KR20160130287A - 생물학적 샘플에서 핵산을 안정화하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

생물학적 샘플에서 핵산을 안정화하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20160130287A
KR20160130287A KR1020167027593A KR20167027593A KR20160130287A KR 20160130287 A KR20160130287 A KR 20160130287A KR 1020167027593 A KR1020167027593 A KR 1020167027593A KR 20167027593 A KR20167027593 A KR 20167027593A KR 20160130287 A KR20160130287 A KR 20160130287A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
sample
dna
kit
days
Prior art date
Application number
KR1020167027593A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102392407B1 (ko
Inventor
하이만 차임 번보임
린지 포짜
카를로스 알베르토 메리노 헤르난데스
에브게니 블라디미로비치 두크하니네
Original Assignee
디엔에이 제노텍 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 디엔에이 제노텍 인코퍼레이티드 filed Critical 디엔에이 제노텍 인코퍼레이티드
Publication of KR20160130287A publication Critical patent/KR20160130287A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102392407B1 publication Critical patent/KR102392407B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Abstract

복합적인 생물학적 샘플, 예컨대 대변에 존재하는 인간 및 미생물 데옥시리보핵산(DNA) 모두를 안정화하기 위한 방법, 조성물, 및 키트가 개시된다. 특히, 상온에서 생물학적 샘플에 함유된 DNA를 안정화하기 위한 수성 조성물이 이를 이용하는 관련 방법 및 키트와 함께 개시된다. 하나의 측면에서, 조성물은 적어도 약 150 mM의 농도로 존재하는 킬레이트화제를 포함하며, 조성물은 적어도 약 9.5의 pH를 갖는다.

