CN107460190A - 一种细菌rna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌RNA的提取方法，包括(1)收集菌体，并将该菌体置于离心管中；(2)向离心管中加入含有溶菌酶的EB缓冲液50～200μl，以彻底重悬菌体；(3)向离心管中加入200～600μl buffer A，并通过涡旋振荡混匀；若出现不溶性沉淀则对其进行离心，并将离心后得到的上清液转移至另一离心管中；(4)向离心管中加入200～600μl buffer B并混匀，接着再加入磁珠溶液，通过振荡混匀等步骤。本发明提供了一种细菌RNA的提取方法，可以快速裂解菌体，进而释放RNA，并通过磁珠结合核酸的优势，提高了提取的浓度，并且操作简单快捷，大大提高了提取效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学、医学领域，具体是指一种细菌RNA的提取方法。
背景技术
RNA是存在于生物细胞内，并用以将遗传信息从DNA上转移到功能蛋白上的信使或称模版。近年来，随着细菌基因工程的进展，我们迎来了细菌的后基因组时代，通过研究基因表达谱分析来阐释基因的功能和基因表达调控机制已经成为目前研究的热点。RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学科研技术的重要基础。随着细菌的后基因组时代的到来，寻求一种有效的提取细菌RNA的试剂和方法成为迫切需要解决的问题。
申请号为ZL201210162646.0的专利文件公开了一种革兰氏阳性细菌RNA的提取试剂，由破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂、结合液和洗涤液组成：破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂由提取液A和提取液B组成；所述提取液A按照如下方法配置：将Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，得到提取液A；所述提取液B按照如下方法配置：将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B。所述结合液为浓度4.6M的异硫氰酸胍水溶液；所述洗涤液为70％(体积百分含量)乙醇水溶液。
虽然上述的专利文件公开了一些细菌RNA的提取试剂，能够满足一定的需要，但这些细菌RNA提取试剂仍然存在一定的缺陷：利用上述方法提取的基因组DNA和总RNA中，基因组DNA和总RNA的量大约各占一半，总RNA的含量偏低，说明上述提取剂在革兰氏阳性菌总RNA提取的效率偏低，影响使用。
因此，对于革兰氏阳性菌RNA的提取试剂存在进一步的改进和优化需求，这也是该技术领域内的研究热点和重点之一，更是本发明得以完成的动力和出发点的所在。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题，提供了一种细菌RNA的提取方法，可以快速裂解菌体，进而释放RNA，并通过磁珠结合核酸的优势，提高了提取的浓度，并且操作简单快捷，大大提高了提取效率。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种细菌RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)收集菌体，并将该菌体置于离心管中；
(2)向离心管中加入含有溶菌酶的EB缓冲液50～200μl，以彻底重悬菌体；
(3)向离心管中加入200～600μl buffer A，并通过涡旋振荡混匀；若出现不溶性沉淀则对其进行离心，并将离心后得到的上清液转移至另一离心管中；
(4)向离心管中加入200～600μl buffer B并混匀，接着再加入磁珠溶液，通过振荡混匀；
(5)将离心管放入磁力架静置，然后去除离心管中的液体，并加入DNASE I，接着将其混匀后在室温中静置，最后加入400～700μl buffer C并振荡混匀，接着进行磁分离，以再次去除离心管中的溶液；
(6)向离心管中加入400～700μl buffer D，并振荡混匀，再次进行磁分离，去除离心管中的溶液，接着再次重复步骤(6)一次后进行步骤(7)；
(7)将离心管在室温中静置，直至离心管中的乙醇挥发干净；
