CN107099527A - 一种组织dna快速提取试剂盒 - Google Patents

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陈华云
丁渭
肖湘文
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Abstract

本发明公开了一种组织DNA快速提取试剂盒，包括组分有：组织消化液、裂解液、蛋白酶K、结合液、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液。采用的是96孔预分装深孔板模式，可配合中山大学达安基因股份有限公司的核酸自动提取仪smart32，自动提取核酸，可以大量、快速、有效地提取组织DNA。

Description

一种组织DNA快速提取试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种组织DNA快速提取试剂盒，本发明还涉及使用磁珠法提取组织DNA的方法。
背景技术
在现代疾病诊断当中，核酸占据着非常重要的地位，其中DNA的作用更显突出，而血液跟组织则是容易获取的DNA重要来源。但是，组织提取与血液提取相比较而言，采集动物组织操作简单、不需要抗凝剂，便于保存和携带运输。所以组织提取DNA更具优势。不过在PCR分子诊断过程中，获得的DNA的总拷贝数和质量会直接影响到后续检验实验的结果，所以，获得有效、可靠的DNA是PCR分子诊断的关键。
虽然传统的液氮研磨和酚氯仿提取核酸的方法能够获得质量较好的核酸，但是其中用到的化学物质却有着不可忽视的毒性，而且整个提取过程耗时较长，浪费大量的时间和人力物力。进一步来说，现在普及的柱提法核酸提取试剂也能获得质量很好的核酸，毒性也可以忽略，但是耗费的时间之久同样不可忽视。
除去毒性和时间的因素以外，这两种试剂提取核酸的操作当中免不了各种洗涤液的添加和丢弃，这个过程极其容易导致样本之间的交叉污染。当样本量较多的情况下，还容易出错，致使工作效率低下。所以，发明一种快速、高效和操作方便的DNA提取方法势在必行。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种使用便捷、安全、高效、自动化的组织DNA快速提取试剂盒，解决目前市面上同类产品提取效率低、提取耗费时间长以及需要全程手工操作提取等问题。
一种组织DNA快速提取试剂盒，组分包括裂解液、蛋白酶K、结合液、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、组织消化液，提取操作时还需使用组织DNA提取方法以及Smart32自动化提取程序。
优选的，其中裂解液中含有Tris-HCl、异硫氰酸胍、氢氧化钠、Nonidet P 40、EDTA-2Na；结合液含有Tris-HCl、乙醇；洗涤液1含有Tris-HCl、乙醇；洗涤液2中含有CaCl2、乙醇；磁珠洗脱液中含有Tris-HCl、EDTA-2Na；组织消化液含有Tris-HCl、NaCl、SDS。
优选的，所述裂解液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为5~11mmol/L，pH为3.5-4.5；异硫氰酸胍的浓度为5~10mmol/L；氢氧化钠浓度为3~5mmol/L；NP-40的浓度为1%~5%；EDTA-2Na的浓度为2~5mmol/L。
优选的，所述结合液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为2~5mmol/L，pH为5.0-6.0；乙醇的浓度为85~100%。
优选的，所述洗涤液1中各成分分别为：NaCl的浓度为2~5mmol/L、Tris-HCl的浓度为2~5mmol/L，pH为5.0-6.0；无水乙醇的浓度为25%~45%。
优选的，所述洗涤液2中各成分分别为： CaCl2的浓度为2~5mmol/L；无水乙醇的浓度为60%~85%。
优选的，所述洗脱液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为10~30 mmol/L，pH为8.0-8.5；EDTA-2Na的浓度为1~3mmol/L。
优选的，所述组织消化液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为1~3mmol/L，pH为4.0-5.0；NaCl的浓度为5~10mmol/L、SDS的浓度为20~40mmol/L。
优选的，所述试剂盒采用96孔预分装深孔板模式，第1列和第7列预分装的是裂解液；第2列和第8列预分装的是洗涤液1；第3、4列和第9、10列预分装的是洗涤液2；第5列和第11列预分装的是磁珠；第6列和第12列预分装的是洗脱液。
优选的，所述试剂盒采用热封膜工艺进行封装，可有效防止96深孔板中的提取试剂漏液。
优选的，试剂盒可配合市面上的的核酸自动提取仪smart32使用，smart32自动化提取程序如下表：
本发明的有益效果在于：
（1）提高提取效率
与传统柱提法试剂相比，（QIAamp DNA Mini Kit）本试剂盒中含有的裂解液，能够强力快速裂解样本释放大量的DNA，结合液能够快速为磁珠结合核酸提供稳定的环境，大大地增强了提取效率。