Description

생물학적 샘플에서 핵산을 안정화하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHOD FOR STABILIZING NUCLEIC ACIDS IN BIOLOGICAL SAMPLES}
본 출원은 생물학적 샘플에서 핵산을 안정화하는 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 복합적인 생물학적 샘플, 예컨대 대변에 존재하는 인간 및 미생물 데옥시리보핵산(DNA) 모두를 안정화하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
대변은 오랫동안 기생충, 예컨대 요충 및/또는 이들의 알에 대해 시험하기 위해 또는 증상 동물 및 인간에서 병원성 박테리아 및 진균을 검출하기 위해 수집되는 동물의 소화관으로부터 감염 가능성이 있는 폐기 산물로 분류되어 왔다. 그러나 최근에, 개인맞춤 의약 및 프리- 및 프로-바이오틱스의 광범위 상업화의 증가와 더불어, 상기 "폐기" 산물의 진단적, 특히 예후적 가치가 증가되었다. 단순히 식이 습관에서의 변화가 대변에서 미생물군 또는 미생물 집단 조성물에 영향을 미치는 것으로 나타났으며(Walker 등, 2011; Wu 등, 2011), 이는 다시 건강에 영향을 미치고 일정 질환의 발생률을 감소시킬 수 있다.
위장(GI)관의 집락형성은 출생 시 시작되며, 경시적으로 발달하는 미생물 집단은 개인의 유전적 조성, 연령, 성별, 영양, 항생제 사용 및 소비되는 다른 약제, 질환 상태, 생활습관, 지리적 위치/환경, 화학적 노출, 수술적 개입 등을 포함하는 여러 영향에 의해 형상화된다. 인간 건강, 특히 식품 소화, 숙주 에너지 대사, 필수 비타민 합성, 상피 성숙, 담즙염의 분해, 약물 대사 및 식이 발암원뿐만 아니라 병원체 집락형성으로부터의 장 보호에 중요한 역할을 담당하는 대략 100 조 박테리아로 구성된 다양한 미생물 집단이 장에 집락한다.
'장 미생물군유전체'는 인간 GI 시스템 내의 이러한 거대한 공생 미생물 집합 및 이들의 집합적 상호작용 게놈을 설명하기 위해 주어지는 용어이다. 그러나 장 미생물군 및 숙주 생리 간 이들 기능적 상호작용의 이해는 유아기에 머물러있다. 인간 미생물군유전체 프로젝트(Human Microbiome Project)는 장 미생물군유전체가 300 내지 1000 개 박테리아 종 및 7000 개를 초과하는 계통으로 구성되어 인간 게놈보다 대략 150 배 더 크다는 것을 드러내었다. 대부분의 포유류에서, 장 미생물군유전체에는 4 박테리아 문: 피르미쿠테스 , 박테로이데테 스, 악티노박테리아 및 프로테오박테리아가 우세하다(Ley 등, 2007). 새로운 작업 영역은 장 기생충, 바이러스, 효모 및 여러 진균, 예컨대 칸디다, 사카로마이세스 , 아스페르길러스, 및 페니실리움과 장 미생물군유전체의 상호작용 분석에 관련된다. 일부 전문가들은 인간 게놈만에 의해 인코딩되는 전체 정보가 신체의 생물학적 기능을 전부 수행하기에 충분하지 않음을 제시하였고(Lee and Mazmanian, 2010) 박테리아 및 인간 간 공생을 설명으로서 지적한다. 약 10%의 인간 세포만 실제 인간의 것이고, 미생물이 나머지 90%를 차지하여, 인간은 우리 미생물 손님 또는 초-개체에 대한 숙주로 생각될 수 있다.
수십 년 동안, 장내 미생물은 결장암의 개시에 연루되었다(Aries 등, 1969; Moore and Moore, 1995). 보다 최근에, 헬리코박터 필로리 감염은 위의 암(위암), 위 림프종 및 소화성 궤양 질환의 주요 원인으로 확인되었다(Parsonnet 등, 1991). 그러나 장 미생물은 우리가 아는 것보다 우리가 어떻게 느끼고 행동하는지에 대해 더 많은 영향을 미치는 것으로 나타났다. 장 및 뇌 간에 커뮤니케이션이 존재한다는 증가하는 증거로 인해, 장은 '제2의 뇌'로 불려왔다. 증거는 수많은 질환, 예컨대 심혈관 질환, 당뇨병, 스트레스/불안, 자폐증, 크론병, 과민성 장 질환(IBD), 알러지성 장애, 대사 증후군 및 신경 염증이 장 미생물군유전체의 조절이상으로 야기될 수 있음을 제시한다. 그러나 연구자들은 현재 '미생물군유전체-장-뇌 축'으로 명명된 것, 즉 GI 관에 집락하는 미생물이 어떻게 장을 너머 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있는지, 특히 장 미생물군유전체가 그 숙주에서 면역, 내분비 및 신경 질환에 영향을 미치는 분자 기전 또는 크로스톡을 막 해석하기 시작했다(Grenham 등, 2011; Kinross 등, 2011). 예를 들면, 많은 미생물은 장 내 신경 말단 상에서 직접 또는 GI 관에 걸쳐 존재하는 장크롬친화성 세포를 통해 작용하는 GABA, 노르아드레날린, 세로토닌, 도파민 및 아세틸콜린을 포함하는 신경전달물질 또는 신경전달의 조절물질인 신경대사물질을 생성한다. 식이 섬유로부터의 탄수화물도 미생물에 의해 분해되어, 신경활성 화학물질, 예컨대 n-부티레이트, 아세테이트, 하이드로겐 설파이드 및 프로피오네이트의 생성을 일으킨다. 또한, 미생물은 대사물질, 예컨대 단백질, 탄수화물 및 다른 분자를 흘리며, 이는 장을 떠나서 신체에 걸쳐 신호전달 질환에서 역할을 담당할 수 있다.
건강한 개인 및 질환 개인 모두에서 뿐만 아니라 장 미생물 집단을 이루는 수백 여 상이한 종의 동정에서, 전체로서의 박테리아 컨소시엄의 기능성에 대한 이해를 얻는 것이 중추적이다. 예를 들어, 미생물군의 조성은 성장 기질로서의 식이 성분에 대한 경쟁, 당의 저해성 발효 산물로의 전환, 성장 기질의 생성, 박테리오신(다른 박테리아 종에 대해 독성인 분자)의 방출, 선천성 면역계의 자극, 장 벽에 집락하는 미생물에 대한 경쟁 및 장-배리어 기능 등을 결정한다. 불행하게도, 전통적인 미생물 배양 기법은 시험관내에서 번성하기 위해 전체 장내 미생물군에 대한 적절한 성장 영양소 및 복합적 조건에 대한 이들의 의존에 기인하는 상당한 제한으로 인해, 장 미생물군유전체 구성원의 정체 및 기능을 결정하는 것을 돕는데 있어서 대부분 성공적이지 못한 것으로 입증되었다. 추정치에서는 총 장내 미생물군의 20-40%만(Apajalahti 등, 2003) 표준 배양 기법에 의해 배양될 수 있어서, 대부분의 미생물 생물다양성이 배양-기반 방법에 의해 소실되었음을 시사한다. 상기 요인은 그 다수가 혐기성인 시험관내 장내 미생물군의 생존력을 보장하기 위한 필요성에 의해 추가로 악화된다(O'Sullivan, 2000).
여러 배양 배지는 내재적으로 일부 박테리아, 특히 대변 또는 장 물질로부터의 직접 배양에 이바지하지 않은 생리적 상태에서 추가적 또는 선택적 제제 또는 박테리아를 필요로 하는 것에 대해 선택된다. 또한, 장내 미생물군의 동정 및 특성규명을 위한 전통적인 형태 검사 및 생화학적 시험은 매우 노동 집약적이고 시간 소모적이고 정밀도가 떨어지므로, 다수의 개체로부터의 시료 분석 및 상이한 개체로부터의 박테리아 종 간 관련성 비교를 위한 이들의 유효성을 제한한다. 따라서, 배양-독립적 분자 도구, 예컨대 16S 리보솜 RNA 유전자-기반 접근법, TaqMan 탐침, 디지털 및 LATE PCR 및 메타게놈 서열분석과 함께 선택 시점에 미생물군 유전자를 포획하고 안정화하거나 "스냅-샷"하기 위한 신속한 방법이 이러한 제한 및 편향을 극복하여 상기 풍부한 생태계의 진정한 상세 그림이 드러날 수 있도록 하기 위해 필요하다.
오늘날, 20 명의 입원 환자 당 대략 1 명이 병원-획득 감염(HAI)에 걸릴 것이다. HAI의 대다수 유형은 감소되고 있으나, 알려진 병원생물체인 클로스트리듐 디피실레에 의해 야기되는 발생은 병원 및 장기 헬쓰케어 시설에서 환자에 피해를 입히며 증가 중인 문제이다. C. 디피실레 감염(CDI)은 위장관 이상생활, 즉 체류 미생물군의 손상에서 야기되는 것으로 여겨진다. 항생제 치료는 보통 C. 디피실레를 제어하는 GI 관에서 대부분의 박테리아를 사멸시킨다. 상기 변형된 환경에서, C. 디피실레는 복제하여 장 내벽을 공격하는 독소를 생성함으로써 설사에서부터 생명을 위협하는 결장 내벽의 염증 및 출혈에까지 이르는 증상을 유도한다. 질병 대책 센터(CDC)에 따르면, C. 디피실레 하나만 미국에서 매년 14,000 명의 사망에 연관된다. 병원에서, 대변에 흘린 C. 디피실레 포자는 주로 오염된 표면 및 물품을 터치한 헬쓰케어 직원의 손을 통해 환자 및 표면으로 전달된다. 재발성 C. 디피실레 감염에 대한 효과적인 치료는 널리 이용가능하지 않다. 역설적으로, C. 디피실레 감염에 대한 일차 치료는 더 많은 항생제의 투여이며, 환자의 약 20%가 1 개월 내에 재발하고, 이들 중 다수가 반복된 발작을 갖는다.
한 명의 "공여자"로부터의 대변이 환자의 장내로 주입되는 비정통적인 대안적 절차, 대변 미생물군 이식(FMT)은 재발성 GI 감염 치료에서 항생제보다 훨씬 더 효과적인 것으로 입증되고 있다. 미생물 평형의 교란을 복원함으로써, 건강한 공여자로부터의 대변 주입은 유해한 박테리아, 예컨대 C. 디피실레를 저지하여 반복되는 약화 발작을 겪은 환자에서도 질병을 박멸하는 것으로 나타난다. 암스테르담 대학의 소규모 네덜란드인 연구에서, 항생제 반코마이신의 2-주 요법이 제공된 환자에서의 단지 27%에 비해, 재발성 C. 디피실레 감염을 갖는 16 명의 환자 중 15 명이 공여자 대변의 십이지장 주입으로 치유되었다(van Nood, Els 등(2013)). 공여자 대변 주입은 환자의 GI 관에서 미생물 다양성의 개선을 일으키며, 상기 다양성은 경시적으로 지속되는 것으로 나타났다. 최근에, Song 등(2013)은 재발성 C. 디피실레 감염(RCDI) 환자로부터의 대변 샘플에서 미생물군 다양성 및 풍부도의 감소가 FMT 이후 복원되어 건강한 공여자와 유사해진다는 이전 보고를 확인시켜주었다. 이러한 장기적인 연구에서, FMT는 피르미쿠테 스 및 프로테오박테리아에 우선적으로 영향을 미쳤고, 대변 미생물군이 적어도 16 주 동안 FMT-후 환자에서 계속 변화하였다.
중요하게는, RCDI를 치료하기 위한 FMT의 성공에 관여하는 정확한 작용 기전은 여전히 알려지지 않았고, 적합한 공여자 또는 이상적인 공여자 미생물군을 정의하기 위해 임상적으로 검증된 파라미터 세트가 존재하지 않는다. 여러 시점에 건강한 공여자 및 RCDI 환자 모두의 다수의 개인으로부터 상온에서 현장에서 대변 샘플을 수집하고 조성물 중에 샘플링된 미생물군유전체를 스냅샷하기 위한 용이하고 효과적인 수단이 집단 내 건강한 개체의 GI 관에서 확인되는 '코어' 미생물군유전체를 맵핑하기 위해 필요하며, 그 위에 RCDI 환자의 변화하는 미생물군유전체를 더할 수 있다. 궁극적으로, 향후 RCDI 환자는 이들의 미생물군유전체를 건강한 상태로 회복시키기 위해 항생제가 아니라 개인맞춤된 프로바이오틱스(유익한 박테리아를 신체로 복원하기 위해 경구 섭취되는 생박테리아를 함유하는 제조물/보충물) 및 프리바이오틱스(GI 미생물군의 선택된 표적 그룹의 활성을 촉진하는 소화-불가능한 식품 성분, 예컨대 올리고당) 또는 신바이오틱스(프로바이오틱스 및 프리바이오틱스의 상승작용 조합물)로 치료될 것이다.
확인되지 않은, 잠재적으로 유해한 미생물의 도입 위험을 배제하기 위해, 일부 병원에서는 자가-뱅킹 시스템을 구축하기 시작하고 있다. 환자의 대변이 병원-획득 '수퍼 버그'로의 가능한 감염에 반한 해독제로서 향후 사용하기 위해 뱅크화될 수 있다. 이식을 위한 환자 자신의 대변 사용은 유해한 미생물의 도입 위험을 크게 감소시키고, 전염성 질환에 대해 관련없는 공여자로부터 시간-소모적이고 고비용이 드는 대변 스크리닝을 배제한다. 불행하게도, 일정 개인의 '생태계'는 이들을 다른 사람에 비해 질병에 더 감수성으로 만드는 것으로 나타난다. 따라서, 환자 자신의 대변을 재도입하는 것과 연관되는 가능한 단점은 이것이 단기 유익만을 제공하고 이들을 유해한 미생물, 예컨대 C. 디피실레로부터 치유할 수 없다는 것이다. 조만간, 미생물군유전체 연구는 인간 건강을 정의하는 것을 돕는 '코어' 또는 '근본' 박테리아 종의 확인으로 이어진 후 완전히 특성규명된, 유익한 박테리아 '칵테일'로 구성된 개인맞춤 '박테리오요법'을 개발하여 '원' 대변의 상기 미가공 이식 방법을 대체할 수 있다. 실제로, 프로바이오틱스 요법은 현재 매우 다양한 장-관련된 장애, 예컨대 IBD 및 염증성 장 증후군에 대해 제안되었다. 기본적으로, 공여자의 미생물군의 전체 종을 특성규명하고 질환 감수성을 예측하기 위한 진단 마커를 확인하고, 궁극적으로 '개인맞춤' 헬쓰케어를 제공하기 위해 노력하는 연구자 및 임상의는 시험되고 있는 대변 샘플이 미생물 집단의 '분해된' 또는 인공적 표시가 아닌 생체내 공여자의 미생물군유전체의 실제 표시 또는 '스냅샷'을 제공한다는 것을 확신할 필요가 있다. 따라서, 수집 시점에 대변의 미생물군유전체를 즉시 포획하고 안정화하거나 스냅샷하기 위한 효과적인 수단이 중추적이다.
결장직장암(CRC)은 유럽 및 미국에서 가장 높은 암 사망률을 갖는다. CRC는 그 초기 단계에 검출되는 경우 치유가능성이 매우 높은 것으로 알려져 있어서(>90%) 초기 암 스크리닝을 귀중한 자산으로 만든다. 여러 민감한 검사 방법, 예컨대 이중-조영 바륨 관장기, 결장경 검사 및 가요성 직장경 검사가 암을 검출하기 위해 여러 해에 걸쳐 고안되었다. 그러나 이들 절차와 연관된 재정적 비용, 인프라구조 및 인력 요건은 환자에 대해 편안하지 않고 침습성일 뿐만 아니라 엄청난 장애를 제공한다. 비용에 부가하여, 이들 검사 방법의 저처리량 성질은 국가 규모의 일차 스크리닝에 대한 이들의 실시를 방해한다.
현재, 결장직장암을 스크리닝하기 위한 또 다른 방법은 대변 잠혈 시험(FOBT)이다. 상기 시험은 대변 샘플 내 해모글로빈의 존재를 검출하여 CRC의 간접적 예측인자로서 GI 관에서 출혈의 존재 또는 부재를 결정한다. 상기 시험은 고가는 아니지만, 그 민감성 및 양성 예측값이 매우 낮고, 위양성 발생률이 높다. 따라서, 민감하고, 재현성 있고, 비용-효과적이고, 확장가능한 방법이 위험 및/또는 증상 개인에서 질환의 진단뿐만 아니라 무증상 집단의 일상적인 진단 스크리닝 둘 다를 위해 매우 필요하다. 이상적으로는 개인이 이들의 가정에서 프라이버시 하에 일상적으로 이들의 대변을 수집하고 일부를 안정화한 후 이를 CRC 및 다른 질환에 대해 스크리닝될 시험 시설로 발송할 것이다.
결장 관강 내로 탈피되고 대변에서 회수되는 종양 세포의 직접적 검출 및 검사가 잠혈보다 결장직장암의 더 양성 예측인자임은 이미 수용되어 있다. 그러나 암 또는 다른 질환을 시사하는 "표적" 또는 돌연변이체 인간 DNA는 종종 높은 배경의 야생형 DNA(예로, 정상 결장 세포로부터의 인간 DNA 및 박테리아 DNA) 대비 보통 낮은 빈도로(예로, CRC에 있어서 총 인간 DNA의 1%) 생물학적 샘플에 존재하며, 내인성 인간 DNase(예로, 데옥시리보뉴클레아제 I) 및/또는 박테리아 뉴클레아제(예로, 마이크로코칼 뉴클레아제)에 노출된다. 상기 복합적 시료에서, 대변 샘플에 존재하는 극소량의 "표적" 인간 DNA는 이것이 실험실에 도달하기도 전에 뉴클레아제 및 환경 조건에 의해 신속히 분해될 수 있어서, 진단 시험의 임상적 민감성에 부정적으로 영향을 미친다. 뉴클레아제의 풍부성에 부가하여, 장에서 박테리아의 99% 초과를 이루는 혐기성 박테리아는 대변이 소화관에서 제거되자마자 공기에 노출된다. 공기, 특히 산소는 혐기성 박테리아에 대한 독성 환경으로, 4-5 분 내에 50%를 그리고 20 분 만에 95-97%의 혐기성 미생물을 사멸시킨다(Brusa 등, 1989). 또 다시, 대부분의 대변 샘플이 실험실 또는 헬쓰케어 시설이 아닌 가정에서 수집된다는 것을 고려할 때 대변에서 전체 미생물군유전체 및 인간 DNA의 대표적 그림 또는 "스냅-샷"을 획득하는 것은 난제이다.
생물학적 샘플 내의 전체 핵산이 샘플 취급, 수송 및 보관 동안 분해되지 않도록 안정화하는 것이 필수적이다. 생물학적 샘플에서 핵산의 분해를 최소화하기 위해, 전체 샘플 또는 이들의 일부를 드라이 아이스(-78℃) 상에서 중앙처리 시험 시설로 수송하고, 여기서 해동되어 즉시 가공되거나 냉동 보관 유지되는(-80℃ 내지 -20℃) 것이 표준 관례이다. 수집된 샘플이 즉시 냉동되고, 시험 시설까지의 수송 동안 냉동 유지되고, 분석 전에 최적 조건 하에 보관되는 것을 보장하기 위해 필요한 비용, 물류 및 인프라구조는 대규모 및 집단-기반 스크리닝 적용에서 특히, 상당한 난제와 위험을 부과한다. 분산된 샘플 분석을 위해 '대표' 샘플을 제공하고, 여전히 최대의 샘플 온전성을 보유하는 것은 더욱 큰 난제가 될 수 있다. 각 샘플의 핵산 프로파일의 실제 표시를 포획하고 유지하는 더욱 강력하고 표준화된 샘플-취급 방법 및 조성물을 개발하는 것이 매우 바람직하다.
건강 및 질환에서 미생물군유전체 및 그 인간 숙주 간 상관관계의 연구는 일정 시기에 걸친 미생물 집단의 확인 및 모니터링에 의존한다. 최근 발견은 이들 미생물 프로파일의 예후적 및 진단적 가치를 갖는 바이오마커로서의 유용성을 실증한다. 장 미생물군유전체의 동적 성질로 인해, 경시적으로 대규모 집단의 반복되는 샘플링이 이러한 바이오마커의 개발을 위해 필수적이라는 것이 문헌에서 자명해지고 있다. 미생물군유전체-범위 연합 연구(MWAS)로 알려져 있는 이들 연구는 낮은 공여자 순응도, 생물학적 샘플의 신뢰할 수 없는 자가-수집, 높은 비용 및 번거로운 운송 및 취급 절차에 의해 어려움을 겪는다.
대변 샘플링 및 미생물군 분석을 위한 현재의 방법에는 샘플을 미생물군유전체 안정화와 비상용성인 온도로 노출시킬 가능성을 갖는 조건 하에서의 시료 수송이 관여된다. 샘플 수집, 수송, 가공 및 분석 동안 미생물군유전체를 적절하게 안정화하지 못하는 것은 미생물군유전체 프로파일의 생물학적 및 임상적 의미를 모호하게 만들 위험이 있다. 결과적으로, 생체내 미생물군유전체 프로파일의 가능한 최대 표시를 보장하기 위해 적절한 분석-전 절차가 필요하다.
상온에서의 수송 및 보관 동안, 복합적인 생물학적 샘플, 예컨대 대변에서 핵산, 특히 인간 및 미생물 DNA를 모두 안정화하기 위한 조성물 및 방법이 필요하다.
본 배경 정보는 본 발명과 가능한 관련성이 있는 것으로 본 출원인들이 믿는 정보를 공지하기 위한 목적으로 제공된다. 임의의 이전 정보도 본 발명에 대한 선행 기술을 구성한다는 인정이나 간주로 의도되지 않는다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 상온에서 생물학적 샘플에 함유된 핵산을 안정화하기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
하나의 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 상온에서 생물학적 샘플에 함유된 핵산을 안정화하기 위한 방법이 제공된다: a) 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b) 생물학적 샘플을 킬레이트화제를 포함하는 수성 조성물과 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계(상기 킬레이트화제는 적어도 약 150 mM의 농도로 존재하며, 상기 조성물은 적어도 약 9.5의 pH를 가짐); c) (b)의 혼합물을 균질화하여 균질 혼합물을 형성하는 단계; 및 d) 균질 혼합물을 상온에서 보관하는 단계.
또 다른 측면에서, 킬레이트화제를 포함하는, 상온에서 생물학적 샘플에 함유된 핵산을 안정화하기 위한 수성 조성물이 제공되며, 상기 킬레이트화제는 적어도 약 150 mM의 농도로 존재하고, 상기 조성물은 적어도 약 9.5의 pH를 갖는다.
또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, 상온에서 생물학적 샘플에 함유된 핵산을 안정화하기 위한 키트가 제공된다: a) 재밀봉가능한 마개를 갖는 샘플 용기; b) 킬레이트화제를 포함하는 수성 조성물(상기 킬레이트화제는 적어도 약 150 mM의 농도로 존재하며, 상기 조성물은 적어도 약 9.5의 pH를 가지고, 상기 조성물은 선택적으로 샘플 용기 내에 함유됨); c) 선택적으로 샘플 용기 내에 함유된, 균질화 수단; d) 생물학적 샘플, 또는 이들의 일부를 샘플 용기 내로 옮기기 위한 수단; 및 d) 사용 지침.
하나의 구현예에서, 핵산은 데옥시리보핵산(DNA)이다.
또 하나의 구현예에서, 생물학적 샘플은 대변 샘플, 토양 샘플, 하수 샘플, 폐수 샘플, 또는 물 샘플로부터 선택된다. 또 하나의 구현예에서, 생물학적 샘플은 대변 샘플이다. 또 하나의 구현예에서, 대변 샘플은 포유동물로부터 수득된다. 또 하나의 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
또 하나의 구현예에서, 킬레이트화제는 1,2-사이클로헥산디아민 테트라아세트산(CDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 테트라아자사이클로도데칸테트라아세트산(DOTA), 테트라아자사이클로테트라데칸테트라아세트산(TETA), 데스페리옥시민, 또는 이들의 킬레이터 유사체로부터 선택된다. 또 하나의 구현예에서, 킬레이트화제는 CDTA이다.
또 하나의 구현예에서, 킬레이트화제의 농도는 약 150 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 250 mM 내지 약 350 mM이다. 또 하나의 구현예에서, 킬레이트화제의 농도는 약 300 mM이다.
또 하나의 구현예에서, 조성물은 약 9.5 내지 약 11.5, 또는 약 10.5 내지 약 11.5의 pH를 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 조성물은 약 11의 pH를 갖는다.
또 하나의 구현예에서, 조성물은 pH 범위 9.5 내지 11.5에서 완충할 수 있는 적어도 하나의 버퍼제를 추가로 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 버퍼제는 베타-알라닌이다.
또 하나의 구현예에서, 조성물은 수용성 유기 용매, 예컨대 C1-C6 알칸올을 추가로 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 수용성 유기 용매는 에탄올이다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 약 30 부피% 미만의 농도로 조성물에 존재한다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 약 24 부피% 미만의 농도로 조성물에 존재한다.
또 하나의 구현예에서, 조성물은 세제, 예컨대 나트륨 도데실설페이트를 추가로 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 조성물은 소포제, 예컨대 소포제 A를 추가로 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 조성물은 항미생물제, 예컨대 트리클로산 또는 프로클린을 추가로 포함한다.
또 하나의 구현예에서, 핵산은 미생물 DNA이다.
또 하나의 구현예에서, 핵산은 미생물 DNA이며, 방법은 생물학적 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화한다. 또 하나의 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 실온에서 적어도 7 일, 적어도 14 일, 적어도 30 일, 또는 적어도 60 일 동안; 약 37℃ 내지 약 50℃의 온도에서 적어도 7 일, 또는 적어도 14 일 동안; 및/또는 -20℃에서 적어도 30 일 동안 안정하게 만든다.
또 하나의 구현예에서, 핵산은 미생물 DNA이고, 조성물/키트는 미생물 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화하기 위한 것이다.
또 하나의 구현예에서, 핵산은 인간 DNA이다. 또 하나의 구현예에서, 방법은 인간 DNA를 실온에서 적어도 7 일, 적어도 14 일, 적어도 30 일, 또는 적어도 60 일 동안; 약 37℃ 내지 약 50℃의 온도에서 적어도 7 일, 또는 적어도 14 일 동안; 및/또는 -20℃에서 적어도 30 일 동안 안정하게 만든다.
또 하나의 구현예에서, 방법은 균질화 수단을 이용하여 생물학적 샘플 및 수성 조성물의 혼합물을 균질화하는 단계를 포함한다.
또 하나의 구현예에서, 상술된 방법 및 키트의 균질화 수단은 적어도 하나의 혼합 볼이다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 혼합 볼은 스테인레스 스틸 혼합 볼 또는 텅스텐 카바이드 혼합 볼이다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 혼합 볼은 약 5.6-11.1 mm의 직경 및 적어도 약 7.6 g/cm3의 밀도를 갖는 스테인레스 스틸 혼합 볼이다. 또 하나의 구현예에서, 스테인레스 스틸 혼합 볼은 약 7.1 - 8.7 mm의 직경을 가지며, 샘플 용기는 약 12.9 mm의 내경을 갖는 둥근-바닥 튜브이다.
또 하나의 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 혼합 볼을 함유하는 샘플 용기에서 생물학적 샘플 및 수성 조성물의 혼합물을 형성하는 단계, 샘플 용기를 밀봉하는 단계, 및 적어도 하나의 혼합 볼의 존재 하에 혼합물을 진탕하여 혼합물을 균질화하는 단계를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 진탕은 수동으로 수행된다.
다른 구현예에서, 핵산의 안정화는 상온에서 보관 동안 생물학적 샘플에 함유된 핵산의 상대적 풍부성 보존을 포함한다.
또 하나의 구현예에서, 하기 단계를 포함하는, 상온에서 대변 샘플에 함유된 DNA를 안정화하기 위한 방법이 제공된다: a) 포유동물로부터 대변 샘플을 수득하는 단계; b) 대변 샘플을 약 10.5 내지 약 11.5의 pH를 갖는 수성 조성물과 접촉시키는 단계(상기 조성물은 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성된다: 약 250 mM 내지 약 350 mM 양의 CDTA; 약 30 mM 내지 약 70 mM 양의 β-알라닌; 약 21.5 부피% 내지 약 23.5 부피% 양의 에탄올; 약 0 내지 약 1%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및 약 0 내지 약 0.2%(v/v) 양의 소포제 A); c) (b)의 혼합물을 균질화하여 균질 혼합물을 형성하는 단계; 및 d) 균질 혼합물을 상온에서 보관하는 단계. 또 하나의 구현예에서, 수성 조성물은 약 11의 pH를 가지며, 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성된다: 약 300 mM 양의 CDTA; 약 50 mM 양의 β-알라닌; 약 23.5 부피% 양의 에탄올; 약 0.5%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및 약 0.1%(v/v) 양의 소포제 A. 또 하나의 구현예에서, 방법은 약 12.9 mm의 내경을 가지며 약 5.6-11.1 mm의 직경 및 적어도 약 7.6 g/cm3의 밀도를 갖는 적어도 하나의 스테인레스 스틸 혼합 볼을 함유하는 둥근 바닥 튜브에서 대변 샘플 및 수성 조성물의 혼합물을 형성하는 단계, 둥근 바닥 튜브를 밀봉하는 단계, 및 적어도 하나의 스테인레스 스틸 혼합 볼의 존재 하에 수동으로 혼합물을 진탕하여 혼합물을 균질화하는 단계를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, DNA는 미생물 DNA이며, 방법은 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화한다.
또 하나의 구현예에서, 상온에서 대변 샘플에 함유된 DNA를 안정화하기 위한 수성 조성물이 제공되며, 상기 대변 샘플은 포유동물로부터 수득되며, 상기 조성물은 약 10.5 내지 약 11.5의 pH를 가지며, 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성된다: 약 250 mM 내지 약 350 mM 양의 CDTA; 약 30 mM 내지 약 70 mM 양의 β-알라닌; 약 21.5 부피% 내지 약 23.5 부피% 양의 에탄올; 약 0 내지 약 1%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및 약 0 내지 약 0.2%(v/v) 양의 소포제 A. 또 하나의 구현예에서, 수성 조성물은 약 11의 pH를 가지며, 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성된다: 약 300 mM 양의 CDTA; 약 50 mM 양의 β-알라닌; 약 23.5 부피% 양의 에탄올; 약 0.5%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및 약 0.1%(v/v) 양의 소포제 A. 또 하나의 구현예에서, DNA는 미생물 DNA이며, 조성물은 대변 샘플에서 미생물군유전체 프로파일을 안정화하기 위한 것이다.
또 하나의 구현예에서, 상온에서 생물학적 샘플에 함유된 핵산을 안정화하기 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는 하기를 포함한다: a) 재밀봉가능한 마개를 갖는 샘플 용기; b) 약 10.5 내지 약 11.5의 pH를 가지며, 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성되는 수성 조성물: 약 250 mM 내지 약 350 mM 양의 CDTA; 약 30 mM 내지 약 70 mM 양의 β-알라닌; 약 21.5 부피% 내지 약 23.5 부피% 양의 에탄올; 약 0 내지 약 1%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및 약 0 내지 약 0.2%(v/v) 양의 소포제 A(상기 조성물은 선택적으로 샘플 용기 내에 함유됨); c) 선택적으로 샘플 용기 내에 함유된, 균질화 수단; d) 생물학적 샘플, 또는 이들의 일부를 샘플 용기 내로 옮기기 위한 수단; 및 d) 사용 지침. 또 하나의 구현예에서, 수성 조성물은 약 11의 pH를 가지며, 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성된다: 약 300 mM 양의 CDTA; 약 50 mM 양의 β-알라닌; 약 23.5 부피% 양의 에탄올; 약 0.5%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및 약 0.1%(v/v) 양의 소포제 A. 또 하나의 구현예에서, 핵산은 미생물 DNA이며 키트는 생물학적 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화하기 위한 것이다. 또 하나의 구현예에서, 균질화 수단은 약 5.6-11.1 mm의 직경 및 적어도 약 7.6 g/cm3의 밀도를 갖는 적어도 하나의 스테인레스 스틸 혼합 볼이며, 샘플 용기는 약 12.9 mm의 내경을 갖는 둥근 바닥 튜브이다.
본 발명뿐만 아니라 이들의 다른 측면 및 추가 특색을 더욱 잘 이해하기 위해, 수반되는 도면과 함께 이용될 하기 설명을 참조한다:
도 1은 2 명의 공여자로부터의 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일에서의 차이(PCR-DGGE 분석)를 도식적으로 나타내며;
도 2는 1) 상이한 농도의 CDTA(150-500 mM)를 함유하는 조성물, 2) 상이한 농도의 EDTA(150-500 mM)를 함유하는 조성물, 및 3) 안정화 용액 없이 보관된(안정화되지 않음) 대변에서, T=0 및 실온에서 14 일 후 대변 샘플에서 고분자량 DNA의 양을 실증하는 아가로스 겔을 나타내고;
도 3은 본 발명의 조성물의 샘플 균질화 및 pH에 대한 미생물군유전체 프로파일 안정성의 의존성을 도식적으로 나타내고;
도 4는 실온에서 14 일 동안 다양한 조성물에 보관된 대변 샘플의 DGGE 분석을 나타내고;
도 5는 실온에서 4 일 동안 다양한 조성물에 보관된 대변 샘플의 DGGE 분석을 나타내고;
도 6은 실온에서 9 일 동안 다양한 pH 값의 조성물에 보관된 대변 샘플에서 고분자량 DNA의 품질을 실증하는 아가로스 겔을 나타내고;
도 7은 본 발명의 조성물에서 (A) 다중 유리 비드 및 (B) 스테인레스 스틸 볼과 함께 대변 샘플을 혼합한 결과를 실증하는 아가로스 겔을 나타내고;
도 8은 (A) 0 일, (B) 6 일, (C) 7 일, (D) 14 일, (E) 1 개월, 및 (F) 2 개월째에 실온에서 본 발명의 조성물에 보관 시 DNA 품질을 나타내는 아가로스 겔을 도시하고;
도 9는 본 발명의 조성물에 보관된 동일한 공여자의 시료로부터의 3 개씩의 대변 샘플 분취물의 DGGE 겔을 나타내고;
도 10은 (A) 실온에서 14 일, 및 (B) 실온에서 7 일 및 2 개월 동안, 본 발명의 조성물에서 보관된 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일의 대표적인 DGGE 겔 및 유사성%(겔 하부)를 나타내고;
도 11a 및 11b는 본 발명의 조성물에 37℃에서 보관된 2 명의 공여자로부터의 대변 샘플의 아가로스 겔을 나타내고;
도 12a 및 12b는 본 발명의 조성물에 37℃에서 보관된 2 명의 공여자로부터의 대변 샘플의 DGGE 분석을 나타내고;
도 13a-e는 -20℃, 실온 및 50℃에서 본 발명의 조성물에 보관된 3 명의 공여자로부터의 대변 샘플의 아가로스 겔을 나타내고;
도 14a-d는 50℃ 및 -20℃에서 본 발명의 조성물에 보관된 3 명의 공여자로부터의 대변 샘플의 아가로스 겔 전기영동을 나타내고;
도 15a-b는 14 일 동안 50℃에서 본 발명의 조성물에 보관된 2 명의 공여자로부터의 대변 샘플의 DGGE 분석을 나타내고;
도 16a-b는 11 일 동안 -20℃에서 본 발명의 조성물에 보관된 2 명의 공여자로부터의 대변 샘플의 DGGE 분석을 나타내고;
도 17은 본 발명의 조성물에서 5 회 냉동/해동 사이클에 노출된 대변 샘플의 아가로스 겔을 나타내고;
도 18은 본 발명의 조성물에서 5 회 냉동/해동 사이클에 노출된 대변 샘플의 DGGE 분석을 나타내고;
도 19는 다양한 온도 및 시간(3 및 14 일)에 걸쳐 안정화 용액에 보관된 샘플이 OTU 풍부성에서 높은 유사성 수준을 나타냄을 실증하는 주 좌표 분석(PCoA)을 나타내고;
도 20은 다양한 온도 및 시간(3 및 14 일)에 걸쳐 안정화 용액을 함유하고 및 함유하지 않고 보관된 샘플의 과 수준의 비례적 풍부성을 나타낸다.
도 21은 신선 상태 및 104B pH 11 안정화된 샘플 내의 및 간의 브레이-커티스(Bray-Curtis) 비유사성 거리를 나타낸다. 만-휘트니(Mann-Whitney) 시험은 모든 조건에서 필적하는 비유사성을 나타내었고, 통계적인 차이는 관측되지 않았다.
도 22는 104B pH 11 안정화된 샘플이 풍부도를 보존함을 나타낸다. 풍부도는 개별 OTU에 존재/부재를 할당하여 평가하였고 샤논(Shannon)-지수를 이용하여 비교하였다. 만-휘트니 시험은 신선 상태 및 104B pH 11 샘플 간에 유의차를 나타내지 않았다.
도 23는 104B pH 11 샘플이 고도로 재현가능한 미생물군유전체 프로파일을 부여함을 나타낸다. 브레이-커티스 거리에 대한 만-휘트니 시험은 3 개씩의 샘플에서 필적하는 비유사성을 나타내었다.
