) período de tempo em que as fezes ficaram congeladas antes da análise; 4) período de tempo e temperatura usada para descongelar as fezes congeladas; e 5) tempo variável da coleta antes da primeira alíquota ser isolada e processada para DNA. Nestes estudos, T=0 representa o momento em que essas amostras coletadas, congeladas e frequentemente armazenadas foram descongeladas para processamento, não o momento da defecação.

[00128] No entanto, estudos metagenômicos da microbiota humana demonstraram claramente que as condições de armazenamento das amostras de fezes podem afetar negativamente a composição inferida da comunidade. Por exemplo, Bahl et al. (2012), demonstraram,usando qPCR e 6 pares de iniciador diferentes que direcionam genes 16S rRNA de grupos bacterianos significantes, que o congelamento das amostras de fezes a -20°C para 53±5 dias antes da extração afetou a razão entre os dois filos mais predominantes, ou seja, Firmicutes e Bacteroidetes, um biomarcador frequentemente usado na microbiologia do intestino. Especificamente, a razão do gene 16S rRNA entre Firmicutes e Bacteroidetes foi significativamente maior em amostras fecais que foram congeladas, em comparação com amostras idênticas que não foram. É desesperadamente necessário um meio de captura ou snapshot de pelo menos três aspectos principais da comunidade microbiana original ou in vivo em amostras de fezes coletadas, estabilizando i) a abundância de cada micróbio, ii) a riqueza da comunidade inteira e iii) perfis totais de DNA microbiano.

[00129] A estabilização (e extração) eficiente e imparcial extração do DNA bacteriano genômico total das amostras fecais complexas é uma primeira etapa crucial para estudos de base molecular da comunidade bacteriana no intestino, por exemplo, gerando perfis de microbioma que representam o estado in vivo do doador. Em particular, o estudo de comunidades microbianas requer a captura de um "snapshot" do perfil de microbiota imediatamente após a coleta. Fica claro que a coleta de campo atual de amostras fecais é impraticável, cara e não escalável (McInnes & Cutting, 2010).Também é bem conhecido no campo que problemas relacionados à coleta de amostra causam resultados inconsistentes e baixa reprodutibilidade. Além disso, manipulação de amostras sólidas apresenta um desafio para automação, aumentando o custo e limitando o tamanho de estudos longitudinais.

[00130] Para eliminar fortes tendências entre e dentro de estudos de laboratórios, há uma necessidade de desenvolver e implementar um método padronizado ou universal para a coleta e estabilização de amostras biológicas no ponto de coleta, antes de serem submetidas a temperaturas desfavoráveis e muitas vezes extremas durante o transporte e o armazenamento prolongado. O presente método de homogeneização de amostras biológicas, em particular, amostras altamente variáveis no tipo, complexas e não-homogêneas, que variam de líquido a sólidos duros, em uma composição de estabilização de DNA eficaz no ponto de coleta de amostra, garante a máxima integridade do DNA na amostra inteira, representando o máximo possível o estado in vivo.

[00131] Atualmente, muitos estudos recrutam doadores para coletar amostras de fezes e não fornecem nenhum meio de estabilização nem exigem o uso de gelo durante o transporte. O Projeto Microbioma Humano (Human Microbiome Project) (HMP), um programa iniciado de acordo Estratégias do National Institutes of Health (NIH), patrocina estudos para caracterizar a microbioma humana e analisar o seu papel na saúde e na doença humana. Todos os membros que participam do estudo de Amostragem de Microbioma Nuclear do HMP devem seguir o Manual de Procedimentos (McInnes & Cutting, 2010) que descreve, entre outros, coleta de amostras do trato GI (vide seção 7.3.3). São fornecidos aos sujeitos um kit de coleta de fezes e é solicitado que coletem amostras de fezes em um período de 24 horas antes de trazer as amostras de volta à clínica. Os kits do HMP incluem dois recipientes de coleta de fezes (um é de reserva) que se parecem potes grandes de margarina, um recipiente para transporte Thermosafe (uma caixa grande de isopor dentro de uma caixa de papelão), 8-10 polar packs para o transporte da amostra (em cerca de 4°C), instruções, etiquetas e outros materiais de acondicionamento. Antes de coletar uma amostra, os sujeitos devem colocar as bolsas de gel no freezer por pelo menos 12 horas. As fezes são depositadas diretamente no recipiente de coleta, a tampa é aplicada e o recipiente inteiro é vedado com um saco Ziplock, antes ser acondicionado na caixa de isopor, completamente cercada por 8-10 bolsas de gel congeladas. A caixa de isopor é fechada, vedada dentro de uma caixa de papelão, o sujeito transporta este pacote volumoso até o laboratório clínico.

[00132] Os requisitos de cadeia a frio existente para transporter amostras frescas embaladas em gelo ou gelo seco, vedadas em isopor volumoso e recipientes de papelão/refrigeradores são muito dispendiosos e até mesmo proibitivos para os investigadores que estão conduzindo os estudos necessitando de números moderados a grandes de doadores. Simplesmente, o transporte de um recipiente de coleta de fezes comercialmente disponível, rodeado por bolsas de gelo congeladas, em um recipiente de isopor, dentro de uma caixa de transporte de papelão ou over-pack (16x13x14 polegadas) custa aproximadamente US$ 175 cada usando o serviço de entrega UPS Next Day nos Estados Unidos. Esta estimativa não leva em consideração o custo do recipiente de coleta de fezes e os materiais de transporte. Além disso, muitos centros de teste exigem que as amostras biológicas sejam enviadas em gelo seco o que adiciona custo considerável a esta estimativa de transporte. Uma vez que o laboratório recebe estes recipientes de transporte grandes, a equipe deverá desempacotar imediatamente e processar rapidamente as amostras biológicas ou colocar os recipientes de coleta em congeladores de armazenamento grandes até que o processamento em lote possa ser realizado. Em contraste, a presente invenção alivia a maior parte do custo de transporte atual e inconveniência e, mais importante, garante que o DNA nas amostras biológicas coletadas seja estabilizado no ponto de coleta em temperatura ambiente. Segundo perspectiva do doador, a amostra biológica é coletada na privacidade do seu lar, uma pequena porção da amostra é transferida para um tubo ou recipiente familiar que já contém solução de estabilização, uma tampa é aplicada ao tubo e agitada com a mão para misturar, o tubo é vedado em um saco de risco biológico e enviado para o centro de testes em um envelope bolha ou caixa pequena por uma fração do custo atual.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS

[00133] Os seguintes materiais e métodos gerais são usados nos Exemplos que se seguem, exceto se condições diferentes forem especificadas.

Coleta de Amostras de Fezes

[00134] Foram dados os seguintes suprimentos para coleta a doadores saudáveis: a) um recipiente de coleta de fezes (senta-se no vaso sanitário; b) uma seringa para coleta volumétrica de fezes de cerca de 400 mg (isto é, seringa de 3 mL com ponta cortada, êmbolo ajustado para volume de coleta de 400 mg); c) um tubo Sarstedt de 10ml de fundo redondo (92 x 15,3 mm), Cat. N° 60.610) contendo a presente composição (2 mL) e vários meios de homogeneização (por exemplo, rolamento de esferas de aço inoxidável de 7,9 mm, 420/440 SS Grau 25, Aimark Travers LTD ou outros mencionados abaixo); e d) instruções para coleta de fezes. Os tubos foram pesados antes e depois da coleta para determinar a quantidade real da amostra de fezes coletada. Foi pedido a cada doador para preencher a ponta da seringa com fezes até o volume marcado (400 mg) e transferir a amostra de fezes para o tubo. Para homogeneização completa das amostras, os tubos foram agitados com a mão por 20-30 segundos.

Extração de DNA das Amostras de Fezes na Presente Composição

[00135] Salvo indicação em contrário, 400 mg de fezes foram transferidos para um tubo Sarstedt (tubo de 10mL de fundo redondo tubo (92x15,3 mm), Cat. N° 60.610) contendo 2 mL da presente composição (especificada nos Exemplos abaixo) e um rolamento de esferas de aço inoxidável de 7,9 mm. O DNA foi prontamente extraído de alíquotas de 250 μL das amostras de fezes coletadas e armazenadas na presente composição utilizando vários kits de isolamento de DNA comercialmente disponíveis. Foi constatado que as amostras de fezes nas presentes composições são compatíveis com o Kit de Isolamento de DNA PowerSoil® (MO BIO Laboratories, Inc., Cat. N° 12888-100), Kit de Isolamento de DNA PowerFecalTM (MO BIO Laboratories, Inc., Cat. N° 12830-50), MiniPrep de DNA Fecal Zymo Research incorporando bead beater (Zymo, Research Cat. N° D6010), Minikit de Fezes QIAamp (Qiagen, Cat. N° 51504) e Kit Plus DNA Fezes PSP Spin (Invitek, Cat. N° 1038110200).

[00136] De acordo com as Instruções do Kit de Isolamento de DNA PowerFecal®, o procedimento a seguir foi seguido [Nota: a etapa de aquecimento de 65°C foi eliminada]:

[00137] 1. Foram adicionados ao tubo PowerBead fornecido, μ750 Lde solução de esfera e 250 μL de amostra de fezes na presente composição. O tubo foi gentilmente submetido a vórtice para misturar.

[00138] 2. 60μL da solução C1 foram adicionados e o tubo foi invertido várias vezes ou brevemente submetido a vórtice.

[00139] 3. O tubo PowerBead foi fixado no adaptador de vórtice e submetido a vórtice por 10 minutos em velocidade máxima.

[00140] 4. O tubo PowerBead foi centrifugadas a 10.000 x g por 30 segundos.

[00141] 5. O sobrenadante foi transferido para um tubo de coleta de 2 mL limpo (fornecido).

[00142] 6. 250 μL de Solução C2 foram adicionados e o tubo foi submetido a vórtice por 5 segundos e, em seguida, foram incubados a 4°C por 5 minutos.

[00143] 7. O tubo de coleta foi centrifugado em temperature ambiente por 1 minuto em 13.000 x g.

[00144] 8. Evitando pelota, no máximo 600 μL de sobrenadante foram transferidos para um tubo limpo de 2 mL.

[00145] 9. 200 μL de Solução C3 foram adicionados e o tubo foi submetido a vórtice brevemente e, em seguida, foram incubados a 4°C por 5 minutos.

[00146] 10. O tubo de coleta foi centrifugado em temperature ambiente por 1 minuto em 13.000 x g.

[00147] 11. Evitando pelota, no máximo 750 μL de sobrenadante foram transferidos para um tubo limpo de 2 mL.

[00148] 12. A Solução C4 foi misturada antes do uso. 1200μL de Solução C4 foram adicionados ao sobrenadante e o tubo foi submetido a vórtice por 5 segundos.

[00149] 13. 675μL foram carregados em um Filtro Rotativo e centrifugados a 13.000 x g por 1 minuto. O fluxo foi descartado e 675μL adicionais de sobrenadante foram adicionados ao Filtro Rotativo e foram centrifugados a 13.000 x g por 1 minuto. O sobrenadante restante foi carregado no Filtro Rotativo e foi centrifugado a 13.000 x g por 1 minuto.

[00150] 14. 500μL de Solução C5 foram adicionados ao Filtro Rotativo e foram centrifugados em temperatura ambiente por 30 segundos a 13.000 x g. O fluxo foi descartado.

[00151] 15. A centrifugação foi realizada novamente em temperatura ambiente por 1 minuto a 13.000 x g.

[00152] 16. O filtro rotativo foi cuidadosamente colocado em um tubo de coleta de 2 mL limpo (fornecido).

[00153] 17. 100μL de Solução C6 foram adicionados ao centro da membrana de filtro branco.

[00154] 18. O tubo de coleta foi centrifugado em temperature ambiente por 30 segundos em 13.000 x g.

[00155] 19. O DNA foi armazenado congelado (-20 a -80°C).

Determinação da Concentração de DNA em Amostras Purificadas A. Determinação de Absorvância da Concentração de DNA

[00156] A medição da absorvância a 260 nm (A260nm) é comumente usado para quantificar DNA. Uma absorvância de 1,0 a 260 nm corresponde a uma concentração de 50 ng/μL para DNA de fita dupla puro. Os rendimentos de DNA das amostras de fezes, tratadas com ou sem as presentes composições em diversas condições, foram determinados utilizando espectrofotômetro NanoDrop 2000C (Thermo Fisher Scientific Inc.). Um volume de 2 μL de cada amostra de DNA foi colocado no pedestal e digitalizado de 220 nm a 350 nm com absorvâncias medidas a 230 nm, 260 nm e 280 nm. A concentração de DNA da amostra (ng/μL), razão A260/A280280 e razão A260/A230 foram relatadas pelo software NanoDrop 2000 c. O rendimento total do DNA por amostra foi calculado pela multiplicação da concentração da amostra pelo respectivo volume de eluição do DNA.

B. Determinação Fluorométrica da Concentração de DNA

[00157] As desvantagens do uso de A260nm incluem (i) insensibilidade do ensaio e (ii) a interferência por componentes de não-DNA, como o RNA, particularmente em amostras que não sejam altamente purificadas.