（2）缩短提取时间
本试剂盒采用的是96孔预分装深孔板模式，人工操作时间较短，32个样本的提取全程能在40min以内完成，相对于柱提法等传统试剂提取30个左右样本需要至少90分钟的手动操作，大大缩减了提取所需的时间和人力劳动。
（3）自动化程度高，减少人为失误和实验误差
本试剂盒采用的是96孔预分装深孔板模式，配合中山大学达安基因股份有限公司的核酸自动提取仪smart32使用，除加样和加结合液外其他实验操作均由自动化提取程序控制仪器完成，大大解放了人力，并降低了操作中带入的人为失误和误差。
附图说明
图1 为本发明方法提取核酸时使用的96 孔深孔板的俯视图；
图2 为按照本发明方法向96孔深孔板各排中注入试剂的示意图；
具体实施方式
一种组织DNA快速提取试剂盒，组分包括裂解液、蛋白酶K、结合液、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、组织消化液，提取操作时还需使用组织DNA提取方法以及Smart32自动化提取程序。其中裂解液中含有Tris-HCl、异硫氰酸胍、氢氧化钠、Nonidet P 40、EDTA-2Na；结合液含有Tris-HCl、乙醇；洗涤液1含有Tris-HCl、乙醇；洗涤液2中含有CaCl2、乙醇；磁珠洗脱液中含有Tris-HCl、EDTA-2Na；组织消化液含有Tris-HCl、NaCl、SDS。
裂解液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为8mmol/L，pH为4.0；异硫氰酸胍的浓度为6mmol/L；氢氧化钠浓度为4mmol/L；NP-40的浓度为3%；EDTA-2Na的浓度为3mmol/L。
结合液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为3mmol/L，pH为5.5；乙醇的浓度为90%。
洗涤液1中各成分分别为：NaCl的浓度为3mmol/L、Tris-HCl的浓度为3mmol/L，pH为5.5；无水乙醇的浓度为35%。
洗涤液2中各成分分别为： CaCl2的浓度为3mmol/L；无水乙醇的浓度为75%。
洗脱液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为20 mmol/L，pH为8.3；EDTA-2Na的浓度为2mmol/L。
组织消化液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为2mmol/L，pH为4.4；NaCl的浓度为6mmol/L、SDS的浓度为30mmol/L。
试剂盒采用96孔预分装深孔板模式，第1列和第7列预分装的是裂解液；第2列和第8列预分装的是洗涤液1；第3、4列和第9、10列预分装的是洗涤液2；第5列和第11列预分装的是磁珠；第6列和第12列预分装的是洗脱液。
下面结合实施例，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1 一种组织DNA快速提取试剂盒的配制方法：
a.裂解液的配置：先在容量瓶中加入称取的异硫氰酸胍，加入浓度为5~11mmol/L、pH为4.0的Tris-HCl；加入浓度为3~5mmol/L的氢氧化钠；待异硫氰酸胍全溶解后，加入浓度为1%~5%的NP-40和浓度为2~5mmol/L的EDTA-2Na混匀，加入无菌水至所需体积。
b.洗涤液1的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为2~5mmol/L、pH为5.5的Tris-HCl；加入浓度为25%~40%的乙醇；加入浓度为2~5mmol/L的NaCl2混匀，加入无菌水至所需体积。
c.洗涤液2的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为2~5mmol/L的CaCl2；加入浓度为60%~85%的乙醇；混匀，加入无菌水至所需体积。
d.洗脱液的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为10~30mmol/L、pH为8.3的Tris-HCl；加入浓度为1~3mmol/L的EDTA-2Na的；混匀，加入无菌水至所需体积。
e.消化液的配制：先在容量瓶中加入少量无菌水，浓度为1~3mmol/L，pH为4.4的Tris-HCl；加入浓度为5~10mmol/L的Nacl；加入浓度为20~40mmol/L的SDS；混匀，加入无菌水至所需体积。
f.所述结合液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为2~5mmol/L，pH为5.5；乙醇的浓度为85%~100%。
第1列和第7列预分装的是裂解液；第2列和第8列预分装的是洗涤液1；第3、4列和第9、10列预分装的是洗涤液2；第5列和第11列预分装的是磁珠；第6列和第12列预分装的是洗脱液。
e.往96 孔深孔板的第1列和第7列预分装裂解液；第2列和第8列预分装洗涤液1；第3、4列和第9、10列预分装洗涤液2；第5列和第11列预分装磁珠；第6列和第12列预分装洗脱液。