도 24는 신선 상태 샘플과 비교되는 경우 안정화되지 않은 및 104B pH 11(23℃에서 14 일) 및 냉동(-80℃에서 14 일) 대변 샘플 간의 브레이-커티스 거리 비유사성을 나타낸다. 유의미한 비유사성을 만-휘트니를 이용하여 평가하였다(*P≤0.05).
도 25는 표적인 공여자의 미생물군유전체의 가중치를 부여한 Unifrac 유사성%의 수상도를 나타낸다. 3 개의 생물학적 반복물로부터의 추출을 매 조건에 대해 수행하였다. 신선 상태 샘플에 대한 낮은 유사성%는 경시적인 미생물군유전체 프로파일 변화를 시사한다.
도 26은 시뮬레이션된 수송 조건을 거친 104B pH 11 샘플의 DNA 온전성을 나타낸다. 대표적인 공여자 샘플을 14 일 동안 23℃, 1 일 동안 50℃, 3 일 동안 37℃에 보관하거나 다회 냉동-해동 사이클에 노출시켰다. 신선 상태 샘플을 또한 대조군으로서 14 일 동안 -80℃에서 보관하였다.
도 27은 시뮬레이션된 운송 조건에 노출된 104B pH 11 샘플의 브레이-커티스 거리 비유사성을 나타낸다. 만-휘트니 시험은 다양한 온도에서 보관된 104B pH 11 샘플과 -80℃에서 보관된 것 간에 차이를 나타내지 않았다. 페어링된 -80℃ 샘플과 비교되는 경우, 유의미한 비유사성이 37℃에서 유지되거나 냉동-해동(F/T) 조건을 거친 안정화되지 않은 샘플에서 관측되었다(각각 P≤0.05 및 P≤0.01).
도 28은 40℃에서 5 일 동안 가변 농도의 CDTA를 함유하는 본 발명의 조성물 및 CDTA를 함유하지 않는 조성물로 처리된 2 명의 공여자로부터의 대변 샘플의 박테리아 집단 프로파일의 DGGE 분석을 나타낸다.
도 29는 상온에서 21 일 동안 본 발명의 조성물 "104B pH 11" 또는 TEN 버퍼로 처리된 2 명의 공여자로부터의 대변 샘플의 박테리아 집단 프로파일의 DGGE 분석을 나타낸다.
본원에 기재된 핵산을 안정화하기 위한 조성물의 역할은 연장된 시기 동안 상온에서 생물학적 샘플, 예컨대 대변 샘플에서 핵산을 안정화하고 전체 DNA 프로파일을 '스냅-샷'하는 것임이 주지되어야 한다. 핵산, 예컨대 DNA의 추출 및 단리는 본원에 기재된 조성물을 이용하여 대변 샘플에 함유된 핵산의 안정화 후 상업적으로 이용가능한 추출 키트를 이용해서 후속 단계에서 수행된다. 바람직하게는, 본원에 기재된 핵산을 안정화하기 위한 조성물은 무질서유발 염(예로, 구아니디늄 염, 예컨대 구아니디늄 티오시아네이트(GuSCN) 또는 구아니디늄 하이드로클로라이드(GuHCl)), 요소, 고정제(예로, 포르말린, 파라포름알데하이드 등), 환원제, 다중 양이온(예컨대 폴리라이신 또는 폴리아크릴아미드), 페놀 또는 클로로포름을 함유하지 않는다. 효소, 예컨대 프로테아제(예로, 프로니타제 K), 라이소자임 등은 본원에 기재된 조성물을 이용하여 대변 샘플에 함유된 핵산의 안정화를 시행하기 위해 필요하지 않으며, 이에 따라 바람직하게는 본원에 기재된 조성물에 포함되지 않는다. 따라서 핵산을 안정화하는 본 발명의 조성물 및 방법은 종종 특수 보관 및 수송 조건을 필요로 하는 고가이고/이거나 독성인 화합물의 사용을 배제한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
명세서 및 청구범위에서 이용되는 단수 형태에는 문맥 상 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수의 참조물이 포함된다.
본원에서 이용되는 용어 "포함하는"은 이후 목록이 비-포괄적이고 임의의 다른 추가의 적합한 물품, 예를 들면 적절한 바에 따라 하나 이상의 추가 특색(들), 성분(들) 및/또는 요소(들)가 포함되거나 포함되지 않을 수 있음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 이용되는 용어 "샘플"은 잠재적으로 관심 물질, 특히 핵산 및 선택적으로 단백질 또는 다른 관심 생체분자를 함유하는 임의의 시료를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 용어 "샘플"은 용액, 예컨대 수용액, 세포, 조직, 생검, 분말, 또는 하나 이상의 상기 물질의 집단을 포괄할 수 있다. 샘플은 생물학적 샘플, 예컨대 타액, 가래, 볼 면봉 샘플, 혈청, 혈장, 혈액, 버피 코트, 인두, 코/코 인두 또는 굴 면봉 또는 분비물, 목 면봉 또는 찰과, 소변, 점액, 대변/변/배설물, 직장 면봉, 병소 면봉, 미즙, 구토물, 위액, 췌장액, 위장(GI)관 액 또는 고체, 정액/정자, 요도 면봉 및 분비물, 뇌 척수액, 수유 또는 생리 산물, 난황, 양수, 수양액, 유리체액, 자궁경부 분비물 또는 면봉, 질액/분비물/면봉 또는 찰과, 골수 샘플 및 흡입물, 흉막액 및 유출물, 땀, 고름, 누액, 림프, 기관지 또는 폐 세척액 또는 흡입물, 복막 유출물, 세포 배양물 및 세포 현탁물, 연결 조직, 상피, 상피 면봉 및 도말, 점막, 근육 조직, 태반 조직, 생검, 삼출물, 장기 조직, 신경 조직, 모발, 피부 또는 손발톱일 수 있고, 여기서 상기 물질의 샘플은, 예를 들면 포유동물을 포함하는 척추동물로부터 수득될 수 있다. 포유동물은, 예를 들면 인간, 비-인간 영장류, 소(예컨대 젖소, 염소 또는 양)뿐만 아니라 개, 고양이, 말 등일 수 있다.
하나의 구현예에서, 생물학적 샘플은 대변 샘플이고, 대상체는 포유동물이다. 또 하나의 구현예에서, 생물학적 샘플은 대변 샘플이고, 대상체는 인간이다.
다른 유형의 생물학적 샘플에는 식물, 식물 추출물, 조류, 토양 샘플, 하수, 폐수, 물, 환경 샘플, 식료품, 소 먹이, 어류 먹이, 동물 먹이, 오염된 또는 잠재적으로 감염성인 표면 또는 설비(예로, 고기 가공 표면)의 면봉, 병원, 너싱 홈, 외래 환자 시설, 의료 기관 내 '터치' 표면의 면봉 등이 포함된다. 다른 구현예에서, 생물학적 샘플은 토양 샘플, 하수 샘플, 폐수 샘플, 또는 물 샘플로부터 선택되며, 그 중 임의의 것이 대변으로 오염될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "미생물"은 모든 원핵생물, 즉 유박테리아 및 아캐아박테리아 및 프로토조아, 진균(예로, 효모), 조류 및 동물, 예컨대 윤충 및 플라나리아를 포함하는 다양한 형태의 진핵생물을 포함하는 임의의 미소 개체 및 포자를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 16S rRNA 유전자 서열분석을 이용해서 인간 대변에서 가장 빈번하게 검출되는 박테리아 그룹에는 피르미쿠테스 , 박테로이데테스 , 스피로캐테스 , 푸소박 테리아, 델타프로테오박테리아 , 엡실론프로테오박테리아 , 알파프로테오박테리아, 베타프로테오박테리아 , 감마프로테오박테리아 , 유리아캐 오타, 유카리아 , 데설포티오비브리오 , Tm7 , 시아노박테리아, 악티노박테리아 , 베루코마이크로비아 및 렌티스패래가 포함된다.
본원에서 이용되는 용어 "바이러스" 또는 "비리온"은 다른 개체의 생존 세포 내부에서만 복제하는 임의의 작은 감염성 제제를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 바이러스는 동물 및 식물로부터 박테리아 및 아캐아까지 모든 유형의 생명 형태를 감염시킬 수 있고 거의 모든 생태계에서 생존한다. 현재, 인간에서 질환을 일이키는 것으로 공지된 21 개의 바이러스 패밀리가 존재한다: 아데노비 리대, 헤르페스비리대 , 파필로마비리대 , 폴리오마비리대 , 폭스비리대 , 헤파드나비리대 , 파보비리대 , 아스트로비리대 , 칼리시비리대 , 피코마비리대 , 코로나비리대, 플라비비리대 , 토가비리대 , 헤페비리대 , 레트로비리대 , 오르소믹소비리대 , 아레나비리대, 부냐비리대 , 필로비리대 , 파라믹소비리대 , 랩도비리대 , 레오비리대(및 현재 할당되지 않은 D형 간염). 바이러스 내의 유전 물질은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다.
본원에 기재된 조성물에 의해 안정화될 핵산은 mRNA 또는 바이러스 RNA를 포함하는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 하나의 구현예에서, 핵산은 DNA이다. 또 하나의 구현예에서, DNA는 인간, 바이러스, 및 미생물 기원이다. 또 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 조성물에 의해 안정화될 핵산은 인간 DNA 및 미생물 DNA를 포함한다.
본원에서 이용되는 용어 "상온"은 수집 시점, 수송 동안(비록 보통 짧은 시기 동안(예로, 5 일 미만)이기는 해도, 상대적으로 극한 온도가 관여될 수 있음)뿐만 아니라 분석 전의 연장된 보관 동안 생물학적 샘플(예로, 대변 샘플) 및 본원에 기재된 핵산 안정화 조성물의 혼합물이 겪을 수 있는 온도 범위를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 온도는 약 -20℃ 내지 약 60℃ 범위의 상온이다. 또 하나의 구현예에서, 상온은 실온이며 약 15℃ 내지 약 30℃ 범위이다.
대변 샘플과 본원에 기재된 수성 조성물을 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계는 대변 배설 후 가능한 빨리 수행되어야 하며, 혼합물을 균질화하여 균질 혼합물을 형성하는 단계는 대변 샘플 내에 함유된 핵산을 안정화하기 위해 가능한 빨리, 바람직하게는 즉시 수행되어야 한다.
일반적으로 생물학적 샘플, 예컨대 타액, 혈액, 가래, 대변/변 및 소변에서 DNA 및 RNA의 화학적 안정화는 적절한 pH를 유지하기 위한 버퍼의 사용뿐만 아니라 핵산의 포스페이트 골격으로의 금속 이온의 결합 또는 금속 산화환원 사이클링 현상을 방지하기 위한 킬레이트화제의 사용을 통해 달성된다. 본원에서 이용되는 용어 "킬레이터" 또는 "킬레이트화제"는 일정 금속 이온(예로, Ca2+ 및 Mg2+)과 가용성의 안정한 복합체를 형성하여 이온을 격리시킴으로써 이들이 보통 다른 성분, 예컨대 GI 관에서 풍부한 효소들인 데옥시리보뉴클레아제(DNase) 또는 엔도뉴클레아제(예로, I, II 및 III 형 제한 엔도뉴클레아제) 및 엑소뉴클레아제(예로, 3' → 5' 엑소뉴클레아제)와 반응할 수 없도록 하는 화학물질을 의미하는 것으로 이해될 것이다. GI 관에서 DNase의 주요 공급원은 췌장 분비물뿐만 아니라 체류 미생물이다. 본 발명의 조성물에서, 킬레이트화제(들)는 생물학적 샘플에서 DNase 및 미생물 성장의 저해에 참여한다. 킬레이터는, 예를 들면 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), (2-하이드록시에틸)에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 니트릴로트리아세트산(NTA), 에틸렌디아민트리아세트산(EDTA), 1,2-사이클로헥산디아민테트라아세트산(CDTA), N,N-비스(카복시메틸)글리신, 트리에틸렌테트라아민(TETA), 테트라아자사이클로도데칸테트라아세트산(DOTA), 데스페리옥시민, 시트레이트 무수물, 나트륨 시트레이트, 칼슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 바이시트레이트, 시트르산, 디암모늄 시트레이트, 제2 철 암모늄 시트레이트, 및 리튬 시트레이트일 수 있다. 이들 킬레이트화제는 단독으로 또는 이들 둘 이상의 조합으로 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약 150 mM 내지 약 600 mM의 양으로, 바람직하게는 약 150 mM 내지 약 500 mM의 양으로, 보다 바람직하게는 약 250 mM 내지 약 350 mM의 양으로, 가장 바람직하게는 약 300 mM의 양으로, 비제한적으로 CDTA, DTPA, DOTA, TETA, 및 데스페리옥시민, 또는 이들의 킬레이터 유사체를 포함하는, 단독으로 또는 조합으로 사용되는 EDTA보다 강력한 킬레이터(즉, 금속에 결합된 경우, EDTA보다 높은 해리 상수를 갖는 킬레이터)가 바람직하다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 조성물에서의 킬레이트화제는 CDTA이다.
EDTA는 산업, 실험실, 화장품, 의약 및 일부 식품 제품에서 널리 사용되는 화학물질이다. 그 유용성은 특히 2 가 및 그 초과 공유가로, 금속 이온을 '킬레이트'하는 그 능력에 기반한다. CDTA는 이들 분야에서 덜 일반적으로 사용되지만, 금속 이온을 킬레이트하는 능력을 EDTA와 공유한다. 중요하게는 상이한 금속 이온에 대한 두 킬레이터의 친화도는 상당히 변한다. log 척도 상에 표시되는 친화도 측정치, K1를 표 1(아래)에 나타낸다. 기재된 최초 5 개의 킬레이터는 질소기에 부착된 상이한 수 및 배치의 카복실레이트(R-COO-)기를 갖는다. 표 1에서, OPT는 질소기에만 기반하는 킬레이터로서 비교를 위해 제시된다.
표 1에서 CDTA 및 EDTA의 비교는 이들이 매우 상이함을 나타낸다. log K1 값의 차이는 2.3(Mg2 +); 2.6(Ca2 +); 2.4(Mn2 +); 대략 3(Fe3 +); 3.6(Co2 +); 0.8(Cu2 +); 2.9(Zn2+)이다. 즉, CDTA는 대부분의 금속에 대해 EDTA보다 200 내지 4,000 배 더 단단히 결합한다.
[표 1]
상이한 금속 이온에 대한 킬레이터의 친화도
Figure pct00001
금속을 복합체화하는 CDTA의 이러한 더 강한 능력의 하나의 결과는 임의의 유리 금속 이온의 농도가 동일한 농도의 CDTA 또는 EDTA의 존재 하에 더 낮을 것이라는 점이다. 그러나 더 중요하게는, 생체분자, 예컨대 핵산 또는 단백질에 복합체화될 수 있는 금속의 양이 상당히 더 낮을 것이다. 용액 중의 핵산은 금속 이온에 결합하는 것으로 공지되어 있고, 이러한 금속의 제거는 이들의 화학적 안정성을 개선할 가능성이 있다. 이는 특히, 생체분자 산소, 수퍼옥사이드 음이온 및 과산화수소와 같은 종으로부터 전자를 얻거나 잃어서 상이한 산화 상태로 존재할 수 있는 전이 금속, 예컨대 Mn, Fe, Co 및 Cu에 대해 중요할 수 있다. 마지막으로, 금속을 복합체화하는 CDTA의 더 강한 능력은 이들의 활성 형태를 안정화하기 위해 Ca2 + 및 Mg2 +가 필요한 다량의 DNase를 천연 함유하는 것으로 공지되어 있는 생물학적 샘플, 예컨대 대변에서 핵산의 분해를 얻제하기 위해 개발된 조성물에서 매우 유익하다.
[표 2]
CDTA 및 EDTA에 대한 pK 값
Figure pct00002
CDTA 및 EDTA 간에 존재하는 다른 차이는 실험실 또는 연구 환경에서 실제적인 결과를 갖는다는 점이다. 가능하게는 EDTA의 더 낮은 k1 및 k2 pKa 값으로 인해(상기 표 2 참고), pH 7.0에서 디나트륨 형태(산 형태로 시작하여)를 제조하기가 상당히 더 어렵다. EDTA보다 농축된 CDTA 용액이 제조될 수 있다. 마지막으로, CDTA의 디나트륨 형태는 EDTA의 디나트륨 형태의 제한된 용해도에 비해 에탄올에서 매우 가용성이다. 이러한 차이는 CDTA를 제조 관점에서 최고의 킬레이터 선택으로 만든다.
일반적으로, 본 발명의 조성물의 pH는 하나 이상의 적절한 버퍼를 사용해서 원하는 알칼리 범위로 유지될 수 있다; 여기서 조성물이 완충되어 적합한 pH에서 생물학적 샘플의 pH를 유지하며, 상기 조성물은 상기 핵산을 상온에서 안정화한다. 하나의 구현예에 따르면, 조성물은 pH를 약 9.5 내지 약 11.5의 바람직한 범위 내에 유지하기 위해 25℃에서 8.0 내지 12.5 범위의 로그 산 해리 상수, pKa 값을 갖는 1 개, 2 개 또는 그 초과의 버퍼제(비제한적 예가 제공됨, 표 3 참고)를 포함한다. 산 해리 상수, Ka는 용액 중 산 강도의 정량적 측정치이다. Ka 값이 클수록 용액 중 분자의 해리가 더 크므로, 더 강산이다. Ka 값이 미치는 여러 차수 크기로 인해, 산 해리 상수의 로그 측정치, pKa가 더 일반적으로 실제로 사용된다. pKa 값이 클수록, 임의의 주어진 pH에서 해리 정도가 더 작다, 즉 더 약산이다.
생존 유기체에서, 산-염기 항상성 및 효소 반응속도는 세포내 및 체내에 존재하는 여러 산 및 염기의 pKa 값에 의존한다. 화학에서, pKa 값에 대한 지식이 버퍼 용액의 제조를 위해 필요하며, 또한 복합체를 형성하기 위한 산 또는 염기 및 금속 이온 간 상호작용의 정량적 이해를 위한 필요조건이다. 당해분야의 숙련가는 그 농도가 충분하고 용액의 pH가 그 pKa와 가까운(약 1 pH 단위 내인) 경우에만 주어진 화합물/버퍼가 용액의 pH를 완충할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 하나의 구현예에서, 조성물의 pH는 약 9.5 내지 약 11.5 범위이다. 바람직한 구현예에서, 조성물의 pH는 약 10.5 내지 약 11.5 범위이며, 바람직하게는 pH는 약 11이다. 버퍼제(들)의 양은, 예를 들면 약 1 mM 내지 약 1 M일 수 있다.
일정 구현예에 따르면, 조성물은 pH를 약 9.5 내지 약 11.5의 원하는 범위 내로 유지하기 위해 주요 버퍼제로서 베타-알라닌을 포함한다. pH를 약 11에서 유지하기 위해, 버퍼는 10-12 범위에 pKa를 갖는 버퍼를 표 3으로부터 선택할 수 있다. 카복실레이트 킬레이트화제, 예컨대 CDTA 및 EDTA도 상기 범위에서 완충능에 기여할 수 있음을 주지할 필요가 있다. 그러나, CDTA 및 EDTA의 pKa(k4) 값(표 2)은 유의미하게 상이하다. EDTA의 더 낮은 pKa(k4) 값(표 2)은 이를 원하는 pH 범위의 하한에서 본 발명의 조성물을 유지하는 것을 돕는데 유용할 수 있게 만든다. 그러나 CDTA의 더 높은 pKa(k4) 값은 이들 원하는 범위의 상한(즉, pH 11)에서 베타-알라닌(또는 표 3에 기재된 다른 버퍼)의 완충능을 강화하기 위해 더 적합하게 만든다.
[표 3]
본 발명의 조성물의 적합한 버퍼
Figure pct00003
Figure pct00004
β-알라닌은 본 출원의 조성물에 대해 특히 적합한 버퍼이다. 하나의 구현예에서, 조성물의 pH는 약 10.5 내지 약 11.5이며, β-알라닌은 약 10 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 30 mM 내지 약 70 mM의 양으로, 가장 바람직하게는 약 50 mM의 양으로 존재한다.
본원에서 이용되는 용어 "수용성" 또는 "수혼화성 유기 용매"는 용질, 화학적으로 상이한 액체, 고체 또는 기체를 용해시키는 임의의 탄소-함유 물질 또는 화합물, 일반적으로 액체를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 수용성 유기 용매는, 예를 들면 직쇄 또는 분기쇄일 수 있는 하나 이상의 단쇄(예로, C1-C6) 알칸올, 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, n-부탄올, 펜탄올, 헥산올 또는 이들의 임의 조합일 수 있다. 본 발명의 조성물의 하나의 구현예에서, 바람직한 알코올은 에탄올이다. 또 하나의 구현예에서, 수용성 유기 용매(예로, 에탄올)는 조성물에 약 30 부피% 미만, 바람직하게는 약 24 부피% 미만, 예컨대 약 21.5 부피% 내지 약 23.5 부피%, 가장 바람직하게는 약 23.5 부피%의 농도로 존재한다. 다른 구현예에서, 수혼화성 유기 용매가 없을 수 있다.
일반적으로 당해분야에서, 30% 초과 에탄올이 대부분의 단백질을 변성시키기 위해 필요한 것으로 공지되어 있다. 60% 초과 에탄올 또는 50% 초과 이소프로판올이 용액으로부터 DNA를 침전시키기 위해 필요하다. 무수 에탄올 또는 메탄올은 일반적으로 생화학적 반응을 종료시키기 위해 조직학, 병리학 및 세포생물학에서 고정제로서 사용된다. 일부 단백질은 수혼화성 유기 용매, 예컨대 20-50%(부피/부피) 범위의 에탄올 및 아세톤 첨가에 의해 침전될 수 있다. 에탄올은 단백질의 탈수 또는 수 활성 감소에 이어 단백질 간 정전기적 유인에 의해, 응집 및 불용화를 유도한다. 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 본 발명의 조성물에서 비교적 적은 퍼센트의 수혼화성 유기 용매가 고정제 특성을 거의 갖지 않고 오히려 생물학적(예로, 대변) 샘플의 혼합 및 분산을 촉진하며 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 다른 화학적 화합물의 용해도를 개선한다고 믿는다. 또한, 가연성 액체의 운송/수송을 위해, 유기 용매, 예컨대 에탄올을 위험물 수송(TDG) 규제(UN 번호 1170)에서 제외되는 용액 중 24 부피% 미만으로 유지하는 것이 바람직하다; 그렇지 않은 경우, 24% 초과 에탄올을 함유하는 용액은 클래스 3(가연성 액체)으로 분류되어 특수 패키징이 요구되며 수송 복잡성 및 비용이 증가한다.
본원에서 이용되는 용어 "세제" 또는 "계면활성제"는 양쪽성이고, 단백질에서 비공유 결합을 손상시켜 이들을 변성시키고 분자가 이들의 천연 이차, 삼차 및/또는 사차 구조를 잃도록 유도할 수 있는 임의의 유기 화합물을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 적합한 세제는, 예를 들면 음이온성 세제(예컨대, 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 리튬 도데실 설페이트, 나트륨 라우릴 설페이트(SLS), 암모늄 라우릴 설페이트), 양이온성 세제(사차 암모늄 염, 예컨대 세트리모늄 브로마이드/세틸트리메틸암모늄 브로마이드/헥사데실-트리메틸-암모늄 브로마이드 또는 CTAB, 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(CTAC), 세틸피리디늄 클로라이드(CPC), 벤잘코늄 클로라이드(BAC)), 쯔비터이온성 계면활성제(예를 들어, 베타인, 3-[(3-클로아미도프로파일)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), 레시틴) 또는 비이온성 세제(예컨대, Tween, Triton X, 또는 Brij)일 수 있다. 그러나 CTAB는 DNA로 작업하는 경우에는 덜 이상적이다. 세제는 이들 효소의 복잡한 구조를 파괴함으로써 DNase의 작용을 저해하고, 본 발명의 조성물 중 생물학적 샘플의 촉진하고, 다양한 화학 종의 가용화를 도울 수 있다. 본 발명의 조성물의 일정 구현예에서, 세제는 SDS이다. 다른 구현예에서, 세제(예로, SDS)는 수성 조성물에 약 0-4%(w/v), 바람직하게는 약 0-1%(w/v), 가장 바람직하게는 약 0.5%(w/v)의 양으로 존재할 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "소포제" 또는 "탈포제"는 거품 형성을 감소시키거나 방해하는 화학적 첨가제를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명자들은 세제를 포함하는 본 발명의 조성물의 일정 구현예를 함유하는 튜브에 일부 생물학적 샘플, 특히 대변을 신속하게 그리고 완전히 분산시키기 위해 필요한 강력한 진탕 동안 거품 형성을 관측하였다. 상기 거품은 균질화 수단을 포함하는 및 포함하지 않는 완전한 혼합을 방해했으며, 일부 샘플에서는 방지하였다. 소포제, 예컨대 활성 실리콘 중합체인 소포제 A 농축물(Sigma-Aldrich; Cat. No. A-5633)은 생물학적 샘플 및 본 발명의 조성물의 상기 혼합 동안 거품의 형성을 유의미하게 감소시켰다. 따라서 소포제는 바람직하게는 거품 형성을 최소화하기 위해 세제를 함유하는 조성물에 포함되어야 한다. 단독으로 또는 둘 이상의 조합으로 사용될 수 있는 적절한 소포제의 다른 예에는 불용성 오일, 폴리디메틸실록산 및 다른 실리콘, 일정 알코올, 스테아레이트 및 글리콜이 포함된다. 다른 구현예에서, 소포제(예로, 소포제 A)는 약 0-1%(v/v), 바람직하게는 약 0-0.2%(v/v)의 양으로 수성 조성물에 존재할 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "항미생물제"는 이들의 부재 하에 개체의 성장 속도에 비해, 개체의 성장 속도를 감소시키는 물질 또는 물질 그룹을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 개체의 성장 속도 감소는 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%, 50%, 또는 75%, 가장 바람직하게는 90% 이상일 수 있다. 정의는 또한 개체의 생존력, 병독성 또는 병원성에 영향을 미치는 물질로 연장된다. 항미생물제는 천연(예로, 박테리아 유래), 합성, 또는 재조합일 수 있다. 항미생물제는 정균성, 살균성 또는 둘 다일 수 있다. 항미생물제는 이들이 저해된 세포의 생존력에 영향을 주지 않고 세포 분열을 저해하는 경우 정균성이다. 항미생물제는 이것이 세포사를 유도하는 경우 살균성이다. 세포사는 액체 성장 배지 내에서 세포 성장의 부재(예로 탁도의 부재) 또는 고체 표면 상에서 세포 성장의 부재(예로, 한천 상 집락 형성의 부재)에 의해 일반적으로 검출된다. 당해분야의 숙련가는 주어진 농도에서 정균성인 물질 또는 물질 그룹이 더 높은 농도에서 살균성일 수 있음을 안다. 당해분야에 공지된 일반적인 항미생물제에는 일정 알코올, 트리클로산 또는 이르가산, 및 프로클린 950이 포함된다. 선택적으로, 본 발명의 조성물에는 항미생물제, 예컨대 트리클로산이 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 항미생물제(예로, 트리클로산)는 약 0-2%(w/v), 바람직하게는 약 0-0.5%(w/v)의 양으로 수성 조성물에 존재할 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 생물학적 샘플, 특히 대변 샘플과 혼합되는 경우, 핵산이 연장된 시기 동안 균질화된 혼합물의 보관 시 안정화되도록 상온에서 내부에 함유된 핵산을 안정화한다.
하나의 구현예에서, 생물학적 샘플은 인간 대상체로부터 수득된 대변 샘플이며, 핵산은 DNA이다.
당해분야의 숙련가는 샘플에서 고분자량 DNA의 존재가 보관 조건 하에 샘플 내에서 DNA 안정화의 일반적 지표를 제공할 수 있음을 인식할 것이다. 이는 아가로스 겔 전기영동에 의해 평가될 수 있고, 이는 고분자량 DNA의 품질(예로, 깔끔한 밴드 대 도말)의 지표뿐만 아니라 고분자량 DNA의 양의 정량적 측정치(밀도측정 분석에 의해)를 제공할 수 있다.
고분자량 DNA의 안정화에 부가하여, 본원에 기재된 조성물은 생물학적 샘플, 특히 대변 샘플과 혼합되는 경우, 연장된 시기 동안 균질화된 혼합물의 보관 시 미생물 및/또는 인간 핵산의 상대적 풍부성이 유지되도록 상온에서 내부에 함유된 핵산을 안정화한다. 당해분야의 숙련가에게 공지된 여러 기법, 예를 들면 핵산의 증폭 또는 혼성화를 이용하는 기법이 미생물 및/또는 인간 핵산의 상대적 풍부성이 유지되는지 여부를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 연장된 시기 동안 균질화된 혼합물의 보관 시 미생물 및/또는 인간 핵산의 상대적 풍부성이 유지되는지 여부를 평가하기 위해 이용될 수 있는 또 다른 기법은 아래에 더욱 상세히 기재되는 PCR-DGGE 분석이다. 표적화된 16S 프로파일(운영 분류 단위(OTU)의 상대적 풍부성을 결정하기 위해)뿐만 아니라 게놈 DNA의 전체-메타게놈 샷건 서열분석(WMS; 미생물 유전자/핵산의 상대적 풍부성을 결정하기 위해)도 이용될 수 있다.
하나의 예시적 구현예에서, 특히 인간 DNA의 안정화는 생물학적 샘플, 예컨대 대변 샘플로부터 수득되고, 조성물과 일정 시기 동안(tstorage) 본원에 기재된 방법에 따라 인큐베이션된 DNA가 표적 인간 유전자의 검출가능한 산물로의 PCR 증폭을 뒷받침하는 능력을 보유하는지 여부, 보다 구체적으로 PCR 산물의 증폭 수준이 시점 0에 동일한 균질 혼합물 또는 다른 대조군 혼합물로부터 추출되고 정제된 DNA와 유사한지 여부를 결정함으로써 평가될 수 있다. 아래 실시예에서 추가 기재된 바와 같이, 대변 샘플로부터 정제되고 조성물과 함께 본원에 기재된 방법에 따라 T=0 및 T=tstorage 인큐베이션된 인간 DNA는 인간 유전자를 표적으로 하는 프라이머를 이용해서 실시간, 정량적 PCR(qPCR)에서 증폭될 수 있고, T=0 및 T=tstorage에 정제된 DNA 분취물에서 얻어진 Ct 값의 변화(ΔCt)는 인간 DNA 안정성의 정량적 측정치를 제공할 수 있다. 약 2 미만의 ΔCt 값은 인간 DNA가 보관 시기에 걸쳐 안정해짐을 시사한다. 약 1 미만의 ΔCt 값은 뛰어난 안정화의 지표이다.
하나의 구현예에서, 조성물과 함께 본원에 기재된 방법에 따라 인큐베이션된 대변 샘플에 함유된 인간 DNA는 적어도 7 일, 적어도 14 일, 적어도 21 일, 적어도 30 일, 또는 적어도 60 일 동안 실온에서 안정하게 된다. 또 하나의 구현예에서, 조성물과 함께 본원에 기재된 방법에 따라 인큐베이션된 대변 샘플에 함유된 인간 DNA는 적어도 7 일, 또는 적어도 14 일 동안 승온, 예컨대 37℃ 또는 50℃에서 안정하게 된다. 또 하나의 구현예에서, 조성물과 함께 본원에 기재된 방법에 따라 인큐베이션된 대변 샘플에 함유된 인간 DNA는 적어도 1 개월(즉, 30 일) 동안 -20℃에서 안정하게 된다.
또 하나의 구현예에서, 핵산은 미생물 DNA이며, 방법은 생물학적 샘플(예로, 대변 샘플)의 미생물군유전체 프로파일을 안정화한다. 본원에서 이용되는 용어 "미생물군유전체 프로파일"은 일반적으로 정의된 환경 내의 전체 미생물 집단 및 생체분자 그리고 이들의 상대량을 나타낸다.
아래에서 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 미생물군유전체 프로파일의 안정성은, 예를 들면 특정 시기(tstorage) 동안 상온에서 균질 혼합물의 보관 후 본원에 기재된 생물학적 샘플 및 조성물의 균질 혼합물로부터 추출되고 정제된 DNA 상에 박테리아 16S rRNA 유전자를 표적화하는 프라이머 페어 및 변성 구배 겔 전기영동(DGGE) 분석을 이용해서 PCR을 수행함으로써 결정될 수 있다. 당해분야의 숙련가는 관심 종 간 차이가 존재하는 경우, 가변 및 비-가변 영역을 갖는 다른 박테리아 유전자가 표적화될 수 있음을 인식할 것이다. 이어서 생성 PCR-DGGE 프로파일은 시점 0에 생물학적 샘플 및 조성물의 동일한 균질 혼합물 또는 다른 대조군 혼합물로부터 추출되고 정제된 DNA 상에서 동일한 방식으로 PCR-DGGE 분석을 수행함으로써 수득되는 것과 비교된다. 하나의 구현예에서, 생물학적 샘플, 예컨대 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일은 상온에서 (tstorage) 후 PCR-DGGE 프로파일이 T=0에서의 PCR-DGGE 프로파일과 적어도 75% 유사성을, 가장 바람직하게는 T=0에서의 PCR-DGGE 프로파일과 적어도 82% 유사성을 나타내는 경우 일정 시기(tstorage) 동안 상온에서 안정화된 것으로 간주될 수 있다.
또 하나의 구현예에서, 미생물군유전체 프로파일의 안정성은, 예를 들면 특정 시기 동안 상온에서 균질 혼합물의 보관 후 본원에 기재된 생물학적 샘플 및 조성물의 균질 혼합물로부터 추출되고 정제된 DNA로부터 박테리아 16S rRNA 유전자의 가변 영역(예컨대 V4 초가변 영역)을 증폭하고 서열분석함으로써 결정될 수 있다. 이어서 생성 서열분석 정보는 시점 0에서의 동일한 균질 혼합물 또는 다른 대조군으로부터 추출되고 정제된 DNA 상에서 동일한 방식으로 박테리아 16S rRNA 유전자의 가변 영역의 증폭 및 서열분석을 수행함으로써 수득된 것과 비교된다. 당해분야의 숙련가에게 공지된 수득된 서열분석 데이터의 다양한 바이오인포마틱스 분석 형태를 이용해서 실시예에서 추가로 상세히 설명한 바와 같이, 보관 조건 하에 미생물군유전체의 안정성을 평가할 수 있다.
하나의 구현예에서, 조성물과 함께 본원에 기재된 방법에 따라 인큐베이션된 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일은 적어도 7 일, 적어도 14 일, 적어도 21 일, 적어도 30 일, 또는 적어도 60 일 동안 실온에서 안정하게 된다. 또 하나의 구현예에서, 조성물과 함께 본원에 기재된 방법에 따라 인큐베이션된 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일은 적어도 7 일, 또는 적어도 14 일 동안 승온, 예컨대 37℃ 또는 50℃에서 안정하게 된다. 또 하나의 구현예에서, 조성물과 함께 본원에 기재된 방법에 따라 인큐베이션된 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일은 적어도 1 개월(즉, 30 일) 동안 -20℃에서 안정하게 된다.
본 발명자들은 놀랍게도 알칼리성 pH(pH ≥9.5, 바람직하게는 pH 11)로 완충된 덜 일반적으로 사용되는 킬레이트화제, CDTA의 매우 높은 농도를 이용해서 연장된 기간 동안 상온에서 생물학적 샘플 중 핵산을 신속하고 효과적으로 포획하고 안정화하며 전체 DNA 프로파일을 '스냅-샷'할 수 있음을 확인하였다.
특히, 본 발명자들은 놀랍게도 더 강한 알칼리성 pH(약 pH 10.5-11.5, 바람직하게는 약 pH 11)로 완충된 조성물이 더 낮은 pH 값으로 완충된 안정화 조성물에 비해 미생물군유전체 DNA의 개선된 안정성을 나타냄을 확인하였다. 이는 예측될 수 없었으며, 실제로 하기 측면에서 예상되지 않았다. 일반적으로 더 높은 pH에서, 시토신의 탈아민화가 가속화될 것으로 알려져 있다. DNA는 또한 더 높은 pH에서 더 쉽게 변성하는 것으로 알려져 있다. DNA에서의 퓨린제거 부위(낮은 빈도로 일어남)도 더 쉽게 절단될 것이다. 따라서, 본 발명자들이 더 높은 pH 값에서 아가로스 겔 전기영동, 박테리아 16S rRNA 유전자 서열분석 및 DGGE에 기반하여 DNA/미생물군유전체 프로파일이 더 안정한 것으로 나타남을 관측한 것은 놀라운 것이다.
이론에 구애받지 않고, 뚜렷한 개선된 안정성의 이유는 순수히 "화학적"인 것이 아니라고 여겨진다. 즉, 더 강한 알칼리성 pH는 아마도 그 일부가 아래 제시되는 이유의 조합으로 인해, 미생물군유전체 DNA의 개선된 안정성을 나타낸다.
CDTA는 DNA/미생물군유전체 안정화를 위해 본원에 기재된 조성물에서 EDTA보다 훨씬 더 우수히 작용하는 것으로 관측되었다. EDTA 및 CDTA에 대해 4 개의 pKa가 위의 표 2에 나타난다. 이들 값에 기반하여, 알칼리성 pH에서 CDTA가 3의 음전하를 가질 것인 반면 EDTA는 pH가 11로 접근함에 따라 4의 음전하를 가질 것임을 의미한다. 역시 이론에 구애받지 않고, 아마도 EDTA 대비 CDTA의 훨씬 더 우수한 성능에 대한 이유는 더 낮은 음전하에 기인하는 것으로 여겨진다.
미생물군유전체 연구에서의 목적은 모든 세포로부터 DNA를 동일한 비율로, 바람직하게는 100% 세포로부터 100% DNA를 안정화하고 궁극적으로 방출하는 것이다. 상기 목적에 도달하기 위해 더 가까워질 수 있으므로, 방출된 DNA '프로파일'의 안정성은 더 높은 pH에서 더 우수할 수 있다. 다시 말하면, pH 9.5에 비해 pH 11에서 더 많은 정도의 박테리아 DNA가 안정화되고 궁극적으로 방출될 수 있다.