[00158] Os rendimentos de DNA das amostras purificadas também foram quantificados usando corante fluorescente PicoGreen® (200x; Invitrogen, Cat. N° P7581); DNA Lambda (Invitrogen, Cat. N° 25250010) foram usados para gerar uma curva padrão [em triplicado; 0-50 ng/μL]. PicoGreen® é um corante de ligação de DNA de fita dupla fluorescente (Excitação de 485 nm/Emissão de 535 nm) que permite a quantificação sensível das quantidades de subnanograma de DNA de fita dupla (dsDNA). As alíquotas em triplicado de cada amostra purificada e padrões de DNA Lambda foram processados em uma microplaca de 96 poços de fundo plano preta (Greiner Bio-One, Cat. N° 655209) e a fluorescência foi medida utilizando um leitor de microplacas Infinite M200 (TECAN).

Integridade do DNA nas Amostras Armazenadas em Composições de Estabilização

[00159] Uma alíquota de cada amostra purificada foi diluída em 10 ng/μL, com base na concentração determinada por PicoGreen (acima). Para avaliar a integridade do DNA, aproximadamente 80 ng de cada amostra de fezes diluído purificada e diluída foram separados em gel de agarose de 1% por eletroforese por 30 minutos em 100 volts. O gel foi corado em 1 μg/mL de brometo de etídio (EtBr) em água destilada por 15 minutos em temperatura ambiente, lavado e fotografado em um transiluminador UV usando um sistema de geração de imagens DigiDoc-ITTM (UVP LLC). O DNA foi determinado para ficar estabilizado e intacto quando a banda corada no gel estiver afiada e > 23Kb, em comparação com a escada de DNA. Escada de DNA 1kb + (Life Technologies, Cat. N° 10787-018) ou fragmentos de DNA Lambda/Hind III (Life Technologies, Cat. N° 15612-013) foram usados como referências de tamanho.

[00160] a. gel de agarose a 1% foi preparado (80 mL 1xTAC + 0,8 g de agarose).

[00161] b. 2 μL de 5 x tampão de carregamento foram adicionados a μ8 L de 10 ng/μL de amostra purificada.

[00162] c. Em poços de gel de agarose a 1% foram carregados 10 μL de amostra preparada (etapa b); 5 μL de fragmentos de DNA Lambda/Hind III fragmentos e/ou 5 μL 1Kb de escada de DNA.

[00163] d. gel foi executado a 100 V por 30 minutos.

[00164] e. O gel foi corado com EtBr (500μL 1 mg/mL EtBr + 500 mL de água) por 15 minutos.

[00165] f. O gel de foi descorado em água por 5 minutos.

[00166] g. As imagens foram tiradas em luz ultravioleta.

Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação (DGGE)

[00167] Para avaliar com precisão e de maneira reprodutiva a estabilidade de vários microbiomas (fezes, saliva, escarro, pele, etc.) na presente composição, foi utilizado um novo método chamado Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação (DGGE). Este método se baseia na ideia de que se considera-se uma região variável do gene 16S rRNA bacteriano (neste caso a região V3) e a amplifica usando PCR e iniciadores na região conservada de flaqueamento, esses amplicons terão um ponto de fusão único para as espécies de bactérias (mesmo diferenças de nucleotídeo afetarão a fusão e, assim, produzirá um perfil diferente).

[00168] Quando esse método é aplicado a uma amostra que contém várias espécies de bactérias, a amplificação que usa iniciadores conservados resultará em uma matriz de amplicons, sendo que todos têm aproximadamente o mesmo comprimento, mas têm uma composição de nucleotídeo diferente na área não-conservada. Em seguida, estes amplicons são executados em um gel que contém um gradiente de solução de desnaturação (ureia e formamida). Os amplicons irão desnaturar em diferentes estágios no gel, dependendo da composição do nucleotídeo, dando assim uma resolução de todas as espécies que estavam presentes na amostra.

[00169] Para que os amplicons de DNA não desnaturem para uma forma de fita simples, clamp CG de ~30 nucleotídeos foi adicionado ao iniciador dianteiro que retarda a migração dos amplicons no gel, uma vez que a seção variável desnaturou. Em geral, um 40%-60% de gradiente de desnaturação no gel fornece uma boa resolução das bandas, capturando a maior parte das espécies no instinto. O gel é executado em um 60°C constante para facilitar a desnaturação dos amplicons e manter também o gel em temperatura igual durante toda a execução.

[00170] As imagens de gel DGGE foram analisadas usando o software Syngene GeneTools (versão 4.03.00, Syngene). O plano de fundo da imagem foi subtraído usando o método de disco de rolamento com um raio de 30 pixels. As faixas foram manualmente detectadas e definidas. O local e ângulo inicial e final Rf foram definidos como manual para ajustar quanto à "distorção" no gel. As bandas para análise foram automaticamente detectadas para cada faixa; o pico de detecção foi definido como abaixo do padrão (largura mínima de 7 pixels, altura de pico mínima de 3 e volume de pico mínimo de 1%). Os perfis foram combinados usando o tipo de "perfil" de acordo com os parâmetros de combinação com uma tolerância de definição de 1%. A comparação de perfil resultou em uma matriz de similaridade automaticamente gerada com valores de similaridade que variam de 0 a 100. De um modo geral, para % de similaridade, isto se refere a quaisquer alterações entre 2 perfis, geralmente diferenças nas intensidades de banda. Assim, a % de similaridade fornece uma medida da diferença de abundância de espécies. Quando uma banda está ausente entre perfis, o impacto sobre a % de similaridade é maior do que quando essa banda só diminuiu em intensidade.

[00171] O gel DGGE mostrado na Figura 1 ilustra o quão diferente o perfil de microbioma das amostras de fezes de dois doadores diferentes pode parecer; existe apenas 22% de similaridade entre a primeira amostra de fezes (Doador A) e a segunda amostra (Doador B).

[00172] A PCR-DGGE foi realizada de acordo com o procedimento descrito abaixo.

Amplificação por PCR para DGGE (usando Iniciadores 16S com clamp 5' no iniciador dianteiro)

[00173] a. 2 μL de 10 ng /μL de DNA foram adicionados em tubos de PCR de 12 tiras.

[00174] b. Master Mix foi preparada (98 μL/reação): 76,7 μL de água, 10 μL 10xPCR Tampão, 4 μL 50 mM de MgCl2, 2,5 μL de dNTPs a 10 mM, 2 μL 10 pmol Iniciador Rev (PPUN518R, 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG -3'), 2 μL 10 pmol Iniciador Fwd (PRBA338F, 5'-CGCCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3') e 0,8 μL 5 U/μL Taq.

[00175] c. 98 μL de master mix foram adicionados a cada tubo.

[00176] d. A PCR foi executada na máquina de PCR convencional: 1 ciclo a 92°C por 2 minutos; 28 ciclos a 92°C por 60 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 60 segundos; seguido por 1 ciclo a 72°C por 6 minutos.

DGGE de Amplicons de PCR

[00177] a. As soluções de estoque foram preparadas para um gel a 8% de Acrilamida/Bis em 40% e 60% de soluções de desnaturação:

[00178] b. As placas de vidro e espaçadores foram montados de acordo com o manual de instruções para o sistema DCode (Bio-Rad).

[00179] c. Para preparar e despejar um gel a 8% de Acrilamida/Bis com um gradiente paralelo usando soluções de desnaturação a 40% e 60% foi usado o seguinte procedimento:

[00180] • 20 mL de soluções de desnaturação a 40% e 60% foram medidos em 2 béqueres separados com rótulos de "baixa densidade" e "alta densidade", respectivamente;

[00181] • 200μL de persulfato de amônio a 10% (APS) foram adicionados a cada solução;

[00182] • 20μL de TEMED foram adicionados a cada solução;

[00183] • As soluções foram bem misturadas por agitação;

[00184] • Cada solução foi preenchida em uma seringa de 20 mL separada;

[00185] • As seringas foram fixadas ao aparelho de carregamento onde tinha a especificação de "baixa densidade" ou "alta densidade" para o preenchimento superior;

[00186] • Observação: As definições do ajuste de volume para 16 x 16 cm de gel com espaçadores de 1,0 mm foi de 18,5 mL;

[00187] • A tubulação em Y foi fixada a cada uma das seringas, com uma agulha na outra extremidade da tubulação;

[00188] • A agulha foi colocada entre as placas de vidro;

[00189] • O gel foi vertido lentamente e de forma consistente, girando a roda para que o gradiente tivesse tempo para sair;

[00190] • O gel foi deixado para polimerizar por algumas horas;

[00191] • A tubulação em Y foi lavada com água.

[00192] d. O sistema de execução de gel foi pré-aquecido com 1xTAE tampão a 55°C.

[00193] e. 8 μL de corante de carregamento Fermentas 6x foram adicionados a 42 μL do produto da PCR.

[00194] f. O gel foi executado por 5 minutos a 200 V, antes de ligar a bomba de recirculação para tirar as amostras dos poços e colocar no gel.

[00195] g. O gel foi executado por 14 horas em 70 V com a bomba de recirculação ligada.

[00196] h. O gel foi corado em 1 x Sybr Gold por 30 minutos (250 mL 1xTAE + 25 μL 10.000 x SybrGold).

[00197] O gel de foi descorado em 1xTAE por 5 minutos.

[00198] As imagens foram tiradas em luz ultravioleta.

[00199] A PCR de 16s rRNA foi realizada usando iniciadores universais (região V3) seguida por DGGE usando Sistema de Detecção de Mutação Universal DCode (Bio-Rad).

Sequenciamento de 16S rRNA

[00200] Preparação da biblioteca de sequenciamento de 16S rRNA, foram conduzidos sequenciamento e bioinformática. O sequenciamento de aplicon de extremidade emparelhada de região hipervariável V4 foi realizado usando Illumina® MiSeq® (250 ciclos). Usando QIIME e scripts personalizados, as sequências foram filtradas quanto à qualidade. As leituras de extremidade emparelhada foram montadas e pesquisadas no banco de dados de referência Greengenes, agrupado em 97% por UCLUST. Após a normalização de dados, distância de amostra para amostra foi medida usando Unifrac Ponderado em dados de abundância em OTU (unidades taxonômicas operacionais) (utiliza diferenças de abundância de táxon nas amostras, empregando uma normalização por pares, dividindo a soma das diferenças pela soma de todas as abundâncias) e dados de incidência Unifrac não ponderados (considera apenas a presença/ausência de táxons).

Amplificação do DNA Humano de Amostras de Fezes Purificadas Armazenados na Presente Composição

[00201] A estabilidade do DNA humano nas amostras de fezes coletadas na presente composição (detalhada abaixo) e armazenadas em temperatura ambiente por 2 semanas, antes da extração de DNA total (MoBio PowerSoil ou Kit de Isolamento de DNA PowerFecal) foi avaliada em PCR em tempo real ou quantitativa (qPCR) usando iniciadores que direcionam o gene timidilato sintase humano de cópia única (locus TYMS; NM001071.2). Para cada reação, 50 ng de DNA purificado foi amplificado em um volume de 25 μL contendo: 1x PCR Tampão (20 mM Tris, 50 mM KCl), 2 mM MgCk, 200 μM dNTPs (Invitrogen), 50 μg/mL BSA (Sigma Aldrich), 1 μM corante SYTO9 (Invitrogen), 0,4 μM cada de Iniciador hTSm143F (5'- GCCCTCTGCCAGTTCTA-3') e hTSm143R (5'-TTCAGGCCCGTGATGT-3'; Invitrogen), 1U Taq polimerase (Invitrogen). As condições de amplificação para o alvo TS143 foram: 1 ciclo a 95°C por 5 minutos; 35 ciclos a 95°C por 20 segundos, 55°C por 20 segundos, 72°C por 30 segundos; seguido por 1 ciclo a 72°C por 10 minutos. Um programa de curva de fusão foi incluído e consistia em: 11 ciclo a 95°C por 30 segundos em uma taxa de rampa de 44°C/segundo (sem aquisição), 72°C por 10 minutos em uma taxa de rampa de 2,2°C/segundo (sem aquisição), 95°C em uma taxa de rampa de 0,11°C/segundo (aquisição contínua). As mostras de DNA foram executadas em triplicado em Corbett Rotorgene RG-6000 e os valores de Ct para cada amostra foram calculados usando Rotorgene série 6000. O valor de Ct se refere ao número fracionário do ciclo no ponto onde a curva de amplificação cruza um limite de detecção. Ao definir uma linha de limite e calcular a interseção com cada curva da amostra, os valores de Ct para cada amostra são estabelecidos. A linha de limite é definida na fase exponencial da execução, significativamente acima do nível do fundo para evitar ruído e abaixo do início do platô de sinal em ciclos posteriores. Geralmente, o valor de Ct é inversamente proporcional à quantidade de DNA na amostra.ΔCt representa a diferença nos valores de C t resultantes das duas alíquotas tomadas da mesma amostra em épocas diferentes, por exemplo, T=0 e T=14 dias após a coleta da amostra.

EXEMPLO 1 - Comparação de Agentes Quelantes Diferentes em Composições para Estabilização de DNA em Amostras Fecais

[00202] Devido a grande quantidade de nucleases nas fezes, principalmente de origem bacteriana, os inventores fizeram experimentos com agentes quelantes diferentes e suas concentrações durante o desenvolvimento da presente composição.

[00203] As composições descritas no Exemplo atual continham 23,5% de etanol, 0,5% de SDS e 0,1% de Antiespumante A,juntamente com EDTA ou CDTA em quantidades variáveis,tamponadas para pH 11 com alanina a 50 mM. As percentagens de etanol e Antiespumante A são (% v/v) neste Exemplo e nos Exemplos posteriores e as porcentagens de outros componentes (SDS, triclosan) estão em (% p/v).