(8)向离心管中加入30～100μl RNase-Free ddH2O并振荡混匀，水浴加热后进行磁分离，将水溶液转入新的离心管中，即得RNA溶液。
作为优选，步骤(1)中收集菌体的方法为：首先将菌液置于离心管中并进行离心处理，接着去除所有培养基上清液。
作为优选，步骤(3)中的buffer A包括异硫氰酸胍、盐酸胍和β～巯基乙醇，其中异硫氰酸胍的浓度为1～5M、盐酸胍的浓度为1～5M，β～巯基乙醇的含量为1～5％；所述buffer A中的β～巯基乙醇在使用之前加入；所述离心是以10000～12000rpm的转数离心1min。
作为优选，步骤(4)中的buffer B为异丙醇；且所述的振荡混匀时间为5min。
作为优选，步骤(5)中的离心管放入磁力架静置的时间为1min；加入DNASE I后在室温静置的时间为15min；buffer C溶液由1～5M盐酸胍和40～80％无水乙醇组成。
作为优选，步骤(6)中的buffer D溶液为60～80％的乙醇。
作为优选，步骤(8)中的水浴温度为37℃～95℃；水浴时间为1～10min。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明能快速裂解菌体，进而达到快速释放RNA的目的，还通过磁珠结合核酸的优势，提高了提取的浓度，并且该方法的操作简单快捷，大大提高了提取效率。
附图说明
图1为本发明所提取的RNA电泳条带图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种细菌RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)收集菌体，并将该菌体置于离心管中；
收集菌体的方法为：首先将菌液置于离心管中并进行离心处理，接着去除所有培养基上清液。
(2)向离心管中加入含有溶菌酶的EB缓冲液50μl，以彻底重悬菌体；
(3)向离心管中加入200μl buffer A，并通过涡旋振荡混匀；若出现不溶性沉淀则对其进行离心，并将离心后得到的上清液转移至另一离心管中；
其中，buffer A为细菌细胞壁破除试剂，包括异硫氰酸胍、盐酸胍和β～巯基乙醇，其中异硫氰酸胍的浓度为1M、盐酸胍的浓度为1M，β～巯基乙醇的含量为1％；所述buffer A中的β～巯基乙醇在使用之前加入；所述离心是以10000rpm的转数离心1min。
(4)向离心管中加入200μl buffer B并混匀，接着再加入磁珠溶液，通过振荡混匀；
buffer B为异丙醇；且所述的振荡混匀时间为5min。
buffer A和buffer B的混合液可以使得RNA结合到硅基磁珠上。
(5)将离心管放入磁力架静置，然后去除离心管中的液体，并加入DNASE I，接着将其混匀后在室温中静置，最后加入400μl buffer C并振荡混匀，接着进行磁分离，以再次去除离心管中的溶液；
离心管放入磁力架静置的时间为1min；加入DNASE I后在室温静置的时间为15min；buffer C溶液由1M盐酸胍和40％无水乙醇组成。
(6)向离心管中加入400μl buffer D，并振荡混匀，再次进行磁分离，去除离心管中的溶液，接着再次重复步骤(6)一次后进行步骤(7)；
buffer D溶液为60％的乙醇。
buffer C和buffer D则可以对RNA进行漂洗，以降低RNA中其他物质的残留度。
(7)将离心管在室温中静置，直至离心管中的乙醇挥发干净；
(8)向离心管中加入30μl RNase-Free ddH2O并振荡混匀，水浴加热后进行磁分离，将水溶液转入新的离心管中，即得RNA溶液；
水浴温度为37℃；水浴时间为10min。
实施例2
一种细菌RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)收集菌体，并将该菌体置于离心管中；
收集菌体的方法为：首先将菌液置于离心管中并进行离心处理，接着去除所有培养基上清液。
(2)向离心管中加入含有溶菌酶的EB缓冲液200μl，以彻底重悬菌体；
(3)向离心管中加入600μl buffer A，并通过涡旋振荡混匀；若出现不溶性沉淀则对其进行离心，并将离心后得到的上清液转移至另一离心管中；
其中，buffer A为细菌细胞壁破除试剂，包括异硫氰酸胍、盐酸胍和β～巯基乙醇，其中异硫氰酸胍的浓度为5M、盐酸胍的浓度为5M，β～巯基乙醇的含量为5％；所述buffer A中的β～巯基乙醇在使用之前加入；所述离心是以12000rpm的转数离心1min。