일단 DNA가 방출되면, 대변 샘플에서 DNase에 의한 분해로부터 보호되어야 한다. 일부 DNase는 보조-인자로서 금속 이온을 필요로 한다; 다른 것들은 그렇지 않다. 또 다시 이론에 구애받지 않고, 더 높은 pH가 두 번째 클래스의 DNase 저해에서 더 효과적일 수 있다.
대변에서 알려지지 않은 인자(예로, 저해제)가 DNA에 결합하고 이를 격리시키거나 PCR 증폭을 차단할 수 있다. 더 높은 pH는 이러한 가능성 중 하나 또는 둘 다를 완화시킬 수 있다.
마지막으로, 박테리아 성장이 안정화 조성물 내로의 대변 샘플의 수집 후 방지되어야 한다. 다른 경우, DNA/미생물군유전체의 '프로파일'이 변할 것이다. 더 높은 pH는 더 낮은 pH(9.5)보다 일부 미생물종의 성장 저해에서 더 효과적일 수 있다.
복합적이고 매우 가변적인 고체 및 반고체 샘플 유형, 예컨대 대변에 있어서, 수집 시 샘플을 조성물과 즉시 혼합하는 기계적 또는 물리적 수단을 제공하는 것이 또한 필요하다. 본 발명의 조성물에서 신선 상태로 수집된 생물학적 샘플의 신속한 균질화 및 완전 파괴는 상온에서 연장된 시기 동안 샘플에서 전체 DNA 프로파일의 대표적인 스냅샷의 안정화를 보장한다. 아래 실시예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 조성물이 수집된, 그러나 적절히 혼합되지 않은 고체 대변 샘플에 첨가되는 경우, DNA의 품질은 균질하게 혼합되는 샘플에 비해 손상된다. 따라서 샘플의 적절한 혼합은 이것이 생체내(T=0) 상태를 대표하도록 DNA를 안정화하기 위해 중추적이다. 예를 들어, 이러한 샘플로부터 추출된 DNA는 아가로스 겔 전기영동에 이어 일부 공여자로부터의 샘플에서 고분자량 DNA의 분해를 나타낼 수 있다. 또한 아래 실시예에 나타난 바와 같이, 일부 공여자로부터의 대변 샘플의 부적절한 혼합은 박테리아 16S rRNA PCR 및 DGGE 분석으로 측정된 바와 같이, 미생물군유전체 프로파일에 대한 불리한 변화로 이어진다.
많은 경우, 생물학적 샘플 수집, 특히 대변 수집은 이들 자신의 집에서 프라이버시 하에 공여자에 의해 가장 잘 수행된다. 상기 환경에서 공여자가 더 편안하고, 안정화 화학 또는 용액을 함유하는 적절한 생물학적 샘플 수집 디바이스 또는 키트 및 지침이 제공되는 경우, 공여자가 신선 상태의 생물학적 샘플을 즉시 수집하고 안정화할 수 있다. 상기 방식의 샘플 수집은 후속 추출 및 분석을 위한 최적 품질의 핵산을 보장하는 것을 돕고, DNA 프로파일이 생체내 상태와 가능한 가깝게 매칭된다. 그러나 가정 또는 원거리 장소의 수집 사이트에서 생물학적 샘플을 수집하고 안정화하기 위해, 공여자에게는 스스로 이들의 수집된 샘플을 안정화 용액과 함께 수동으로 또는 물리적으로 혼합하기 위한 단순하고, 안전하고, 직관적이지만, 고도로 효과적인 수단이 제공되어야 한다. 바람직하게는, 상기 혼합 수단은 저렴하며, 전기, 설비 또는 특수 훈련을 필요로 하지 않는다.
DNA는 안정화 용액과 혼합되지 않은 경우, 또는 수집 시점에 드라이 아이스 상에 즉시 냉동되지 않은 경우, 공기에 대한 노출 시 생물학적 샘플(예로, 대변)에서 빠르게 분해될 수 있다. 균질한 액체 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 및 소변에서는 혼합은 중요한 문제가 아니다; 그러나 제한된 양의 용액 및 시간으로 고체 및 반고체, 비-균질 생물학적 샘플, 예컨대 대변의 파괴는 더욱 더 문제가 될 수 있다. 수많은 혼합 수단(예로, 유리/실리카 입자(≤1 mm; 2.65 g/cm3), 유리/실리카 비드(2-4 mm; 2.65 g/cm3), 구슬(12.7 mm), 알루미나 옥사이드 볼(7.9 mm; 3.95 g/cm3), 및 실리카 니트라이드 볼(7.1-7.9 mm; 3.21 g/cm3)을 이용한 많은 실험을 통해, 본 발명자들은 본 발명의 조성물을 함유하는 표준, 상업적으로 이용가능한 실험실 또는 수송 튜브(예로, 10 mL 둥근 바닥 튜브(92x15.3 mm), Cat. No. 60.610; Sarstedt)에 수집된 모든 대변 샘플 유형(1-7, Bristol 변 척도)의 완전한 파괴 및 균질화가 튜브의 내경(예로, 12.9 mm)보다 작은 크기인 적어도 하나의 큰(5.6-11.1 mm, 바람직하게는 7.9 mm) 밀도 높은(7.6-15.63 g/cm3) 금속 볼의 튜브 내 도입을 포함하는 단순 수동 혼합으로 달성될 수 있음을 발견하였다.
본 발명자들은 표준, 상업적으로 이용가능한 실험실 튜브에 대한 균질화 수단의 최적 선택에, 하기가 포함된다고 결정하였다: 1) 튜브 또는 용기 영역에 도달하기 어려운 고체 물질의 압축 및/또는 포착을 방지하기 위한 튜브 형태(예로, 튜브 내부 하부 또는 저부)와 균질화 수단의 형태(예로, 적어도 하나의 혼합 볼, 예컨대 스테인레스 스틸 혼합 볼인 균질화 수단을 위한 둥근 바닥 튜브)의 매칭; 2) 균질화 수단에 대해 가능한 가장 밀도 높은 물질의 선택(예로, 텅스텐 카바이드(15.63 g/cm3), 스테인레스 스틸(7.6-8.0 g/cm3); 3) 튜브 또는 용기 내경보다 약간 작은 외경을 갖는 균질화 수단의 선택(예를 들어, 균질화 수단이 혼합 볼인 경우, 혼합 볼은 혼합 튜브의 내경보다 약 4-6 mm, 바람직하게는 약 4-5 mm, 가장 바람직하게는 약 5 mm 작은 직경을 가질 것임); 및 4) 수동 진탕 동안 균질화 수단이 운동량을 획득할 수 있도록 하기 위한 샘플 및 안정화 용액 위 '헤드스페이스'를 갖는 튜브 또는 용기의 선택. 혼합 볼은 규칙적 또는 불규칙적 형태일 수 있고(예로, 혹, 돌기 등을 가질 수 있고 완벽하게 구형일 필요는 없음) 상기 주지된 바와 같이 바람직하게는 적어도 5.0 g/cm3, 가장 바람직하게는 적어도 7.6 g/cm3의 밀도를 가지는 것이 주지되어야 한다.
균질화 수단/볼이 튜브에 비해 너무 작은 경우, 샘플은 안정화 용액에 분산되지 않고 균질화 수단/볼 주위를 통과한다. 대조적으로, 균질화 수단/볼이 튜브(12.9 mm 내경)에 비해 너무 큰 경우(예로, >11.1 mm), 샘플은 균질화 수단/볼 및 튜브의 벽 사이에서 분산되지 않거나 '분쇄되고', 균질화 수단/볼은 충분한 운동력을 획득하지 않고, 샘플은 튜브의 한 쪽 또는 양 쪽 말단에서 압축된다. 이상적으로, 균질화 수단의 외경(예로, 7.9 mm 텅스텐 카바이드 또는 스테인레스 스틸 볼)이 튜브의 내부 수직 벽(예로 상기, 12.9 mm의 내경을 갖는 10 mL Sarstedt 튜브)에서 약 5 mm(벽의 어느 한 쪽 2.5 mm)로 지나는 경우, 균질화 수단은 균질화기로서 효과적으로 기능하여 본 발명의 조성물(예로, 2 mL) 내에 수집된 고체 및 반-고체 대변 샘플(예로, 400 mg; 유형 1-7)을 신속히 분해하고 파괴하여 실험실에서 쉽게 피펫팅되거나 조작되고 가공될 수 있는 균질 액체 샘플을 형성한다. 상기 균질화 수단은 수집된 생물학적 샘플을, 고체 대변까지도 신속하고 완전히 파괴되도록, 이렇게 함으로써 본 발명의 조성물에 빠르게 노출되도록 보장한다. 중요하게는, 본 발명자들은 튜브/용기 대비 균질화 수단의 직경이 아니라 밀도가 튜브를 단순히 수동 진탕하며 적시에(20-30 초) 샘플의 완전한 파괴를 달성하기 위해 중추적이라고 결정하였다. 종종 점착성이고 가단성인 대변(예로, 유형 4)의 성질로 인해, 구형 균질화 수단을 이용하는 경우 편평-바닥 또는 원뿔-바닥 튜브에서 상기 샘플의 완전한 균질화를 달성하기 어려웠다. 따라서, 구형 균질화 수단에 대해 둥근-바닥 튜브가 가장 잘 기능하였다.
본 발명은 인간 및 동물의 의학적 진단 및 임상 연구(예로, 질환 및 감염의 진단, 인간 건강에서 미생물의 역할, 미생물 진화, 병독성, 약물 내성 및 역학을 연구하기 위한 집단 게노믹스), 식품 안전(식품/육류 가공 플랜트), 토양 및 폐수 샘플링(환경 시험), 생물안전성 또는 생물보호(생물학적 무기), 동물 먹이 시험, 식물 및 동물 과학/산업 등)에서의 후속 사용을 위해 상온에서 특히 복합적이고 비-균질한 생물학적 샘플에서 전체 DNA를 안정화하기 위한 신규하고 범용으로-적용가능한 방법 및 조성물을 제공한다. 연구자 및 임상의 모두의 새롭고 빠르게 확장 중인 포커스는 장내 미생물군 또는 장 미생물군유전체이다. 건강한 공여자로부터의 대변 내 미생물의 프로파일이 질환 개인에서와 어떻게 상이한가? 인간 장 미생물군유전체의 조작이 건강에 유익할 수 있는가? 연구, 환경적 및 경제적 이유로, 많은 가축, 특히 육류 및 유제품을 위해 기르는 동물의 반추에서 수천 여 상이한 미생물의 분석에도 막대한 관심이 주어진다.
본 발명은 생물학적 샘플 수집 및 제조를 단순화하고 촉진하여 수송 또는 보관 동안 저온-유통을 유지할 필요 없이 인간, 동물 및 미생물 DNA의 후속 검출을 위한 품질의 샘플을 제공한다. 본 발명은 a) 고처리량 또는 자동화된 시스템을 이용하는 중앙 실험실 또는 시험 시설, b) 최소 실험실 인프라구조 및 설비를 갖는 농촌 또는 이동식 클리닉, 및 c) 전기가 없는 원거리 장소에서 이용될 수 있다. 또한, 아프고 감염 가능성이 있는 개인이 생물학적 샘플을 제공하기 위해 클리닉 또는 병원으로 여행할 필요가 없어서 감염성 질환의 확산을 최소화하고, 발생의 제어 및 감독을 촉진하고, 치료에 대한 환자 반응의 신속한 평가 및 모니터링을 가능케 한다.
본원에 기재된 밀폐된 수집 및 균질화 시스템/키트는 제조하기 저렴하고 추가적인 실험실 설비(예로, 볼텍스)를 구매할 필요가 없다. 가장 중요하게는, 본 발명의 조성물, 하나 이상의 균질화 볼, 및 심지어 단단한 대변(유형 1-2, Bristol 변 척도) 샘플을 함유하는 캡핑된 튜브의 수동 진탕이 수초 내에 샘플의 완전 파괴를 달성하여 균질 혼합물을 생성할 수 있다. 공여자 자가-수집은 감염의 확산 및 다른 공여자 샘플과의 교차-오염 가능성을 감소시킨다. 현저하게는, 상기 샘플 수집 및 균질화 공정은 실험실 또는 임상 경험을 갖지 않는 본인에 의해 자신의 집에서 프라이버시 하에 수행됨으로써 공여자 참여 및 순응도를 크게 개선할 수 있다. 하류 시험 결과의 품질을 위해 중요하게, 본 발명은 "신선 상태" 생물학적 샘플의 안전한 수집 및 안정화를 허용하여 미가공 또는 미처리 생물학적 샘플의 시험 시설로의 운송 및/또는 가변적인 보관 조건 동안 관측되는 분해를 극적으로 감소시킨다.
결정적으로, 본 발명은 편향되지 않은 DNA가 추출될 수 있는 절대적으로 필요한 안정화된 대표적 생물학적 샘플을 연구자와 임상의에게 제공할 것이다. 편향되지 않은 DNA 입력, 즉 샘플 수집 시점의 장 미생물군유전체의 대표적인 스냅-샷은 하류 분석의 품질과 정확성을 증강시키고, 건강 및 질환에서 인간 장내 미생물 집단의 변화를 연구하기 위해 대상체-간 및 대상체-내 뿐만 아니라 연구-간 차이의 보다 정확한 비교 평가를 가능케할 것이다. 온전하고 편향되지 않은 풍부한 고분자량 DNA는 서열-기반 또는 기능적 스크리닝-기반 접근에 의해 온전한 유전 경로의 특성규명 및 메타게놈 라이브러리 구축을 위해 중추적이다. 또한 생물학적 샘플에서 DNA의 과도한 분해는 샷건 서열분석의 효율을 감소시킨다.
최근 몇 년 동안 비로소 신선 상태 대변에서 박테리아 집단에 관해 대변에서 추출된 DNA의 계통발생적 조성에 유의미한 관심이 주어졌다. 주로 실질적인 이유에서, 수집 후 대변 샘플을 냉동하고, 매우 다양한 시기 후 하류 분석, 예컨대 서열분석 또는 정량적 PCR(qPCR)을 위해 DNA를 추출하는 것이 일반적 관례이다. 그러나 결정적으로, 공개된 연구 간에 그리고 내에, 하기에 관해 상당히 가변적인 것으로 나타난다: 1) 배변 및 '신선 상태' 대변의 냉동 간 시기; 2) 수송 조건 및 기간; 3) 분석 전 대변이 냉동된 시간; 4) 냉동된 대변을 해동하기 위해 채용된 시간 및 온도; 그리고 5) 수집부터 최초 분취물이 단리되고 DNA에 대해 가공될 때까지의 가변 시간. 이들 연구에서, T=0는 배변 시점이 아니라 이들 수집되고 냉동되고 종종 보관된 샘플이 가공을 위해 해동된 순간을 나타낸다.
그러나 인간 미생물군의 메타게놈 연구에서, 대변 샘플의 보관 조건이 언급되는 집단 조성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있음이 명확히 드러났다. 예를 들어, [Bahl 등(2012)]은 중요 박테리아 그룹의 16S rRNA 유전자를 표적으로 하는 6 개의 상이한 프라이머 페어와 qPCR을 이용하여, 추출 전 53±5 일 동안 -20℃에서의 대변 샘플의 냉동이 가장 우세한 2 개의 문, 즉 장 미생물학에서 빈번하게 이용되는 바이오마커인 피르미쿠테스 및 박테로이데테스 간의 비에 영향을 미침을 실증하였다. 구체적으로 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 간 16S rRNA 유전자 비는 냉동되지 않았던 동일한 샘플에 비해 냉동되었던 대변 샘플에서 유의미하게 더 높았다. i) 각 미생물의 풍부성, ii) 전체 집단의 풍부도, 및 iii) 전체 미생물 DNA 프로파일을 안정화하는, 수집된 대변 샘플에서 원래 또는 생체내 미생물 집단의 적어도 3 가지 주요 측면을 포획하거나 스냅-샷하기 위한 수단이 절대적으로 필요하다.
복합적인 대변 샘플로부터 전체 게놈 박테리아 DNA의 효율적이고 편향되지 않은 안정화(및 추출)는 장 내 박테리아 집단의 분자-기반 연구, 예로 공여자의 생체내 상태를 표시하는 미생물군유전체 프로파일을 생성하기 위해 중추적인 첫 번째 단계이다. 특히, 미생물 집단의 연구는 수집 직후 미생물군 프로파일의 "스냅샷" 포획을 필요로 한다. 대변 샘플의 현재 당해분야의 수집은 비실용적이고, 고가이며, 확장성이 없다는 것이 명확하다(McInnes & Cutting, 2010). 또한 당해분야에서는 샘플 수집에 관련된 문제가 일관되지 않는 결과와 낮은 재현성을 유도함이 잘 알려져 있다. 또한, 고체 샘플의 취급은 자동화에 대한 어려움, 비용 증가, 그리고 추적 연구의 크기 제한을 부여한다.
실험실들에 걸친 연구 간 및 연구 내의 강력한 편향을 제거하기 위해, 수송 및 연장된 보관 동안 바람직하지 못한, 종종 극한 온도를 거치기 전에 수집 시점에 생물학적 샘플의 수집 및 안정화를 위해 표준화된 또는 범용 방법을 개발하고 구현할 필요가 있다. 샘플 수집 시점에 효과적인 DNA-안정화 조성물에 액체부터 단단한 고체까지의 범위인 생물학적 샘플, 특히 매우 가변적인 유형의, 복합적인, 비-균질한 샘플을 균질화하는 본 발명의 방법은 전체 샘플에서 DNA의 최대 온전성을 보장하여 생체내 상태를 가능한 가깝게 표시하다.
현재, 많은 연구가 대변 샘플을 수집하기 위해 공여자를 모집하며 안정화 수단을 제공하지 않거나 수송 동안 아이스 팩의 사용을 필요로 한다. 미국 국립보건원(NIH) 로드맵 하에 시작된 프로그램인 인간 미생물군유전체 프로젝트(HMP)는 인간 미생물군유전체를 특성규명하고 인간 건강 및 질환에서의 그 역할을 분석하기 위한 연구를 후원한다. HMP 핵심 미생물군유전체 샘플링 연구에 참여하는 모든 구성원은 무엇보다도 GI 관으로부터의 시료 수집을 개괄하는(섹션 7.3.3 참고) 절차 매뉴얼(McInnes & Cutting, 2010)을 따라야 한다. 대상체에는 대변 수집 키트가 제공되며, 시료를 클리닉으로 가져오기 전 24 시간의 기간 내에 대변 시료를 수집해야 한다. HMP 키트에는 큰 마가린 통과 비슷한 2 개의 대변 수집 용기(하나는 백업용임), Thermosafe 운송 용기(판지 상자 내부의 큰 스티로폼 상자), 시료 수송을 위한 8-10 개의 냉각 팩(약 4℃에서), 지침, 라벨 및 다른 충전재가 포함된다. 시료 수집 전에, 대상체는 겔 팩을 적어도 12 시간 동안 자신의 냉동고에 넣어두어야 한다. 대변을 수집 용기 내로 직접 받아 뚜껑을 덮고, 전체 용기를 Ziplock 백에 밀봉하여, 8-10 개의 냉동 겔 팩으로 완전히 둘러싸인 스티로폼 상자에 포장한다. 스티로폼 상자를 닫고, 판지 상자 내부에 밀봉하고, 대상체가 이 부피가 큰 패키지를 임상 실험실로 수송한다.
부피가 큰 스티로폼 및 판지 용기/쿨러에 밀봉되어 얼음 또는 드라이 아이스 상에 패킹된 신선 상태 시료를 운송하는 기존 저온 유통 요건은 매우 비용이 많이 들어서, 연구자가 적당한 수 내지 많은 수의 공여자를 필요로 하는 연구를 수행하지 못하게 만든다. 단순히, 판지 운송 상자 또는 오버팩(16x13x14 인치) 내에서 스티로폼 용기 내의 냉동 아이스 팩으로 둘러싸인 상업적으로 이용가능한 대변 수집 용기의 운송은 미국 내에서 UPS 익일 배송 서비스를 이용하면 각각 대략 $175가 든다. 상기 추정치는 대변 수집 용기의 비용 및 임의의 운송 재료의 비용은 고려하지 않은 것이다. 또한 많은 시험 시설에서는 생물학적 샘플이 상기 운송 추정치에 상당한 비용을 부가하는 드라이 아이스 상에서 운송되도록 요구한다. 일단 실험실에서 이러한 큰 운송 용기를 수신하면, 직원이 즉시 포장을 풀고 생물학적 샘플을 빠르게 가공하거나, 배치 가공을 수행할 수 있을 때까지 수집 용기를 큰 보관 냉동고에 넣어야 한다. 대조적으로, 본 발명은 현재의 운송 비용 및 불편함의 대부분을 완화시키고, 가장 중요하게는 수집된 생물학적 샘플에서의 DNA가 상온 수집 시점에 안정화되도록 보장한다. 공여자 관점에서, 생물학적 샘플을 이들의 집에서 프라이버시 하에 수집하고, 시료의 작은 부분을 이미 안정화 용액을 함유하는 친숙한 튜브 또는 용기로 옮겨서 튜브에 뚜껑을 닫고 수동 진탕 혼합하고, 튜브를 생물학적위험 백에 밀봉하여 현재 비용의 일부만으로 버블 봉투 또는 작은 상자 안에서 시험 시설로 발송한다.
실시예
물질 및 방법
내부에 상이한 조건이 명시된 경우를 제외하고, 하기 일반 물질 및 방법을 후술되는 실시예에서 이용한다.
대변 샘플의 수집
건강한 공여자에게 수집을 위해 하기 공급품을 제공하였다: a) 대변 수집 용기(변기 상에 배치); b) 약 400 mg의 대변 수집용 부피측정 시린지(즉, 400 mg 수집 부피로 조정된 팁 컷오프, 피스톤을 갖는 3 mL 시린지); c) 본 발명의 조성물(2 mL), 및 다양한 균질화 수단(예로, 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼 베어링, 420/440 SS 등급 25, Aimark Travers LTD, 또는 아래 주지된 기타 물품)을 함유하는 둥근-바닥 Sarstedt 튜브(10 mL 둥근 바닥 튜브(92x15.3 mm), Cat. No. 60.610; Sarstedt); 및 d) 대변 수집 지침. 튜브를 수집-전 및 -후에 칭량하여 수집된 대변 샘플의 실제량을 결정하였다. 각각의 공여자에게 표시된 부피(400 mg)까지 대변을 시린지 팁에 충전하여 대변 샘플을 튜브로 옮기도록 요청하였다. 샘플의 완전 균질화를 위해, 튜브를 20-30초 동안 수동 진탕하였다.
본 발명의 조성물에서 대변 샘플로부터의 DNA 추출
달리 언급되지 않는 한, 400 mg 대변을 2 mL의 본 발명의 조성물(아래 실시예에 명시됨) 및 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼 베어링을 함유하는 Sarstedt 튜브(10 mL 둥근 바닥-튜브(92x15.3 mm), Cat. No. 60.610; Sarstedt)로 옮겼다. DNA는 몇몇 상업적으로 이용가능한 DNA 단리 키트를 이용하여 본 발명의 조성물에 수집되고 보관된 250 ㎕ 분취량의 대변 샘플에서 쉽게 추출되었다. 본 발명의 조성물 내의 대변 샘플은 PowerSoil® DNA 단리 키트(MO BIO Laboratories, Inc., Cat. No.12888-100), PowerFecal™ DNA 단리 키트(MO BIO Laboratories, Inc., Cat. No. 12830-50), 비드-격타를 도입하는 Zymo Research Fecal DNA MiniPrep(Zymo Research, Cat. No. D6010), QIAamp DNA Feces Mini 키트(Qiagen, Cat. No. 51504) 및 PSP Spin Feces DNA Plus 키트(Invitek, Cat. No. 1038110200)와 상용성인 것으로 나타났다.
PowerFecal® DNA 단리 키트 지침에 따라, 하기 절차를 따랐다[주: 65℃ 가열 단계는 제거하였음]:
1. 제공된 PowerBead 튜브에, 750 ㎕의 비드 용액 및 250 ㎕의 본 발명의 조성물 내 대변 샘플을 첨가하였다. 튜브를 부드럽게 볼텍싱하여 혼합하였다.
2. 60 ㎕의 용액 C1을 첨가하고, 튜브를 몇 번 뒤집거나 짧게 볼텍싱하였다.
3. PowerBead 튜브를 볼텍스 어댑터 상에 고정하고, 최대 속도에서 10 분 동안 볼텍싱하였다.
4. PowerBead 튜브를 30 초 동안 10,000 x g에서 원심분리하였다.
5. 상청액을 깨끗한 2 mL 수집 튜브(제공됨)로 옮겼다.
6. 250 ㎕의 용액 C2를 첨가하고, 튜브를 5 초 동안 볼텍싱한 뒤 4℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다.
7. 수집 튜브를 실온에서 1 분 동안 13,000 x g에서 원심분리하였다.
8. 펠렛을 피해서 최대 600 ㎕의 상청액을 깨끗한 2 mL 튜브로 옮겼다.
9. 200 ㎕의 용액 C3을 첨가하고, 튜브를 짧게 볼텍싱한 뒤 4℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다.
10. 튜브를 실온에서 1 분 동안 13,000 x g에서 원심분리하였다.
11. 펠렛을 피해서 최대 750 ㎕의 상청액을 깨끗한 2 mL 튜브로 옮겼다.
12. 용액 C4를 사용 전에 혼합하였다. 1200 ㎕의 용액 C4를 상청액에 첨가하고, 튜브를 5 초 동안 볼텍싱하였다.
13. 675 ㎕을 Spin Filter 상에 로딩하고 13,000 x g에서 1 분 동안 원심분리하였다. 용출액을 버리고, 추가 675 ㎕의 상청액을 Spin Filter에 첨가하여 13,000 x g에서 1 분 동안 원심분리하였다. 잔여 상청액을 Spin Filter 상에 로딩하고 13,000 x g에서 1 분 동안 원심분리하였다.
14. 500 ㎕의 용액 C5를 Spin Filter 상에 첨가하고, 실온에서 30 초 동안 13,000 x g에서 원심분리하였다. 용출액을 버렸다.
15. 원심분리를 다시 실온에서 1 분 동안 13,000 x g에서 수행하였다.
16. Spin 필터를 조심스럽게 깨끗한 2 mL 수집 튜브(제공됨)에 넣었다.
17. 100 ㎕의 용액 C6을 흰색 필터 멤브레인 중앙에 첨가하였다.
18. 튜브를 실온에서 30 초 동안 13,000 x g에서 원심분리하였다.
19. DNA를 냉동 보관하였다(-20 내지 -80℃).
정제된 샘플에서 DNA 농도의 결정
A. DNA 농도의 흡광도 결정
260 nm에서의 흡광도(A260nm) 측정이 DNA 정량을 위해 일반적으로 이용된다. 260 nm에서 흡광도 1.0은 순수한 이중 가닥 DNA에 대해 50 ng/㎕의 농도에 해당한다. 다양한 조건 하에 본 발명의 조성물을 포함하고 또는 포함하지 않고 처리된 정제된 대변 샘플로부터의 DNA 수율을 NanoDrop 2000c 분광측정기(Thermo Fisher Scientific Inc.)를 이용하여 결정하였다. 각각의 DNA 샘플의 2 ㎕ 부피를 대에 놓고 230 nm, 260 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정하며 220 nm부터 350 nm까지 스캐닝하였다. 샘플 DNA 농도(ng/㎕), A260/A280 비, 및 A260/A230 비를 NanoDrop 2000c 소프트웨어로 보고하였다. 샘플 농도에 각 DNA의 용출 부피를 곱하여 샘플 별 전체 DNA 수율을 계산하였다.
B. DNA 농도의 형광측정 결정
A260nm 이용의 단점에는 (i) 검정의 비민감성 및 (ii) 특히 고도 정제되지 않은 샘플에서, 비-DNA 성분, 예컨대 RNA에 의한 간섭이 포함된다. 정제된 샘플로부터의 DNA 수율을 또한 PicoGreen® 형광 염료(200x; Invitrogen, Cat. No. P7581)를 이용하여 정량하였다; 람다 DNA(Invitrogen, Cat. No.25250-010)를 이용하여 표준 곡선을 생성하였다[3 개씩, 0-50 ng/㎕]. PicoGreen®은 나노그램-미만 양의 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 민감한 정량을 가능케 하는 형광 이중 가닥 DNA-결합 염료(485 nm 여기/535 nm 방출)이다. 각각의 정제된 샘플 및 람다 DNA 표준의 3 개씩의 분취물을 검은 편평-바닥 96 웰 마이크로플레이트(Greiner Bio-One, Cat. No. 655209)에서 가공하고, Infinite M200 마이크로플레이트 판독기(TECAN)를 이용해서 형광을 측정하였다.
안정화 조성물에 보관된 샘플에서 DNA의 온전성
각각의 정제된 샘플의 분취량을 PicoGreen에 의해 결정된 농도(상기)에 기반하여 10 ng/㎕로 희석하였다. DNA 온전성을 평가하기 위해, 각각의 희석된 정제 대변 샘플로부터 대략 80 ng을 100 볼트에서 30 분 동안 전기영동에 의해 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 겔을 실온에서 15 분 동안 증류수 중 1 ㎍/mL 에티듐 브로마이드(EtBr)로 염색하고, 헹구고, DigiDoc-IT™ 영상화 시스템(UVP LLC)을 이용하여 UV 투과조명기 상에서 사진촬영하였다. DNA 래더에 비해 겔 상의 염색된 밴드가 예리하고 23 Kb 초과인 경우, DNA가 안정화되고 온전한 것으로 결정하였다. 1Kb+ DNA 래더(Life Technologies, Cat. No. 10787-018) 또는 람다 DNA/Hind III 단편(Life Technologies, Cat. No. 15612-013)을 크기 참조로 사용하였다.
a. 1% 아가로스 겔을 제조하였다(80 mL 1xTAC + 0.8 g 아가로스).
b. 2 ㎕의 5x 로딩 버퍼를 10 ng/㎕의 정제 샘플 8 ㎕에 첨가하였다.
c. 제조된 1% 아가로스 겔의 웰 내로 10 ㎕의 제조된 샘플(단계 b); 5 ㎕의 람다 DNA/Hind III 단편 및/또는 5 ㎕ 1 Kb DNA 래더를 로딩하였다.
d. 겔을 30 분 동안 100 V에서 작동시켰다.
e. 겔을 15 분 동안 EtBr(500 ㎕ 1 mg/mL EtBr + 500 mL 물) 중에 염색하였다.
f. 겔을 5 분 동안 수중 탈색시켰다.
g. 영상을 UV 하에 찍었다.
변성 구배 겔 전기영동( DGGE )
본 발명의 조성물에서 다양한 미생물군유전체(대변, 타액, 가래, 피부 등)의 안정성을 정확하고 재현성 있게 평가하기 위해, 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)으로 불리는 새로운 방법을 이용하였다. 상기 방법은 박테리아 16S rRNA 유전자의 가변 영역(본 경우에는 V3 영역)을 취해 이를 보존된 영역 측면의 프라이머 및 PCR을 이용해서 증폭하면, 앰플리콘이 박테리아 종에 고유한 용융점을 가질 것이라는(뉴클레오타이드 차이라도 용융에 영향을 미쳐 상이한 프로파일을 제공할 것이라는) 아이디어에 기반한다.
상기 방법이 여러 종의 박테리아를 함유하는 샘플에 적용되는 경우, 보존된 프라이머를 이용하는 증폭은 모두 대략 동일한 길이이지만 비-보존된 영역에서 상이한 뉴클레오타이드 구성을 갖는 앰플리콘 어레이를 생성할 것이다. 다음으로, 이들 앰플리콘을 변성 용액(요소 및 포름아미드)의 구배를 함유하는 겔 상에 건다. 앰플리콘은 이들의 뉴클레오타이드 구성에 따라 겔 상에서 상이한 단계에 변성하여 샘플에 존재하는 모든 종의 분해를 제공할 것이다.
DNA 앰플리콘이 단일 가닥 형태로 변성하지 않도록 하기 위해, 일단 가변 섹션이 변성되면 겔 상 앰플리콘의 이동을 지연시키는 ~30 뉴클레오타이드 CG 클램프를 전방 프라이머에 부가하였다. 일반적으로, 겔 상의 40%-60%의 변성 구배는 대부분의 장 종을 포획하면서 우수한 밴드 분해를 제공한다. 겔은 앰플리콘의 변성을 촉진하고 또한 작동에 걸쳐 동일한 온도에서 겔을 유지하기 위해 일정한 60℃에서 작동시킨다.
DGGE 겔 영상을 Syngene GeneTools 소프트웨어(버전 4.03.00, Syngene)를 이용하여 분석하였다. 영상 배경을 30 픽셀 반경의 롤링 디스크 방법을 이용해서 감산하였다. 레인을 수동 검출하고 설정하였다. Rf 개시 및 종료 위치와 각을 수동으로 설정하여 겔에서의 "스마일링"에 대해 조정하였다. 분석을 위한 밴드를 각 레인에 대해 자동 검출하였다; 피크 검출은 디폴트(최소 폭 7 픽셀, 최소 피크 높이 3, 및 최소 피크 부피 1%) 하에 설정하였다. 프로파일을 1%의 설정 관용도로 매칭 파라미터 메뉴 하에 "프로파일" 유형을 이용하여 매칭하였다. 프로파일 비교는 0 내지 100 범위의 유사성 값으로, 자동 생성 유사성 매트릭스를 생성하였다. 일반적으로 말하면, 유사성%에 있어서, 이는 2 프로파일 간의 임의 변화, 보통 밴드 강도의 차이를 나타낸다. 따라서 유사성%는 종의 풍부성 차이의 측정치를 제공한다. 프로파일 간에 밴드가 부재하는 경우, 유사성%에 대한 영향은 밴드 강도만 감소된 것에 비해 더 높다.
도 1에 나타낸 DGGE 겔은 두 상이한 공여자로부터의 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일이 어떻게 상이한지가 드러날 수 있음을 예시한다; 제1 대변 샘플(공여자 A) 및 제2(공여자 B) 샘플 간에는 22%의 유사성만이 존재한다.
PCR-DGGE를 아래에 기재된 절차에 따라 수행하였다.
DGGE에 대한 PCR 증폭(전방 프라이머 상에 5' 클램프를 갖는 16S 프라이 머 사용 )
a. 2 ㎕의 10 ng/㎕ DNA를 12-스트립 PCR 튜브 내로 첨가하였다.
b. 마스터 믹스를 제조하였다(98 ㎕/반응): 76.7 ㎕ 물, 10 ㎕ 10xPCR 버퍼, 4 ㎕ 50 mM MgCl2, 2.5 ㎕ 10 mM dNTP, 2 ㎕ 10 pmol 후방 프라이머(PPUN518R, 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'), 2 ㎕ 10 pmol 전방 프라이머(PRBA338F, 5'-CGCCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'), 및 0.8 ㎕ 5 U/㎕ Taq.
c. 98 ㎕의 마스터 믹스를 각각의 튜브로 첨가하였다.
d. PCR을 통상적 PCR 기계 상에서 수행하였다: 2 분 동안 92℃에서 1 사이클; 60 초 동안 92℃, 30 초 동안 55℃, 60 초 동안 72℃에서 28 사이클; 이어서 6 분 동안 72℃에서 1 사이클.
PCR 앰플리콘의 DGGE
a. 40% 및 60% 변성 용액 중 8% 아크릴아미드/비스 겔에 대한 스톡 용액을 제조하였다:
Figure pct00005
b. 유리 플레이트 및 스페이서를 DCode 시스템(Bio-Rad)에 대한 지침 팜플렛에 따라 조립하였다.
c. 40% 및 60% 변성 용액을 이용한 병렬 구배로 8% 아크릴아미드/비스 겔을 제조하고 붓기 위해, 하기 절차를 이용하였다:
· 20 mL의 40% 및 60% 변성 용액을 각각 "저밀도" 및 "고밀도"로 표지된 2 개의 별도 비이커에서 측정하였다;
· 200 ㎕의 10% 암모늄 퍼설페이트(APS)를 각 용액에 첨가하였다;
· 20 ㎕의 TEMED를 각 용액에 첨가하였다;
· 용액을 휘저어 잘 혼합하였다;
· 각 용액을 별도의 20 mL 시린지 내로 충전하였다;
· 상부 충전을 위해 "저밀도" 또는 "고밀도"로 명시된 겔 로딩 장치에 시린지를 부착하였다;
· 주: 1.0 mm 스페이서를 포함하는 16 x 16 cm 겔에 대한 부피 조정 설정은 18.5 mL이었다;
· 튜브의 다른 말단에 바늘이 달린 Y 튜브를 각각의 시린지에 부착하였다;
· 바늘을 유리 플레이트 사이에 배치하였다;
· 구배가 균일해질 시간을 갖도록 휠을 돌려 겔을 느리고 일관되게 부었다;
· 겔이 몇 시간 동안 중합하도록 두었다;
· Y 튜브에 물을 통과시켰다.
d. 겔 작동 시스템을 1xTAE 버퍼로 55℃로 가열하였다.
e. 8 ㎕의 Fermentas 6x 로딩 염료를 42 ㎕의 PCR 산물로 첨가하였다.
f. 겔을 200 V에서 5 분 동안 작동시킨 후 샘플을 웰 밖에서 겔 내로 얻기 위해 재순환 펌프 상에서 켰다.
g. 재순환 펌프를 켜고 겔을 70 V에서 14 시간 동안 작동시켰다.
h. 겔을 30 분 동안 1x Sybr Gold로 염색하였다(250 mL 1xTAE + 25 ㎕ 10,000x SybrGold).
i. 겔을 5 분 동안 1xTAE 중에 탈색시켰다.
j. 영상을 UV 하에 촬영하였다.
16S rRNA PCR을 범용 프라이머(V3 영역)를 이용하여 수행한 뒤 DCode 범용 돌연변이 검출 시스템(Bio-Rad)을 이용하여 DGGE를 수행하였다.
16S rRNA 서열분석
16S rRNA 서열분석 라이브러리 제조, 서열분석 및 바이오인포마틱스를 수행하였다. V4 초가변 영역 페어링된-말단 앰플리콘 서열분석을 Illumina® MiSeq®(250 사이클)를 이용하여 수행하였다. QIIME 및 맞춤 스크립트를 이용하여, 서열을 품질 필터링하였다. 페어링된-말단 판독치를 어셈블링하고 Greengenes 참조 데이타베이스에 대해 검색하여 UCLUST에 의해 97%에서 클러스터링하였다. 데이터 정상화 후, 샘플-대-샘플 거리를 OTU(운영 분류 단위) 풍부성 데이타(차이의 합을 모든 풍부성의 합으로 나누는 페어식 정상화를 채용하여 샘플에 걸친 분류 풍부성 차이를 이용함) 상 가중치를 부여한 Unifrac 및 가중치를 부여하지 않은 Unifrac 발생률 데이타(분류의 존재/부재만 고려함)를 이용하여 측정하였다.
본 발명의 조성물에 보관된 정제된 대변 샘플로부터의 인간 DNA의 증폭
본 발명의 조성물(아래 상세 기재) 내로 수집되고 전체 DNA 추출(MoBio PowerSoil 또는 PowerFecal DNA 단리 키트) 전에 2 주 동안 실온에서 보관된 대변 샘플 내 인간 DNA의 안정성을 단일 카피 인간 티미딜레이트 합성효소 유전자(TYMS 유전자위; NM001071.2)를 표적으로 하는 프라이머를 이용하여 실시간 또는 정량적 PCR(qPCR)로 평가하였다. 각각의 반응을 위해, 50 ng의 정제된 DNA를 하기를 함유하는 25 ㎕ 부피 중에 증폭하였다: 1x PCR 버퍼(20 mM Tris, 50 mM KCl), 2 mM MgCl2, 200 μM dNTP(Invitrogen), 50 ㎍/mL BSA(Sigma Aldrich), 1 μM SYTO9 염료(Invitrogen), 0.4 μM의 각각의 프라이머 hTSm143F(5'-GCCCTCTGCCAGTTCTA-3') 및 hTSm143R(5'-TTCAGGCCCGTGATGT-3'; Invitrogen), 1U Taq 폴리머라제(Invitrogen). TS143 표적에 대한 증폭 조건은 하기와 같았다: 5 분 동안 95℃에서 1 사이클; 20 초 동안 95℃, 20 초 동안 55℃, 30 초 동안 72℃에서 35 사이클; 이어서 10 분 동안 72℃에서 1 사이클. 용융 곡선 프로그램이 포함되었고, 하기로 구성되었다: 4.4℃/초의 경사 속도(획득 없음)로 30 초 동안 95℃, 2.2℃/초의 경사 속도(획득 없음)로 10 분 동안 72℃, 0.11℃/초의 경사 속도(연속 획득)로 95℃에서 1 사이클. DNA 샘플을 Corbett Rotorgene RG-6000에서 3 개씩 실험하고, 각 샘플에 대한 Ct 값을 Rotorgene 6000 시리즈 소프트웨어 1.7을 이용해서 계산하였다. Ct 값은 증폭 곡선이 검출 역치와 교차하는 지점에서의 분획 사이클 수를 나타낸다. 역치 라인을 설정하고, 각 샘플 곡선과의 교점을 계산하여, 각 샘플에 대한 Ct 값을 구축하였다. 역치 라인은 노이즈를 배제하기 위해 배경 수준 위 그리고 이후 사이클에서 신호 평탄부의 개시 아래에서 유의미하게, 수행의 지수상에서 설정한다. 일반적으로, Ct 값은 샘플에서 DNA의 양과 반비례한다. ΔCt는 상이한 시점, 예로 T=0 및 샘플 수집 후 T=14 일에 동일한 샘플에서 얻은 두 분취물에서 생성된 Ct 값의 차이를 나타낸다.