[00204] Referindo-se à Figura 2, as fezes foram coletado por um doador saudável e amostras de 400 mg foram homogeneizadas em várias soluções de estabilização ou armazenadas na ausência de tampão de estabilização (instabilizado) por 14 dias em temperatura ambiente (RT, 19-23°C) antes da extração de DNA com um kit comercialmente disponível (Kit de Isolamento de DNA PowerSoil ou PowerFecal, MoBio). Em comparação com a qualidade ou integridade de DNA purificado em T=0 e T=14 dias, o gel de agarose mostra claramente que o DNA de peso molecular elevado nas fezes não tratadas degrada significativamente durante o armazenamento em RT (controle, 2 últimas faixas de gel de agarose), formando uma mancha sobre o gel. As amostras (400 mg) das fezes do mesmo doador também foram homogeneizadas em: 1) presente composição, incluindo aumento das quantidades de CDTA (150, 300, 500 mM); e 2) presente composição em que CDTA foi substituído por EDTA (150, 300, 500 mM).

[00205] Surpreendentemente, em todas as concentrações testadas (150, 300, 500 mM) com amostras fecais, CDTA apresentou um desempenho significativamente melhor do que EDTA quanto à estabilização do DNA de peso molecular elevado em ambas as amostras recém-coletadas (T=0) e exposição após RT por 14 dias (Figura 2). De fato, EDTA, e não CDTA, prejudicaram, de forma inesperada, a estabilização (e extração) de DNA de peso molecular elevado em concentrações superiores a 150 mM.

[00206] Além disso, uma comparação de concentrações mais elevadas (150, 300 e 500 mM) de EDTA e CDTA (Tabela 4), sustenta a constatação surpreendente que CDTA é superior a EDTA para estabilizar perfis de microbioma, como exemplificado através de PCR do gene rRNA 16S bacteriano e análise de DGGE dos amplicons, conforme descrito na seção materiais e métodos acima. Após 14 e 30 dias em RT, o DNA das amostras fecais armazenadas na presente composição com CDTA mantiveram altas porcentagem similares para controlar as amostras processadas em T = 0. No contrato, o perfil de microbioma do DNA das mesmas fezes armazenadas na presente composição substituída com EDTA mostrou disparidade crescente com o tempo em RT, comparados às amostras de controle (processados em T = 0; Tabela 4).Tabela 4. A estabilidade de microbioma das fezes armazenadas em composições com concentrações crescentes de agentes quelantes.

[00207] Portanto, CDTA surpreendentemente superou EDTA em sua capacidade de estabilizar DNA de alto peso molecular, alta qualidade e intacto e produz imagem do perfil de microbioma nas fezes não-homogêneas complexas. Assim, quelantes tais como CDTA, com uma constante de dissociação superior ao EDTA, fornecem a melhor estabilização de DNA em amostras biológicas, tais como amostras fecais e são particularmente preferidos para uso nas composições descritas aqui. Essa capacidade de estabilizar as amostras no ponto de coleta de amostra ajudará a eliminar as fortes tendencias vistas entre e dentro dos estudos em laboratórios.

EXEMPLO 2 - Papel de pH e Agentes Quelantes na Estabilidade de Amostra Fecal na Presente Composição

[00208] As relações complexas entre a mistura de amostra fecal, pH e concentração de agente de quelantes foram investigadas por seus efeitos sobre a estabilidade do perfil de microbioma como exemplificado através de PCR do gene de rRNA 16S bacteriano e análise de DGGE de amplicons.

[00209] No primeiro dentre quatro experimentos, um doador saudável coletou as fezes e transferiu 400 mg de fezes em quatro tubos contendo uma única esfera de aço inoxidável de 7,9 mm e 2 mL ou da composição "104B pH 9,5" (300mM de CDTA, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,1% de Antiespuma A, pH 9,5) ou "104B pH 11" (300 mM de CDTA, 50 mM de β-alanina, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,1% de Antiespuma A, pH 11). As amostras nos tubos foram deixadas inalteradas (sem misturar) ou homogeneizadas com sacudir de mãos (misturar) e depois retornou para o laboratório sob condições de temperatura ambiente. Dentro de 3-4 horas de coleta de amostra, 250 μL de alíquota foi removida de cada tubo para extração de DNA (T = 0) e em seguida as amostras foram realçadas armazenando-se em 30 °C por 24 horas, seguido por -20 °C por 11 dias (T = 11), antes da extração de DNA de uma segunda alíquota. DNA purificado foi quantificado e então resolvido como perfis de comunidade bacteriana ou impressões digitais usando DGGE para separar amplicons PCR rRNA 16S. Por cento similaridade entre as amostras (linhas em gel de DGGE), em comparação com as amostras de controle em T = 0 para cada composição, foi calculada separadamente usando o software Syngene GeneTools (consultar Materiais e Métodos).

[00210] A Figura 3 ilustra similaridades percentual melhoradas ou estabilidade de perfil de microbioma entre exemplos de "dia 11 sem mistura" e amostra de "dia 0 com mistura" quando o pH da composição atual for aumentou de 9,5 para 11, indicando que o pH 11 oferece estabilidade de DNA adicional do que pH 9,5. Também, amostras de "dia 11 de mistura", em tubos utilizando meios de homogeneização presentes, uma esfera de aço densa, consistentemente levou à estabilidade de perfil microbioma melhorada em relação às amostras de "dia 11 de mistura", em ambos os valores de pH testados e, em particular, a pH 11.

[00211] Em um segundo experimento, a relação entre o pH e a concentração de CDTA foi abordada. As alíquotas (400 mg) das fezes de um doador saudável foram transferidas para tubos contendo uma esfera de metal de aço inoxidável de 7,9 mm e 2 mL de uma dentre as três composições: 1) 104B pH 9,5 (como acima); 2) 50 mM de CDTA, 50 mM β-alanina, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,2% de Triclosan, 0,1% de Antiespuma A, pH 11,5; e 3) 50mm de CDTA, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,2% de Triclosan, 0,1% de Antiespuma A, pH 9,5. As amostras foram homogeneizadas misturando-se a mão e retornadas ao laboratório sob condições de temperatura ambiente em que uma alíquota de T = 0 (250 μL) foi coletada e o DNA extraído. Os restantes das amostras foram armazenados em temperatura ambiente por 4 e 14 dias, com alíquotas removidas e DNA extraído em cada ponto de tempo.

[00212] A eletroforese em gel de agarose revelou que 300 mM de composição de CDTA em pH 9,5 (104B pH 9,5) de DNA de alto peso molecular estabilizou por pelo menos 14 dias e exibiu a estabilização superior de DNA de alto peso molecular do que as outras duas composições contendo 50 mM de composição de CDTA em ou pH 9,5 ou 11,5 (dados não mostrados). No entanto, a presença de DNA de alto peso molecular intato não confiável indica que uma imagem da microbioma foi alcançada. Na ausência de uma solução de estabilização eficaz, a espécie bacteriana pode replicar ou entrar em óbito, sem alterar a quantidade total de DNA, assim como a sua qualidade. Os perfis de microbioma das amostras, portanto, foram examinados através de PCR do gene de rRNA 16S bacteriano e análise de DGGE de amplicons, conforme descrito na seção Materiais e Métodos acima.

[00213] Referindo-se à Figura 4 e à Tabela 5, a análise de DGGE revelou que 300 mM de composição de CDTA no pH 9,5 exibiu excelente estabilização do perfil microbioma (94-96% de similaridade em comparação com t = 0 de controle) pelo menos 14 dias à temperatura ambiente. A eficácia da 300 mM de composição de CDTA em pH 9,5 na estabilização o perfil de microbioma foi surpreendentemente superior àquele da composição de CDTA de 50 mM em pH 9,5, que exibiu somente 15% de semelhança em comparação ao t = 0 de controle após 14 dias à temperatura ambiente. A composição de pH 11,5 com 50 mM de CDTA pareceu "resgatar" de certa maneira a degradação considerável de DNA pelo perfil de microbioma visto na composição de pH 9,5 com 50 mM de CDTA.

[00214] Portanto, uma combinação de alta concentração de CDTA e pH alcalino consideravelmente é necessário para estabilizar o perfil de microbioma de amostras fecais.Tabela 5: Análise de perfil de microbioma de amostras fecais armazenadas em várias composições por 14 dias à temperatura ambiente.

[00215] Em um terceiro experimento, a relação entre o pH e a concentração de CDTA na presente composição foi adicionalmente abordada. As alíquotas (400 mg) das fezes de um doador saudável foram transferidas para tubos contendo uma esfera de metal de aço inoxidável de 7,9 mm e 2 mL de uma dentre as duas composições: 1) 300 mM de CDTA, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,2% de Triclosan, 0,1% de Antiespuma A, pH 9,5; e 2) 50 mM de CDTA, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,2% de Triclosan, 0,1% de Antiespuma A, pH 7,4. As amostras foram homogeneizadas misturando-se a mão e retornadas ao laboratório sob condições ambiente em que uma alíquota de T = 0 (250 μL) foi coletada e o DNA extraído. Restante das amostras foram armazenadas em temperatura ambiente por 4 dias antes de uma segunda alíquota ser removida e processada.

[00216] Eletroforese em gel de agarose revelou que a 300 mM de composição de CDTA no pH 9,5 de DNA de alto peso molecular intacto estabilizado em fezes em maior medida do que 50 mM de composição de CDTA em pH 7,4 durante 4 dias em RT e análises de DGGE indicaram que essa composição também exibiu estabilização superior do perfil de microbioma fecal (97% de similaridade para T = 0 versus 10% de similaridade para T = 0, respectivamente - consulte Figura 5 e Tabela 6). A estabilidade do perfil de microbioma de fezes homogeneizadas com a composição de pH 7,4 (10% de similaridade para T = 0 depois de 4 dias em RT) também foi consideravelmente menor do que a estabilidade do perfil de microbioma das fezes homogeneizadas com 50 mM de composição de CDT no pH 9,5 (91% de similaridade para T = 0 depois de 4 dias no RT, como mencionado acima).Tabela 6: Análise de perfil de microbioma de amostras fecais armazenadas em várias composições por 4 dias à temperatura ambiente.

[00217] Em um quarto experimento, foi abordado a relação entre o pH em uma alta concentração fixa de CDTA na presente composição. As alíquotas (400 mg) das fezes de um doador saudável foram transferidas para tubos contendo uma esfera de metal de aço inoxidável de 7,9 mm e 2 mL de uma dentre as duas composições: 1) 300 mM de CDTA, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,2% de Triclosan, 0,1% de Antiespuma A, pH 7,4; e 2) 300 mM de CDTA, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,2% de Triclosan, 0,1% de Antiespuma A, pH 9,5. As amostras foram homogeneizadas misturando-se a mão e retornadas ao laboratório sob condições ambiente em que T = 0, 24 horas e 9 dias de alíquota (250 μL) foi coletada e o DNA extraído.

[00218] A eletroforese em gel de agarose demonstrou que amostras fecais misturadas com uma composição em pH 9,5 exibem estabilização superior de DNA de alto peso molecular em comparação às amostras fecais misturadas com uma composição em condições de pH neutro (pH 7,4), mesmo na presença de altas concentrações (300 mM) de CDTA (ver Figura 6).

[00219] Levado em conjunto com os resultados mostrados no Exemplo 1, essas experiências indicam que as condições ideais para preservar o DNA de alto peso molecular intacto e perfis de microbioma estáveis durante a temperatura de armazenamento existem quando o pH da composição for maior ou igual a 9,5, de preferência, de pH 10,511,5 ou cerca de pH 11 e a concentração de CDTA é maior que 50 mM, de preferência, pelo menos cerca de 150 mM, mais preferencialmente cerca de 300 mM.

Exemplo 3 - Estabilização de fezes Após Mistura com Microesferas de Vidro e Aço Inoxidável

[00220] As fezes de um doador saudável foi transferido em 400 mg de alíquotas em quatro tubos contendo: 1) 2 mL de solução de estabilização 104B de pH 9,5 (conforme definido acima) e quatro microesferas de vidro de 4 mm mais dez de 2 mm; 2) 2 mL de solução de estabilização 104B de pH 11 (conforme definido acima) e quatro microesferas de vidro de 4 mm mais dez de 2 mm; 3) 2 mL de solução de estabilização 104B de pH 9,5 e uma esfera de aço inoxidável de 6 mm; 4) 2 mL de solução de estabilização 104B pH 11 e uma esfera de aço inoxidável de 6 mm Todos os quatro tubos foram sacudidos pelo doador à mão até misturado e trazidos de volta para o laboratório em condições ambientes. Dentro de 3-4 horas de coleta de amostra, o DNA foi extraído, quantificado e 80 ng de cada amostra purificada foi passada em um gel de agarose (ver Materiais e Métodos e Figura 7). As amostras de microesfera de vidro submetidas a vórtice e as amostras contendo esferas de aço foram sacudidas antes da remoção de uma alíquota.

[00221] Esse exemplo demonstram a vantagem do uso de uma esfera de mistura de aço inoxidável, DNA de alto peso molecular (>23kb) em fezes recém coletadas em temperatura ambiente. Misturar as amostras de fezes nos tubos de laboratório contendo as composições presentes, em ambos pH 9,5 e 11, e uma esfera de aço inoxidável densa único (Figura 7B) provou ser superior à mistura com múltiplas microesferas de vidro pequenas de dois tamanhos (Figura 7A) ao se comparar a qualidade do DNA de alto peso molecular em gel de agarose. A mistura à mão das fezes com múltiplas microesferas de vidro e a composição atual (104B pH 9,5) levou significativamente mais tempo do que a mistura com uma esfera de aço inoxidável e o último demonstrou um resultado superior em termos de preservação de DNA de alto peso molecular intacto. Surpreendentemente, observou-se uma melhoria na integridade de DNA em amostras misturadas com microesferas de vidro com uma composição ainda mais alcalina (pH 11), sugerindo que ambos os meios de mistura/homogeneização e o pH da solução de estabilização são críticos.