f.封膜：在热封仪上，利用热封仪将96孔板封住。
实施例2 一种组织DNA快速提取试剂盒的使用方法
1：用剪刀切取一小块组织样本（不大于25mg），用剪刀或刀片，将其碎片化，可有效减少消化时间；标本共用剪刀，刀片时，注意避免交叉污染。
2：在1.5ml的无菌离心管内加入组织，180µl的组织消化液，50µl的蛋白酶K。
3：振荡混匀，高速离心10秒，56℃温育，期间不时振荡（可加速组织消化），直至组织块消失，作为待测样本。
4：先将预分装深孔板颠倒混匀后瞬时离心10秒，随后小心撕开封膜，并在其第1列和第7列加入200µl的待测样本。
5：然后按照下面表格在核酸提取仪器上设置提取程序，然后进行核酸的半自动化提取。
6：程序到达第3个步骤时会暂停运行，此时打开仪器舱门，往样本孔（第1列和第7列）中逐孔添加200μl结合液，随后点击“继续运行”。
7：提取程序运行完成后取出预分装深孔板，其中第6列和第12列中的溶液即为核酸溶液。
8：相同样本同步进行QIAamp DNA Mini Kit提取，提取步骤严格按照QIAamp DNA MiniKit提取说明书进行。
9：相同样本消化完成后平均分成两份，进行两种试剂盒间的交叉提取效率比较。
10．提取所得核酸使用核酸浓度测定仪器进行浓度测定，结果如表1所示。
结论：从单一提取试剂配搭不同消化液消化相同的样本检测结果可知，本试剂盒消化液消化后的样本所得核酸比同类试剂消化液消化后提取的核酸浓度高5~10ng/μl，本试剂盒中的组织消化液的消化能力比同类试剂的更强；从相同消化液消化相同的样本搭配不同提取试剂检测结果可知，本试剂盒提取所得核酸比同类型试剂提取所得核酸高约10ng/μl，本试剂盒中的提取能力比同类试剂的更强。
表1
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种组织DNA快速提取试剂盒，其特征在于：组分包括裂解液、蛋白酶K、结合液、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、组织消化液，提取操作时还需使用组织DNA提取方法以及Smart32自动化提取程序。
2.根据权利要求1 所述的一种组织DNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为5~11mmol/L，pH为3.5-4.5；异硫氰酸胍的浓度为5~10mmol/L；氢氧化钠浓度为3~5mmol/L；NP-40的浓度为1%~5%；EDTA-2Na的浓度为2~5mmol/L。
3.根据权利要求1 所述的一种组织DNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述结合液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为2~5mmol/L，pH为5.0-6.0；乙醇的浓度为85%~100%。
4.根据权利要求1 所述的一种组织DNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液1中各成分分别为：NaCl2的浓度为2~5mmol/L、Tris-HCl的浓度为2~5mmol/L，pH为5.0-6.0；无水乙醇的浓度为25%~45%。
5.根据权利要求1 所述的一种组织DNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液2中各成分分别为： CaCl2的浓度为2~5mmol/L；无水乙醇的浓度为60%~85%。
6.根据权利要求1 所述的一种组织DNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为10~30 mmol/L，pH为8.0-8.5；EDTA-2Na的浓度为1~3mmol/L。
7.根据权利要求1 所述的一种组织DNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述组织消化液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为1~3mmol/L，pH为4.0-5.0；NaCl的浓度为5~10mmol/L、SDS的浓度为20~40mmol/L。
8.根据权利要求1~7所述的一种组织DNA快速提取试剂盒，其特征在于，本发明试剂盒所用试剂成分为无毒性或低毒性试剂。
9.根据权利要求1 所述的一种组织DNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用96孔预分装深孔板模式，第1列和第7列预分装的是裂解液；第2列和第8列预分装的是洗涤液1；第3、4列和第9、10列预分装的是洗涤液2；第5列和第11列预分装的是磁珠；第6列和第12列预分装的是洗脱液。
10.根据权利要求1 所述的一种组织DNA快速提取试剂盒，其特征在于，试剂盒可配合试剂盒可配合市面上的的核酸自动提取仪smart32使用，smart32自动化提取程序如下表：
。 2
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