실시예 1 - 대변 샘플에서 DNA 안정화를 위한 조성물에서 상이한 킬레이 트화제의 비교
대변에서 대부분 박테리아 기원인 다량의 뉴클레아제로 인해, 본 발명자들은 본 발명의 조성물의 개발 동안 상이한 킬레이트화제 및 이들의 농도를 이용하여 실험하였다.
본 실시예에 기재된 조성물은 50 mM β-알라닌으로 pH 11로 완충되어, 다양한 양의 EDTA 또는 CDTA와 함께 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 및 0.1% 소포제 A를 함유하였다. 본 실시예 및 후속 실시예에서 에탄올 및 소포제 A의 퍼센트는 (v/v%)이며, 다른 성분(SDS, 트리클로산)의 퍼센트는 (w/v%)이다.
도 2에 대해, 대변을 건강한 공여자가 수집하고, 400 mg 샘플을 상업적으로 키트(PowerSoil 또는 PowerFecal DNA 단리 키트, MoBio)로 DNA 추출 전에 다양한 안정화 용액 중에 균질화하거나 실온(RT, 19-23℃)에서 14 일 동안 안정화 버퍼의 부재 하에(안정화되지 않음) 보관하였다. T=0 및 T=14 일에 정제된 DNA의 품질 또는 온전성 비교에서, 아가로스 겔은 미처리 대변에서 고분자량 DNA가 RT에서 보관 동안 상당히 분해되어(대조군, 아가로스 겔의 마지막 2 개 레인) 겔 상에서 도말을 형성함을 명확히 나타낸다. 동일한 공여자의 대변으로부터의 샘플(400 mg)을 또한 하기 중에 균질화하였다: 1) 증가하는 양의 CDTA(150, 300, 500 mM)를 포함하는 본 발명의 조성물; 및 2) CDTA가 EDTA(150, 300, 500 mM)로 대체된 본 발명의 조성물.
놀랍게도, 대변 샘플과 시험된 모든 농도(150, 300, 500 mM)에서, CDTA는 신선 상태로 수집된 샘플(T=0) 및 14 일 동안 RT 노출 후에 모두 고분자량 DNA의 안정화를 위해 EDTA보다 유의미하게 더 우수히 기능하였다(도 2). 실제로, CDTA가 아닌 EDTA는 예상치 못하게 150 mM을 초과하는 농도에서 고분자량 DNA의 안정화(및 추출)에 유해하였다.
또한, 더 높은 농도(150, 300 및 500 mM)의 EDTA 및 CDTA의 비교(표 4)는 상기 물질 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이, 앰플리콘의 DGGE 분석 및 박테리아 16S rRNA 유전자의 PCR을 통해 예시된 바와 같이, CDTA가 EDTA보다 미생물군유전체 프로파일의 안정화를 위해 더 우수하다는 놀라운 발견을 뒷받침한다. RT에서 14 및 30 일 후, CDTA를 포함하는 본 발명의 조성물에 보관된 대변 샘플로부터의 DNA는 T=0에서 가공된 대조군 샘플과 높은 유사성%를 유지하였다. 대조적으로, EDTA로 치환된 본 발명의 조성물에 보관된 동일한 대변으로부터의 DNA의 미생물군유전체 프로파일은 대조군 샘플(T=0에서 가공됨; 표 4)에 비해 RT에서의 시간과 더불어 증가하는 비유사성을 나타내었다.
[표 4]
증가하는 농도의 킬레이트화제를 포함하는 조성물에 보관된 대변의 미생물군유전체 안정성.
Figure pct00006
따라서, CDTA는 놀랍게도 복합적인 비-균질 대변에서 온전한, 고품질, 고분자량 DNA를 안정화하고 미생물군유전체 프로파일을 스냅샷하는 그 능력에서 EDTA를 능가하였다. 따라서 EDTA보다 높은 해리 상수를 갖는 킬레이터, 예컨대 CDTA는 생물학적 샘플, 예컨대 대변 샘플에서 DNA의 최적 안정화를 제공하며, 본원에 기재된 조성물에서 사용하기 위해 특히 바람직하다. 샘플 수집 시 샘플을 안정화하는 상기 능력은 실험실에 걸친 연구 간 및 내에서 현재 나타나는 강한 편향을 제거하는 것을 도울 것이다.
실시예 2 - 본 발명의 조성물에서 대변 샘플 안정성에서의 pH 및 킬레이 트화제의 역할
대변 샘플 혼합, pH 및 킬레이트화제 농도 간의 복합적 상관관계를 앰플리콘의 DGGE 분석 및 박테리아 16S rRNA 유전자의 PCR을 통해 예시된 바와 같은 미생물군유전체 프로파일 안정성에 대한 이들의 효과에 대해 조사하였다.
4 가지 실험 중 첫 번째에서, 건강한 공여자가 대변을 수집하여 각각 하나의 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼 및 2 mL의 조성물 "104B pH 9.5"(300 mM CDTA, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.1% 소포제 A, pH 9.5) 또는 "104B pH 11"(300 mM CDTA, 50 mM β-알라닌, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.1% 소포제 A, pH 11)을 함유하는 4 개 튜브 내로 400 mg의 대변을 옮겼다. 튜브 내의 샘플을 교란없이 놔두거나(혼합 없음) 수동 진탕으로 균질화(혼합)한 후 상온 조건 하에 실험실로 돌려보냈다. 샘플 수집 3-4 시간 내에, 250 ㎕ 분취물을 DNA 추출을 위해 각각의 튜브에서 꺼낸 뒤(T=0) 샘플을 24 시간 동안 30℃에 이어 11 일 동안 -20℃에서 보관하여 스트레스 처리하고(T=11), 두 번째 분취물로부터 DNA를 추출하였다. 정제된 DNA를 정량한 뒤 16S rRNA 유전자 PCR 앰플리콘을 분리하기 위해 DGGE를 이용한 유전지문 또는 박테리아 집단 프로파일로서 분해하였다. 각 조성물에 있어서 T=0에서의 대조군 샘플 대비 샘플(DGGE 겔 상의 레인) 간 유사성%를 Syngene GeneTools 소프트웨어(물질 및 방법 참고)를 이용하여 별도로 계산하였다.
도 3은 본 발명의 조성물의 pH가 9.2에서 11로 증가될 때 '11 일 혼합 없음' 샘플 및 '0 일 혼합' 샘플 간 개선된 유사성 퍼센트 또는 미생물군유전체 프로파일 안정성을 나타내어, pH 11이 pH 9.5보다 추가적인 DNA 안정성을 부여함을 시사한다. 또한, 본 발명의 균질화 수단인 밀도 높은 스틸 볼을 이용하는 튜브 내의 '11 일 혼합' 샘플은 시험된 두 pH 값 모두에서 특히 pH 11에서, '11 일 혼합 없음' 샘플에 비해 일관되게 개선된 미생물군유전체 프로파일 안정성으로 이어졌다.
두 번째 실험에서, CDTA의 농도 및 pH 간 상관관계를 분석하였다. 건강한 공여자의 대변으로부터의 분취물(400 mg)을 하기 3 가지 중 한 조성물 2 mL 및 7.9 mm 스테인레스 스틸 금속 볼을 함유하는 튜브 내로 옮겼다: 1) 104B pH 9.5(상기와 같음); 2) 50 mM CDTA, 50 mM β-알라닌, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.2% 트리클로산, 0.1% 소포제 A, pH 11.5; 및 3) 50 mM CDTA, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.2% 트리클로산, 0.1% 소포제 A, pH 9.5. 샘플을 수동 혼합에 의해 균질화하고 상온 조건 하에 실험실로 돌려보냈으며, 여기서 T=0 분취물(250 ㎕)을 수집하고 DNA를 추출하였다. 나머지 샘플을 4 및 14 일 동안 실온에서 보관하고, 각 시점에 분취물을 꺼내어 DNA를 추출하였다.
아가로스 겔 전기영동은 pH 9.5에서 300 mM CDTA 조성물(104B pH 9.5)이 적어도 14 일 동안 고분자량 DNA를 안정화하였고, pH 9.5 또는 11.5에서 50 mM CDTA 조성물을 함유하는 다른 두 조성물보다 고분자량 DNA의 더 우수한 안정화를 나타냄을 드러내었다(데이타는 나타내지 않음). 그러나 온전한 고분자량 DNA의 존재가 미생물군유전체의 스냅샷이 달성되었음을 재현성있게 시사하지는 않는다. 효과적인 안정화 용액의 부재 시, 박테리아 종은 전체 DNA의 양뿐만 아니라 그 품질을 변형하지 않고 복제하거나 사멸될 수 있다. 따라서 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 상기 물질 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 앰플리콘의 DGGE 분석 및 박테리아 16S rRNA 유전자의 PCR을 통해 검사하였다.
도 4 및 표 5를 참조하여, DGGE 분석은 pH 9.5에서 300 mM CDTA 조성물이 실온에서 적어도 14 일 동안 미생물군유전체 프로파일의 뛰어난 안정화(t=0 대조군 대비 94-96% 유사성)를 나타냄을 드러내었다. 미생물군유전체 프로파일의 안정화에서 pH 9.5에서의 300 mM CDTA 조성물의 효과는 놀랍게도 실온에서 14 일 후 t=0 대조군 대비 15% 유사성만을 나타낸 pH 9.5에서의 50 mM CDTA 조성물에 비해 더 우수하였다. 50 mM CDTA를 포함하는 pH 11.5 조성물은 50 mM CDTA를 포함하는 pH 9.5 조성물에서 나타난 미생물군유전체 프로파일 별 DNA의 상당한 분해를 다소 '구제'하는 것으로 나타났다.
따라서, 고농도 CDTA 및 상당한 알칼리성 pH의 조합이 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화하기 위해 필요하다.
[표 5]
실온에서 14 일 동안 다양한 조성물에 보관된 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일 분석.
Figure pct00007
세 번째 실험에서, 본 발명의 조성물에서 CDTA의 농도 및 pH 간 상관관계를 추가 분석하였다. 건강한 공여자의 대변으로부터의 분취물(400 mg)을 하기 2 가지 중 한 조성물 2 mL 및 7.9 mm 스테인레스 스틸 금속 볼을 함유하는 튜브 내로 옮겼다: 1) 300 mM CDTA, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.2% 트리클로산, 0.1% 소포제 A, pH 9.5; 및 2) 50 mM CDTA, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.2% 트리클로산, 0.1% 소포제 A, pH 7.4. 샘플을 수동 혼합에 의해 균질화하고 상온 조건 하에 실험실로 돌려보냈으며, 여기서 T=0 분취물(250 ㎕)을 수집하고 DNA를 추출하였다. 나머지 샘플을 4 일 동안 실온에서 보관한 뒤, 두 번째 분취물을 꺼내어 DNA를 가공하였다.
아가로스 겔 전기영동은 pH 9.5에서 300 mM CDTA 조성물이 RT에서 4 일에 걸쳐 pH 7.4에서 50 mM CDTA 조성물보다 더 큰 정도로 대변에서 온전한 고분자량 DNA를 안정화함을 드러내었고, DGGE 분석은 상기 조성물이 또한 대변 미생물군유전체 프로파일의 더 우수한 안정화를 나타냄을 시사하였다(각각 T=0 대비 97% 유사성 대 T=0 대비 10% 유사성 - 도 5 및 표 6 참고). pH 7.4 조성물(RT에서 4 일 후 T=0 대비 10% 유사성)을 이용하여 균질화된 대변의 미생물군유전체 프로파일 안정성도 pH 9.5에서 50 mM CDTA 조성물로 균질화된 대변의 미생물군유전체 프로파일 안정성보다 상당히 더 낮았다(상기 주지된 바와 같이, RT에서 4 일 후 T=0에서 91% 유사성).
[표 6]
실온에서 4 일 동안 다양한 조성물에 보관된 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일 분석.
Figure pct00008
네 번째 실험에서, 본 발명의 조성물에서 고정된 고농도 CDTA에서 pH 간 상관관계를 분석하였다. 건강한 공여자의 대변으로부터의 분취물(400 mg)을 하기 2 가지 중 한 조성물의 2 mL 및 7.9 mm 스테인레스 스틸 금속 볼을 함유하는 튜브 내로 옮겼다: 1) 300 mM CDTA, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.2% 트리클로산, 0.1% 소포제 A, pH 7.4; 및 2) 300 mM CDTA, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.2% 트리클로산, 0.1% 소포제 A, pH 9.5. 샘플을 수동 혼합에 의해 균질화하고 상온 조건 하에 실험실로 돌려보냈으며, 여기서 T=0, 24 시간, 및 9 일에 분취물(250 ㎕)을 수집하고 DNA를 추출하였다.
아가로스 겔 전기영동은 pH 9.5에서의 조성물과 혼합된 대변 샘플이 고(300 mM) 농도 CDTA의 존재 하에서도 거의 중성 pH 조건(pH 7.4)에서의 조성물과 혼합된 대변 샘플에 비해 고분자량 DNA의 더 우수한 안정화를 나타냄을 실증하였다(도 6 참고).
실시예 1에 나타낸 결과와 함께 종합하면, 이들 실험은 조성물의 pH가 9.5 이상, 바람직하게는 약 pH 10.5-11.5 또는 약 pH 11이고, CDTA의 농도가 50 mM 초과, 바람직하게는 적어도 약 150 mM, 가장 바람직하게는 약 300 mM인 경우, 실온 보관 동안 온전한 고분자량 DNA 및 안정한 미생물군유전체 프로파일을 보존하기 위한 최적 조건이 존재함을 시사한다.
실시예 3 - 유리 비드 및 스테인레스 스틸 비드를 이용한 혼합 후 대변의 안정화
건강한 공여자로부터의 대변을 400 mg 분취물로 하기를 함유하는 4 튜브 내로 옮겼다: 1) 2 mL 안정화 용액 104B pH 9.5(상기 정의됨) 및 4 개의 4 mm + 10 개의 2 mm 유리 비드; 2) 2 mL 안정화 용액 104B pH 11(상기 정의됨) 및 4 개의 4 mm + 10 개의 2 mm 유리 비드; 3) 2 mL 안정화 용액 104B pH 9.5 및 1 개의 6 mm 스테인레스 스틸 볼; 4) 2 mL 안정화 용액 104B pH 11 및 1 개의 6 mm 스테인레스 스틸 볼. 모든 4 개 튜브를 혼합될 때까지 공여자가 수동 진탕하고 상온 조건 하에 실험실로 돌려보냈다. 샘플 수집 3-4 시간 내에 DNA를 추출하고, 정량하고, 각각의 정제된 샘플의 80 ng을 아가로스 겔 상에 걸었다(물질 및 방법, 그리고 도 7 참고). 유리 비드 샘플을 볼텍싱하고, 분취물을 꺼내기 전에 스틸 볼-함유 샘플을 진탕하였다.
본 실시예는 실온에서 신선 상태로 수집된 대변에서 온전한 고분자량 DNA(>23 Kb)를 안정화하기 위해 스테인레스 스틸 혼합 볼을 이용하는 이점을 실증한다. pH 9.5 및 11 둘 다에서 본 발명의 조성물, 그리고 하나의 밀도 높은 스테인레스 스틸 볼을 함유하는 실험실 튜브 내 대변 샘플의 혼합(도 7b)은 아가로스 겔 상에서 고분자량 DNA의 품질을 비교하는 경우, 두 크기의 여러 작은 유리 비드를 이용한 혼합(도 7a)보다 우수한 것으로 증명되었다. 여러 유리 비드 및 본 발명의 조성물(104B pH 9.5)을 이용한 대변의 수동 혼합은 스테인레스 스틸 볼을 이용한 혼합보다 유의미하게 더 긴 시간이 걸렸고, 후자는 온전한 고분자량 DNA 보존의 관점에서 더 우수한 결과를 실증하였다. 유리 비드를 이용해서 혼합된 샘플 내 DNA 온전성의 개선은 놀랍게도 더 알칼리성인(pH 11) 조성물로도 관측되어, 안정화 용액의 pH 및 혼합/균질화 수단이 모두 중추적임을 제시하였다.
실시예 4 - 본 발명의 조성물의 부피 관용성
대변은 소화계 상태, 식이 및 일반 건강에 따라 외관 또는 경도가 크게 변할 수 있는 비-균질 생물학적 샘플이다. 보통 변은 점성 코팅을 갖는 반고체이다. Bristol 변 척도 또는 차트는 인간의 대변 형태를 유형 1(너트처럼, 구분되는 단단한 덩어리)부터 유형 7(완전 액체, 고체 파편 없음, 90% 초과가 물)까지 범위의 7 개 범주로 분류하도록 설계된 의학 보조물이다. 일반적으로, 대변은 약 70-80%의 물, 20-30%의 고형 물질로 구성되지만, 상기 퍼센트는 샘플 유형(1-7) 또는 대변의 장내 체류 시간에 따라 변한다. 경도 및 물 함량에서의 대변 간 가변성은 대변 수집 및 안정화 용액과의 일관된 완전 혼합에 대해 상당한 어려움을 부과한다. 유형 1-3 샘플은 하류 분석을 위해 샘플(그러므로 DNA)을 너무 많이 희석하지 않고 안정화 용액 중에 완전 분산시켜 균질 액체를 생성하는 것이 특히 어렵다. 또한, 유형 1-3 샘플은 다른 샘플 유형에 비해 액체, 예로 안정화 용액을 느리게 흡수하는 경향이 더 커서, 실험실에서 피펫팅하기 어려울 수 있는 점성이 높은 반고체 현탁액을 생성한다. 유형 4-7 샘플의 더 높은 물 함량 및 더 부드러운 점도는 이들 샘플을 안정화 용액에서 혼합하고 피펫팅하기 더 쉽게 만든다. 가공 동안, 대변 샘플로부터 DNA를 추출하기 위해 이용되는 방법(또는 상업적 키트)에 의해서도 가변성이 도입될 수 있다.
대변의 비-균질 성질에 기반하여, 전체의 온전한 고분자량 DNA를 안정화하기 위한 본 발명의 조성물의 강건성을 하기 비 실험에서 비교하였다. 두 별도 실험에서, 3 명의 건강한 공여자가 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼 및 다양한 부피의 104B pH 11 안정화 용액(상기 정의됨)을 함유하는 튜브 내로 대변 샘플(400 mg)을 옮겨서 하기 비:안정화 용액의 대변을 얻었다 - 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8 및 1:10. 정교하지 않은 도구로 400 mg의 대변을 정확히 반복 수집하는 것이 매우 어려우므로, "실제 비" 및 표적화된 "비"가 모두 겔 상에 표시됨을 주지하라. 튜브를 샘플 수집 전후에 칭량하여 조성물 부피 별 수집된 대변의 정확한 양을 결정하였다. 튜브를 수동 진탕하고 250 ㎕의 분취물을 T=0(도 8a) 및 6 일 후(도 8b), 7 일 후(도 8c), 14 일 후(도 8d), 1 개월 후(도 8e) 및 2 개월 후(도 8f) 실온에서 꺼내었다. 일부 경우, 2 개 분취물을 추출하여 반복물의 재현성을 실증하였다(도 8a, c-f). DNA를 추출하고, 80 ng를 1% 아가로스 겔 상에서 걸었다(도 8a-f). 별표(*)로 표시한 레인에서는 일부 샘플이 정제되었을 때 10 ng/㎕ 미만의 DNA 농도를 가졌다는 점으로 인해 80 ng 미만의 DNA를 로딩하였다. DGGE 겔(도 10a 및 10b)도 이들 실험에서 수행하고 유사성%를 분석하여 이들 샘플에서 미생물군유전체 프로파일의 안정성을 결정하였다.
본 실시예는 광범위한 대변:안정화 용액 비가 T=0부터 실온에서 적어도 2 개월 보관까지 샘플에서 온전한 고분자량 DNA를 생성하였음을 실증한다(도 8a-f). 0.8 mL만큼 작은 양부터 5.4 mL만큼 많은 양의 본 발명의 조성물은 이들 조건 하에 적어도 2 개월 동안 400 mg의 대변에 함유된 DNA 및 미생물군유전체 프로파일을 성공적으로 안정화하였다(도 8a-f 및 10a-b). 이러한 넓은 '작업' 범위는 공여자가 고정된 부피의 안정화 용액을 함유하는 튜브 내로 매우 다양한 양의 대변 샘플을 옮길 수 있고 샘플이 실온에서 적어도 2 개월 동안 안정할 것이라는 편안함을 연구자에게 제공한다. DGGE를 이용해서 분석된 3 개씩의 샘플 분취물(도 9)은 동일한 대변 시료로부터 취한 분취물 간 미생물군유전체 프로파일이 매우 일관됨을(≥ 97%) 실증하였다. 또한, 비 실험 샘플에 대한 DGGE 겔의 분석은 미생물군유전체 프로파일이 실온에서 연장된 기간 동안 본 발명의 조성물의 넓은 범위의 대변:안정화 용액(1:1.8 내지 1:10.6)에서 고도로 안정화되었음(7 일째에 ≥88%; 14 일째에 ≥91%; 2 개월째에 ≥79%)을 나타내었다(도 10a 및 10b).
따라서 대변:안정화 용액의 바람직한 비는 약 1:1 내지 1:20, 바람직하게는 1:1 내지 1:10, 보다 바람직하게는 1:3 내지 1:8의 범위일 수 있으며, 가장 바람직하게는 대변:안정화 용액의 비는 약 1:5이다.
본원에 기재된 조성물은 연구자들이 다수의 대변 샘플을 수집하는 방법을 혁신할 수 있도록 한다. 더 이상 드라이 아이스 상에서 샘플을 운송하거나 여러 달 동안 냉동고에 수십 만 개의 대변 샘플을 보관하는 비용과 물류로 인해 연구를 제한할 필요가 없다. 본 발명의 조성물을 함유하는 튜브 내에 수집된 샘플은 버블 봉투 중 상온에서 수송되어 연구자의 편의 시 배치 가공을 위해 실험실에서 실온 보관될 수 있다.
실시예 5 - 본 발명의 조성물에서 샘플의 안정화 및 극한 온도
본원에 기재된 다양한 조성물은 '상'온에서 건강한 인간 공여자의 대변에서 고분자량 DNA 및 미생물군유전체 프로파일을 효과적이고 신속하게 안정화한다. 상기 주지된 바와 같이, '상'이란 생물학적 샘플의 수집, 수송, 보관 및 가공 동안 관측되는 전형적인 노출 온도를 의미한다. 생물학적 샘플이 수집/수송/보관되는 세계 속 위치에 따라, 온도는 때로는 단시간에 -20℃부터 50℃까지에 쉽게 이를 수 있다. 당해분야에서는 이들 온도, 특히 승온에서 미처리 생물학적 샘플이 분해된다는 것이 알려져 있다. 수집된 샘플에서 DNA를 생체내 상태와 가능한 가깝게 유지하기 위한, 즉 존재하는 온전한 고분자량 DNA의 분해를 방지하고/하거나 대변 샘플에서 부분적으로 분해된 핵산, 예컨대 인간 DNA의 추가 분해를 방지하고, 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화하기 위한 강력한 범용 생물학적 샘플 안정화 용액에 대한 필요성이 존재한다.
[표 7]
시험된 조성물.
Figure pct00009
본 발명자들이 개발한 6 개의 DNA 안정화 조성물의 성능(표 7)을 복합적인 비-균질 가변 대변 샘플로 광범위한 상온, 예로 -20℃, 실온(일반적으로 19-23℃), 37℃, 및 50℃에 걸쳐 시험하고 비교하였다. 첫 번째 실험에서, 2 명의 건강한 공여자가 각각 2 mL의 상이한 조성물(표 7) 및 하나의 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼을 함유하는 6 개 튜브 내로 400 mg 대변을 옮겼다. 튜브를 수동 진탕하여 대변 샘플을 균질화하고, 분취물(250 ㎕)을 DNA 추출을 위해 즉시 꺼낸(T=0) 뒤 튜브를 7 및 21 일 동안 37℃에서 보관하였다.
도 11a 및 11b는 대변 샘플이 37℃에서 보관되는 경우 적어도 3 주 동안 시험된 모든 조성물이 온전한 고분자량 DNA를 안정화하였음을 실증한다. 37℃에서 21 일 후, CBS, CBSA1, 및 CBSA2 조성물에 보관된 대변 샘플로부터 회수된 DNA의 농도는 다른 조성물에서의 샘플보다 낮아서, 공여자 A 및 B에 대해 아가로스 겔 상에서 더 희미한 밴드가 얻어졌다(도 11a 및 11b). 놀랍게도, DGGE 분석(도 12a 및 12b)는 이들 샘플에서의 미생물군유전체 프로파일이 또한 대변 박테리아의 성장을 위한 최적 온도인 37℃에서 첫 주 동안 안정하였고, 21 일 시점 전에 변하기 시작함을 나타내었다. pH 11로 완충된 300 mM CDTA에 부가하여, 에탄올은 고분자량 DNA 및 미생물군유전체 프로파일 모두의 안정화 또는 회수를 위해 유익한 것으로 나타난다.
두 번째 실험에서, 3 명의 건강한 공여자가 각각 2 mL의 104B 및 하나의 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼을 함유하는 3 개 튜브 내로 400 mg 대변을 옮겼다. 튜브를 수동 진탕하여 대변 샘플을 균질화하고, 분취물(250 ㎕)을 DNA 추출을 위해 즉시 꺼낸(T=0) 뒤 튜브를 3 및 5 일 동안 50℃에서, 1 개월 동안 실온에서, 그리고 1 개월 동안 -20℃에서 보관하였다(도 13a-e). 도 13a-e는 50℃에서 5 일(도 13b-c), 실온에서 1 개월(도 13d), 및 -20℃에서 1 개월(도 13e) 동안 104B가 고분자량 DNA를 안정화하였음을 실증한다. 각 공여자가 수집한 3 개씩의 대변 샘플은 모두 시험한 온도 또는 시기와 무관하게, 온전한 고분자량 DNA를 함유하였다.
세 번째 실험에서, 3 명의 건강한 공여자가 각각 3 개 튜브 내로 400 mg 대변을 옮겼다: 2 개 튜브는 각각 2 mL의 104B 및 CBE(표 7) 그리고 하나의 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼을 함유하였다; 세 번째 튜브는 비어 있었다(없음). 안정화 용액을 함유하는 튜브를 수동 진탕하여 대변 샘플을 균질화하고, 분취물(250 ㎕ 또는 250 mg)을 DNA 추출을 위해 각 튜브로부터 바로 꺼낸(T=0) 뒤 튜브를 5 및 14 일 동안 50℃에서 또는 11 일 동안 -20℃에서 보관하였다(도 14 a-d). 도 14a-c는 104B 및 CBE가 모두 50℃에서 적어도 2 주 동안 온전한 고분자량 DNA를 유지한 반면 대조군(없음) 샘플은 경시적으로 분해 징후를 나타내었음을 실증한다. 놀랍게도, DGGE 분석(도 15a 및 15b)은 이들 샘플에서의 미생물군유전체 프로파일이 DNA와 같은 생체분자에 대한 극한 온도인 50℃에서 2 주 동안 또한 안정함을 나타내었다. 흥미롭게도, 유사성%는 14 일이 아니라 5 일 동안 50℃에서 보관된 샘플에서 더 높아서, 이러한 극한 온도로의 연장된 노출이 DNA 자체의 일부 화학적 불안정성으로 이어질 수 있음을 시사하였다.
도 14d는 104B 및 CBE가 둘 다 적어도 11 일 동안 -20℃에서 냉동된(그리고 이후 해동된) 샘플에서 고분자량 DNA를 유지하였음을 나타낸다. 그러나 안정화 용액의 부재 하에, 대변은 -20℃에서 DNA 분해의 특징적 징후를 나타내었다. 공여자 A(없음) 샘플에서, 대부분의 고분자량 DNA가 분해되었고, 아가로스 겔 상에서 도말로 나타났다. 대조적으로, 소량의 고분자량 DNA를 공여자 B 및 C 샘플에서 여전히 검출할 수 있어서, 공여자 가변성을 시사하였다. 안정화 용액을 함유하지 않는 샘플의 DGGE 분석은 미생물군유전체 프로파일이 -20℃에서 안정하지 않음을 확인시켜주었다; 대조군 T=0에 대한 유사성%는 공여자 A 및 C에 대해 각각 52 및 69%였다. 대조적으로, 대조군(없음) 샘플에 대해 높은 유사성%로 시사된 바와 같이, 미생물군유전체 프로파일이 -20℃에서 11 일 동안 104B 및 CBE에서 안정하였다(도 16a 및 16b).
이들 실시예는 종합적으로, 104B 및 CBE가 모두 연장된 시기 동안 극한 온도에서 보관된 대변 샘플에서 DNA를 안정화함을 실증한다.
실시예 6 - 본 발명의 조성물에서 인큐베이션된 대변 샘플의 냉동/해동 사이클링과의 안정성
상기 논의된 바와 같이, 대변이 보관 또는 뱅크화 목적을 위해 단 1 회의 냉동 및 해동에 노출되는 경우 미생물군유전체 프로파일이 변화하는 것이 당해분야에 알려져 있다. 상기 분해는 0 도 미만 온도에서 수송되고/되거나 보관된 모든 수집 샘플에 불필요한 편향을 부가한다. 본 실시예에서, 대변을 3 명의 건강한 공여자로부터 수집하고 400 mg 샘플을 빈 튜브 및 유리 비드(4 개의 4 mm 및 10 개의 2 mm 비드)와 함께 2 mL의 본 발명의 조성물("104B pH 9.5"; 상기 정의됨)을 함유하는 튜브로 옮겼다. 안정화 용액 및 유리 비드를 함유하는 튜브를 완전 혼합될 때까지 강력하게 볼텍싱하였다. 0 일째에 DNA 추출을 위해 250 mg 또는 ㎕ 분취물을 꺼낸 후, 샘플 튜브를 -20℃ 냉동고에 보관하고, 10 일에 걸쳐 냉동고 및 실온 사이에서 5 회, 각 온도에서 24 시간씩 사이클링하였다. 샘플 튜브를 3 시간 동안 50℃에서 산업 표준 방법으로 해동하였다.
0 일째 분취물의 아가로스 겔 분석은 각 공여자의 대변이 본 발명의 조성물 내로 수집될 때 고분자량 DNA를 함유하였음을 실증한다(도 17). 놀랍게도 5 사이클의 냉동/해동(F/T) 후, DNA는 온전히 남아있었다(도 17). DGGE 분석은 본 발명의 조성물에서 샘플의 미생물군유전체 프로파일이 5 회 F/T 사이클 후 94% 안정하게 유지되었음을 확인시켜주었다(도 18). 강하게 대비되어, 보호되지 않은 샘플은 미생물군유전체 프로파일의 상당한 분해를 나타내었다. 단 1 회의 F/T 사이클 후, 프로파일은 -20℃ 노출 전 0 일째의 '신선 상태 수집된' 샘플의 프로파일과 52%만 유사하였다. 따라서 본 발명의 조성물은 다회의 냉동 및 해동에서 온전한 고분자량 DNA를 보존할 뿐만 아니라 미생물군유전체 프로파일도 안정화하여, 이들 보관 조건과 연관된 편향을 극적으로 감소시켰다.
실시예 7 - 본 발명의 조성물에서 수집된 대변 샘플의 균질화
상술된 바와 같이, 본 발명자들은 모든 유형(1-7, Bristol 변 척도)의 대변 샘플을 완전히 그리고 재현 가능하게 균질화하기 위해 상업적으로 이용가능한 표준 10 mL 실험실 및/또는 수송 튜브(92 mm x 15.3 mm, 내경 약 12.9 mm)에서 이용될 수 있는 여러 상이한 물질로 실험하였다. 공여자가 준수하고 안정화된 생물학적 샘플을 일관되게 제공하도록 보장하기 위해, 혼합은 수동으로 그리고 비교적 단시간에(180 초 이내) 수행되어야 하는 것으로 결정되었다. 당해분야 숙련가는 본 실시예에서 이용된 것보다 크거나 작은 용기에 대해 적절한 균질화 수단을 어떻게 선택하는지를 이해할 것이다(상세한 설명 참고).
표준 일회용 3 mL 시린지를 개질하여 본 발명의 조성물("104B pH 11"; 상기 정의됨) 및 균질화 수단을 함유하는 상기 수집 튜브 내로 작은 부피측정량의 대변을 수집하고 옮겼다. 시린지의 바늘에 대해 테이퍼링된 팁 또는 피팅을 컷오프하여 균일한 직경의 배럴을 노출시켰다. 피스톤이 대변을 함유하는 용기 내로 밀어넣어졌을 때 일관된 양의 대변, 예로 400 mg의 수집을 촉진하는 위치로 사전-설정하였다. 대변 샘플 수집 동안 공기가 빠져나갈 수 있도록 작은 통기 구멍을 시린지 배럴에 뚫었다. 로딩된 샘플을 포함하는 시린지를 튜브의 개구로 옮기고 피스톤을 눌러서 400 mg 샘플을 2 mL의 안정화 용액 및 균질화 수단(예로, 아래 명시된 균질화 볼)을 함유하는 튜브 내로 넣었다. 튜브의 마개를 닫고 약 20-40 초 동안, 단단한 유형 1 샘플에 대해서는 더 길게(1-3 분) 수동으로 진탕하였다(아래 참고). 샘플을 균질화 수단의 존재 하에 전후 운동으로 격렬히 진탕한 후, 대변 샘플을 안정화 용액에 분배하였다.
선택된 용기가 실험실 또는 수송 튜브/바이알인 경우, 적절한 크기, 형태 및 밀도의 균질화 "볼" 또는 "구"가 본 발명의 조성물에서 비-균질 복합적 샘플의 완전 분산을 위해 중추적이다. 수집 시 수집된 샘플의 철저한 균질화가 또한, 온전한 고분자량 DNA의 존재에 의해 입증되는 인간 및 미생물 DNA의 최적 안정화뿐만 아니라 앰플리콘의 DGGE 분석 및 박테리아 16S rRNA 유전자의 PCR을 통해 예시되는 미생물군유전체 프로파일의 안정화를 위해 중추적이다. 상술된 바와 같이, 구형 균질화 수단에 있어서, 수송 튜브/튜브의 하부도 고체 물질이 튜브 내부의 사각 지대 내로 압축되는 것을 방지하기 위해 균질화 수단의 형태를 모방하는 구형이어야 한다. 예를 들어, 구형 균질화 수단을 이용하는 대변 샘플(특히 유형 1-3)의 최적 균질화는 원뿔- 또는 평탄-바닥 튜브로 달성하기 매우 어렵다. 구형 균질화 수단은 수직 튜브 벽이 기부와 교차하는 90 도 각도를 만들거나 원뿔 표면과 직접 접촉할 수 없어서 이들 사각 지대/영역에서 대변 물질의 압출을 야기한다.
하기 표 8-10은 표준 실험실/수송 튜브(예로, Cat. No. 60.610, Sarstedt)를 위한 최적 균질화 수단을 찾기 위해 본 발명자들이 시험한 상이한 상업적으로 이용가능한 물질의 일부를 예시한다.
[표 8]
상이한 물질, 직경 및 갯수의 볼에 대한 혼합 시간(초).
Figure pct00010
[표 9]
상이한 직경의 스테인레스 스틸 볼에 대한 혼합 시간(초).
Figure pct00011
[표 10]
상이한 직경 및 갯수의 스테인레스 스틸 볼에 대한 혼합 시간(초).
Figure pct00012
샘플 유형 1 및 2의 대변은 매우 되고 물을 거의 함유하지 않아서, 균질화 수단 없이 합리적인 기간(<3 분) 내에 본 발명의 조성물에서 수동 분산을 불가해하게 만든다. 더 연한 대변(유형 3-6)에 있어서, 상기 균질화 수단이 여전히 필요하였고, 튜브의 수동 혼합 기간은 샘플 유형의 증가와 함께 상당히 감소되었다(표 8-10). 본 발명의 조성물로 샘플 유형 7 또는 설사를 분산시키기 위해서는 균질화 수단이 필수적이 아니다. 상기 맥락에서, "호모게나이저"의 목적은 전기 또는 배터리의 사용 없이 안정화 용액을 통해 비-균질 고체 또는 반고체 샘플을 완전 파괴하고 분산시키는 것이었다.
균질화 수단의 중요한 특색에는 1) 물질의 밀도, 2) 생물학적 샘플에 있어서 용기의 내경 대비 크기, 및 3) 용기 대비 형태가 포함된다. 유리(약 2.0-4.5 g/cm3)/폴리(메틸 메타크릴레이트 또는 PMMA(약 1.2 g/cm3)/실리카(약 1.6-2.0 g/cm3)/지르코니아(약 6.02 g/cm3)/셀룰로스 아세테이트(약 1.3 g/cm3)/폴리에틸렌(약 0.9-1.3 g/cm3) 입자(< 1.2 mm) 및 소형 비드(≤4 mm)는 내경 12.9 mm를 갖는 표준 실험실 튜브 내에서 유형 1-4 대변에 대한 균질화기로서 기능하기 위해 충분한 크기이거나 밀도가 아니었다(표 8). 중요하게는 알루미나 옥사이드(3.95 g/cm3) 또는 7.1-7.9 mm 실리콘 니트라이드(3.21 g/cm3) 및 12.7 mm 유리 구슬로 제조된 큰 7.9 mm 볼조차도 180 초 미만에 2 mL의 본 발명의 조성물에서 유형 1-3 대변 샘플(400 mg)을 분산시킬 수 없었다(표 8). 놀랍게도, 튜브의 강력 진탕 180 초 후에도, 고체 물질은 본 발명의 조성물에 온전하게 유지되었다. 이들 실험 결과는 더 단단한 물질, 즉 밀도 > 3.95 g/cm3의 시험으로 이어졌다. 불행하게도, 3.95 g/cm3 내지 7.6 g/cm3 밀도의 볼은 상업적으로 이용불가능하였으며, 이에 따라 대변 샘플과 시험할 수 없었다.
다음으로, 스테인레스 스틸(7.6-7.9 g/cm3, 표 9 및 10) 및 텅스텐 카바이드 볼(15.63 g/cm3, 표 8)을 둥근 바닥 튜브 내에서 2 mL의 본 발명의 조성물에서 400 mg 대변 샘플과 시험하였다. 놀랍게도, 단단한 너트-같은 유형 1의 대변 샘플도 각각 ≤ 140 및 ≤ 180 초에 7.1-7.9 mm 텅스텐 카바이드 및 7.1-8.7 mm 스테인레스 스틸 볼로 균질화되었다. 유형 2 샘플은 각각 ≤ 40 및 ≤ 80 초에 7.1-7.9 mm 텅스텐 카바이드 및 7.1-8.7 mm 스테인레스 스틸 볼로 균질화되었다. 텅스텐 카바이드(7.1-7.9 mm) 및 스테인레스 스틸 볼(7.1-8.7 mm)은 각각 ≤ 30 및 ≤ 80 초에 유형 3 샘플을, ≤ 15 및 ≤ 55 초에 유형 4 샘플을, ≤ 15 및 50 초에 유형 5 샘플을, 그리고 ≤ 10 및 ≤ 22 초에 유형 6 샘플을 균질화하였다.