Exemplo 4 - Tolerância de Volume da Presente Composição

[00222] As fezes são uma amostra biológica não homogêneo que podem variar significativamente em aparência ou dureza, de acordo com o estado do sistema digestivo, dieta e saúde geral. Normalmente as fezes humanas são semissólidas, com uma camada de muco. A escala ou gráfico de fezes humana de Bristol é um auxiliar médico designado para classificar a forma das fezes humanas em sete categorias, variando de tipo 1 (pedaços duros separados, como nozes) ao tipo 7 (pedaços inteiramente líquidos e não sólidos, acima de 90% de água). Em geral, as fezes consistem em cerca de 70-80% de água, 20-30% de matéria sólida, mas essa percentagem varia de acordo com o tipo de amostra (1-7) ou tempo de permanência das fezes no intestino. Variabilidade entre as fezes na dureza e teor de água representam um desafio significativo para coleta de fezes e mistura completa e consistente com uma solução de estabilização. As amostras do tipo 1-3 são particularmente difíceis de dispersar totalmente em solução de estabilização para produzir um líquido homogêneo, sem diluir a amostra (e, portanto, DNA) em excesso para análise posterior. Também, as amostras do tipo 1-3 têm uma maior tendência que outros tipos de amostra que absorvem lentamente o líquido, por exemplo, a solução de estabilização, levando a uma suspensão espessa e semissólida que pode ser difícil de pipetar em laboratório. O maior teor de água das amostras do tipo 4-7 e consistência mais macia tornam essas amostras mais fáceis de misturar em solução de estabilização e pipetagem. Durante o processamento, a variabilidade também pode ser introduzida pelo método (ou kit comercial) usado para extrair o DNA de amostras fecais.

[00223] Em virtude da natureza não homogênea das fezes, a robustez da presente composição em estabilizar o DNA de alto peso molecular intacto total foi comparada nos seguintes experimentos de proporção. Em dois experimentos separados, três doadores saudáveis coletaram amostras de fezes (400 mg) em tubos contendo uma esfera de aço inoxidável de 7,9 mm e vários volumes de solução de estabilização 104B de pH 11 (definida acima), para alcançar as seguintes razões de fezes:solução de estabilização - 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8 e 1:10. Observa-se, a "Razão real" e a "Razão alvo" é indicada no gel, uma vez que é muito difícil coletar de forma repetida precisamente de 400 mg de fezes com uma ferramenta simples. Os tubos foram pesados antes e após a coleta da amostra para determinar a quantidade exata de fezes coletadas por volume de composição. Os tubos foram sacudidos à mão e 250 μL de alíquotas foram removidos em T = 0 (Figura 8A) e após 6 dias (Figura 8B), 7 dias (Figura 8C), 14 dias (Figura 8D), 1 mês (Figura 8E) e 2 meses (Figura 8F) à temperatura ambiente. Em alguns casos, duas alíquotas foram extraídas para demonstrar a reprodutibilidade das repetições (Figura 8A, C-F). O DNA foi extraído e 80 ng foi passado em géis de 1% de agarose (Figuras 8A-F). Em linhas marcadas com um asterisco (*), menor que 80 ng de DNA foi carregado devido ao fato de que algumas amostras têm uma concentração de DNA menor que 10 ng/μL uma vez purificado. Os géis de DGGE (Figura 10A e 10B) também foram realizados nessas experiências e similares por cento analisadas para determinar a estabilidade do perfil de microbioma nessas amostras.

[00224] Esse exemplo demonstra que um amplo intervalo de fezes: razões de solução de estabilização resultaram em DNA de alto peso molecular intacto em amostras a partir de T = 0 a pelo menos 2 meses de armazenamento à temperatura ambiente (Figuras 8A-F). Tão pouco quanto 0,8 mL a tanto quando 5,4 mL da presente composição estabilizou com êxito os perfis de DNa e microbioma contidos em 400 mg de fezes pelo menos 2 meses sob essas condições (Figuras 8A-F e 10A-B). Essa ampla gama de "trabalho" dá conforto ao pesquisador que doadores podem transferir quantidades altamente variáveis de amostra fecal em tubos contendo um volume fixo da solução de estabilização e a amostra será estável durante pelo menos 2 meses à temperatura ambiente. As alíquotas de amostra triplicadas (Figura 9) analisadas usando DGGE demonstraram que o perfil de microbioma entre as alíquotas retiradas de mesmos espécimes de fezes foi muito consistente (> 97%). Além disso, a análise de géis de DGGE para amostras de experimentos de razão mostrou que os perfís de microbioma foram altamente estabilizados (> 88% em 7 dias; > 91% em 14 dias; > 79% aos 2 meses) em um amplo intervalo de fezes:solução de estabilização da presente composição (1: 1,8 a 1: 10,6) por períodos prolongados na temperatura ambiente (Figura 10A e 10B).

[00225] Razões preferidas de fezes:solução de estabilização podem, portanto, variar de cerca de 1:1 a 1:20, de preferência, de 1:1 a 1:10, mais preferencialmente, 1:3 a 1:8 e com máxima preferência a razão de fezes:solução de estabilização é de cerca de 1:5.

[00226] As composições descritas aqui permitem pesquisadores revolucionar como os mesmos coletam uma grande variedade de amostras fecais. Os mesmos não precisam limitar estudos devido aos custos e logística de transporte das amostras em gelo seco ou armazenar centenas a milhares de amostras fecais em freezers durante meses. As amostras coletadas em tubos contidos na presente composição podem ser transportadas à temperatura ambiente em um envelope bolha e armazenadas à temperatura ambiente no laboratório para processamento em lote para conveniência do pesquisador.

Exemplo 5 - Estabilização de Amostras na Presente Composição e Temperaturas Extremas

[00227] As várias composições descritas neste documento efetivamente e rapidamente estabilizam perfis de microbioma e DNA de alto peso molecular em fezes de humanos doadores saudáveis à temperatura "ambiente". Como observado acima, as temperaturas de exposição típicas de meios "ambientes" observadas durante a coleta, transporte, armazenamento e processamento de amostras biológicas. Dependendo de onde no mundo a amostra biológica for coletada/transportada/armazenada, as temperaturas podem facilmente variar de -20 °C a 50 °C, às vezes em um curto período de tempo. É conhecido na técnica que as amostras biológicas não tratadas se degradam ao longo dessas temperaturas, particularmente temperaturas elevadas. Há uma necessidade para uma solução de estabilização de amostra biológica robusta, universal para manter o DNA em amostras coletadas tão próximo ao estado in vivo quanto possível, isto é, prevenir a degradação DNA de alto peso molecular intacto existente e/ou evitar degradação adicional do ácido nucleico parcialmente degradado, tal como o DNA humano em amostras fecais e estabilizar o perfil de microbioma das amostras fecais.Tabela 7. Composições testadas.

[00228] O desempenho de 6 composições estabilizadoras de DNA (Tabela 7), desenvolvidas pelos inventores, foi testado e comparado ao longo de um intervalo amplo de temperaturas ambientes, por exemplo, -20 °C, temperatura ambiente (geralmente 19-23 °C), 37 °C e 50 °C, com amostras fecais variáveis não homogêneas complexas. No primeiro experimento, 2 doadores saudáveis transferiram, cada um, 400 mg de fezes em 6 tubos contendo 2 mL de composições diferentes (Tabela 7) e uma esfera de aço inoxidável de 7,9 mm. Os tubos foram sacudidos com a mão para homogeneizar as amostras fecais, uma alíquota (250 μL) foi imediatamente removida para extração de DNA (T = 0) e em seguida os tubos foram armazenados a 37 °C por 7 a 21 dias.

[00229] As Figuras 11A e 11B demonstram que todas as composições testadas de DNA de alto peso molecular intacta estabilizada elevada pelo menos 3 semanas quando amostras fecais foram armazenadas a 37 °C. Após 21 dias a 37 °C, a concentração de DNA recuperada das amostras de fezes humanas armazenadas em composições de CBS, CBSA1 e CBSA2 foram menores do que as amostras nas outras composições, levando a bandas mais fracas nos géis de agarose para o doador A e B (Figura 11A e 11B). Surpreendentemente, a análise de DGGE (Figura 12A e 12B) mostrou o perfil de microbioma nessas amostras também foi estável durante a primeira semana a 37 °C, uma temperatura ideal para o crescimento de bactérias fecais e começou a mudar para o ponto no tempo anterior ao dia 21. Além de 300 mM de CDTA, tamponado a pH 11, o etanol parece ser benéfico para a estabilização ou recuperação de ambos DNA de alto peso molecular e perfil de microbioma.

[00230] No segundo experimento, 3 doadores saudáveis transferiram, cada um, 400 mg de fezes em 3 tubos contendo 2 mL de 104B e uma esfera de aço inoxidável de 7,9 mm. Os tubos foram sacudidos com a mão para homogeneizar as amostras fecais, uma alíquota (250 μL) foi imediatamente removida para extração de DNA (T = 0) e em seguida os tubos foram armazenados a 50 °C por 3 a 5 dias, à temperatura ambiente por 1 mês, e -20 °C por 1 mês (Figuras 13A- E). As Figuras 13A-E demonstram que 104B estabilizou o DNA de alto peso molecular para em 5 dias a 50 °C (Figura 13B-C), 1 mês em temperatura ambiente (Figura 13D) e 1 a -20 °C (Figura 13E). As amostras fecais triplicadas coletadas por cada doador todas continham DNA de alto peso molecular intacto, independentemente da temperatura ou dos períodos testados.

[00231] No terceiro experimento, 3 doadores saudáveis transferiam 400 mg de fezes em 3 tubos; 2 tubos continham 2 mL de 104B e CBE (Tabela 7) e uma esfera de aço inoxidável de 7,9 mm cada; o terceiro tubo estava vazio (nenhum). Os tubos com solução de estabilização foram sacudidos à mão para homogeneizar as amostras fecais, uma alíquota (250 μL ou 250 mg) foi imediatamente removida de cada tubo para extração de DNA (T = 0), e em seguida, os tubos foram armazenados a 50 °C por 5 e 14 dias ou a -20 ° C por 11 dias (Figura 14 A-D). As Figuras 14A-C demonstraram que tanto 104B e CBE mantiveram o DNA de alto peso molecular intacto pelo menos 2 semanas a 50 °C, amostras de controle (nenhum) mostravam sinais de degradação ao longo do tempo. Surpreendentemente, a análise de DGGE (Figura 15A e 15B) mostrou que o perfil de microbioma nessas amostras também foi estável por 2 semanas a 50°C, uma temperatura extrema para biomoléculas como DNA. Curiosamente, as similaridades por cento foram maiores nas amostras armazenadas a 50°C por 5 dias, não 14 dias, indicando que a exposição prolongada a uma temperatura tão extrema pode levar a alguma instabilidade química no DNA em si.

[00232] A Figura 14 mostra que ambos 104B e CBE mantiveram o DNA de alto peso molecular em amostras congeladas a -20°C (e posteriormente descongeladas) por pelo menos 11 dias. No entanto, na ausência de solução de estabilização, as fezes mostraram sinais característicos de degradação de DNA a -20°C. Na amostra do doador A (nenhum), a maioria do DNA de alto peso molecular foi degradado e apareceu como uma mancha sobre o gel de agarose. Em contraste, uma pequena quantidade de DNA de alto peso molecular pode ainda ser detectada nas amostras de doador B e C, indicando a variabilidade do doador. A análise de DGGE das amostras sem solução de estabilização confirmou que o perfil de microbioma não era estável a - 20 °C; % de similaridade ao T = 0 de controle foi de 52 e 69% para doador A e C, respectivamente. Em contraste, o perfil de microbioma era estável em 104B e CBE durante 11 dias a -20 °C, conforme indicado pelas similaridades porcentuais altas em relação às amostras de controle (nenhum) (Figura 16A e 16B).

[00233] Tomados em conjunto esses exemplos demonstram que tanto 104B e CBE estabilizam o DNA em amostras fecais armazenadas em temperaturas extremas por períodos prolongados de tempo.

Exemplo 6 - Estabilidade com Ciclo de Congelamento/Descongelamento das Amostras de Fezes Incubadas na Presente Composição

[00234] Conforme discutido acima, o perfil de microbioma é conhecido na técnica para mudar quando as fezes são expostas a uma rodada de congelamento e descongelamento para armazenamento ou fins de armazenamento em banco. Essa degradação adiciona um viés desnecessário para todas as amostras coletadas transportadas ou armazenadas a temperaturas subzero. No presente exemplo, as fezes foram coletadas de 3 doadores saudáveis e 400 mg de amostras foram transferidas para tubos vazios e tubos contendo 2 mL da presente composição ("104B pH 9,5"; conforme definido acima) com microesferas de vidro (quatro microesferas de 4 mm e dez de 2 mm). Tubos contendo a solução de estabilização e as microesferas de vidro foram vigorosamente submetidas a vórtice até completamente misturados. Após a remoção de 250 mg ou μL de alíquota para extração de DNA no dia 0, os tubos de amostras foram armazenados em um freezer a -20 °C e, ao longo de dez dias, um ciclo de cinco vezes entre o congelador e a temperatura ambiente com 24 horas em cada temperatura. Os tubos de amostra foram descongelados a 50 °C durante 3 horas, um método padrão da indústria.