(4)向离心管中加入600μl buffer B并混匀，接着再加入磁珠溶液，通过振荡混匀；
buffer B为异丙醇；且所述的振荡混匀时间为5min。
buffer A和buffer B的混合液可以使得RNA结合到硅基磁珠上。
(5)将离心管放入磁力架静置，然后去除离心管中的液体，并加入DNASE I，接着将其混匀后在室温中静置，最后加入700μl buffer C并振荡混匀，接着进行磁分离，以再次去除离心管中的溶液；
离心管放入磁力架静置的时间为1min；加入DNASE I后在室温静置的时间为15min；buffer C溶液由5M盐酸胍和80％无水乙醇组成。
(6)向离心管中加入700μl buffer D，并振荡混匀，再次进行磁分离，去除离心管中的溶液，接着再次重复步骤(6)一次后进行步骤(7)；
buffer D溶液为80％的乙醇。
buffer C和buffer D则可以对RNA进行漂洗，以降低RNA中其他物质的残留度。
(7)将离心管在室温中静置，直至离心管中的乙醇挥发干净；
(8)向离心管中加入100μl RNase-Free ddH2O并振荡混匀，水浴加热后进行磁分离，将水溶液转入新的离心管中，即得RNA溶液；
水浴温度为95℃；水浴时间为1min。
实施例3
一种细菌RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)收集菌体，并将该菌体置于离心管中；
收集菌体的方法为：首先将菌液置于离心管中并进行离心处理，接着去除所有培养基上清液。
(2)向离心管中加入含有溶菌酶的EB缓冲液145μl，以彻底重悬菌体；
(3)向离心管中加入450μl buffer A，并通过涡旋振荡混匀；若出现不溶性沉淀则对其进行离心，并将离心后得到的上清液转移至另一离心管中；
其中，buffer A为细菌细胞壁破除试剂，包括异硫氰酸胍、盐酸胍和β～巯基乙醇，其中异硫氰酸胍的浓度为2M、盐酸胍的浓度为3M，β～巯基乙醇的含量为2％；所述buffer A中的β～巯基乙醇在使用之前加入；所述离心是以11000rpm的转数离心1min。
(4)向离心管中加入500μl buffer B并混匀，接着再加入磁珠溶液，通过振荡混匀；
buffer B为异丙醇；且所述的振荡混匀时间为5min。
buffer A和buffer B的混合液可以使得RNA结合到硅基磁珠上。
(5)将离心管放入磁力架静置，然后去除离心管中的液体，并加入DNASE I，接着将其混匀后在室温中静置，最后加入500μl buffer C并振荡混匀，接着进行磁分离，以再次去除离心管中的溶液；
离心管放入磁力架静置的时间为1min；加入DNASE I后在室温静置的时间为15min；buffer C溶液由3M盐酸胍和60％无水乙醇组成。
(6)向离心管中加入600μl buffer D，并振荡混匀，再次进行磁分离，去除离心管中的溶液，接着再次重复步骤(6)一次后进行步骤(7)；
buffer D溶液为70％的乙醇。
buffer C和buffer D则可以对RNA进行漂洗，以降低RNA中其他物质的残留度。
(7)将离心管在室温中静置，直至离心管中的乙醇挥发干净；
(8)向离心管中加入70μl RNase-Free ddH2O并振荡混匀，水浴加热后进行磁分离，将水溶液转入新的离心管中，即得RNA溶液；
水浴温度为56℃；水浴时间为7min。
实施例4
本实施例为实施例1-3的具体试试过程，并以金黄色葡萄球菌进行实验举例。
金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界，可以引起人和动物的感染。在人体主要寄殖于鼻前庭黏膜、腹股沟、会阴部和新生儿脐带残端等部位，偶尔也寄生于口咽部、皮肤、肠道及阴道口等，是医院感染常见的病原体之一。作为革兰氏阳性菌代表，本实验以金黄色葡萄球菌为模型，验证本发明提供的RNA提取方法在金黄色葡萄球菌中的RNA提取效果。
(1)收集菌体：将培养好的菌液收集1ml置于离心管中，以12000rpm离心1min，仔细去除所有培养基上清。
(2)用含有溶菌酶的EB缓冲液100μl彻底重悬菌体。
(3)加入350μl buffer A，并涡旋振荡混匀，若出现不溶性沉淀，则在12000rpm的转速下离心1min，并将上清转移至另一离心管中；所述bufferA由浓度为3M的异硫氰酸胍、浓度为2M的盐酸胍和1％的β～巯基乙醇组成。