유사하게, 7.9 g/cm3 내지 15.63 g/cm3 밀도의 볼은 공급받거나 시험할 수 없었다; 그러나 당해분야 숙련가는 이러한 균질화 수단이 7.1-8.7 mm 크기 범위에서 180 초 이내에 확실히 대변 샘플을 파괴할 것으로 예상할 것이다. 단지 비용 및 입수 용이성을 위해, 스테인레스 스틸 볼이 텅스텐 카바이드 볼보다 바람직하며 최적 직경은 7.1-8.7 mm 직경이었다. 동일한 크기의 제2 볼의 첨가는 일반적으로 혼합 시간을 감소시키는데 유익한 것으로 입증되었다(표 8 및 9). 일부 경우, 하나를 초과하는 크기의 볼의 조합은 대변 샘플을 균질화하기 위해 필요한 시간을 감소시키는데 유익하였다(표 10).
7.1-8.7 mm 볼이 12.9 mm 내경 튜브에서 가장 잘 기능한 것에 기반하여, 볼의 어느 한 쪽의 약 2.1-2.9 mm 제거가 단시간에 샘플을 균질화하기 위해 튜브에서 최적 핏팅을 제공하였다. 스테인레스 스틸 볼이 ≤ 5.6 mm 또는 ≥ 9.5 mm 직경인 경우, 단단한 유형(1-4) 대변 샘플에 대한 혼합 시간이 증가하였다. 따라서, 고체부터 액체까지의 점도 범위인 대변 샘플에 대한 이들 결과에 기반하여, 달리 언급되지 않는 한 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼이 본원에 기재된 실시예에서 균질화 수단으로서 바람직하게 채용되었다.
실시예 8 - 본 발명의 조성물을 이용한 장 미생물군 프로파일의 안정화
장 미생물군의 분석은 인간 건강에서 미생물의 유익한 및 유해한 역할을 조사하는 연구자들에게 점점 더 관심의 대상이 되고 있다. 장 미생물군의 임의 분석을 위해서는, 생체내 상태를 표시하는 미생물군 프로파일의 "스냅-샷"을 정확히 포획하는(즉, 수집 시부터 샘플 가공 및 분석 시까지 운영 분류 단위[OTU]의 상대적 풍부성이 변하지 않고 유지되도록 하는) 것이 필수적이다; 따라서, 수집 시의 샘플 안정화는 이러한 연구에 있어서 매우 중요하다. 대변 샘플 수집 및 미생물군 분석을 위한 현재의 방법에는 상온, 4℃ 또는 냉동 상태에서의 샘플 수송이 관여된다. 그러나 이들 방법은 미생물군유전체 안정화와 비상용성인 온도로 샘플을 노출시킬 가능성을 가지며, 대변 시료의 냉동은 이전에 피르미쿠테스 대 박테로이데스 비를 변형시키는 것으로 나타났다(Bahl 등, (2012) FEMS Microbiol Letters 329: 193-197).
본 실시예에서, 미생물군유전체의 안정성을 민감한 상업적으로 이용가능한 방법인 V4 초가변 영역의 16S rRNA 서열분석을 이용하여 평가하였다. 상기 연구를 위해, 4 명의 공여자가 각각 하나의 대변 시료를 수집하여 안정화 용액을 함유하지 않는 3 개 튜브 및 안정화 용액(300 mM CDTA, 0.5% SDS, 23.5% 에탄올, 0.1% 소포제 A, 0.2% 트리클로산, pH 9.5) 그리고 7.9 mm 스테인레스 스틸 혼합 볼을 함유하는 6 개 튜브 내로 동량의 샘플(400 mg)을 넣었다. 공여자는 샘플을 상온에서 실험실로 수송하였고, 여기서 T=0에 분취물(250 ㎕ 또는 250 mg)을 꺼내고 PowerFecal™ DNA 단리 키트(MoBio Laboratories)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 안정화 조건 당 공여자 별로 하나의 샘플을 3 및 14 일 동안 각각의 시험 온도(-20℃, 4℃, 23℃, 37℃ - 안정화 용액만 함유)에서 보관한 뒤 DNA를 추출하였다. 안정화 용액 내 하나의 샘플을 5 회의 냉동-해동 사이클에 노출시켰다.
나타낸 시점에, 분취물로부터 DNA를 추출하고 16S rRNA 서열분석 라이브러리 제조, 서열분석 및 바이오인포마틱스를 위해 발송하였다. V4 초가변 영역 페어링된-말단 앰플리콘 서열분석을 Illumina® MiSeq®(250 사이클)를 이용해서 수행하였다.
도 19 및 20는 안정화 용액에서 완전 보존된 샘플이 OTU 풍부성에서 고도 유사성을 가짐을 시사하는 데이타를 제시한다.
도 19에서, 가중치를 부여한 unifrac 비유사성 값에 기반하는 주 좌표 분석(PCoA)은 두 공여자(B 및 D)에서 다양한 온도(-20℃, 4℃, 상온, 37℃) 및 시간(3 및 14 일)에 걸쳐 안정화 용액에 보관된 샘플이 PCoA 그래프 상의 조밀한 클러스터링으로 나타난 바와 같이 OTU 풍부성에서 높은 수준의 유사성을 나타냄을 실증한다(안정화 버퍼에 보관된 샘플은 일의 자리수에 4-9의 샘플 식별 번호, 예로 D4 및 B4를 가지며, 각 공여자에 대해 "안정화제 함유" 원 안에 그룹화된다). 대조적으로, 안정화 용액을 함유하지 않고 보관된 샘플(일의 자리수에 0-3의 식별 번호, 예로 D3-1 및 B3-1을 가지며, 각 공여자에 대해 "안정화제 비함유" 원 안에 그룹화되는 샘플)은 샘플 간의 더 큰 거리로 나타난 바와 같이 OTU 풍부성에서 유사성의 손실을 실증하였다. 중요하게는, OTU의 존재 또는 부재 하에 평가하는 경우, 모든 4 명의 공여자에서 안정화된 샘플 및 안정화 용액을 함유하지 않는 것들 간에 통계적으로 유의미한 차이가 존재하였다(각각 p=0.002, 0.002, 0.002 및 0.009, Unifrac 측정). 가장 큰 프로파일 변화는 안정화 용액을 함유하지 않고 -20℃에서 보관된 샘플(PCoA 곡선 상의 샘플 B2-1, B2-2, D2-1 및 D2-2)에서 관측되었고, 이는 안정화 용액 중 -20℃에서 보관된 샘플과 유의미하게 상이하였다(p=0.028, 가중치를 부여한 Unifrac 측정); 이에 따라, 신규한 안정화 용액 중의 보관 샘플이 안정화되지 않은 냉동 샘플에서 관측되는 미생물 프로파일에서의 변화를 방지할 수 있음을 실증하였다(도 19).
도 20에서, 과-수준에서의 비례적 풍부성은 경시적으로(3 및 14 일) 다양한 온도에서 본 발명의 안정화 용액 없이 보관된 샘플의 조성에서의 변화를 실증한다. 특히 라크노스피라세애, 루미노코캐세애 및 프레보텔라세애의 증가 및 박테로이다세애의 손실이 기준선 대비 안정화 용액을 함유하지 않는 공여자 D의 샘플에서 관측된다. 대조적으로, 다양한 온도 및 시간에 걸쳐 안정화 용액과 함께 보관된 샘플은 기준선 샘플 대비 샘플의 미생물 조성을 유지하였다.
상기 데이타는 장 미생물군에서의 변화를 관심 표형형과 강력히 연관시키기 위해, 수집 시 현재의 온도 기반 안정화 방법이 효과적으로 달성할 수 없는 프로파일의 재현가능한 안정화 방식을 가지는 것이 중요함을 제시한다. 본원에서 실증된 안정화 화학은 다양한 수송 온도에서 장 미생물군의 생체내 프로파일(즉, OTU의 조밀한 클러스터링)을 유지하는 능력을 가져서, 연구자들이 데이타 재현성 및 연구-간 비교를 개선할 수 있도록 한다. 상기 안정화 화학은 감독받지 않는 자가-수집의 용이성을 또한 증가시킬 것이며, 현재 물류적으로 어려운 대규모 집단 연구를 유례없이 가능케할 것이다.
실시예 9 - 본 발명의 조성물에서 인간 DNA의 안정화
대변 샘플 수집, DNA의 추출 및 정량, 그리고 인간 DNA의 증폭을 위한 추가 상세내용에 대한 물질 및 방법 섹션을 참고하라.
3 명의 건강한 공여자에게 가정에서 대변 샘플을 수집하기 위한 지침과 물질을 제공하였다. 변기에 부착된 대형 용기 내로의 배변 후, 대략 400 mg의 대변을 2 mL의 본 발명의 조성물("104B pH 11"; 상기 정의됨) 및 하나의 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼을 함유하는 10 mL 둥근 바닥 튜브로 즉시 옮겼다. 튜브의 마개를 닫은 후, 공여자는 약 20 초 동안 밀봉된 튜브를 흔들어서 조성물에서 샘플을 균질화하였다. 공여자는 일반적으로 수집 3-4 시간 내에 균질화된 샘플을 상온에서 실험실로 돌려보냈다. 실험실에서, T=0 분취물(250 ㎕)을 각 튜브에서 꺼내고, 나머지를 두 번째 분취물(250 ㎕)을 취하는 시점인 14 일 동안 실온(RT)에서 보관하였다.
PowerFecal® DNA 단리 키트를 이용하여 각각의 분취물로부터 DNA를 정제하였다; DNA 수율을 PicoGreen® 형광 염료 및 형광측정 방법(물질 및 방법 참고)을 이용하여 정량하였다. T=0 및 T=14 일의 대변 샘플로부터 정제된 인간 DNA를 단일 카피 인간 티미딜레이트 합성효소 유전자를 표적화하는 프라이머를 이용해서 실시간 또는 정량적 PCR(qPCR)로 증폭하였다. Ct(ΔCt) 값에서의 변화, 즉 동일한 샘플에서 취한 T=0 및 T=14 일째에 정제된 분취물에서 생성된 3 개씩의 Ct 값에서의 차이를 아래 표 11에 나타낸다. 각각의 공여자에 있어서, T=0 및 T=14 일째에 정제된 샘플에서 검출된 인간 DNA의 양은 동등하다. 즉시 가공되거나 RT에서 2 주 동안 보관된 대변 샘플로부터의 DNA에서 1 사이클 미만 차이를 가져서, 본 실시예는 인간 DNA가 모든 3 명의 공여자에 대해 본 발명의 조성물에서 안정함을 실증한다.
[표 11]
14 일 동안 실온에서 보관되거나 T=0에서 가공된 대변 샘플에서 인간 DNA에 대한 Ct 값에서의 변화.
Figure pct00013
실시예 10 - 본 발명의 조성물이 14 일 동안 실온에서 그리고 시뮬레이션된 수송 조건 하에 미생물군유전체 프로파일을 안정화함
본 발명의 조성물은 장 미생물군유전체 프로파일링을 위해 대변으로부터 미생물 DNA의 용이한 자가-수집 및 안정화를 가능케 한다. 이는 유례없이 수집 시점에 미생물 프로파일의 스냅샷을 취할 수 있고, 이를 실온에서 14 일 동안 유지할 수 있다.
본 실시예에서, 6 명의 건강한 공여자에게 가정에서 대변 샘플을 수집하기 위한 지침과 물질을 제공하였다. 변기에 부착된 대형 용기 내로의 배변 후, 대략 400 mg의 대변을 2 mL의 본 발명의 조성물("104B pH 11"; 상기 정의됨) 및 하나의 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼을 함유하는 10 mL 둥근 바닥 튜브로 즉시 옮겼다. 튜브의 마개를 닫은 후, 공여자가 약 20 초 동안 밀봉된 튜브를 흔들어서 조성물 중에 샘플을 균질화하였다. 6 명의 공여자는 각각 본 발명의 조성물 내로 동일한 부피의 대변 샘플로부터 3 개 샘플씩(총 n=18)을 수집하였다. 추가로, 신선 상태 대변의 400 mg 분취물을 각 공여자가 동일한 부피의 대변 샘플로부터 수집하여 인간 미생물군유전체 프로젝트 표준 절차(절차 매뉴얼 - Human Microbiome Project, 2010)에 따라 냉동된 저온 팩과 함께 스티로폼 상자 안의 빈 10 mL 튜브에서 수송하였다.
기준선 DNA 추출을 수집 3 시간 내에 수행하였다. 기준선 분석을 위해, 0.25 mL 분취물을 104B pH 11 샘플로부터 취해서 PowerFecal® DNA 단리 키트(MO BIO Laboratories, Inc.)를 이용하여 추출하였다. 각각의 0.25 mL 샘플은 대략 50 mg 대변 및 200 ㎕ 안정화 액체, 104B pH 11을 함유하였다. 균등량의 대변(대략 50 mg)을 신선 상태의 안정화되지 않은 샘플로부터 추출하였다. 나머지 104B pH 11 및 신선 상태의 안정화되지 않은 샘플을 분취하고, 14 일 동안 실온(23±3℃)에서 보관하거나 시뮬레이션된 수송 조건(하루 동안 50℃, 3 일 동안 37℃ 또는 1 사이클이 -20℃에서 최소 3 시간 및 30℃에서 최소 3 시간으로 구성되는, 3 사이클의 냉동 해동)으로 노출시켰다. 추가로, 각 공여자로부터 신선 상태 대변의 분취물을 대조군으로서 -80℃에 보관하였다. 실온, 시뮬레이션된 수송 조건 또는 -80℃에서 보관 14 일 후, 두 번째 분취물을 PowerFecal DNA 단리 키트를 이용하여 모든 샘플로부터 추출하였다.
DNA 농도 및 수율을 Quant-iT™ PicoGreen® 시약(Life Technologies)을 이용하여 결정하였다. 대략 50 ng의 정제된 DNA를 0.8% 아가로스 겔 상에서 걸고 에티듐 브로마이드로 염색하여 경시적인 DNA 온전성 및 안정성을 평가하였다. 람다 Hind III 래더를 이용하여 정제된 DNA의 크기를 결정하였다.
16S rRNA 서열분석 라이브러리 제조, 서열분석 및 바이오인포마틱스를 Metanome, 미생물군유전체 발굴 서비스를 이용해서 수행하였다. V4 초가변 영역 페어링된-말단 앰플리콘 서열분석을 Illumina® MiSeq®을 이용해서 수행하였다. QIIME 및 맞춤 스크립트를 이용해서, 서열을 품질 필터링하였다. 페어링된-말단 판독치를 어셈블리하고, Greengenes 데이타베이스와 비교하여 UCLUST에 의해 96%에서 클러스터링하였다. 데이타 정상화 후, 샘플-대-샘플 거리를 OTU(운영 분류 단위) 풍부성 데이타(차이의 합을 모든 풍부성의 합으로 나누어 페어식 정상화를 채용하는 샘플에 걸친 분류 풍부성 차이를 이용함)를 이용하여 측정하였다. 차이의 합을 모든 검출된 OTU 풍부성의 합으로 나누어서 페어식 정상화를 이용해서 브레이-커티스 거리를 측정하였다. 모든 브레이-커티스 측정에서, 공여자는 수집 직후 추출된 매칭되는 신선 상태 샘플을 페어식 비교의 한 쪽으로 이용하였다. OTU의 총 수 대비 각 OTU의 비율을 측정한 뒤 상기 비율의 자연 로그로 곱해서 각각의 안정화 방법에 대한 샤논 지수(SI) 분석을 수행하였다. 모든 OTU에 걸친 생성 산물의 합산은 각 샘플에 대한 SI를 생성하였다. 샘플 수집 방법을 만-휘트니 시험을 이용해서 비교하였다.
결과
본 발명의 조성물이 수집 시점에 미생물군유전체 프로파일 중립성을 유지함
미생물군유전체의 연구는 생성된 프로파일이 공여자에 존재하는 생체내 미생물 집단을 표시하는 것을 필요로 한다; 따라서, 수집 및 안정화 방법이 미생물군유전체에 변화를 도입해서는 안 된다. 화학적 안정화 버퍼의 사용은 일부 미생물의 성장을 가속화하면서 다른 것의 감퇴를 허용함으로써 샘플의 미생물 조성을 잠재적으로 개질할 수 있다. 이상적인 조건에서, 안정화 액체는 중립성이어야 한다(즉, 미생물군유전체에 임의의 편향을 도입해서는 안 된다). 신선 상태 및 104B pH 11-안정화된 t=0 샘플로부터의 16S rRNA 미생물군유전체 프로파일의 비교는 본 발명의 조성물이 중립성 프로파일을 유지하며 편향을 도입하지 않음을 나타내었다(도 21).
상이한 통계 방법(예로, 가중치를 부여한 UniFrac)에 의한 상대적 OTU 풍부성의 연구는 미생물 집단의 귀중한 설명을 제공한다; 그러나, 저풍부성 미생물의 기여를 최소화함으로써 미생물 집단의 이해를 방해할 수 있다. 미생물군유전체 프로파일의 적절한 연구는 미생물 집단의 "풍부도"의 보존을 필요로 한다. 풍부도는 샘플에 존재하는 미생물 종(OTU)의 목록으로 정의되며, 온도, pH, 산소 농도 및 화학적 조성에서의 변화를 포함하는 환경 조건에 크게 민감하다. 이들 및 다른 요인이 박테리아 성장 또는 감퇴를 유도함으로써, 샘플에서 검출되는 OTU의 수를 변형시킬 수 있다.
6 명의 공여자로부터의 신선 상태 및 104B pH 11 안정화된 샘플을 수집 직후 추출하였다. 104B pH 11 샘플에서 확인된 미생물 OTU를 대응하는 신선 상태 샘플에 존재하는 OTU와 비교하였다. OTU 풍부성 데이타를 존재/부재 콜로 전환하여 다양성에 대한 샤논 지수(SI)를 계산하였다. SI 값 상의 만-휘트니 시험은 104B pH 11 및 신선 상태 샘플 간에 유의차를 나타내지 않아서, 104B pH 11이 샘플의 풍부도에 영향을 미치지 않음을 시사하였다(도 22).
대변 샘플 수집에서 가변성의 원천
브레이-커티스 분석은 신선 상태 및 104B pH 11 t=0 샘플의 반복물 내에서 체계적인 비유사성을 나타내었다. 이러한 비유사성의 원천을 이해하기 위해, 대변 샘플의 수집 및 가공 동안 도입된 가변성을 평가하였다. 동일한 부피의 샘플 내 상이한 부위로부터 수집된 3 개의 신선 상태 및 3 개의 104B pH 11 샘플로부터 미생물군유전체 프로파일을 생성하여 생물학적 가변성을 평가하였다. 상기 수집 시스템은 균질화된 액체 샘플을 제공하여 가공 동안 실험 오차를 감소시키므로, 기술적 가변성을 104B pH 11 수집된 샘플을 이용해서 분석하였다. 동일한 튜브로부터 반복 DNA 추출(추출 가변성) 및 동일한 DNA로부터 반복 PCR/서열분석(서열분석 가변성)의 프로파일을 비교하였다. 브레이 커티스 비유사성 거리를 반복 그룹 내에서 생성하였고, 도 23에 나타낸다.
신선 상태 및 104B pH 11 수집된 샘플(브레이-커티스 거리 각각 0.14 ± 0.01 및 0.11 ± 0.01)의 생물학적 반복물에서 유사한 가변성이 관측되었다. 분석은 기술적 및 생물학적 가변성이 16S rRNA 미생물군유전체 프로파일에 일부 비유사성을 도입함을 나타내었다(브레이-커티스 거리 생물학적 가변성 0.11; 추출 가변성 0.09 및 서열분석 가변성 0.08). 결론적으로, 관측된 비유사성의 원천은 기술적 또는 생물학적 가변성에 의해 설명될 수 있고, 104B pH 11은 임의의 편향을 도입하지 않는다.
104B pH 11이 실온에서 적어도 14 일 동안 미생물군유전체 프로파일을 효과적으로 보존함
프로파일 중립성을 유지하는 것에 부가하여, 미생물군유전체의 연구는 경시적으로 미생물 집단 구조의 정확한 보존을 필요로 한다. 본 발명자들은 14 일 동안 23℃에서 보관 동안 샘플을 안정화하는 104B pH 11의 능력을 평가하였다.
페어링된 104B pH 11-안정화된 및 신선 상태 샘플을 시점 0(T0) 및 14 일 동안 실온(23℃)에서 보관 후 다시 추출하였다. 신선 상태 샘플을 또한 대조군으로서 14 일 동안 -80℃에서 보관하였다. 샘플의 유사성을 브레이-커티스 거리를 이용하여 평가하였다. 만-휘트니 분석은 대응하는 신선 상태 샘플과 비교되는 경우, 14 일 동안 23℃에서의 104B pH 11 샘플 및 -80℃ 샘플간 유의미한 차이를 나타내지 않았다(도 24). 대조적으로, 안정화되지 않은 실온에서 보관된 104B pH 11 또는 -80℃ 대조군과 비교되는 경우, 유의미한 비유사성을 나타내었다.
반복물 간 재현성을 이해하기 위해, 가중치를 부여한 Unifrac의 클러스터 분석을 신선 상태, 104B pH 11 수집된 샘플(T0 및 T14 일) 및 안정화되지 않은 샘플(T14 일)을 이용하여 수행하였다. 생성 수상도(도 25)는 14 일 후에도 신선 상태 및 104B pH 11 안정화된 샘플 간에 조밀한 클러스터링을 나타낸다(96% 유사성). 안정화되지 않은 샘플은 신선 상태 프로파일로부터 고도 분리되어 함께 클러스터링되었다(~63% 유사성). 따라서 적절한 안정화는 경시적으로 프로파일 클러스터링에 큰 효과를 갖는다.
104B pH 11이 시뮬레이션된 수송 조건 하에 미생물군유전체 프로파일을 효과적으로 보존함
샘플은 일반적으로 수집 시점부터 가공 실험실까지의 수송 동안 바람직하지 못한 조건에 노출된다. 표준 운송 조건을 시뮬레이션하기 위해, 안정화되지 않은 및 104B pH 11 안정화된 샘플을 1 일 동안 50℃, 3 일 동안 37℃ 또는 다회의 냉동-해동(F/T) 사이클에 노출시켰다. 104B pH 11은 고분자량 DNA 밴드를 보존한 반면, 안정화되지 않은 샘플은 특히 50℃ 또는 냉동-해동 사이클에 노출된 경우, 다양한 정도의 분해를 나타내었다(도 26).
마지막으로, 16S rRNA 분석은 104B pH 11이 극한 온도에서도 미생물 집단 구조를 보존함을 확인시켜주었다. 일반 운송 온도를 거친 104B pH 11 샘플 및 -80℃에서 유지된 페어링된 샘플의 브레이-커티스 거리를 비교하는 만-휘트니 시험은 유의미한 차이를 나타내지 않았다. 반대로, 37℃에서 유지된 또는 냉동-해동 사이클을 거친 안정화되지 않은 샘플은 -80℃에서 유지된 샘플과 비교되는 경우 유의미한 차이를 나타내었다(도 27).
결론
Metagenomics의 맥락에서, 안정화는 경시적으로 측정되는, 하기를 포괄하는 다차원적 속성이다: a) 중립성(편향되지 않은 프로파일을 포획하는 능력), b) 재현성(고도의 합치된 분취물을 취할 수 있는 균질 샘플 물질), 및 c) 온전성(분자량). 고도로 제어되는 실험 및 강력 분석에 기반하여, 104B pH 11은 실시간 운송 및 취급 조건을 통해 인간 대변에서 장 미생물군을 효과적으로 안정화하였다. 이는 MWAS의 비용-효과적인 확장뿐만 아니라 바이오마커 발굴 및 개발을 위한 데이타 품질 최적화에 가장 중요하다.
실시예 11 - 승온에서의 샘플 안정화에서 킬레이트화제의 역할에 대한 추 가 연구
샘플 내에서 미생물 프로파일의 안정성도 승온에 민감하다. 이들 조건에서는 유해한 뉴클레아제가 활성화될 수 있을 뿐만 아니라 일부 종이 증식하기 시작할 수 있다. 킬레이트화제(CDTA)의 존재는 DNAse의 작용을 중지시키는 것뿐만 아니라 박테리아 성장을 저해하기 위해 상기 경우 특히 유익하다.
본 실험에서, 건강한 공여자가 대변을 수집하여 다양한 하기 최종 농도의 킬레이트화제 CDTA를 포함하는 2 mL의 본 발명의 조성물 및 하나의 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼을 함유하는 튜브 내로 400 mg의 대변을 옮겼다: a) 300 mM CDTA, 50 mM β-알라닌, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.1% 소포제 A, pH 11("104B pH 11"); b) 150 mM CDTA, 50 mM β-알라닌, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.1% 소포제 A, pH 11, 또는 c) 50 mM β-알라닌, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.1% 소포제 A, pH 11(킬레이트화제 없음). 샘플을 수동 진탕으로 균질화(혼합)한 뒤 실온 조건 하에 실험실로 돌려보냈다. 샘플 수집 24 시간 내에, 250 ㎕ 분취물을 DNA 추출을 위해 각 튜브로부터 꺼내었다(T=0). 이어서 수집된 샘플을 5 일 동안 40℃에서 보관(T=5)한 뒤 두 번째 분취물로부터 DNA를 추출하였다. 정제된 DNA를 정량한 뒤 DGGE를 이용하여 박테리아 집단 프로파일 또는 유전지문으로 분해하여 16S rRNA 유전자 PCR 앰플리콘을 분리하였다. 각 조성물에 대해 T=0에서의 대조군 샘플 대비 샘플(DGGE 겔 상의 레인) 간 유사성%를 Syngene GeneTools 소프트웨어(물질 및 방법 참고)를 이용하여 별도로 계산하였다.
도 28은 CDTA 없는 조성물 대비 CDTA가 150 mM 또는 300 mM의 농도로 존재하는 경우, 본 발명의 조성물에 대해 '5 일' 샘플 및 '0 일' 간에 승온에서 더 우수한 유사성% 또는 미생물군유전체 프로파일 안정성을 실증한다. 이는 승온에서의 미생물 프로파일 안정성을 유지하기 위해 킬레이트화제가 본 발명의 조성물에서 필요함을 시사한다. 300 mM 및 150 mM CDTA를 포함하는 조성물에 있어서, 대변 샘플이 40℃에서 보관된 경우 '5 일'째의 미생물 프로파일은 '0 일'째에 비해 각각 96% 및 95% 유사하였다. 대비되어, 대변 샘플이 40℃에서 보관된 경우 CDTA를 함유하지 않는 조성물에서 '5 일'째의 미생물 프로파일은 '0 일'째에 비해 71%였다.
실시예 12 - 선행 기술의 조성물에 비해 본 발명의 조성물에서의 샘플의 더 우수한 안정화
환자 샘플 내의 핵산은 이들이 환자로부터 제거된 후 분해되는 경향이 있다. 상기 분해는 온전한 핵산의 존재에 기반하여 질환으로(예로 암성으로) 샘플을 스코어링하는 핵산 온전성 검정의 유효성을 감소시킬 수 있다. AP Shuber 및 DH Whitney(US 2008/0124714)는 안정화 용액에 버퍼, 염 및 킬레이트화제가 포함되는(예로, "TEN 버퍼") 조직 및 체액 샘플 내 핵산의 안정화 방법을 기재한다.
본 실험에서, 건강한 공여자가 대변을 수집하여 하나의 7.9 mm 스테인레스 스틸 볼 및 2 mL의 본 발명의 조성물(조성물 1; 300 mM CDTA, 50 mM β-알라닌, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.1% 소포제 A, pH 11("104B pH 11"))을 함유하는 튜브 내로 400 mg의 대변을 또는 ii) 2 mL의 "TEN 버퍼"(조성물 2; 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8, US2008/0124714)를 함유하는 튜브 내로 대략 400 mg의 대변을 옮겼다. 두 튜브 내의 샘플을 수동 진탕(혼합)으로 균질화한 뒤 실온 조건 하에 실험실로 돌려보냈다. 샘플 수집 24 시간 내에, 250 ㎕ 분취물을 DNA 추출을 위해 각 튜브로부터 꺼낸(T=0) 뒤 21 일 동안 실온 조건 하에 보관하고(T=21) 두 번째 분취물로부터 DNA를 추출하였다. 정제된 DNA를 추출한 뒤 DGGE를 이용하여 박테리아 집단 프로파일 또는 유전지문으로 분해하여 16S rRNA 유전자 PCR 앰플리콘을 분리하였다. 각 조성물에 대해 T=0에서의 대조군 샘플 대비 샘플(DGGE 겔 상의 레인) 간 유사성%를 Syngene GeneTools 소프트웨어(물질 및 방법 참고)를 이용하여 별도로 계산하였다.
도 29는 TEN 버퍼 조성물 대비 본 발명의 조성물에 있어서 '21 일' 샘플 및 '0 일' 간 더 우수한 유사성% 또는 미생물군유전체 프로파일 안정성을 나타내어, 본 발명의 조성물이 당해분야에서의 다른 공지된 조성물에 비해 개선된 DNA 안정성을 부여함을 시사한다. '21 일'째에 공여자 A 및 B의 미생물 프로파일은 대변 샘플이 본 발명의 "104B pH 11" 조성물에 보관된 경우 '0 일'째에 비해 각각 82% 및 94% 유사하였다. 대비되어, '21 일'째에 공여자 A 및 B의 미생물 프로파일은 대변 샘플이 US 2008/0124714의 조성물에 보관된 경우 '0 일'째에 비해 각각 70% 및 50% 유사하였다.
US2008/0124714는 또한 [0059]의 물질 및 방법 섹션에서의 0.5 M Tris, 0.15 M EDTA, 및 10 mM NaCl(pH 9.0)로 구성된 "안정화 버퍼"를 참조하였다. 그러나, 이후 실시예에서 구체적으로 참조된 유일한 안정화 버퍼/용액이 상기 주지된 "TEN 버퍼"이며, 안정화 용액에 대한 설명의 교시 및 청구범위도 "TEN 버퍼"를 포괄하는 구현예에 대한 것임이 주지된다. 이와 같이, "안정화 버퍼"가 시험되었는지 또는 US2008/0124714에서 교시된 방법에서 작용할 것인지가 명백하지 않다. 그럼에도 불구하고, 실시예 1에 기재된 동일한 조건 하에 150 mM CDTA, 50 mM β-알라닌, 23.5% 에탄올, 0.5% SDS, 0.1% 소포제 A, pH 11을 함유하는 본 발명의 조성물 대비 US2008/0124714의 상기 "안정화 버퍼"의 성능을 비교하는 비교 연구를 수행하였다.
조성 및 시간을 이용한 미생물군유전체 안정성의 평가 동안, 앰플리콘의 DGGE 분석 및 박테리아 16S rRNA 유전자의 PCR을 이용한 증폭은 pH 11에서 150 mM CDTA를 함유하는 본 발명의 조성물이 pH 9.0에서 150 mM EDTA를 함유하는 US 2008/0124714의 "안정화 버퍼"에 비해(79%) 30-일 인큐베이션 후 대조군(T=0)에 대해 더 큰 유사성%(86%)를 유지함을 나타내었다.
따라서 본 출원의 조성물은 US 2008/0124714에 개시된 조성물에 비해 대변 샘플에서 미생물군유전체 프로파일의 더 우수한 안정화를 제공한다.
참고문헌
1. Lee YK and Mazmanian SK (2010) Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system? Science 24: 1768-1773.
2. Aries V, Crowther JS, Drasar BS, Hill MJ, Williams REO (1969) Bacteria and the aetiology of cancer of the large bowel. Gut 10: 334-335.
3. Moore WEC and Moore LH (1995) Intestinal floras of populations that have a high risk of colon cancer. Applied Envir Microbiol 61 (9): 3202-3207.
4. Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, Chang Y, Vogelman JH, Orentreich N, Sibley RK (1991) Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 325: 1127-1131.
5. Grenham S, Clarke G, Cryan JF, Dinan TG (2011) Brain-gut-microbe communication in health and disease. Front Physio 2: 94.
6. Kinross JM, Darzi AW, Nicholson JK (2011) Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine 3:14.
7. Van Nood Els 등(2013) Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. N Engl J Med 368 (5): 407-415.
8. Apajalahti JHA, Kettunen A, Nurminen PH, Jatila H, Holben WE (2003) Selective plating underestimates abundance and shows differential recovery of Bifidobacterial species from human feces. Appl Environ Microbiol 69(9): 5731-5735.
9. O'Sullivan D (2000) Methods for analysis of the intestinal microflora. Current Issues in Intestinal Microbiology 1(2): 39-50.
10. Walker AW, Ince J, Duncan SH, Webster LM, Holtrop G, Ze X, Brown D, Stares MD, Scott P, Bergerat A, Louis P, McIntosh F, Johnstone AM, Lobley GE, Parkhill J, Flint HJ (2011) International Society for Microbial Ecology Journal 5: 220-230.
11. Wu GD, Chen J, Hoffmann C, Bittinger K, Chen Y-Y, Keilbaugh SA, Bewtra M, Knights D, Walters WA, Knight R, Sinha R, Gilroy E, Gupta K, Baldassano R, Nessel L, Li H, Bushman FD, Lewis JD (2011) Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science 334: 105-108.
12. Ley RE, Knight R, Gordon JI (2007) The human microbiome: eliminating the biomedical/environmental dichotomy in microbial ecology. Environ Microbiol 9: 3-4.
13. Bahl MI, Bergstrom A, Licht TR (2012) Freezing fecal samples prior to DNA extraction affects the Firmicutes to Bacteroidetes ratio determined by downstream quantitative PCR analysis. FEBS Microbiol Lett 329: 193-197.
14. Olson J, Whitney DH, Durkee K, Shuber AP (2005) DNA stabilization is critical for maximizing performance of fecal DNA-based colorectal cancer tests. Diagn Mol Pathol 14(3): 183-191.
15. Song Y, Garg S, Girotra M, Maddox C, von Rosenvinge EC, Dutta A, Dutta S, Fricke WF (2013) Microbiota dynamics in patients treated with fecal microbiota transplantation for recurrent Clostridium difficile infection. PLOS ONE 8(11): 1-11.
16. Van der Giessen JWB, Eger A, Haagsma J, Haring RM, Gaastra W, van der Zeijst BAM (1992) Amplification of 16S rRNA sequences to detect Mycobacterium paratuberculosis. J Med Microbiol 36: 255-263.
17. Hurley SS, Splitter GA, Welch RA. Test for Johne's Disease. US 4,918,178
18. Kojima K. Process of extracting nucleic acid and process of simultaneously carrying out extraction and purification of nucleic acid. US 6,852,495
19. Ariefdjohan MW, Savaiano DA, Nakatsu CH (2010) Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutr J 9: 23.
20. Smith B, Li N, Andersen AS, Slotved HC, Krogfelt KA (2011) Optimising bacterial DNA extraction from faecal samples: comparison of three methods. Open Microbiol J 5: 14-17.
21. McInnes P, Cutting M (2010) Manual of procedures for human microbiome project. Core Microbiome Sampling Protocol A; Protocol #07-001 (version 12.0)
22. Brusa T, Canzi E, Pacini N, Zancho R, Farrari A (1989) Oxygen tolerance of anaerobic bacteria isolated from human feces. Curr Microbiol 19: 39-43.
23. US 2008/0124714 (A.P. Shuber and D.H. Whitney).
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본 발명에 속하는 당해분야의 숙련가의 기술 수준을 시사하며, 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 참고문헌으로 도입되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고문헌으로 도입된다.
따라서 본 발명이 기재되며, 이것이 여러 방식으로 변할 수 있음은 명백할 것이다. 이러한 변형은 본 발명의 정수 및 범위에서 벗어나는 것으로 간주되지 않으며, 당해분야의 숙련가에게 자명할 이러한 모든 개질은 하기 청구범위의 범위 내에 포함되려는 것이다. 청구범위의 범위는 설명을 위해 나타낸 바람직한 세트에 제한되지 않으며, 전체로서의 설명과 일관되게 가장 광의의 해석이 주어져야 한다.