[00235] A análise de gel de Agarose das alíquotas de dia 0 demonstra que as fezes de cada doador continham DNA de alto peso molecular, quando recolhidas na presente composição (Figura 17). Surpreendentemente, após 5 ciclos de congelamento/descongelamento (F/T) o DNA manteve-se intacto (Figura 17). A análise de DGGE confirmou que o perfil de microbioma de amostras na presente composição manteve-se estável em 94% após 5 ciclos de F/T (Figura 18). Em contraste, as amostras desprotegidas mostraram degradação considerável do perfil de microbioma. Após somente um ciclo de F/T, o perfil era apenas 52% semelhante ao perfil da amostra de dia 0 "recém coletada", antes da exposição -20 °C. Por conseguinte, a composição presente não só preserva o DNA de alto peso molecular intacto, com várias rodadas de congelamento e descongelamento, a mesma também estabiliza o perfil de microbioma, dramaticamente reduzindo o viés associado a essas condições de armazenamento.

Exemplo 7 - Homogeneização de Amostras Fecais Coletadas na Presente Composição

[00236] Como descrito acima, os inventores experimentaram com inúmeros materiais diferentes, que podem ser usados em tubos de 10 mL de laboratório e/ou de transporte padrão comercialmente disponíveis (92 mm x 15,3 mm, diâmetro interno de cerca de 12,9 mm) para completamente e confiantemente homogeneizar as amostras fecais de todos os tipos (1-7, escala de fezes humana de Bristol). Determinou-se que a mistura deve ser feita à mão e em um período relativamente curto de tempo (dentro de 180 segundos) para garantir que os doadores irão cumprir e fornecer consistentemente as amostras biológicas estabilizadas. Uma pessoa versada na técnica vai entender como selecionar um meio de homogeneização adequado para recipientes maiores ou menores do que aqueles usados nos presentes exemplos (Consulte a Descrição Detalhada).

[00237] Uma seringa descartável de 3 mL de padrão foi modificada para coletar e transferir uma quantidade pequena e volumétrica de fezes dentro do tubo de coleta acima contendo a presente composição ("104B pH 11", definida acima) e meios de homogeneização. A ponta ou o encaixe afunilado da agulha da seringa foi cortado para expor o cano de diâmetro uniforme. O êmbolo foi configurado para uma posição que facilitou a coleta de uma quantidade consistente de fezes, por exemplo, 400 mg, quando foi empurrado para um recipiente contendo fezes. Um pequeno orifício foi perfurado no barril da seringa para o ar escapar durante a coleta de amostra fecal. A seringa com amostra carregada foi transferida para a abertura do tubo e o êmbolo foi pressionado, depositando 400 mg de amostra no tubo contendo 2 mL de solução de estabilização e meio de homogeneização (por exemplo, esfera de homogeneização, especificada abaixo). O tubo foi tampado e sacudido à mão por cerca de 20-40 segundos, mais tempo (1-3 minutos) para amostras duras do tipo 1 (veja abaixo). Após sacudir vigorosamente a amostra em um movimento de vai e vêm, na presença dos meios de homogeneização, a amostra fecal foi distribuída na solução de estabilização.

[00238] Quando o recipiente selecionado é um tubo/frasco de laboratório ou transporte, uma "bola" ou "esfera" de homogeneização de tamanho, forma e densidade apropriados é crítica para a dispersão completa de amostras não homogêneas e complexas na presente composição. A homogeneização completa da amostra coletada no momento de coleta também é crucial para a estabilização ideal do DNA humano e microbiano, como evidenciado pela presença de DNA de alto peso molecular intacto assim como a estabilização do perfil de microbioma como exemplificado através de PCR do gene de rRNA 16S bacteriano e análise de DGGE de amplicons. Como descrito acima, para um meio de homogeneização esférico, o fundo do tubo/frasco de transporte também deve ser redondo, espelhando a forma dos meios de homogeneização, para impedir que a matéria sólida seja compactada em espaços vazios dentro do tubo. Por exemplo, a homogeneização ideal das amostras fecais (particularmente de tipo 1-3) com meio de homogeneização esférica é muito difícil de alcançar com tubos cônico - ou de fundos planos. Um meio de homogeneização esférico não pode fazer contato direto com superfície cônica nem ângulos de 90 graus em que as paredes de tubo verticais cruzam a base, causando compactação da matéria fecal nesses espaços/áreas vazios.

[00239] As seguintes Tabelas 8 a 10 ilustram alguns dos diferentes materiais comercialmente disponíveis testados pelos inventores para encontrar meios de homogeneização ideais para um tubo de laboratório/transporte padrão (por exemplo, n° de Cat. 60.610, Sarstedt).Tabela 8. Tempo (segundos) de mistura para esferas de material, diâmetro e número diferente.Tabela 9. Tempo (segundos) de mistura para esferas de aço inoxidável de diâmetro diferente.Tabela 10. Tempo (segundos) de mistura para esferas de aço inoxidável de diâmetro e número diferentes.

[00240] ND, não determinado; X, > 180 segundos

[00241] As fezes de amostra de tipos 1 e 2 são muito densas e contêm pouca água, tornando-as impenetráveis para a dispersão à mão na presente composição dentro de um período razoável de tempo (< 3 minutos), sem meios de homogeneização. Para fezes mais macias (tipo 3-6) um meio de homogeneização ainda foi necessário e a duração da mistura do tubo à mão reduziu consideravelmente com o aumento do tipo de amostra (Tabelas 8-10). Um meio de homogeneização não foi essencial para dispersar a amostra de tipo 7 ou diarreia com a presente composição. Nesse contexto, o propósito do "homogeneizador" foi romper e dispersar completamente uma amostra de sólido ou semissólido não homogêneo através de solução de estabilização, sem o uso de eletricidade ou baterias.

[00242] As características importantes do meio de homogeneização incluem 1) a densidade do material, 2) o tamanho com relação ao diâmetro interior do recipiente para a amostra biológica e 3) a forma em relação ao recipiente. Vidro (cerca de 2,0-4,5 g/cm3/poli(metil metacrilato or PMMA (cerca de 1,2 g/cm3)/sílica (cerca de 1,6-2,0 g/cm3)/zircônia (cerca de 6,02 g/cm3)/acetato de celulose (cerca de 1,3 g/cm3)/polietileno (cerca de 0,9-1,3 g/cm3) partículas (< 1,2 mm) e pequenas microesferas (<4mm) não foram dimensionadas, nem densas o bastante, para funcionar como um homogenizador para fezes de tipo 1-4 dentro de um tubo de laboratório padrão, tendo um diâmetro interno de 12,9 mm (Tabela 8). Importante, mesmo esferas grandes de 7,9 mm feitas de óxido de alumina (3,95 g/cm3) ou nitreto de silício 7,1-7,9 mm (3,21 g/cm3) e bolinhas de vidro de 12,7 mm não foram capazes de dispersar amostras de fezes de tipo 1-3 (400 mg) em 2 mL da presente composição em menos de 180 segundos (Tabela 8). Surpreendentemente, mesmo depois de 180 segundos de agitação do tubo a matéria sólida e dura permaneceu intacta na presente composição. Esses resultados experimentais conduziram para o teste de materiais mais densos, isto é, densidades > 3,95 g/cm3. Infelizmente, as esferas com densidades entre 3,95 g/cm3 e 7,6 g/cm3 não eram comercialmente disponíveis e, portanto, não podiam ser testadas com amostras fecais.

[00243] Em seguida, o aço inoxidável (7,6-7,9 g/cm3, Tabelas 9 e 10) e esferas de carboneto de tungstênio (15,63 g/cm3, Tabela 8) foram testadas com 400 mg de amostras fecais em 2 mL da composição presente dentro de um tubo de fundo redondo. Surpreendentemente, mesmo amostras fecais de tipo 1 similares a caroço duras foram homogeneizadas por 7,1-7,9 mm de carboneto de tungsténio e esferas de aço inoxidável de 7,1-8,7 milímetros na < 140 e <180 segundos, respectivamente. As amostras de tipo 2 foram homogeneizadas por esferas de 7,1-7,9 mm de carboneto de tungstênio e 7,1-8,7 mm de aço inoxidável em < 40 segundos e <80 segundos, respectivamente. As esferas de carboneto de tungstênio (7,1 - 7,9 mm) e de aço inoxidável (7,1-8,7 mm) homogeneizaram as amostras de tipo 3 em < 30 e < 80 segundos, as amostras de tipo 4 em < 15 e < 55 segundos, as amostras de tipo 5 em < 15 e 50 segundos e a amostra do tipo 6 em < 10 e < 22 segundos, respectivamente.

[00244] Similarmente, as esferas com densidades entre 7,9 g/cm3 a 15,63 g/cm3 não puderam ser originadas ou testadas; no entanto, um indivíduo versado na técnica esperaria que tal meio de homogeneização desfaça as amostras fecais certamente em menos de 180 segundos no intervalo de tamanho 7,1-8,7 mm. Exclusivamente para custo e a facilidade de aquisição, as esferas de aço inoxidável foram preferidas às bolas de carboneto de tungstênio e o diâmetro ideal foi 7,1-8,7 mm de diâmetro. A adição de uma segunda esfera do mesmo tamanho provou geralmente ser benéfica na redução do tempo de mistura (Tabelas 8 e 9). Em alguns casos, as combinações de esferas de mais de um tamanho foram benéficas para reduzir o tempo necessário para homogeneizar as amostras fecais (Tabela 10).

[00245] Dado que as esferas de 7,1-8,7 mm desempenharam melhor em tubos com diâmetro interno de 12,9 mm, cerca de 2,1-2,9 mm de folga em qualquer os lados da esfera forneceram o ajuste ideal no tubo para homogeneizar a amostra em um curto período de tempo. Quando as esferas de aço inoxidável foram < de 5,6 mm ou > 9,5 mm de diâmetro, o tempo de mistura para as amostras fecais do tipo duro (1-4) aumentou. Portanto, dado esses resultados para amostras fecais que varia em consistência do sólido ao líquido, as esferas de aço inoxidável de 7,9 mm foram, preferencialmente, empregadas como meio de homogeneização nos exemplos descritos neste documento, salvo indicação em contrário.

Exemplo 8 - Estabilização de Perfil Microbiota de Intestino Usando a Presente Composição

[00246] A análise da microbiota de intestino foi de interesse crescente aos pesquisadores que investigam os papéis benéficos e deletérios de micro-organismos na saúde humana. Para qualquer análise da microbiota de intestino, é essencial capturar com precisão uma "imagem" do perfil de microbiota (isto é, garantindo que a abundância relativa das Unidades Taxonômicas Operacionais [OTU] permaneçam inalterada do tempo de coleta ao tempo de análise e processamento de amostra) que representa o estado in vivo; dessa forma, a estabilização da amostra no momento da coleta é de suma importância a esses estudos. Os métodos atuais para a análise microbiota e coleta de amostra de fezes envolvem transporte das amostras à temperatura ambiente, a 4°C ou congelados. No entanto, esses métodos têm o potencial para expor as amostras a temperaturas incompatíveis com a estabilização de microbioma e congelar as amostras de fezes mostrou anteriormente para alterar a razão de Firmicutes em relação a Bacteroide (Bahl et al, (2012) FEMS Microbiol Letters 329: 193-197).

[00247] Neste exemplo, a estabilidade de microbioma foi avaliada utilizando um método sensível e comercialmente disponível, a sequenciação de rRNA 16S da região hipervariável V4. Para esse estudo, quatro doadores, cada um, coletaram uma amostra de fezes humana e colocaram quantidades iguais de amostra (400 mg) em três tubos sem solução de estabilizadora e seis tubos com solução de estabilização (300 mM de CDTA, 0,5% de SDS, 23,5% de etanol, 0,1% de Antiespuma A, 0,2% de Triclosan, pH 9,5) e uma esfera de mistura de aço inoxidável de 7,9 mm. Os doadores transportaram as amostras para o laboratório em temperatura ambiente, em que alíquota de T = 0 (250 μL ou 250 mg) foi removida e o DNA extraído usando o PowerFecalTM DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories). Uma amostra por doador por condição de estabilização foi armazenada em cada uma das temperaturas teste (-20 °C, 4 °C, 23 °C, 37 °C - em somente em solução de estabilização) por 3 e 14 dias, seguido da extração de DNA. Uma amostra em solução de estabilização foi exposta a cinco ciclos de congelamento e descongelamento.

[00248] Nos pontos no tempo indicados, o DNA das alíquotas foi extraído e enviados para preparação, sequenciamento e bioinformática da biblioteca de sequenciamento de rRNA 16S. O sequenciamento de aplicon de extremidade emparelhada de região hipervariável V4 foi realizado usando Illumina® MiSeq® (250 ciclos).

[00249] As Figuras 19 e 20 apresentaram dados que indicam que as amostras totalmente preservadas em solução de estabilização têm alto grau de similaridade em abundância OTU.