(4)加入350μl buffer B，并使其混合均匀，再加入20μl磁珠溶液，并振荡5min；所述buffer B为异丙醇。
(5)将离心管放入磁力架静置1min，去除离心管中的液体，再加入80μl DNase I，并使其混合均匀，并在室温静置15min，最后加入500μl buffer C并通过振荡混匀，再进行磁分离，以去除离心管中的溶液；所述buffer C溶液由3M盐酸胍和60％无水乙醇组成；
所述DNase I工作液的配制方法为：向新的RNase-Free离心管中分别加入20μlDNase I、8μl 10×DNase I Buffer和52μl RNase-Free ddH2O，轻柔混匀即可。
(6)加入600μl buffer D，并振荡混匀，接着进行磁分离，以去除离心管中的溶液，然后再重复该步骤一次，以确保RNA更加干净；所述buffer D溶液为80％乙醇。
(7)将离心管在室温静置5min，以使得离心管中的乙醇挥发干净。
(8)加入500μl RNase-Free ddH2O并振荡混匀，接着在水浴加热后对其进行磁分离，并将水溶液转入新的离心管中，即得RNA溶液。
吸取4μl RNA溶液进行电泳，结果如图1所示。从图1中可以看出采用本发明所提取的RNA电泳条带明亮，清晰，无因RNA降解而形成的弥散条带。
以上对本发明的具体实施案例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定的实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (7)
1.一种细菌RNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)收集菌体，并将该菌体置于离心管中；
(2)向离心管中加入含有溶菌酶的EB缓冲液50～200μl，以彻底重悬菌体；
(3)向离心管中加入200～600μl buffer A，并通过涡旋振荡混匀；若出现不溶性沉淀则对其进行离心，并将离心后得到的上清液转移至另一离心管中；
(4)向离心管中加入200～600μl buffer B并混匀，接着再加入磁珠溶液，通过振荡混匀；
(5)将离心管放入磁力架静置，然后去除离心管中的液体，并加入DNASE I，接着将其混匀后在室温中静置，最后加入400～700μl buffer C并振荡混匀，接着进行磁分离，以再次去除离心管中的溶液；
(6)向离心管中加入400～700μl buffer D，并振荡混匀，再次进行磁分离，去除离心管中的溶液，接着再次重复步骤(6)一次后进行步骤(7)；
(7)将离心管在室温中静置，直至离心管中的乙醇挥发干净；
(8)向离心管中加入30～100μl RNase-Free ddH2O并振荡混匀，水浴加热后进行磁分离，将水溶液转入新的离心管中，即得RNA溶液。
2.根据权利要求1所述的一种细菌RNA的提取方法，其特征在于：步骤(1)中收集菌体的方法为：首先将菌液置于离心管中并进行离心处理，接着去除所有培养基上清液。
3.根据权利要求2所述的一种细菌RNA的提取方法，其特征在于：步骤(3)中的buffer A包括异硫氰酸胍、盐酸胍和β～巯基乙醇，其中异硫氰酸胍的浓度为1～5M、盐酸胍的浓度为1～5M，β～巯基乙醇的含量为1～5％；所述buffer A中的β～巯基乙醇在使用之前加入；所述离心是以10000～12000rpm的转数离心1min。
4.根据权利要求3所述的一种细菌RNA的提取方法，其特征在于：步骤(4)中的buffer B为异丙醇；且所述的振荡混匀时间为5min。
5.根据权利要求4所述的一种细菌RNA的提取方法，其特征在于：步骤(5)中的离心管放入磁力架静置的时间为1min；加入DNASE I后在室温静置的时间为15min；buffer C溶液由1～5M盐酸胍和40～80％无水乙醇组成。
6.根据权利要求5所述的一种细菌RNA的提取方法，其特征在于：步骤(6)中的buffer D溶液为60～80％的乙醇。
7.根据权利要求6所述的一种细菌RNA的提取方法，其特征在于：步骤(8)中的水浴温度为37℃～95℃；水浴时间为1～10min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20171212 |