Claims (87)

  1. 하기 단계를 포함하는, 상온에서 생물학적 샘플에 함유된 핵산을 안정화하기 위한 방법:
    a) 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    b) 생물학적 샘플을 킬레이트화제를 포함하는 수성 조성물과 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계(상기 킬레이트화제는 적어도 약 150 mM의 농도로 존재하며, 상기 조성물은 적어도 약 9.5의 pH를 가짐);
    c) (b)의 혼합물을 균질화하여 균질 혼합물을 형성하는 단계; 및
    d) 균질 혼합물을 상온에서 보관하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산이 데옥시리보핵산(DNA)인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 대변 샘플, 토양 샘플, 하수 샘플, 폐수 샘플, 또는 물 샘플로부터 선택되는 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 포유동물로부터 수득되는 대변 샘플인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 킬레이트화제가 1,2-사이클로헥산디아민 테트라아세트산(CDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 테트라아자사이클로도데칸테트라아세트산(DOTA), 테트라아자사이클로테트라데칸테트라아세트산(TETA), 데스페리옥시민, 또는 이들의 킬레이터 유사체로부터 선택되는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 킬레이트화제가 CDTA인 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 킬레이트화제의 농도가 약 150 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 250 mM 내지 약 350 mM인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 킬레이트화제의 농도가 약 300 mM인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 약 9.5 내지 약 11.5, 또는 약 10.5 내지 약 11.5의 pH를 갖는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 조성물이 약 11의 pH를 갖는 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 pH 범위 9.5 내지 11.5에서 완충할 수 있는 적어도 하나의 버퍼제를 추가로 포함하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 버퍼제가 베타-알라닌인 방법.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 수용성 유기 용매, 예컨대 C1-C6 알칸올을 추가로 포함하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 수용성 유기 용매가 에탄올인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 에탄올이 약 30 부피% 미만의 농도로 조성물에 존재하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 에탄올이 약 24 부피% 미만의 농도로 조성물에 존재하는 방법.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 세제, 예컨대 나트륨 도데실설페이트를 추가로 포함하는 방법.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 소포제, 예컨대 소포제 A를 추가로 포함하는 방법.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 혼합물이 균질화 수단을 이용하여 균질화되는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 균질화 수단이 적어도 하나의 혼합 볼인 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 혼합 볼을 함유하는 샘플 용기에서 생물학적 샘플 및 조성물의 혼합물을 형성하는 단계, 샘플 용기를 밀봉하는 단계, 및 적어도 하나의 혼합 볼의 존재 하에 혼합물을 진탕하여 혼합물을 균질화하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 진탕이 수동으로 수행되는 방법.
  24. 청구항 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 혼합 볼이 스테인레스 스틸 혼합 볼 또는 텅스텐 카바이드 혼합 볼인 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 적어도 하나의 혼합 볼이 약 5.6-11.1 mm의 직경 및 적어도 약 7.6 g/cm3의 밀도를 갖는 스테인레스 스틸 혼합 볼인 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 스테인레스 스틸 혼합 볼이 약 7.1 - 8.7 mm의 직경을 가지며, 샘플 용기가 약 12.9 mm의 내경을 갖는 둥근-바닥 튜브인 방법.
  27. 청구항 5 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 인간 DNA인 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 방법이 인간 DNA를
    실온에서 적어도 7 일, 적어도 14 일, 적어도 30 일, 또는 적어도 60 일 동안;
    약 37℃ 내지 약 50℃의 온도에서 적어도 7 일, 또는 적어도 14 일 동안; 및/또는
    -20℃에서 적어도 30 일 동안 안정하게 만드는 방법.
  29. 청구항 3 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 미생물 DNA이고, 방법이 생물학적 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화하는 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 방법이 생물학적 샘플의 미생물군유전체 프로파일을
    실온에서 적어도 7 일, 적어도 14 일, 적어도 30 일, 또는 적어도 60 일 동안;
    약 37℃ 내지 약 50℃의 온도에서 적어도 7 일, 또는 적어도 14 일 동안; 및/또는
    -20℃에서 적어도 30 일 동안 안정하게 만드는 방법.
  31. 킬레이트화제를 포함하는, 상온에서 생물학적 샘플에 함유된 핵산을 안정화하기 위한 수성 조성물로서, 상기 킬레이트화제가 적어도 약 150 mM의 농도로 존재하고, 상기 조성물이 적어도 약 9.5의 pH를 갖는 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 핵산이 데옥시리보핵산(DNA)인 조성물.
  33. 청구항 31 또는 32에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 대변 샘플, 토양 샘플, 하수 샘플, 폐수 샘플, 또는 물 샘플로부터 선택되는 조성물.
  34. 청구항 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 포유동물로부터 수득되는 대변 샘플인 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 조성물.
  36. 청구항 31 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 킬레이트화제가 CDTA, DTPA, DOTA, TETA, 데스페리옥시민, 또는 이들의 킬레이터 유사체로부터 선택되는 조성물.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 킬레이트화제가 CDTA인 조성물.
  38. 청구항 31 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 킬레이트화제의 농도가 약 150 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 250 mM 내지 약 350 mM인 조성물.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 킬레이트화제의 농도가 약 300 mM인 조성물.
  40. 청구항 31 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 약 9.5 내지 약 11.5, 또는 약 10.5 내지 약 11.5의 pH를 갖는 조성물.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 조성물이 약 11의 pH를 갖는 조성물.
  42. 청구항 31 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 pH 범위 9.5 내지 11.5에서 완충할 수 있는 적어도 하나의 버퍼제를 추가로 포함하는 조성물.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 버퍼제가 베타-알라닌인 조성물.
  44. 청구항 31 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 수용성 유기 용매, 예컨대 C1-C6 알칸올을 추가로 포함하는 조성물.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 수용성 유기 용매가 에탄올인 조성물.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 에탄올이 약 30 부피% 미만의 농도로 조성물에 존재하는 조성물.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 에탄올이 약 24 부피% 미만의 농도로 조성물에 존재하는 조성물.
  48. 청구항 31 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 세제, 예컨대 나트륨 도데실설페이트를 추가로 포함하는 조성물.
  49. 청구항 31 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 소포제, 예컨대 소포제 A를 추가로 포함하는 조성물.
  50. 청구항 35 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 DNA인 조성물.
  51. 청구항 33 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 미생물 DNA이고 조성물이 생물학적 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화하기 위한 조성물.
  52. 상온에서 생물학적 샘플에 함유된 핵산을 안정화하기 위한 키트로서, 상기 키트가 하기를 포함하는 키트:
    a) 재밀봉가능한 마개를 갖는 샘플 용기;
    b) 킬레이트화제를 포함하는 수성 조성물(상기 킬레이트화제는 적어도 약 150 mM의 농도로 존재하며, 상기 조성물은 적어도 약 9.5의 pH를 가지며, 상기 조성물은 선택적으로 샘플 용기 내에 함유됨);
    c) 선택적으로 샘플 용기 내에 함유된, 균질화 수단;
    d) 생물학적 샘플, 또는 이들의 일부를 샘플 용기 내로 옮기기 위한 수단; 및
    d) 사용 지침.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 핵산이 데옥시리보핵산(DNA)인 키트.
  54. 청구항 52 또는 53에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 대변 샘플, 토양 샘플, 하수 샘플, 폐수 샘플, 또는 물 샘플로부터 선택되는 키트.
  55. 청구항 52 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 포유동물로부터 수득되는 대변 샘플인 키트.
  56. 청구항 55에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 키트.
  57. 청구항 52 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 킬레이트화제가 CDTA, DTPA, DOTA, TETA, 데스페리옥시민, 또는 이들의 킬레이터 유사체로부터 선택되는 키트.
  58. 청구항 57에 있어서, 상기 킬레이트화제가 CDTA인 키트.
  59. 청구항 52 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 킬레이트화제의 농도가 약 150 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 250 mM 내지 약 350 mM인 키트.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 킬레이트화제의 농도가 약 300 mM인 키트.
  61. 청구항 52 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 약 9.5 내지 약 11.5, 또는 약 10.5 내지 약 11.5의 pH를 갖는 키트.
  62. 청구항 61에 있어서, 상기 조성물이 약 11의 pH를 갖는 키트.
  63. 청구항 52 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 pH 범위 9.5 내지 11.5에서 완충할 수 있는 적어도 하나의 버퍼제를 추가로 포함하는 키트.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 버퍼제가 베타-알라닌인 키트.
  65. 청구항 52 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 수용성 유기 용매, 예컨대 C1-C6 알칸올을 추가로 포함하는 키트.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 수용성 유기 용매가 에탄올인 키트.
  67. 청구항 65에 있어서, 상기 에탄올이 약 30 부피% 미만의 농도로 조성물에 존재하는 키트.
  68. 청구항 67에 있어서, 상기 에탄올이 약 24 부피% 미만의 농도로 조성물에 존재하는 키트.
  69. 청구항 52 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 세제, 예컨대 나트륨 도데실설페이트를 추가로 포함하는 키트.
  70. 청구항 52 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 소포제, 예컨대 소포제 A를 추가로 포함하는 키트.
  71. 청구항 56 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 인간 DNA인 키트.
  72. 청구항 54 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 미생물 DNA이고 키트가 생물학적 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화하기 위한 키트.
  73. 청구항 52 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 균질화 수단이 적어도 하나의 혼합 볼인 키트.
  74. 청구항 73에 있어서, 상기 적어도 하나의 혼합 볼이 스테인레스 스틸 혼합 볼 또는 텅스텐 카바이드 혼합 볼인 키트.
  75. 청구항 74에 있어서, 상기 적어도 하나의 혼합 볼이 약 5.6-11.1 mm의 직경 및 적어도 약 7.6 g/cm3의 밀도를 갖는 스테인레스 스틸 혼합 볼인 키트.
  76. 청구항 75에 있어서, 상기 스테인레스 스틸 혼합 볼이 약 7.1 - 8.7 mm의 직경을 가지며, 샘플 용기가 약 12.9 mm의 내경을 갖는 둥근-바닥 튜브인 키트.
  77. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산이 DNA이며, 생물학적 샘플이 포유동물로부터 수득된 대변 샘플이고, 조성물이 약 10.5 내지 약 11.5의 pH를 가지며, 조성물이 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성되는 방법:
    약 250 mM 내지 약 350 mM 양의 CDTA;
    약 30 mM 내지 약 70 mM 양의 β-알라닌;
    약 21.5 부피% 내지 약 23.5 부피% 양의 에탄올;
    약 0 내지 약 1%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및
    약 0 내지 약 0.2%(v/v) 양의 소포제 A.
  78. 청구항 77에 있어서, 상기 조성물이 약 11의 pH를 가지며, 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성되는 방법:
    약 300 mM 양의 CDTA;
    약 50 mM 양의 β-알라닌;
    약 23.5 부피% 양의 에탄올;
    약 0.5%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및
    약 0.1%(v/v) 양의 소포제 A.
  79. 청구항 77 또는 78에 있어서, 상기 방법이 약 12.9 mm의 내경을 가지며 약 5.6-11.1 mm의 직경 및 적어도 약 7.6 g/cm3의 밀도를 갖는 적어도 하나의 스테인레스 스틸 혼합 볼을 함유하는 둥근 바닥 튜브에서 대변 샘플 및 조성물의 혼합물을 형성하는 단계, 둥근 바닥 튜브를 밀봉하는 단계, 및 적어도 하나의 스테인레스 스틸 혼합 볼의 존재 하에 수동으로 혼합물을 진탕하여 혼합물을 균질화하는 단계를 포함하는 방법.
  80. 청구항 79에 있어서, 상기 핵산이 미생물 DNA이며 방법이 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화하고, 상기 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일이
    실온에서 적어도 7 일, 적어도 14 일, 적어도 30 일, 또는 적어도 60 일 동안;
    약 37℃ 내지 약 50℃의 온도에서 적어도 7 일, 또는 적어도 14 일 동안; 및/또는
    -20℃에서 적어도 30 일 동안 안정해지는 방법.
  81. 청구항 31에 있어서, 상기 핵산이 DNA이며, 생물학적 샘플이 포유동물로부터 수득되는 대변 샘플이고, 조성물이 약 10.5 내지 약 11.5의 pH를 가지며, 조성물이 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성되는 조성물:
    약 250 mM 내지 약 350 mM 양의 CDTA;
    약 30 mM 내지 약 70 mM 양의 β-알라닌;
    약 21.5 부피% 내지 약 23.5 부피% 양의 에탄올;
    약 0 내지 약 1%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및
    약 0 내지 약 0.2%(v/v) 양의 소포제 A.
  82. 청구항 81에 있어서, 상기 조성물이 약 11의 pH를 가지며, 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성되는 조성물:
    약 300 mM 양의 CDTA;
    약 50 mM 양의 β-알라닌;
    약 23.5 부피% 양의 에탄올;
    약 0.5%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및
    약 0.1%(v/v) 양의 소포제 A.
  83. 청구항 81 또는 82에 있어서, 상기 조성물이 대변 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화하기 위한 조성물.
  84. 청구항 52에 있어서, 상기 핵산이 DNA이며, 생물학적 샘플이 포유동물로부터 수득된 대변 샘플이고, 조성물이 약 10.5 내지 약 11.5의 pH를 가지며, 조성물이 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성되는 키트:
    약 250 mM 내지 약 350 mM 양의 CDTA;
    약 30 mM 내지 약 70 mM 양의 β-알라닌;
    약 21.5 부피% 내지 약 23.5 부피% 양의 에탄올;
    약 0 내지 약 1%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및
    약 0 내지 약 0.2%(v/v) 양의 소포제 A.
  85. 청구항 84에 있어서, 상기 조성물이 약 11의 pH를 가지며, 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 구성되거나, 하기로 구성되는 키트:
    약 300 mM 양의 CDTA;
    약 50 mM 양의 β-알라닌;
    약 23.5 부피% 양의 에탄올;
    약 0.5%(w/v) 양의 나트륨 도데실 설페이트; 및
    약 0.1%(v/v) 양의 소포제 A.
  86. 청구항 85에 있어서, 상기 핵산이 미생물 DNA이고 키트가 생물학적 샘플의 미생물군유전체 프로파일을 안정화하기 위한 키트.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 균질화 수단이 약 5.6-11.1 mm의 직경 및 적어도 약 7.6 g/cm3의 밀도를 갖는 적어도 하나의 스테인레스 스틸 혼합 볼이며, 샘플 용기가 약 12.9 mm의 내경을 갖는 둥근 바닥 튜브인 키트.
KR1020167027593A 2014-03-07 2015-03-06 생물학적 샘플에서 핵산을 안정화하기 위한 조성물 및 방법 KR102392407B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461949692P 2014-03-07 2014-03-07
US61/949692 2014-03-07
US201462057769P 2014-09-30 2014-09-30
US62/057769 2014-09-30
PCT/CA2015/050173 WO2015131291A1 (en) 2014-03-07 2015-03-06 Composition and method for stabilizing nucleic acids in biological samples