[00250] Na Figura 19, a análise de coordenadas principais (PCoA) com base em valores de dissimilaridade unifrac ponderados demonstrou em dois doadores (B e D) que as amostras armazenadas em solução de estabilização ao longo de diferentes temperaturas (-20 °C, 4 °C, temperatura ambiente, 37 °C) e tempo (dias 3 e 14) apresentam um elevado nível de similaridade em abundância de OTU conforme mostrado pelo agrupamento unido no gráfico de PCoA (amostras armazenadas em tampão de estabilização têm números de identificação da amostra com um 4-9 como primeiro dígito, por exemplo, D4 e B4, e são agrupadas em círculos "Com Estabilizador" para cada doador). Em contraste, as amostras armazenadas sem solução de estabilização (amostras com números de identificação com 0-3 como primeiro dígito, por exemplo, D3-1 e B3-1 e agrupadas em círculos "Sem Estabilizador" para cada doador) demonstraram uma perda de similaridade em abundância de OTU como mostrado pelas maiores distâncias entre as amostras. Importante, ao avaliar a presença ou ausência de OTUs, houve uma diferença estatisticamente significativa entre amostras estabilizadas e aqueles sem solução de estabilização em todos os quatro doadores (p = 0,002, 0,002, 0,002 e 0,009 respectivamente, medição de Unifrac). As maiores alterações de perfil foram observadas em amostras armazenadas a -20 °C, sem solução de estabilização (amostras B2-1, B2-2, D2-1 e D2-2 nos gráficos PCoA), que foram significativamente diferentes das amostras armazenadas a -20 °C em solução de estabilização (p = 0,028, medição Ponderada de Unifrac); mostrando, assim, que armazenar as amostras na solução de estabilização inovadora pode impedir as alterações no perfil microbiano observadas em amostras congeladas não estabilizadas (Figura 19).

[00251] Na Figura 20, a abundância proporcional no nível de família demonstra uma mudança na composição das amostras armazenadas sem a presente solução de estabilização em várias temperaturas ao longo do tempo (dias 3 e 14). Em particular, um aumento de Lachnospiraceae, Ruminococcaceae e Prevotellaceae e uma perda de Bacteroidaceae é observada em amostras do doador D sem solução de estabilização em relação à linha de base. Em contraste, as amostras armazenadas com a solução de estabilização ao longo das várias temperaturas e tempo mantiveram a composição microbiana da amostra em comparação à amostra de linha de base.

[00252] Esses dados sugerem que a fim de correlacionar robustamente as alterações de microbiota de intestino ao fenótipo de interesse, é importante ter uma maneira reprodutível de estabilizar o perfil no ponto de coleta, algo que os métodos atuais de estabilização com base em temperatura não são capazes de atingir eficazmente. A química de estabilização demonstrada aqui tem a capacidade de manter o perfil in vivo do microbiota de intestino (isto é, agrupamento unido de OTUs) em diferentes temperaturas de transporte, permitindo que os pesquisadores melhorem a confiabilidade dos dados e comparação de entre estudos. Essa estabilização química também irá aumentar a facilidade de autocoleta sem supervisão e permitirá excepcionalmente estudos em grande população que atualmente são logisticamente difíceis.

Exemplo 9 - Estabilização de DNA Humano na Presente Composição

[00253] Consulte a seção de Materiais e Métodos para obter mais detalhes na coleta de amostra fecal, extração e quantificação de DNA e amplificação de DNA humano.

[00254] Três doadores saudáveis foram fornecidos instruções e materiais para coletar uma amostra fecal em casa. Depois de defecar em um recipiente grande fixado à toalete, aproximadamente 400 mg de fezes foi imediatamente transferido para um tubo de fundo redondo de 10 mL contendo 2 mL da presente composição ("104B pH 11", definido acima) e uma esfera de aço inoxidável de de 7,9 mm. Depois de tampar o tubo, os doadores sacudiram o tubo fechado por cerca de 20 segundos para homogeneizar a amostra na composição. Os doadores geralmente retornaram as amostras homogeneizadas ao laboratório à temperatura ambiente dentro de 3-4 horas de coleta. No laboratório, T = 0 de alíquota (250 μL) foi removida de cada tubo e o restante foi armazenado à temperatura ambiente (RT) durante 14 dias, tempo no qual foi retirada uma segunda alíquota (250 μL).

[00255] O DNA foi purificado de cada alíquota usando PowerFecal®DNA Isolation Kit; o rendimento de DNA foi quantificado usando a tintura fluorescente PicoGreen® e um método fluorométrico (ver Materiais e Métodos). DNA humano purificado a partir das amostras fecais de T = 0 e T = 14 dias foi amplificado em tempo real ou PCR quantitativo (qPCR) usando iniciadores que alvejam o gene de sintase de timidilato humana de única cópia. A mudança nos valores Ct (ΔCt), isto é, a diferença de valores Ct triplicados resultante de alíquotas purificadas de T = 0 e T = 14 dias tomadas da mesma amostra, é mostrada na Tabela 11 abaixo. Para cada doador, a quantidade de DNA humano detectada em amostras purificadas em T = 0 e T = 14 dias é equivalente. Com menos de uma diferença de ciclo no DNA das amostras fecais processadas imediatamente ou armazenadas por 2 semanas à RT, esse exemplo demonstra que o DNA humano é estável na presente composição para todos os três doadores.Tabela 11. Alteração nos valores de Ct para DNA humano em amostras fecais armazenados à temperatura ambiente durante 14 dias ou processados em T = 0.

Exemplo 10 - A Presente Composição Estabiliza o Perfil de Microbioma à Temperatura Ambiente por 14 Dias e em Condições de Transporte Simuladas

[00256] A presente composição possibilita a autocoleta fácil e estabilização de DNA microbiano de fezes para realização de microbioma de intestino. É excepcionalmente capaz de tirar uma imagem do perfil microbiano no momento da coleta e mantê-lo durante 14 dias à temperatura ambiente.

[00257] Nesse exemplo, seis doadores saudáveis foram fornecidos instruções e materiais para coletar uma amostra fecal em casa. Depois de defecar em um recipiente grande fixado à toalete, aproximadamente 400 mg de fezes foi imediatamente transferido para um tubo de fundo redondo de 10 mL contendo 2 mL da presente composição ("104B pH 11", definido acima) e uma esfera de aço inoxidável de de 7,9 mm. Depois de tampar o tubo, os doadores sacudiram o tubo fechado por cerca de 20 segundos para homogeneizar a amostra na composição. Cada um dos 6 doadores coletou 3 amostras da mesma amostra fecal a granel (n = total de 18) na presente composição. Além disso, 400 mg de alíquotas de fezes frescas foram coletadas a partir da mesma amostra fecal a granel para cada doador e transportada em tubos de 10 mL vazios em uma caixa de isopor com bolsas de gelo congeladas conforme procedimento padrão do Human Microbiome Project (Manual of Procedures - Human Microbiome Project, 2010).

[00258] As extrações de DNA de linha de base foram realizadas dentro de 3 horas antes da coleta. Para análise de linha de base, uma alíquota de 0,25 mL foi tomada de amostras de 104B pH 11 e extraídas usando o Kit de isolamento de PowerFecal®DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.). Cada amostra de 0,25 mL continha cerca de 50 mg de fezes e 200 μl de líquido de estabilização, 104B pH 11. As quantidades equivalentes de fezes (aproximadamente 50 mg) foram extraídas das amostras frescas instabilizadas. O restante de 104B pH 11 e amostras frescas instabilizadas foram aliquotadas e armazenadas à temperatura ambiente (23±3 °C) por 14 dias ou expostos às condições de transporte simuladas (50 °C para 1 dia, 37 °C, durante 3 dias ou 3 ciclos de congelamento e descongelamento em que um ciclo consistia em um mínimo de 3 horas a -20 °C e um mínimo de 3 horas a 30 °C). Além disso, uma alíquota de fezes humanas frescas de cada doador foi armazenada a -80 °C como um controle. Após o dia 14 manter as condições de transporte simuladas à temperatura ambiente ou -80 °C, uma segunda alíquota foi extraída de todas as amostras usando o PowerFecal DNA Isolation Kit.

[00259] Rendimento e a concentração de DNA foram determinados usando o reagente Quant-iT™ PicoGreen® (Life Technologies). A integridade de DNA e a estabilidade ao longo do tempo foram avaliadas através da execução de cerca de 50 ng do DNA purificado em um gel de agarose 0,8% e coloração com brometo de etídio. Uma escada de Lambda Hind III foi usada para determinar o tamanho do DNA purificado.

[00260] Preparação, sequenciamento e bioinformática de biblioteca de sequenciamento rRNA 16S foram conduzidos por Metanome, Microbiome Discovery Service. O sequenciamento de aplicon de extremidade emparelhada de região hipervariável V4 foi realizado usando Illumina® MiSeq®. Usando QIIME e scripts personalizados, as sequências foram filtradas quanto à qualidade. As leituras de extremidade emparelhadas foram reunidas e comparadas com o banco de dados Greengenes, agrupados em 96% por UCLUST. Após a normalização de dados, distância de amostra para amostra foi medida usando UniFrac ponderado em dados de abundância em Unidades Taxonômicas Operacionais (OTU) (utiliza diferenças de abundância de táxon nas amostras, empregando uma normalização por pares, dividindo a soma das diferenças pela soma de todas as abundâncias). As distâncias de Bray-Curtis foram medidas usando normalização por pares dividindo a soma das diferenças pela soma de todas as abundâncias de OTU detectadas. Em todas as medições de Bray-Curtis, uma amostra fresca correspondente ao doador que foi extraída logo após a coleta foi usada como um lado da comparação em pares. A análise de Índice de Shannon (SI) para cada método de estabilização foi realizada medindo-se a proporção de cada OTU em relação ao número total de OTUs e, em seguida, multiplicado pelo logaritmo natural dessa proporção. Somatório do produto resultante através das todas OTUs produziu SI para cada amostra. Métodos de coleta de amostra foram comparados usando o teste de Mann-Whitney.

Resultados A presente composição mantém a neutralidade do perfil microbioma no ponto-de-coleção

[00261] O estudo da microbioma requer que o perfil gerado represente as comunidades microbianas in vivo presentes no dador; assim, o método de coleta e estabilização não deve apresentar alterações para o microbioma. O uso tampões de estabilização química pode potencialmente modificar a composição microbiana da amostra mediante aceleração do crescimento de alguns micróbios permitindo a decadência de outros. Em condições ideais, o líquido de estabilização deve ser neutro (isto é, não deve apresentar qualquer viés ao microbioma). A comparação do perfil de microbioma de rRNA 16S de amostras t = 0 estabilizada com 104B pH 11 e de frescas mostraram que a presente composição mantém um perfil neutro e não apresenta viés (Figura 21).

[00262] O estudo da abundância de OTU relativa por diferentes métodos estatísticos (por exemplo, UniFrac Ponderado) fornece uma valiosa descrição da comunidade microbiana; no entanto, pode obscurecer a compreensão da comunidade microbiana, minimizando a contribuição de micróbios de baixa abundância. Um estudo adequado do perfil de microbioma exige a preservação da "riqueza" das comunidades microbianas. A riqueza é definida como a enumeração das espécies microbianas (OTUs) presentes na amostra e é altamente suscetível às condições ambientais, incluindo as mudanças de temperatura, pH, concentração de oxigênio e composição química. Esses e outros fatores podem induzir o crescimento bacteriano ou deterioração, alterando, assim, a quantidade de OTUs detectadas na amostra.

[00263] As amostras estabilizadas de 104B pH 11 e frescas de 6 doadores foram extraídas logo após a coleta. As OTUs microbianas identificadas nas amostras de 104B pH 11 foram comparadas aos OTUs presentes em amostras frescas correspondentes. O Índice de Shannon (SI) para a diversidade foi calculada mediante conversão dos dados de abundância de OTU em chamadas de presença/ausência. O teste de Mann-Whitney nos valores de SI não mostrou a diferença significativa entre 104B pH 11 e amostras frescas, indicando que o 104B pH 11 não teve nenhum impacto sobre a riqueza das amostras (Figura 22).

Fontes de variabilidade na coleta de amostra fecal

[00264] A análise de bray-Curtis mostrou dissimilaridade sistemática dentro de réplicas de amostras de t = 0 104B pH 11 e frescas. Para entender as fontes de tal dissimilaridade, a variabilidade introduzida durante a coleta e processamento das amostras fecais foi avaliada. Variabilidade biológica foi avaliada gerando-se perfis de microbioma de três amostras coletadas frescas e três de 104B pH 11 em diferentes locais dentro da mesma amostra geral. A variabilidade técnica foi abordada usando amostras de coletadas de 104B pH 11, devido ao fato de que esse sistema de coleta fornece amostras líquidas homogeneizadas, reduzindo erros experimentais durante o processamento. Os perfis de extrações de DNA de replica do mesmo tubo (variabilidade de extração) e replicar PCR/sequenciamento do mesmo DNA (variabilidade de sequenciamento) foram comparados. As distâncias de dissimilaridade de Bray Curtis foram geradas dentro dos grupos de replicação e são mostradas na Figura 23.

[00265] A variabilidade semelhante foi observada em réplicas biológicas de amostras coletadas frescas e de 104B pH 11 (distâncias Bray-Curtis 0,14 ±0,01 e 0,11 ±0,01, respectivamente). A análise mostrou que a variabilidade técnica e biológica introduz algumas dissimilaridades ao perfil de microbioma de rRNA 16S (distâncias de variabilidade biológica de Bray-Curtis 0,11; variabilidade de extração 0,09 e variabilidade de sequenciamento 0,08). Em conclusão, a fonte da dissimilaridade observada pode ser explicada pela variabilidade biológica ou técnica e que 104B pH 11 não introduz qualquer viés.

104B pH 11 efetivamente preserva os perfis de microbioma pelo menos 14 dias à temperatura ambiente

[00266] Em adição a manter a neutralidade de perfil, o estudo da microbioma exige a preservação precisa da estrutura de comunidade microbiana ao longo do tempo. Avaliou-se a capacidade dos 104B pH 11 para estabilizar as amostras durante o armazenamento a 23° C durante 14 dias.

[00267] As amostras frescas e estabilizadas com 104B pH 11 foram extraídas no Tempo Zero (T0) e novamente depois de armazenamento à temperatura ambiente (23 °C) por 14 dias. As amostras frescas também foram armazenadas a -80 °C por 14 dias como um controle. A similaridade das amostras foi avaliada usando distâncias de Bray- Curtis. A análise de Mann-Whitney não mostrou diferenças significativas entre amostras de 104B pH 11 a 23 °C por 14 dias e amostras de -80 °C, quando comparado às amostras frescas correspondentes (Figura 24). Em contraste, as amostras desestabilizadas mostraram dissimilaridade significativa quando em comparação ao controle a -80 °C controle ou 104B pH 11 armazenado à temperatura ambiente.

[00268] A fim de compreender a reprodutibilidade entre as repetições, uma análise de agrupamento de Unifrac ponderado foi realizada usando amostras coletadas frescas e 104B pH 11 (T0 e T14 dias) e amostras instabilizadas (T14 dias). O dendrograma resultante (Figura 25) mostra agrupamentos unidos entre amostras estabilizadas frescas e 104B pH 11, mesmo depois de 14 dias (96% de similaridade). As amostras instabilizadas agrupadas juntamente com uma separação elevada do perfil fresco (~63% de similaridade). A estabilização adequada, portanto, tem um grande efeito no perfil de agrupamento ao longo do tempo.

104B pH 11 efetivamente preserva o perfil de microbioma em condições de transporte simulado.

[00269] As amostras são geralmente expostas às condições indesejáveis durante o transporte do ponto de coleta para o laboratório de processamento. Para simular condições de transporte padrão, amostras estailizadas de 104B pH 11 e instabilizadas foram expostas a 50 °C por 1 dia, 37 °C por 3 dias ou vários ciclos de congelamento- descongelamento (F/T). As tiras de DNA de alto peso molecular preservadas com 104B pH 11, enquanto que amostras instabilizadas mostraram vários graus de degradação, particularmente quando expostas a ciclos de 50 °C ou congelamento-descongelamento (Figura 26).

[00270] Finalmente, a análise de rRNA 16S confirmou que 104B pH 11 preservou a estrutura de comunidade microbiana mesmo em temperaturas extremas. O teste de Mann-Whitney comparando as distâncias de Bray-Curtis de amostras de 104B pH 11 submetidas a temperaturas de transporte comuns e amostras emparelhadas mantidas a -80 °C mostraram que não houve diferença significativa. Por outro lado, as amostras instabilizadas mantidas a 37 °C ou submetidas a ciclos congelamento-descongelamento mostrou diferenças significativas quando em comparação às amostras mantidas a -80 °C (Figura 27).

Conclusões

[00271] Estabilização, no contexto de metagenômica, é um atributo multidimensional que engloba: a) neutralidade (capacidade de capturar perfis sem viés), b) reprodutibilidade (material de amostra homogênea da qual pode ser tomada alíquotas altamente concordantes) e c) integridade (peso molecular), medida ao longo do tempo. Com base em experiências rigidamente controladas e uma análise rigorosa, microbiota do intestino efetivamente estabilizada 104B pH 11 em fezes humanas através de condições de manuseio e transporte de vida real. Isso é de importância extrema o dimensionamento econômico de MWAS, assim como otimizar a qualidade de dados para verificação de biomarcador e desenvolvimento.

Exemplo 11 - Estudos adicionais sobre o papel de agentes de quelação na estabilização da amostra a temperaturas elevadas

[00272] A estabilidade do perfil microbial na amostra também é sensível a elevadas temperaturas. Nessas condições não apenas as nucleases prejudiciais podem ser potencialmente ativadas, mas também algumas espécies podem começar a proliferar. A presença de um agente de quelação (CDTA) é especialmente benéfica nesse caso para interromper a ação das DNAses, bem como inibir o crescimento bacteriano.

[00273] Nesse experimento, os doadores saudáveis coletaram fezes e transferiram 400 mg de fezes para um tubo contendo uma esfera de aço inoxidável de 7,9 mm e 2 mL da presente composição com concentrações finais variadas do agente de quelação (CDTA): a) 300 mM de CDTA, 50 mM de β-alanina, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,1% de antiespumante, pH 11 ("104B pH11"); b) 150 mM de CDTA, 50 mM de β- alanina, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,1% de antiespumante A, pH 11 ou c) 50 mM de β- alanina, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,1% de antiespumante A, pH 11 (nenhum agente de quelação). As amostras nos tubos foram homogeneizadas com sacudir de mãos (misturar) e depois retornaram para o laboratório sob condições de temperatura ambiente. Em 24 horas desde a coleta da amostra, uma alíquota de 250 μL foi removida de cada tubo para extração de DNA (T=0). As amostras coletadas foram então armazenadas a 40°C por 5 dias (T=5) antes da extração do DNA de uma segunda alíquota. O DNA purificado foi quantificado e então resolvido como perfis de comunidade bacteriana ou impressões digitais usando DGGE para separar amplicons de PCR de rRNA 16S. A similaridade percentual entre as amostras (faixas em gel de DGGE) em comparação com as amostras de controle em T = 0 para cada composição foi calculada separadamente usando o software Syngene GeneTools (consultar Materiais e Métodos).

[00274] A Figura 28 demonstra similaridades percentuais superiores ou uma estabilidade de perfil de microbioma a elevadas temperaturas entre as amostras do "dia 5" e "dia 0" para a presente composição quando o CDTA estiver presente a uma concentração de 150 mM ou 300 mM em comparação à composição sem CDTA. Isso indica que um agente de quelação é necessário na presente composição para manter a estabilidade do perfil microbiano a elevadas temperaturas. Para as composições com 300 mM e 150 mM de CDTA, os perfis microbianos no "dia 5" foram 96% e 95% similares, respectivamente, em comparação ao "dia 0" quando as amostras de fezes foram armazenadas a 40°C. Em comparação, o perfil microbiano no "dia 5" na composição sem CDTA foi de 71% em comparação ao "dia 0", quando as fezes foram armazenadas a 40°C.

Exemplo 12 - Estabilização superior das amostras na composição atual em comparação às composições da técnica anterior

[00275] Os ácidos nucleicos nas amostras dos pacientes tendem a degradar após eles terem sido removidos dos pacientes. Essa degradação pode diminuir a eficácia de um ensaio de integridade de ácido nucleico que marca uma amostra como doente (por exemplo, cancerosa) com base na presença de ácidos nucleicos intactos. AP Shuber e DH Whitney (US 2008/0124714) descrevem um método para estabilizar ácidos nucleicos em amostras de tecido e fluido corporal, a solução de estabilização incluindo um tampão, um sal e um agente de quelação (por exemplo, "tampão de TEN").

[00276] Nesse experimento, os doadores saudáveis coletaram fezes e transferiram 400 mg de fezes em um tubo contendo uma esfera de aço inoxidável única de 7,9 mm e 2 mL da presente composição (Composição 1; 300 mM de CDTA, 50 mM de β- alanina, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,1% de antiespumante A, pH 11 ("104B pH 11")) ou ii) aproximadamente 400 mg de fezes em um tubo contendo 2 mL de "tampão de TEN" (Composição 2; 10 mM de Tris- HCl, 1 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, pH 8, US 2008/0124714). As amostras em ambos os tubos foram homogeneizadas com sacudir de mãos (misturar) e depois retornaram para o laboratório sob condições de temperatura ambiente. Dentro de 24 horas desde a coleta de amostra, 250 μL de alíquota foi removida de cada tubo para extração de DNA (T = 0) e em seguida armazenadas em condições de temperatura ambiente por 21 dias (T = 21) antes da extração de DNA de uma segunda alíquota. O DNA purificado foi quantificado e então resolvido como perfis de comunidade bacteriana ou impressões digitais usando DGGE para separar amplicons de PCR de rRNA 16S. A similaridade percentual entre as amostras (faixas em gel de DGGE) em comparação com as amostras de controle em T = 0 para cada composição foi calculada separadamente usando o software Syngene GeneTools (consultar Materiais e Métodos).

[00277] A Figura 29 ilustra uma estabilidade de perfil de microbioma e similaridades percentuais superiores entre as amostras do "dia 21" e do "dia 0" para a presente composição em comparação à composição do tampão de TEN, indicando que a presente composição oferece uma estabilidade de DNA melhorada em relação às outras composições conhecidas na técnica. Os perfis microbianos do doador A e B no "dia 21" foram 82% e 94% similares, respectivamente, em comparação ao "dia 0" quando as amostras de fezes foram armazenadas na presente composição de "104B pH 11". Em comparação, os perfis microbianos do doador A e B no "dia 21" foram 70% e 50% similares, respectivamente, em comparação ao "dia 0" quando as amostras de fezes foram armazenadas na presente composição de US 2008/0124714.

[00278] US2008/0124714 também faz referência a um "tampão de estabilização" consistindo em 0,5 M de Tris; 0,15 de EDTA e 10 mM de NaCl (pH 9,0) na seção Materiais e métodos em [0059]. Entretanto, nota-se que o único tampão de estabilização/solução referenciados com especificidade nos Exemplos subsequentes é o "tampão de TEN" observado acima, e as reivindicações e ensinamentos da descrição acerca da solução de estabilização também são voltados às modalidades concernentes ao "tampão de TEN". Desse modo, não fica aparente se o "tampão de estabilização" foi testado ou se ele funcionaria nos métodos ensinados em US 2008/0124714. Todavia, foi conduzido um estudo comparativo comparando a performance do "tampão de estabilização" acima de US 2008/0124714 em relação à presente composição contendo 150 mM de CDTA, 50 mM de β- alanina, 23,5% de etanol, 0,5% de SDS, 0,1% de antiespumante A, pH 11, sob as mesmas condições descritas no Exemplo 1.

[00279] Durante a avaliação de estabilidade do microbioma com composição e tempo, a amplificação utilizando PCR do gene de rRNA 16S bacteriano e análise de DGGE dos amplicons mostraram que a presente composição com 150 mM de CDTA a um pH 11 manteve uma maior similaridade percentual (86%) para o controle (T=0) após uma incubação de 30 dias do que o "tampão de estabilização" de US 2008/0124714 contendo EDTA a 150 mM em pH 9,0 (79%).

[00280] As composições do presente pedido preveem, portanto, uma estabilização superior dos perfis de microbioma nas amostras fecais em relação às composições divulgadas em US 2008/0124714. Referências 1. Lee YK and Mazmanian SK (2010) Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system? Science 24: 1768-1773. 2. Aries V, Crowther JS, Drasar BS, Hill MJ, Williams REO (1969) Bacteria and the aetiology of cancer of the large bowel. Gut 10: 334-335. 3. Moore WEC and Moore LH (1995) Intestinal floras of populations that have a high risk of colon cancer. Applied Envir Microbiol 61 (9): 3202-3207. 4. Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, Chang Y, Vogelman JH, Orentreich N, Sibley RK (1991) Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 325: 11271131. 5. Grenham S, Clarke G, Cryan JF, Dinan TG (2011) Brain gut-microbe communication in health and disease. Front Physio 2: 94. 6. Kinross JM, Darzi AW, Nicholson JK (2011) Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine 3:14. 7. Van Nood Els et al. (2013) Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. N Engl J Med 368 (5): 407-415. 8. Apajalahti JHA, Kettunen A, Nurminen PH, Jatila H, Holben WE (2003) Selective plating underestimates abundance and shows differential recovery of Bifidobacterial species from human feces. Appl Environ Microbiol 69(9): 5731-5735. 9. O'Sullivan D (2000) Methods for analysis of the intestinal microflora. Current Issues in Intestinal Microbiology 1(2): 39-50. 10. Walker AW, Ince J, Duncan SH, Webster LM, Holtrop G, Ze X, Brown D, Stares MD, Scott P, Bergerat A, Louis P, McIntosh F, Johnstone AM, Lobley GE, Parkhill J, Flint HJ (2011) International Society for Microbial Ecology Journal 5: 220-230. 11. Wu GD, Chen J, Hoffmann C, Bittinger K, Chen Y-Y, Keilbaugh SA, Bewtra M, Knights D, Walters WA, Knight R, Sinha R, Gilroy E, Gupta K, Baldassano R, Nessel L, Li H, Bushman FD, Lewis JD (2011) Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science 334: 105-108. 12. Ley RE, Knight R, Gordon JI (2007) The human microbiome: eliminating the biomedical/environmental dichotomy in microbial ecology. Environ Microbiol 9: 3-4. 13. Bahl MI, Bergstrom A, Licht TR (2012) Freezing fecal samples prior to DNA extraction affects the Firmicutes to Bacteroidetes ratio determined by downstream quantitative PCR analysis. FEBS Microbiol Lett 329: 193-197. 14. Olson J, Whitney DH, Durkee K, Shuber AP (2005) DNA stabilization is critical for maximizing performance of fecal DNA-based colorectal cancer tests. Diagn Mol Pathol 14(3): 183-191. 15. Song Y, Garg S, Girotra M, Maddox C, von Rosenvinge EC, Dutta A, Dutta S, Fricke WF (2013) Microbiota dynamics in patients treated with fecal microbiota transplantation for recurrent Clostridium difficile infection. PLOS ONE 8(11): 1-11. 16. Van der Giessen JWB, Eger A, Haagsma J, Haring RM, Gaastra W, van der Zeijst BAM (1992) Amplification of 16S rRNA sequences to detect Mycobacterium paratuberculosis. J Med Microbiol 36: 255-263. 17. Hurley SS, Splitter GA, Welch RA. Test for Johne's Disease. US 4,918,178 18. Kojima K. Process of extracting nucleic acid and process of simultaneously carrying out extraction and purification of nucleic acid. US 6,852,495 19. Ariefdjohan MW, Savaiano DA, Nakatsu CH (2010) Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutr J 9: 23. 20. Smith B, Li N, Andersen AS, Slotved HC, Krogfelt KA (2011) Optimising bacterial DNA extraction from faecal samples: comparison of three methods. Open Microbiol J 5: 14-17. 21. McInnes P, Cutting M (2010) Manual of procedures for human microbiome project. Core Microbiome Sampling Protocol A; Protocol #07-001 (version 12.0) 22. Brusa T, Canzi E, Pacini N, Zancho R, Farrari A (1989) Oxygen tolerance of anaerobic bacteria isolated from human feces. Curr Microbiol 19: 39-43. 23. US 2008/0124714 (A.P. Shuber and D.H. Whitney).

[00281] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são indicativos do nível da habilidade daqueles versados na técnica a qual esta invenção pertence e são incorporadas neste documento por referência à mesma extensão como se cada publicação, patente, ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporado por referência.

[00282] A invenção sendo descrita assim, será óbvio que a mesma pode ser variada em muitas maneiras. Tais variações não devem ser consideradas como uma fuga do espírito e do âmbito da invenção, e todas as modificações como seriam óbvias a uma pessoa versada na técnica são destinadas a serem incluídas dentro do âmbito das seguintes reivindicações. O espaço das reivindicações não deve ser limitado às modalidades preferidas ajustadas à descrição, mas deve ser dada a interpretação mais ampla consistente com a descrição como um todo.

Claims (20)

1. Método de estabilização do ácido desoxirribonucleico (DNA) contido em uma amostra fecal ou amostra contaminada com fezes à temperatura ambiente, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) contactar uma amostra fecal ou amostra contaminada com fezes com uma composição aquosa que compreende um agente de quelação, em que o agente de quelação é selecionado dentre ácido 1,2-ciclo-hexanodiamina tetra-acético (CDTA), ácido dietilenotriamina penta-acético (DTPA), ácido tetra-azaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido tetra-azaciclotetradecanotetra-acético (TETA), ou desferioximina, em que o agente de quelação está presente a uma concentração de pelo menos 150 mM, e em que a composição tem um pH de pelo menos 9,5 para formar uma mistura; b) homogeneizar a mistura de (a) para formar uma mistura homogênea; e c) armazenar a mistura homogênea à temperatura ambiente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra fecal obtida de um mamífero, tal como um ser humano.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: (a) o agente de quelação é CDTA; (b) a concentração do agente de quelação é de 150 mM a 500 mM, ou de 250 mM a 350 mM, ou de 300 mM; (c) a composição tem um pH de 9,5 a 11,5, ou de 10,5 a 11,5, ou 11. (d) a composição compreende ainda pelo menos um agente de tamponamento, tal como beta-alanina, apto ao tamponamento no intervalo de pH de 9,5 a 11,5; (e) a composição compreende ainda um solvente orgânico solúvel em água, como alcanol C1- C6, preferivelmente, em que o solvente orgânico solúvel em água é etanol; em que o etanol está presente na composição a uma concentração inferior a 30% em volume, ou inferior a 24% em volume; (f) a composição compreende ainda um detergente, tal como dodecilsulfato de sódio; e/ou (g) a composição compreende ainda um agente antiespumante, como um Antiespumante A.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a mistura é homogeneizada utilizando meios de homogeneização, tal como pelo menos uma esfera de mistura; em que, quando os meios de homogeneização são pelo menos uma esfera de mistura, o método compreende a formação da mistura da amostra biológica e a composição em um recipiente de amostra contendo pelo menos uma esfera de mistura, a vedação do recipiente de amostra e a homogeneização da mistura agitando-se a mistura na presença de pelo menos uma esfera de mistura, em que a agitação é, opcionalmente, feita manualmente; opcionalmente, em que (a) pelo menos uma esfera de mistura é uma esfera de mistura de aço inoxidável ou uma esfera de mistura de carboneto de tungstênio; (b) pelo menos uma das esferas de mistura ser uma esfera de mistura de aço inoxidável com um diâmetro de 5,6-11,1 mm e uma densidade de pelo menos 7,6 g/cm3; ou (c) a pelo menos uma esfera de mistura é uma esfera de mistura de aço inoxidável tendo um diâmetro de 7,1 a 8,7 mm e uma densidade de pelo menos 7,6 g/cm3 e o recipiente de amostra é um tubo de fundo redondo com um diâmetro interno de 12,9 mm.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que: (a) a amostra biológica é uma amostra fecal obtida de um ser humano, e o ácido nucleico é DNA humano; opcionalmente, em que o método torna o DNA humano estável para: pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 30 dias, ou pelo menos 60 dias à temperatura ambiente; pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias a uma temperatura de 37°C a 50°C; e/ou pelo menos 30 dias a -20 °C; ou (b) o ácido nucleico é um DNA microbiano e o método estabiliza um perfil de microbioma da amostra biológica; opcionalmente, em que o método torna o perfil do microbioma da amostra biológica estável para pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 30 dias, ou pelo menos 60 dias à temperatura ambiente; pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias a uma temperatura de 37°C a 50°C; e/ou pelo menos 30 dias a -20 °C.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é DNA, a amostra biológica é uma amostra fecal obtida de um mamífero, a composição tem um pH de 10,5 a 11,5, e a composição compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em: CDTA em uma quantidade de 250 mM a 350 mM, ou 300 mM; β-alanina em uma quantidade de 30 mM a 70 mM, ou 50 mM; etanol em uma quantidade de 21,5% a 23,5% em volume, ou 23,5% em volume; dodecil sulfato de sódio em uma quantidade de 0 a 1% (p/v), ou 0,5% (p/v); e Antiespumante A em uma quantidade de 0 a 0,2% (v/v), ou 0,1% (v/v); opcionalmente, em que o método compreende a formação da mistura da amostra fecal e da composição em um tubo de fundo redondo com um diâmetro interno de 12,9 e contendo pelo menos uma esfera de mistura de aço inoxidável com um diâmetro de 5,6-11,1 mm e uma densidade de pelo menos 7,6 g/cm3, a vedação do tubo de fundo redondo e a homogeneização da mistura agitando-se a mistura manualmente na presença de pelo menos uma esfera de mistura de aço inoxidável.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é um DNA microbiano e o método estabiliza um perfil de microbioma da amostra fecal, em que o perfil de microbioma da amostra fecal é tornado estável por: pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 30 dias ou pelo menos 60 dias à temperatura ambiente; pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias a uma temperatura de 37°C a 50°C; e/ou pelo menos 30 dias a -20°C.

8. Composição aquosa para a estabilização de um ácido desoxirribonucleico (DNA) contido em uma amostra fecal ou amostra contaminada com fezes, caracterizada pelo fato de que compreende um agente de quelação, em que o agente de quelação é selecionado dentre ácido 1,2-ciclo-hexanodiamina tetra-acético (CDTA), ácido dietilenotriamina penta-acético (DTPA), ácido tetra- azaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido tetra- azaciclotetradecanotetra-acético (TETA), ou desferioximina, em que o agente de quelação está presente a uma concentração de pelo menos 150 mM e em que a composição tem um pH de pelo menos 9,5.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra fecal obtida de um mamífero, tal como um ser humano.

10. Composição de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que: (a) o agente de quelação é CDTA; (b) a concentração do agente de quelação é de 150 mM a 500 mM, ou de 250 mM a 350 mM, ou de 300 mM; (c) a composição tem um pH de 9,5 a 11,5, ou de 10,5 a 11,5, ou 11. (d) a composição compreende ainda pelo menos um agente de tamponamento, tal como beta-alanina, apto ao tamponamento no intervalo de pH de 9,5 a 11,5; (e) a composição compreende ainda um solvente orgânico solúvel em água, como alcanol C1- C6, preferivelmente, em que o solvente orgânico solúvel em água é etanol; em que o etanol está presente na composição a uma concentração inferior a 30% em volume, ou inferior a 24% em volume; (f) a composição compreende ainda um detergente, tal como dodecilsulfato de sódio; e/ou (g) a composição compreende ainda um agente antiespumante, como um Antiespumante A.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 8 a 10, caracterizada pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra fecal obtida de um ser humano, e o ácido nucleico é DNA humano; ou o ácido nucleico é um DNA microbiano e a composição é para estabilizar um perfil de microbioma da amostra biológica.

12. Composição de acordo com a reivindicação 8, carac-terizada pelo fato de que o ácido nucleico é DNA, em que a amostra biológica é uma amostra fecal obtida de um mamífero, a composição tem um pH de 10,5 a 11,5 e a composição compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em: CDTA em uma quantidade de 250 mM a 350 mM, ou 300 mM; β-alanina em uma quantidade de 30 mM a 70 mM, ou 50 mM; etanol em uma quantidade de 21,5% a 23,5% em volume, ou 23,5% em volume; dodecil sulfato de sódio em uma quantidade de 0 a 1% (p/v), ou 0,5% (p/v); e Antiespumante A em uma quantidade de 0 a 0,2% (v/v), ou 0,1% (v/v).

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição é destinada à estabilização de um perfil de microbioma da amostra fecal.

14. Kit de estabilização do ácido desoxirribonucleico (DNA) contido em uma amostra fecal ou amostra contaminada com fezes, caracterizado pelo fato de que compreende: a) um recipiente de amostra que tem um fechamento destacável: b) uma composição aquosa que compreende um agente de quelação selecionado dentre ácido 1,2-ciclo-hexanodiamina tetra- acético (CDTA), ácido dietilenotriamina penta-acético (DTPA), ácido tetra-azaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido tetra- azaciclotetradecanotetra-acético (TETA), ou desferioximina, onde o agente de quelação está presente a uma concentração de pelo menos 150 mM e onde a composição tem um pH de pelo menos 9,5, onde a referida composição é contida, opcionalmente, no recipiente de amostra; c) meios de homogeneização contidos opcionalmente no recipiente de amostra; d) meios para transferir a amostra biológica, ou uma porção dela, para o recipiente de amostra; e e) instruções de uso.

15. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra fecal obtida de um mamífero, tal como um ser humano.

16. Kit de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que: (a) o agente de quelação é CDTA; (b) a concentração do agente de quelação é de 150 mM a 500 mM, ou de 250 mM a 350 mM, ou de 300 mM; (c) a composição tem um pH de 9,5 a 11,5, ou de 10,5 a 11,5, ou 11. (d) a composição compreende ainda pelo menos um agente de tamponamento, tal como beta-alanina, apto ao tamponamento no intervalo de pH de 9,5 a 11,5; (e) a composição compreende ainda um solvente orgânico solúvel em água, como alcanol C1- C6, preferivelmente, em que o solvente orgânico solúvel em água é etanol; em que o etanol está presente na composição a uma concentração inferior a 30% em volume, ou inferior a 24% em volume; (f) a composição compreende ainda um detergente, tal como dodecilsulfato de sódio; e/ou (g) a composição compreende ainda um agente antiespumante, como um Antiespumante A.

17. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra fecal obtida de um ser humano, e o ácido nucleico é DNA humano; ou o ácido nucleico é um DNA microbiano e a composição é para estabilizar um perfil de microbioma da amostra biológica.

18. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o meio de homogeneização é pelo menos uma esfera de mistura; opcionalmente, (a) em que pelo menos uma esfera de mistura é uma esfera de mistura de aço inoxidável ou uma esfera de mistura de carboneto de tungstênio; (b) em que pelo menos uma das esferas de mistura ser uma esfera de mistura de aço inoxidável com um diâmetro de 5,6-11,1 mm e uma densidade de pelo menos 7,6 g/cm3; ou (c) em que a pelo menos uma esfera de mistura é uma esfera de mistura de aço inoxidável tendo um diâmetro de 7,1 a 8,7 mm e uma densidade de pelo menos 7,6 g/cm3 e o recipiente de amostra é um tubo de fundo redondo com um diâmetro interno de 12,9 mm.

19. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é DNA, em que a amostra biológica é uma amostra fecal obtida de um mamífero, a composição tem um pH de 10,5 a 11,5 e a composição compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em: CDTA em uma quantidade de 250 mM a 350 mM, ou 300 mM; β-alanina em uma quantidade de 30 mM a 70 mM, ou 50 mM; etanol em uma quantidade de 21,5% a 23,5% em volume, ou 23,5% em volume; dodecil sulfato de sódio em uma quantidade de 0 a 1% (p/v), ou 0,5% (p/v); e Antiespumante A em uma quantidade de 0 a 0,2% (v/v), ou 0,1% (v/v).

20. Kit de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de o ácido nucleico ser um DNA microbiano e o kit ser para estabilizar um perfil de microbioma da amostra biológica; opcionalmente, em que os meios de homogeneização serem pelo menos uma esfera de mistura de aço inoxidável com um diâmetro de 5,6 a 11,1 mm e uma densidade de pelo menos 7,6 g/cm3 e o recipiente de amostra ser um tubo de fundo redondo com um diâmetro interno de 12,9 mm.