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160130287A true KR20160130287A (ko) 2016-11-10
KR102392407B1 KR102392407B1 (ko) 2022-04-29

Family

ID=54054312

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167027593A KR102392407B1 (ko) 2014-03-07 2015-03-06 생물학적 샘플에서 핵산을 안정화하기 위한 조성물 및 방법

Country Status (18)

Country Link
US (2) US10435735B2 (ko)
EP (1) EP3114225B1 (ko)
JP (1) JP6670765B2 (ko)
KR (1) KR102392407B1 (ko)
CN (1) CN106255753B (ko)
AU (1) AU2015226811B2 (ko)
CA (1) CA2941764C (ko)
DK (1) DK3114225T3 (ko)
ES (1) ES2880310T3 (ko)
IL (1) IL247662A0 (ko)
MX (1) MX2016011495A (ko)
PL (1) PL3114225T3 (ko)
PT (1) PT3114225T (ko)
RU (1) RU2717644C2 (ko)
SA (2) SA516371797B1 (ko)
SG (2) SG10201807736SA (ko)
WO (1) WO2015131291A1 (ko)
ZA (1) ZA201906139B (ko)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
EP2721140B1 (en) 2011-06-19 2016-11-23 Abogen, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
DK3114225T3 (da) * 2014-03-07 2021-07-26 Dna Genotek Inc Sammensætning og fremgangsmåde til stabilisering af nukleinsyrer i biologiske prøver
CA3055981A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Ancestry.Com Dna, Llc Sample collection device and method
AU2018345714A1 (en) 2017-10-06 2020-05-21 Ancestry.Com Dna, Llc Systems, devices, and methods for sample collection
BR112020010274A2 (pt) 2017-11-22 2020-11-17 Ancestry. Com Dna, Llc kit de coleta de amostra incluindo tampa tendo luva seletivamente móvel
US11426734B2 (en) 2017-11-22 2022-08-30 Ancestry.Com Dna, Llc Sample collection kit including cap having selectively movable sleeve
CN107955810A (zh) * 2017-12-25 2018-04-24 宁波卡尔新材料科技有限公司 一种新型动物肝脏核酸提取试剂盒及提取方法
CN111868530A (zh) 2018-02-14 2020-10-30 萨琳格纳斯提克斯有限公司 用于检测分析物的方法和装置
CN108893523A (zh) * 2018-05-31 2018-11-27 厦门安捷致善医学数据科技有限公司 一种粪便样品常温保存液
CA3120086A1 (en) * 2018-11-14 2020-05-22 Spectrum Solutions L.L.C. Rna preservation solution and methods of manufacture and use
WO2020174442A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Ancestry.Com Dna, Llc Graphical user interface displaying relatedness based on shared dna
CN109810974B (zh) * 2019-04-08 2020-11-24 珠海丽珠试剂股份有限公司 提取人类免疫缺陷病毒hiv-1核酸的试剂组合产品及其方法
EP4025301A4 (en) 2019-09-05 2023-07-19 The Regents of the University of California NON-INVASIVE METHOD FOR QUANTIFYING KIDNEY FUNCTION AND FUNCTIONAL DECLINE
CN113186185B (zh) * 2020-01-14 2023-05-26 东北林业大学 一种从哺乳动物粪便中高效富集宿主dna的方法
US20210223268A1 (en) * 2020-01-21 2021-07-22 Board Of Regents Of The University Of Texas System Discriminating parkinson's disease from multiple system atrophy using alpha-synuclein pmca
CN115279901A (zh) * 2020-03-11 2022-11-01 花王株式会社 来自皮肤表面脂质的rna的制备方法
US20220064709A1 (en) * 2020-09-01 2022-03-03 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and Methods for Screening Biological Samples
US20240002905A1 (en) * 2020-11-11 2024-01-04 Biocept, Inc. Pathogen inactivating and nucleic acid stabilization media for microorganism collection and transport
WO2022219514A1 (en) * 2021-04-16 2022-10-20 Grifols Diagnostic Solutions Inc. Compositions and methods for storing a biological sample
WO2023019124A1 (en) * 2021-08-09 2023-02-16 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Method to preserve nucleic acids in water samples
WO2023150879A1 (en) * 2022-02-10 2023-08-17 Dna Genotek Inc. Methods and systems for defining test sample read count limits for a range of microbial sequence reads

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004500001A (ja) * 1998-02-02 2004-01-08 ジエントラ・システムズ・インコーポレーテツド Ｄｎａを単離するための溶解マトリックスを使用するための組成物および方法
US20040038269A1 (en) * 2002-06-07 2004-02-26 Birnboim H. Chaim Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
KR20070097430A (ko) * 2004-11-05 2007-10-04 퀴아젠 노쓰 아메리칸 홀딩즈, 인크. 안정화 시약으로부터 핵산을 정제하기 위한 조성물 및 방법

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4663161A (en) * 1985-04-22 1987-05-05 Mannino Raphael J Liposome methods and compositions
GB8614084D0 (en) * 1986-06-10 1986-07-16 Serono Diagnostics Ltd Immunoassay
US4918178A (en) 1987-10-22 1990-04-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Test for Johne's disease
JP2791367B2 (ja) 1988-04-21 1998-08-27 マイクロプローブ・コーポレーション 核酸抽出方法
JPH04187077A (ja) 1990-11-22 1992-07-03 Shimadzu Corp 核酸の抽出精製装置
JPH0599923A (ja) 1991-10-11 1993-04-23 Nitto Denko Corp ヒトヘモグロビンの検出方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液
DE4204012A1 (de) * 1992-02-12 1993-08-19 Ulrich Prof Dr Zimmermann Mitogenfreie substanz, deren herstellung und verwendung
ES2210239T3 (es) 1992-04-01 2004-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Metodo para detectar acidos nucleicos de mamiferos aislados en heces y reactivos para el mismo.
DE4321904B4 (de) 1993-07-01 2013-05-16 Qiagen Gmbh Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
KR100230909B1 (ko) 1993-11-29 1999-12-01 다니엘 엘. 캐시앙 광범위의 유기체로부터 핵산 추출 방법
GB9506843D0 (en) 1995-04-03 1995-05-24 Chiroscience Ltd Oxidative process and products thereof
DE19530132C2 (de) 1995-08-16 1998-07-16 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien
GB9518156D0 (en) 1995-09-06 1995-11-08 Medical Res Council Method of isolating cells
NO954667D0 (no) 1995-11-17 1995-11-17 Dagfinn Oegreid Fremgangsmåte til deteksjon av Ki-ras mutasjoner
ATE378422T1 (de) 1996-08-26 2007-11-15 Invitek Biotechnik & Biodesign Verfahren zum nachweis klinisch relevanter veränderungen der dns-sequenz des ki-ras-onkogens,seine verwendung und testkit zur früherkennung von tumoren
AU4775497A (en) 1996-09-19 1998-04-14 W. Kurt Roth Method for purifying and eventually analyzing nucleic acids from biological test samples
WO1998058081A1 (en) 1997-06-16 1998-12-23 Exact Laboratories, Inc. Methods for stool sample preparation
US6268136B1 (en) 1997-06-16 2001-07-31 Exact Science Corporation Methods for stool sample preparation
DE19858447A1 (de) 1997-12-18 1999-07-01 Invitek Gmbh Verfahren zur Isolierung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren
EP0939118A1 (en) 1998-02-20 1999-09-01 Universiteit Maastricht Method for isolating DNA and RNA from faeces
AU4934099A (en) 1998-08-04 2000-02-28 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. Method for enzymatic amplification of nucleic acid
AU1716500A (en) 1998-11-12 2000-06-05 University Of Virginia Patent Foundation Non-invasive detection of helicobacter pylori infection
DE19856064C2 (de) * 1998-12-04 2000-11-30 Invitek Gmbh Universelles Verfahren zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien
DE19900638C2 (de) 1999-01-11 2002-12-19 Max Planck Gesellschaft Methode zur Isolierung von DNA aus biologischen Materialien
US6551777B1 (en) 1999-02-25 2003-04-22 Exact Sciences Corporation Methods for preserving DNA integrity
US20020004206A1 (en) 1999-04-09 2002-01-10 Berger Barry M. Methods of screening for disease
WO2000066606A1 (en) 1999-04-30 2000-11-09 Whatman, Inc. Substrate including anionic detergent for purifying nucleic acid
US6270970B1 (en) * 1999-05-14 2001-08-07 Promega Corporation Mixed-bed solid phase and its use in the isolation of nucleic acids
US6849403B1 (en) 1999-09-08 2005-02-01 Exact Sciences Corporation Apparatus and method for drug screening
US6586177B1 (en) 1999-09-08 2003-07-01 Exact Sciences Corporation Methods for disease detection
JP2003516162A (ja) 1999-12-07 2003-05-13 エグザクト サイエンシーズ コーポレイション 核酸分析に基づく薬物スクリーニングのための装置および方法
US6919174B1 (en) 1999-12-07 2005-07-19 Exact Sciences Corporation Methods for disease detection
US7005266B2 (en) 2000-02-04 2006-02-28 Qiagen Gmbh Nucleic acid isolation from stool samples and other inhibitor-rich biological materials
DK1254238T3 (da) * 2000-02-09 2009-11-30 Basf Se Nyt elongasegen og fremgangsmåde til fremstilling af flerumættede fedtsyrer
FR2808276B1 (fr) 2000-04-26 2004-04-02 Renaud Nalin Procede d'extraction indirecte de l'adn d'organismes non cultivables et adn susceptible d'etre obtenu par ledit procede
DE10031236A1 (de) 2000-06-27 2002-01-10 Qiagen Gmbh Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien
JP4599684B2 (ja) 2000-07-26 2010-12-15 株式会社島津製作所 糞便からの核酸精製法
CU23095A1 (es) * 2000-11-07 2005-11-18 Cnic Ct Nac Investigaciones Proceso para la tipificación rápida de microorganismos y juego de reactivos empleado
US7029840B2 (en) 2000-11-15 2006-04-18 Becton, Dickinson And Company Method for preservation of cells and nucleic acid targets
US6911308B2 (en) 2001-01-05 2005-06-28 Exact Sciences Corporation Methods for detecting, grading or monitoring an H. pylori infection
DE10102338A1 (de) * 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
AU2002356053A1 (en) 2001-08-20 2003-03-03 Whatman, Inc. Dna purification and recovery from high particulate and solids samples
US7893228B2 (en) 2001-10-12 2011-02-22 Qiagen North American Holdings, Inc. Compositions and methods for using a solid support to purify RNA
WO2003033739A1 (en) 2001-10-12 2003-04-24 Gentra Systems, Inc. Compositions and methods for using a solid support to purify rna
US7148343B2 (en) 2001-10-12 2006-12-12 Gentra Systems, Inc. Compositions and methods for using a solid support to purify RNA
US20030109548A1 (en) * 2001-11-09 2003-06-12 Royt Paulette W. Compositions and methods of treating iron excess
WO2003097831A1 (en) 2002-05-17 2003-11-27 Gl Bio Tech Gmbh Method for nucleic acid extraction and nucleic acid purification
DE10222133A1 (de) 2002-05-17 2003-12-04 Gl Biotech Gmbh Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion und Nukleinsäure-Reinigung
US20030215954A1 (en) 2002-05-17 2003-11-20 Cockerill Franklin R. Nucleic acid recovery reagents and methods
JP3910198B2 (ja) 2002-05-21 2007-04-25 アークレイ株式会社 抗酸菌の溶菌方法およびそれを用いた遺伝子増幅若しくは検出方法
JP4092141B2 (ja) 2002-06-07 2008-05-28 株式会社島津製作所 核酸抽出同時精製法
US6852495B2 (en) 2002-06-06 2005-02-08 Shimadzu Corporation Process of extracting nucleic acid and process of simultaneously carrying out extraction and purification of nucleic acid
JP4092139B2 (ja) 2002-06-06 2008-05-28 株式会社島津製作所 核酸抽出法
EP1391520A1 (en) 2002-08-20 2004-02-25 Becton Dickinson and Company Method for preservation of cells and nucleic acid targets
US20040157219A1 (en) 2003-02-06 2004-08-12 Jianrong Lou Chemical treatment of biological samples for nucleic acid extraction and kits therefor
FR2861085B1 (fr) 2003-10-15 2006-01-27 Bertin Technologies Sa Methode d'extraction d'acides nucleiques et son application dans l'analyse de la population microbienne de l'air
US20050239045A1 (en) 2003-12-08 2005-10-27 Arkray Inc. Microorganism or cell collecting method, and microorganism or cell collecting implement used for the method
DE102004004901B4 (de) * 2004-01-30 2006-01-05 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Verfahren zur Herstellung von Sorbicillacton A
US20080124714A1 (en) 2004-05-14 2008-05-29 Exact Sciences Corporation Method for Stabilizing Biological Samples for Nucleic Acid Analysis
AU2005323451B2 (en) 2004-05-21 2010-11-18 Qiagen Sciences Llc Kits and processes for removing contaminants from nucleic acids in environmental and biological samples
WO2005116081A2 (en) 2004-05-24 2005-12-08 Genvault Corporation Stable protein storage and stable nucleic acid storage in recoverable form
US20050277121A1 (en) 2004-06-11 2005-12-15 Ambion, Inc. Crude biological derivatives competent for nucleic acid detection
CA2587419C (en) * 2004-11-17 2013-03-19 Forensink Corporation Inc. Compositions for marking objects with dna and methods for marking and linking an object to its owner
US8158357B2 (en) 2005-03-16 2012-04-17 Dna Genotek Inc. Compositions and method for storage of nucleic acid from bodily fluids
US20070141582A1 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Weiwei Li Method and kit for detection of early cancer or pre-cancer using blood and body fluids
JP2007248170A (ja) * 2006-03-15 2007-09-27 Hitachi Ltd 糞便懸濁液作製用容器
WO2008021995A1 (en) 2006-08-10 2008-02-21 Cohen Ariel B Methods and compositions for detecting an analyte in a biological sample
US8080645B2 (en) * 2007-10-01 2011-12-20 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection/transport compositions and methods
AU2007304776A1 (en) 2006-10-06 2008-04-10 Dna Genotek Inc. Stabilizing compositions and methods for extraction of ribonucleic acid
WO2008089198A1 (en) 2007-01-15 2008-07-24 Greg Liang Sample collector and tester
JPWO2008152980A1 (ja) 2007-06-12 2010-08-26 オリンパス株式会社 生物学的試料と試薬との混合用容器及び生物学的試料と試薬との混合方法
CA2861667C (en) 2007-10-01 2017-06-13 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Biological specimen collection and transport system and methods of use
US20100255481A1 (en) 2007-10-30 2010-10-07 Olympus Corporation Method for detection of adenoma or cancer by genetic analysis
US9347055B2 (en) 2007-11-05 2016-05-24 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method and kit for preparation of sample for use in nucleic acid amplification
WO2009066695A1 (ja) 2007-11-20 2009-05-28 Olympus Corporation 糞便試料の調製方法、糞便試料調製用溶液、及び採便用キット
EP2816122A1 (en) 2008-02-15 2014-12-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting neoplasm from a stool sample
WO2009133928A1 (ja) 2008-05-02 2009-11-05 アークレイ株式会社 白血球の分析方法およびそれに使用する分析試薬
JP5616786B2 (ja) 2008-05-12 2014-10-29 オリンパス株式会社 糞便処理容器
EP2314677A4 (en) 2008-07-23 2011-12-14 Olympus Corp METHOD OF TAKING NUCLEIC ACID FROM A CHAIR SAMPLE, NUCLEIC ACID ANALYSIS METHOD AND DEVICE FOR TREATING CHAIR SAMPLES
CN102131928A (zh) 2008-08-26 2011-07-20 奥林巴斯株式会社 粪便试样的调制方法、粪便试样调制用溶液、及粪便采集用试剂盒
WO2010028382A2 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Collecting and processing complex macromolecular mixtures
US8405379B1 (en) 2008-09-18 2013-03-26 Luc Montagnier System and method for the analysis of DNA sequences in biological fluids
JPWO2010064628A1 (ja) 2008-12-05 2012-05-10 オリンパス株式会社 核酸含有試料の調製方法、試料調製用溶液、及び核酸の解析方法
WO2010064634A1 (ja) 2008-12-05 2010-06-10 オリンパス株式会社 糞便試料の調製方法、糞便試料調製用溶液、及び採便用キット
US8427428B2 (en) 2009-03-31 2013-04-23 Key Ovation Llc Adjustable ergonomic keyboard
WO2010134245A1 (ja) 2009-05-20 2010-11-25 オリンパス株式会社 哺乳細胞由来核酸の回収方法、核酸解析方法、及び採便用キット
JPWO2010134246A1 (ja) 2009-05-20 2012-11-08 オリンパス株式会社 核酸含有試料の調製方法
JP2011250757A (ja) 2010-06-03 2011-12-15 Olympus Corp 生体試料中の核酸検出方法
US9376709B2 (en) 2010-07-26 2016-06-28 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing DNA and RNA in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
EP2598661B1 (en) 2010-07-26 2017-09-27 Biomatrica, INC. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
NZ607043A (en) 2010-08-04 2015-05-29 Borody Thomas J Compositions for fecal floral transplantation and methods for making and using them and devices for delivering them
WO2012044581A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Enrichment of low molecular weight dna
US8530228B2 (en) 2010-12-28 2013-09-10 Bexmart Integrated versatile and systems preparation of specimens
EP2699907A1 (en) 2011-04-19 2014-02-26 Porex Corporation Cards for sample storage and delivery comprising sintered porous plastic
US20130071847A1 (en) 2011-09-19 2013-03-21 BioPet Vet Lab Methods and materials for determining the source of waste
DK3114225T3 (da) * 2014-03-07 2021-07-26 Dna Genotek Inc Sammensætning og fremgangsmåde til stabilisering af nukleinsyrer i biologiske prøver

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004500001A (ja) * 1998-02-02 2004-01-08 ジエントラ・システムズ・インコーポレーテツド Ｄｎａを単離するための溶解マトリックスを使用するための組成物および方法
US20040038269A1 (en) * 2002-06-07 2004-02-26 Birnboim H. Chaim Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
KR20070097430A (ko) * 2004-11-05 2007-10-04 퀴아젠 노쓰 아메리칸 홀딩즈, 인크. 안정화 시약으로부터 핵산을 정제하기 위한 조성물 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
RU2717644C2 (ru) 2020-03-24
US20170166955A1 (en) 2017-06-15
MX2016011495A (es) 2017-07-11
CA2941764C (en) 2023-10-24
CN106255753A (zh) 2016-12-21
BR112016020659A8 (pt) 2021-07-13
ES2880310T3 (es) 2021-11-24
RU2016138077A (ru) 2018-04-13
US11198899B2 (en) 2021-12-14
DK3114225T3 (da) 2021-07-26
RU2016138077A3 (ko) 2018-10-23
SG11201607364RA (en) 2016-10-28
EP3114225A4 (en) 2017-08-09
WO2015131291A1 (en) 2015-09-11
KR102392407B1 (ko) 2022-04-29
EP3114225A1 (en) 2017-01-11
US20200239931A1 (en) 2020-07-30
SG10201807736SA (en) 2018-10-30
AU2015226811B2 (en) 2021-07-15
AU2015226811A1 (en) 2016-10-20
JP6670765B2 (ja) 2020-03-25
PT3114225T (pt) 2021-07-26
EP3114225B1 (en) 2021-04-21
PL3114225T3 (pl) 2021-11-08
JP2017508478A (ja) 2017-03-30
BR112016020659A2 (pt) 2017-08-15
CN106255753B (zh) 2020-11-06
ZA201906139B (en) 2023-04-26
IL247662A0 (en) 2016-11-30
US10435735B2 (en) 2019-10-08
SA516371797B1 (ar) 2021-06-07
SA521421271B1 (ar) 2022-09-11
CA2941764A1 (en) 2015-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11198899B2 (en) Composition and method for stabilizing nucleic acids in biological samples
Lagier et al. Culturing the human microbiota and culturomics
US20230416671A1 (en) Composition And Method For Stabilizing And Maintaining The Viability Of Hardy Microorganisms
Bahl et al. Freezing fecal samples prior to DNA extraction affects the Firmicutes to Bacteroidetes ratio determined by downstream quantitative PCR analysis
Tedjo et al. The effect of sampling and storage on the fecal microbiota composition in healthy and diseased subjects
Hsieh et al. Impact of different fecal processing methods on assessments of bacterial diversity in the human intestine
Hevia et al. Application of density gradient for the isolation of the fecal microbial stool component and the potential use thereof
Wegl et al. Toward best practice in livestock microbiota research: a comprehensive comparison of sample storage and DNA extraction strategies
Ribeiro et al. An alternative storage method for characterization of the intestinal microbiota through next generation sequencing
Lima et al. DNA extraction leads to bias in bacterial quantification by qPCR
Kim et al. Effects of crude oil, dispersant, and oil-dispersant mixtures on human fecal microbiota in an in vitro culture system
Yip et al. Antibiotics promote intestinal growth of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae by enriching nutrients and depleting microbial metabolites
Zhao et al. Probiotic characteristics and whole-genome sequence analysis of Pediococcus acidilactici isolated from the feces of adult beagles
Gangadoo et al. The multiomics analyses of fecal matrix and its significance to coeliac disease gut profiling
Fitzsimons et al. Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR
Santos et al. Transfaunation of the ruminal fluid from cows alters ruminal microbiota structure but not dominant protozoa in healthy sheep
Niu et al. Grinding Beads Influence Microbial DNA Extraction from Organic-Rich Sub-Seafloor Sediment
Bruggeling et al. Optimized DNA isolation method for microbiome analysis of human tissues
Bennett Jr et al. A method for isolating and analyzing human mRNA from newborn stool
BR112016020659B1 (pt) Método, composição e kit para estabilização de ácido desoxirribonucleico (dna) em amostras fecais
Pearson et al. Lack of evidence that ursodeoxycholic acid’s effects on the gut microbiome influence colorectal adenoma risk
Seethalakshmi et al. Comparative analysis of commercially available metagenomic kits for optimal DNA extraction from bovine fecal samples
Pareek Evaluation of intra-species diversity of Oxalobacter formigenes strains using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multiplex PCR
Malukiewicz et al. Bifidobacteria De ne Gut Microbiome Pro les of Golden Lion Tamarin (Leontopithecus rosalia) and Marmoset (Callithrix sp.) Metagenomic Shotgun Pools

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant