JP3803935B2 - 真菌細胞dnaの抽出、増幅および逐次ハイブリッド形成、並びに臨床物質中における真菌細胞の検出法 - Google Patents
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Description
このような方法は実務から知られており、適切な栄養培地で臨床物質からの真菌種の培養に通常基づいている。
同定の速度および感度は、特に真菌種の遅い増殖のために、例えばペトリ皿での培養と、増殖したりまたはしなかったりするコロニーに基づく検出により、かなり影響される。このため、侵襲性真菌感染は臓器の極端に複雑な生検により、または患者の死亡後に診断できるだけである。
真菌細胞の検出方法における関心は、特にここ数年にわたり、真菌病原体が重要な院内病原体として免疫抑制患者にとって非常に重要になってきた、という事実に関連させてみられるにちがいない。侵襲性真菌感染は、骨髄移植(BMT)後に、肝臓、腎臓、膵臓と心臓または心-肺移植後でも、著しく増加した。1994年に、例えばFrench BMTセンターで感染、特にAspergillus感染が次第に増加して、数か月にわたりこれらのセンターの閉鎖を招いた。
臓器移植患者の他にも、特に化学療法または手術後のがん患者、火傷した患者、並びに外科および新生児集中治療室の患者は、侵襲性真菌病原体により次第に侵襲されていく。1つの臓器系または更にいくつかの臓器系がこれらの患者群で侵襲されると、これら感染合併症の死亡率は80〜100%に高まる。
治療の成功は、このような場合に、早期診断だけで改善されることがある。上記標準検出方法に伴う欠点のために、全身真菌感染の早期で安全な診断を行える集中的試みがあった。
分子生物学法に基づく新規技術が、いくつか他の病原体による感染症のより高感度の診断と、ひいてはある程度より早期の検出および治療とを既に実現させたが、これは真菌病原体についてはなお不可能であった。
しかしながら、文献″Detection of various fungal pathogens in blood samples″in: EBMT 1995,Vol.15,Suppl.2,March 1995,Abstract Book,Abstract 432,P.103では、血中でいくつかの真菌病原体を同定するためにPCR法を用いる真菌遺伝子のDNAセグメントの増幅について既に記載している。種特異性オリゴヌクレオチドとの追加ハイブリッド形成によれば、様々な真菌株間の識別も可能であった。
分子生物学技術を用いた真菌感染の検出に際して最も重要な問題は、真菌細胞壁の非常に複雑な組成に起因しており、そのため時間のかかる高価な抽出方法が今までに必要であった。
別な問題は真菌種の数の増加が免疫抑制患者で危険な感染を引き起こしうるという事実であり、これらの患者において全範囲の異なる真菌種および株の記録および検出が必要となっている。治療法は様々な真菌種で異なるため、すべての真菌種を記録するだけでなく、これらの種を識別して同定することも必要である。
上記からみて、真菌感染の早期診断を行うために上記方法を改善することが本発明の目的である。
その方法はできるだけ迅速かつ容易であるべきであり、できるだけ多くの真菌種を記録すべきであり、しかも開発の別な段階でこれらを同定することができるべきである。
本発明に従って見い出された臨床物質で真菌病原体を検出するための方法は、下記工程を含む:
1)全血からの真菌DNAの抽出;および
2)抽出された真菌DNAの検出
臨床物質から真菌種の伝統的培養をやめて、真菌DNA自体に向かうことにより、真菌特異性DNAの検出から高感度で真菌感染の非常に早期な検出を行える方法が開発された。検出はDNAレベルで行えるため、少くとも部分的に高感度で確立された迅速な方法が使用でき、感度および速度に関して既知方法よりも大きな利点を生じる。真菌DNAの放出および精製は、高感度を保証して迅速な診断を行う上で、迅速なだけでなくほぼ完全にかつ比較的純粋にも行なえねばならないことが想起されるべきである。
更に、新規方法はいくつかの真菌種に感度があり、しかも真菌種は最少の可能な操作工程で同定されるべきである。
この追加目的は、操作工程2)に加えてまたはその代わりに行われる下記操作工程を介して、前記の新規方法で達成される:
3)抽出された真菌DNAからの真菌種の決定。
この方法は、例えば既知の配列決定方法が使用できるために、特定の真菌感染がDNAレベルで非常に迅速に行われて、高い特異性を示せる、という別の利点を有している。
いくつかの問題が新規方法の個別工程で克服されなければならない。その一部は真菌細胞壁の組成と、多数の真菌細胞が全血中でフリーに溶解されずに、食作用後にいくつかの血液細胞群、特に顆粒球およびマクロファージに存在するという事実に基づく。
このため、本方法の独立した第一工程、即ち全血から真菌DNAの抽出も本出願の目的である。この方法は患者で真菌感染を検出する上で診断学上有利に使用できるが、真菌DNAが他の別な処理のために必要とされる場合はいつでも用いることができる。
例えば新規方法を用いると、真菌DNAは問題の真菌種で特に感染した動物の血液から抽出することができる。DNAプローブはこの手法で得られた真菌DNAから切り出されて、その後検出反応に用いられるかまたはプラスミドにクローニングされる。基本リサーチ、診断、治療、工業遺伝子テクノロジーなどの全分野にわたる適用が考えられる。
真菌DNAの抽出プロセスでは、全血中で非常に少量の真菌でさえも確実に真菌DNAを抽出することができるはずである。更に、本方法のこの工程では迅速かつ容易に行えるはずで、そのため熟練者により病院における日常の作業に用いることができる。
この目的は、全血から真菌DNAを抽出する工程が:
1)全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離;および
2)単離された真菌細胞からDNAの抽出
の工程を含む本発明に従い達成される。
本発明の目的はこの手法で完全に達成される。新規方法は、第一工程で全血からの真菌細胞の単離と、第二工程でこれらの単離真菌細胞からDNAの抽出からなる2段階から構成されていて、こうして抽出されたDNAは真菌感染を検出して、必要であれば同定するために用いられる。この2段階プロセスではとりわけ特異性を改善するが、その理由は干渉する他のDNAがその方法の第二工程にほんの少量でしか存在しないためである。
その方法が下記操作工程:
a1)全血中における血液細胞の分解;
a2)細胞DNAからのほぼ無傷の真菌細胞の単離
b1)単離された真菌細胞の分解;および
b2)真菌DNAの単離
を含むならば、好ましい。
これは細胞DNAから真菌DNAの非常に迅速で安全な分離を行える。細胞DNAは全血中で血液細胞の溶解によりこの初期溶液中に放出されるため、それまでに先の分解プロセスで分解されなかったかまたは少くとも完全には分解されなかった真菌細胞は、迅速で容易なプロセス、例えば遠心により遊離細胞DNAから分離できる。この手法で単離された真菌細胞のその後の溶解に際して、溶液中には細胞DNAが全く存在しないかまたはわずかな量で存在するだけであると仮定してもさしつかえない。工程a1)における血液細胞の分解は、真菌細胞までが溶解されないように行われねばならない。真菌細胞壁は血液細胞の細胞壁よりもかなり複雑であるため、これは適切で慎重な分解プロセスにより保証することができる。
操作工程a1)は別な利点、即ち非常に少量の真菌が特に診断目的のためになお全血から抽出できるように、全細胞に捕捉された真菌を放出させるという利点を有している。新規な方法では、少くともいくつかの真菌細胞が全血中でフリーに溶解される必要性はもはやなく、いくつかの真菌細胞が食作用後も例えば顆粒球またはマクロファージ中に存在していれば十分である。
下記工程が工程a)で行われるならば好ましい:
a1.1)浸透溶血による赤血球の溶解;
a1.2)白血球の酵素分解;および
a2.1)この手法で処理された全血の遠心と、次の操作工程でペレットの使用
ここの利点は、血液細胞が工程a1.1)およびa1.2)で確実に溶解されていながら、真菌細胞自体はなお損傷をうけていないことである。その後の遠心では、一方で血液細胞の放出された細胞DNAおよび細胞フラグメントと、他方でなおそっくりそのままな真菌細胞との、非常に安全な分離を保証している。これは、真菌DNAがペレット中の真菌細胞中になお存在しているために、真菌DNAが失われないことも保証している。要約すると、前記工程の利点は、一方で最少濃度の真菌細胞さえも検出できて、他方で単離された真菌DNAがせいぜいわずかな細胞DNAで汚染されているにすぎないことであり、真菌対細胞DNAの比率が真菌DNAの方に有意に改善されたために、後の診断工程で高い感度および特異性を発揮する。
別な開発では、下記工程が工程b)で行われるならば好ましい:
b1.1)真菌細胞のアルカリ溶解および酵素処理。
この単純な操作工程は操作工程a2.1)でペレットから回収された真菌細胞の安全な分解を行えることが示された。
工程a1.1)における赤血球の溶解が、好ましくは約10mM Tris pH7.6、5mM MgCl2および10mM NaClの最終濃度で低張液を用いて行われて、工程a1.2)における白血球の酵素消化が、200μg/mlプロテイナーゼK、10mM Tris pH7.6、10mM EDTA pH8.0、50mM NaClおよび0.2% SDSの最終濃度を有する溶液で行われるならば、更に好ましい。
別な開発において、工程a1.2)からの溶液は60〜70℃、好ましくは65℃で100〜140分間、好ましくは120分間にわたりインキュベートされる。
この手法で血液細胞は真菌細胞を損傷させずに確実かつ完全に分解できるため、これらの操作工程後に、溶液中でフリーな真菌細胞と、初期血液中で食細胞に捕捉された真菌細胞とは、双方とも、比較的未損傷のままであり、それらのDNAを失わずに遠心により分離できることがわかった。
工程b1.1)が下記工程からなるならば、更に好ましい:
-50mM NaOH含有溶液中において、90〜98℃、好ましくは95℃で5〜15分間、好ましくは10分間にわたる、工程a2.1)からのペレット中に存在する真菌細胞のインキュベート
-1M Tris-HCl pH7.0による中和
-30〜40℃、好ましくは37℃で50〜70分間、好ましくは60分間にわたるザイモリアーゼでの酵素処理
-60〜70℃、好ましくは65℃で10〜30分間、好ましくは20分間にわたるTris/EDTAとのインキュベートによるタンパク質変性。
これらの操作工程は、真菌細胞の安全な分解と、その後で真菌DNAの完全放出を行うため、真菌DNAは溶解状態にあり、真菌細胞の細胞フラグメントから単離できることがわかった。
この関係において、工程b2)が下記工程を含むならば、好ましい:
-5M酢酸カリウムによるタンパク質沈降、および
-氷冷イソプロパノール中で上澄のDNA沈降。
これらの操作工程は実施が非常に容易であり、タンパク質は最初に酢酸カリウムを加えることにより沈降され、その後上澄が取り出されて、DNAが沈降されるように氷冷イソプロパノールと混合される。沈降したDNAは、別な操作工程に、即ち真菌感染を検出および同定するために用いることができる。
今までに記載された操作をまとめると、第一の利点は、真菌種が通常それらのDNAに基づき検出されて、その後特異的に同定できることである。真菌DNAは全血から直接抽出されず、むしろ最初は検出の感度および特異性を改善するために細胞DNAから真菌細胞の分離である。換言すれば、非常にわずかな真菌細胞が全血中に存在するだけならば、これから抽出された非常に少量の真菌DNAが非常に高濃度で存在する細胞DNAのバックグラウンドに対して検出されたことになり、そのため上記された分離は感度の点で大きな利点になる。
新規方法の別な利点は、全血の血液細胞が真菌細胞を損傷させずに最初に分解されるため、これらが溶解状態にあるかまたは食細胞に捕捉されているかにかかわらず、食細胞に捕捉された真菌細胞も検出目的に利用できることである。真菌細胞は細胞DNAから真菌細胞の分離後に分解されて、血液細胞の細胞残渣を残すだけである。ここで用いられる方法は、やや複雑な真菌細胞壁にもかかわらず、真菌DNAに損傷のない完全な分解を保証する。
上記方法を行うキットも本発明の目的である。このようなキットには上記操作工程に必要なすべての基本溶液セットを含有させることができる。しかしながら、検査室には通常みられないそれらの基本溶液のみをこのキットに入れることも可能であり、例えばTris緩衝液は使い捨てできるが、少くともプロテイナーゼKおよびザイモリアーゼがキットに存在している。
独立したまたは上記方法の第一工程と組み合わされた本方法の第二工程、即ち抽出された真菌DNAの検出も、本出願の目的である。検出される真菌DNAは、上記のように抽出および単離されることがここでは好ましい。しかしながら、適切な密度勾配遠心、DNAプローブとの特異的沈降工程などにより真菌DNAを得ることも可能である。
これらすべての場合において、真菌DNAが更に使用のためにその初期溶液中に実際に存在しているかどうか調べることが望ましい。
真菌DNAは真菌感染の診断に有利に使用できるが、それとは異なって用いることもできる。真菌DNAは、寒天プレートから、または問題の真菌種に特に感染した動物の血液から得られる。DNAプローブはこの手法で得られた真菌DNAから開裂されて、その後で検出反応に用いられるか、またはプラスミドにクローニングされる。基本リサーチ、診断、治療、工業遺伝子テクノロジーなどの全分野にわたる適用が考えられる。
新規検出工程では単一プロセスで初期溶液中に低濃度であってもいくつかの異なる真菌種の記録を行えるはずであり、そのため非常に迅速にかつ診断の早期段階で真菌感染があるかどうかに答えることが可能である。更に、新規操作は迅速かつ容易に行えるはずであり、そのため熟練者により病院において日常の作業に用いることができる。
その目的は、抽出された真菌DNAを検出する工程が下記工程:
c)単離された真菌DNAの少くとも1つのセグメントの増幅;および
d)増幅産物の検出
を含む本発明に従い達成される。
少量の単離されたDNAであっても最初に増幅されて、その後検出できる、いくつかの標準方法がある。これらの方法は高度に特異的で非常に高感度であるため、それらは診断、治療、工業遺伝子テクノロジーなどで望ましい特徴を発揮する。更に、これらの方法は熟練者により行える。
増幅はPCR、クローニング、DNA依存性DNAポリメラーゼなどにより行って、検出はゲル電気泳動、光学密度、核酸と特異的に結合するマーカーでの染色などにより行える。
別な開発では、増幅はいくつか異なる真菌種のDNA、好ましくは18ssu-rRNAに関する真菌遺伝子と結合する2つのプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により行われる。
ここでの利点は、単純でこうして確立された方法が容易に検出される適量のDNAを作るために使用できるが、そのDNAは対応真菌種を同定するためにも更に使用できることである。
配列番号1および配列番号2のヌクレオチド配列が工程c)でプライマーとして用いられるならば、好ましい。
本出願の発明者は、これら2種のヌクレオチド配列が様々な臨床的に関連した真菌種についてのプライマーとして用いられることを、意外にも発見した。PCR反応でこれら2種のプライマーの使用は約500塩基対の鎖長を有する増幅産物を作り出し、それらがゲル電気泳動により容易に検出できることから、更に処理していくことが容易である。こうして、2種のプライマー配列が様々な真菌DNAと結合することがわかったため、すべての病原性真菌種について同一の検出方法が存在するのである。
ポリメラーゼ連鎖反応が下記サイクル:
c1)90〜96℃、好ましくは94℃で0.3〜1分間、好ましくは0.5分間の変性;
c2)58〜64℃、好ましくは62℃で0.5〜1.5分間、好ましくは1分間のハイブリッド形成;
c3)68〜75℃、好ましくは72℃で1.5〜2.5分間、好ましくは2分間の伸長
で行われるならば、好ましい。
90〜96℃、好ましくは94℃で5〜9分間、好ましくは3分間の変性工程がサイクル工程の開始前に行われるならば、好ましい。
PCRは上記条件下で非常に再現性があり、特に高度に特異性であることがわかり、そのため増幅産物は実際にオリジナル真菌DNAのフラグメントであることが保証される。
工程d)において、増幅産物は好ましくはアガロースゲル上でゲル電気泳動により検出されて、好ましくは臭化エチジウムで染色されるならば、更に好ましい。
この利点は、真菌感染を示す増幅産物が実際にPCR反応により生産されることを示すために、既知の確立された検出法が用いられることである。
18ssu-rRNAに関する真菌遺伝子からのDNA配列が増幅されるならば、更に好ましい。
本出願の発明者は、一方ですべての真菌株および種に同一のプライマーに対する2つの結合領域と隣接した特異的配列セグメントをこの真菌遺伝子が様々な真菌株および種で示すが、他方でこのセグメントの配列が個別の真菌種および株を検出するために使用できる程度に様々な真菌株および種で異なることを発見した。
本発明は、配列番号1および配列番号2のヌクレオチド配列に更に関する。これら2つのヌクレオチド配列が真菌DNAのセグメントを増幅させるために用いられるならば、好ましい。
本発明は試験溶液中で真菌DNAを検出するためのキットにも関し、そのキットはいくつかの真菌種のDNAと結合するポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーを含有している。キットはプライマーとして配列番号1および配列番号2のヌクレオチド配列を含有していることが好ましい。
本発明は上記方法を行うためのキットにも関する。
このようなキットの利点は、すべての必要な溶液と、特に必要なプライマーが一緒にされるため、それらがルーチン操作で使用できることである。このため、これらの新規キットは、試験溶液中で真菌種を検出するために、毎日の検査室作業で用いることができる。更に、このキットは証明された真菌種のあるセグメントを増幅させるために使用でき、これは例えば更に同定プロセスに用いることができる。
上記方法の第一および第二工程と組み合わされたまたは独立した本方法の第三工程、即ち抽出および検出された真菌DNAを用いる真菌種の同定も、本出願の目的である。
種の真菌同定は診断目的に迅速かつ容易に行えるはずで、そのため熟練者により病院における日常の作業に用いることができる。
この目的は、下記工程が行われるかぎり、本発明に従い達成される:
e)真菌種を特徴付ける、試験溶液中に含有されたDNAのヌクレオチド配列セクションの同定。
検出プロセスはDNAレベルで行われるため、真菌DNAのあるセグメントが同定されれば十分であるが、但しこれらのセグメントは各真菌種に特異的でなければならない。標準方法は、増幅産物の少くとも一部を配列決定して、二本鎖の融解性質などを研究することにより使用できる。
これらの方法は通常迅速かつ容易に行えるため、それらも熟練者により行える。
真菌DNAまたは真菌DNAのセグメントが工程e)で所定の真菌株および/または種に特異的なDNAプローブとハイブリッド形成されて、成功したハイブリッド形成の試験が真菌種の同定につながるならば、好ましい。
この利点は、非常に速くて簡単なハイブリッド形成プロセスが同定に用いられることである。各真菌種に特異的であるため、これら真菌種の増幅セグメントと排他的に結合する特異的プローブが用いられる。このようなプロセスはゲル上で行われ、例えばハイブリッドは染色により示される。もう1つの別なプロセスは、一本鎖および二本鎖領域の光学的に異なる性質、例えば光学密度、二色性または類似特徴を活用することからなる。
プローブが成功したハイブリッド形成の試験のためにジゴキシゲニンで標識されて、ハイブリッドが例えばサザンブロット法を用いて検出されるならば、更に好ましい。
プローブ自体が、好ましくは視覚的に検出可能な色素反応により、周知の方法を用いて、ハイブリッド形成後にハイブリッドの形成を示す対応マーカーと共に既に準備されていれば、この工程はそのプロセスを更に簡略化する。
配列番号3〜配列番号8のヌクレオチド配列のうち1以上がDNAプローブとして用いられ、そのDNAプローブが好ましくは配列配列番号3、配列番号8、
配列番号6、配列番号7、配列番号4および配列番号5の順序で用いられて、各ハイブリッド形成が試験されるならば、好ましい。
個別の真菌種は逐次ハイブリッド形成によりそれらの頻度の順序で試験され、そのため検出プロセスを有意に速めることができる。
本発明は、配列番号3〜配列番号8のヌクレオチド配列にも更に関する。
本発明は、真菌種を同定する上で、DNAプローブとしてこれらヌクレオチド配列の1以上の使用にも更に関する。
ここでの利点は、6つの特定されたヌクレオチド配列がすべての臨床的に関連した真菌種間で特異的に識別できることである。
配列番号3のヌクレオチド配列は真菌種Candida albicansを検出し、配列番号4のヌクレオチド配列はCandida glabrataを検出し、配列番号5のヌクレオチド配列はCandida kruseiを検出し、配列番号6のヌクレオチド配列はCandida tropicalisを検出し、配列番号7のヌクレオチド配列はCandida parapsilosisを検出し、配列番号8のヌクレオチド配列はAspergillus株に属する真菌種、特にA.fumigatus、A.flavus、A.versiculor、A.niger、A.nidulansおよびA.terreusを検出する。
本発明は、各真菌種のDNAの特異的ヌクレオチド配列セクションとハイブリッド形成するDNAプローブを含有した、真菌種を同定するためのキットにも更に関する。そのキットは、DNAプローブとして、配列番号3〜配列番号8のヌクレオチド配列のうち1以上を含有していることが好ましい。
本発明は、上記方法を行うためのキットにも更に関する。
この利点は、このようなキットにDNAプローブだけかまたは更に適切な追加溶液を準備しておけることであり、そのため毎日の検査室作業に必要なすべての一次溶液などがこのキットから直接取り出せる。これは各真菌種の検出または同定を著しく簡略化するが、それは個別の一次溶液が検査室でもはや別々に作らなくてよいからである。しかしながら、プローブだけか、できればこのキットでポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーおよび酵素/一次溶液とを含有させることも可能であり、そのためこれとは別に標準一次溶液が使用できる。
有利な手法で上記工程を組み込んだ全血中における真菌細胞の検出方法は、下記工程を含む:
-全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離
-単離された真菌細胞からのDNAの抽出
-単離された真菌DNAの少くとも1つのセグメント、好ましくは18ssu-rRNAに関する真菌遺伝子の少くとも1つのセグメントの増幅
-yes/no決定による増幅産物の検出、および
-所定の真菌株および/または種に特異的なDNAプローブと増幅産物をハイブリッド形成させることによる、それらから個別の真菌種への特定。
この要約された方法の主要利点の1つは、増幅産物が真菌種の決定のためyes/no決定に更に用いられるように、真菌DNAのセグメント、好ましくは18ssu-rRNAに関する真菌遺伝子のセグメントを増幅させる増幅工程が、1回だけですむことである。本出願の発明者は、18ssu-rRNAに関する真菌遺伝子が、一方で対象となるすべての真菌種に同一である2つのプライマー、他方で様々な真菌種で異なるアンプリコンと少くとも部分的に隣接していて、そのためそれが真菌種に特徴的な異なるプローブとハイブリッド形成できることを発見した。
したがって、単一の増幅工程があれば、真菌感染が本当にあるのかどうかという質問に答えて、どんな真菌種が関与しているかという質問に答える上で十分である。したがって、その方法は極端に簡単であり、実施しやすく、専門知識は不要であるため、熟練者でさえも実施することができる。
別な利点は以下の記載から得られる。
上記特徴と下記で説明される特徴は、特定の組合せだけでなく、他の組合せまたは単独でも、本発明の範囲から逸脱せずに用いることができると理解されている。
個別操作工程の性能の例と、臨床試験プログラムのプログラム範囲内における方法の使用が、以下の記載に示されている。
新規方法の具体的利点は、それが全血を用いて行われる、即ち生検が不要であり、最初に作られねばならない血清が用いられないという事実である。真菌細胞は全血中で細胞DNAから最初に分離される。これは非常に少量で存在するだけかもしれない真菌DNAに必要であり、かなり高濃度の細胞DNAのバックグラウンドに対して検出する必要はない。これは検出方法の特異性も増加させる。この目的のため、赤血球が最初に浸透溶血により溶解され、その後白血球が酵素消化される。これら2つの操作工程は、真菌細胞自体がなお損傷をうけずに、食細胞に捕捉された真菌細胞が損傷をうけずに放出されて、その後の検出にも利用しうるように選択される。
例1:浸透溶血による赤血球の溶解
赤血球の溶解は低張液を用いて行う。下記最終濃度を有した下記緩衝液を用いる:
Tris pH7.6 10mM
MgCl2 5mM
NaCl 10mM
溶液は室温で10分間インキュベートして、その後遠心する。
全血3mlの量があれば第一工程に十分である。
例2:白血球の酵素消化
真菌細胞を含んでいるかもしれない白血球は、下記最終濃度を有する下記緩衝液中において、Boehringer Mannheimから得たプロテイナーゼK(20μg/ml)でその細胞を酵素消化させることにより慎重に分解させ、その中に例1のペレットを再懸濁させる:
Tris pH7.6 10mM
EDTA pH8.0 10mM
NaCl 50mM
SDS 0.2%
プロテイナーゼK 200μg/ml
この緩衝液は65℃で2時間インキュベートする。
例3:細胞DNAからのほぼ無傷の真菌細胞の分離
血液細胞が例1および2で説明されたように分解されて、細胞DNAが放出されてから、遠心を5000rpmで行うと、細胞DNAはこの遠心速度で沈降しないため、そのDNAをかなり取ることができる。
沈降物はすべての遊離または放出真菌細胞を含有しており、それを更なる処理のために緩衝液(Aqua bidest)に再懸濁させる。
例4:真菌細胞の分解
真菌細胞をアルカリ中で溶解させ、酵素処理して、真菌DNAを放出させる。
最初に、アルカリ溶解は95℃で10分間にわたり50mM NaOH 200mlを用いて行う。
この工程の後に、1M Tris-HCl pH7.0を用いて中和工程を続ける。
次いでSigmaのザイモリアーゼ500μl(300μg/ml)を加え、溶液を37℃で60分間インキュベートして、真菌細胞を酵素消化させる。
次いでTris/EDTA500μlおよび10%SDS溶液50μlを加え、溶液を65℃で20分間インキュベートして、タンパク質を変性させる。
例5:真菌DNAの単離
真菌細胞残渣と、次に単離されねばならない遊離真菌DNAとが、この溶液中に存在している。
最初に、タンパク質沈降を5M酢酸カリウムを用いて行い、その後上澄を除去して、DNAは氷冷イソプロパノールを加えることにより沈降させる。次いで沈降産物を別な操作工程に用いる。
例1〜5に記載された操作工程では、全血から高い選択的手法で真菌DNAの抽出を行うが、これは沈降物として利用できて、細胞DNAでやや汚染されているだけであるため、下記検出が非常に高感度でかつ高い特異性で行える。
例6:真菌特異性DNAセグメントの増幅
この操作工程では、真菌DNAが例5の操作工程から得られた沈降物中に本当に存在しているかどうかが最初に示される。この工程では、配列リストに配列番号1および配列番号2として示されたDNA配列が、多数の真菌株および種の18ssu-rRNAに関する真菌遺伝子上の結合部位と特異的に結合する、という事実を利用している。
本出願の発明者は、一方ですべての真菌株および種に同一のプライマーに対する2つの結合領域と隣接した特異的配列セグメントをこの真菌遺伝子が様々な真菌株および種で示し、他方でこのセグメントの配列が個別の真菌種および株を検出するために使用できる程度に様々な真菌株および種で異なることを発見した。
配列番号1のDNA配列はセンス鎖と結合するが、配列番号2のDNA配列はアンチセンス鎖と結合して、2つの結合部位間の距離は約500塩基対である。そのためこれら2つのDNA配列配列番号1および配列番号2はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)用のプライマーとして適しており、鎖長約500塩基対の増幅産物(アンプリコン)の生産を行う。
プライマーの位置および各アンプリコンの鎖長は下記表1に示されている。
2つのプライマー配列番号1および配列番号2を用いて、CandidaおよびAspergillus株のすべての関連真菌種に関して約500塩基対のアンプリコンの十分量の生産がPCR操作で得られる。
PCR条件は下記のとおりである:
緩衝液(50μl):
10mM Tris pH9.6
50mM NaCl
10mM MgCl2
0.2mg/ml BSA
ポリメラーゼ
各0.5mMヌクレオチド
各100pMプライマー
初期変性:94℃で3分間
サイクル変性:94℃で0.5分間
アニーリング:62℃で1分間
伸長:72℃で2分間
末端伸長:72℃で5分間
サイクルの数:34
緩衝液中で高いマグネシウム濃度はポリメラーゼの高い特異性を可能として、これは伸長工程に72℃のその至適温度で取り扱える。
Candida albicans40株、Candida tropicalis10株、Candida parapsilosis6株、Candida glabrata11株、Candida krusei8株、Aspergillus fumigatus8株、Aspergillus flavus6株、Aspergillus terreus5株、Aspergillus niger7株、Aspergillus nidulans5株およびAspergillus versiculor3株を、これらのプライマーで首尾よく増幅させることができた。
例7:例6からの増幅産物の検出
次の工程では、鎖長約500塩基対のDNAセグメントが例6でPCR反応中に実際に増幅されるかどうかが示される。真菌特異性DNAセグメントの検出は、2%アガロースゲルで特異的バンドの臭化エチジウム染色により行う。
特異的バンドがここで検出されたら、配列番号1および配列番号2のプライマーがすべての前記真菌株と結合しているために、真菌感染と考えられる。このため、真菌DNAが例1〜5の操作工程中に抽出されていれば、それは臭化エチジウム染色により検出できる程度まで例6のPCR工程により増幅される。
例8:個別真菌種における例6からの増幅産物の分類
工程7で既に証明された真菌感染は、次いで具体的な治療にもっと正確に特定されねばならない。例6からのPCR工程の別な利点がここで明らかになってくる。十分な真菌特異性DNAセグメントを、真菌種の決定に関する別な検出法のために生産した。
配列リストに掲載された配列番号3〜配列番号8のヌクレオチド配列をここで用いる。これらは例6で生産されたDNAセグメントの配列セクションと特異的にハイブリッド形成する種特異性プローブとして働く。
配列番号3のプローブはCandida albicansと、配列番号4のプローブはCandida glabrataと、配列番号5のプローブはCandida kruseiと、配列番号6のプローブはCandida tropicalisと、配列番号7のプローブはCandida parapsilosisと、配列番号8のプローブはAspergillus fumigatus、A.flavus、A.versiculor、A.niger、A.nidulansおよびA.terreusとハイブリッド形成することがわかった。このため、配列番号8のヌクレオチド配列は全般的Aspergillusプローブであるが、配列番号3〜配列番号5のヌクレオチド配列はCandida株の真菌種間で識別することができる。
成功したハイブリッド形成を証明できるように、プローブはBoehringer Mannheimからのトランスフェラーゼキットで標識して、検出は既知の発色反応を用いてサザンブロット法に従い行う。
個別真菌種の頻度に従い段階的に逐次ハイブリッド形成をこれらのプローブで行い、ハイブリッド形成は配列番号3(C.albicans)から始めて、その後配列番号8(Aspergillus)、配列番号6(C.tropicalis)、配列番号7は(C.parapsilosis)、配列番号4(C.glabrata)、最後に配列番号5(C.krusei)と行う。
こうして、工程例6で生産された増幅産物に従い真菌種を同定して、その後具体的な治療を開始することが可能である。
例9:血液中に散在する真菌細胞の検出
特異的増幅および逐次ハイブリッド形成の助けにより、真菌細胞1〜3個の感度で真菌種をうまく検出することが可能であった。血液サンプル中における真菌種の散在から、前記方法はいわゆる1CFU(コロニー形成単位)/ml血液の感度に達することが証明できた。この検出限界は血液中で臨床上関連した真菌散在について予想されるよりもかなり下である。
例10:臨床試験のプログラム
臨床試験の大規模プログラムでは、新規方法の高感度が健常試験者65例からの血液サンプル165例の分析に際して示すことができた。165例すべての血液サンプルは陰性のままであった。
次いで不明瞭な発熱の免疫抑制患者94例を真菌感染の存在について試験した。侵襲性真菌感染を有しない患者65例中、200例以上の血液サンプル(例外1例は別にして)も陰性であった。
他方、侵襲性真菌感染を有する25例すべての患者は、第一週目以内に既に陽性であると判定できた。更に、原因となる真菌病原体はすべての患者で分類することができた。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
ハイポセティカル:YES
アンチセンス:NO
配列
配列番号:2
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
ハイポセティカル:YES
アンチセンス:NO
配列
配列番号:3
配列の長さ:30
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
ハイポセティカル:YES
アンチセンス:NO
配列
配列番号:4
配列の長さ:30
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
ハイポセティカル:YES
アンチセンス:NO
配列
配列番号:5
配列の長さ:30
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
ハイポセティカル:YES
アンチセンス:NO
配列
配列番号:6
配列の長さ:30
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
ハイポセティカル:YES
アンチセンス:NO
配列
配列番号:7
配列の長さ:30
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
ハイポセティカル:YES
アンチセンス:NO
配列
配列番号:8
配列の長さ:30
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
ハイポセティカル:YES
アンチセンス:NO
配列
Claims (16)
- a)全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離;
b)b1)単離された真菌細胞の分解;および
b2)真菌DNAの単離
による、単離された真菌細胞からのDNAの抽出;
の工程を含み、
工程a)が更に
a1)全血中に含有される血液細胞の分解;
a2)細胞DNAからのほぼ無傷の真菌細胞の単離
の工程を含み、
工程b1)がb1.1)真菌細胞のアルカリ溶解および酵素処理の工程を含む、全血から真菌DNAの抽出による臨床物質中における真菌DNAの検出方法。 - 工程a)が更に
a1.1)浸透溶血による赤血球の溶解;
a1.2)白血球の酵素消化;および
a2.1)この手法で処理された全血の遠心と、次の操作工程でペレットの使用
の工程を含む、請求項1に記載の方法。 - 工程a1.1)において赤血球の溶解が、10mM Tris pH7.6、5mM MgCl2および10mM NaClの最終濃度で、低張液および界面活性剤を用いて行われる、請求項2に記載の方法。
- 工程a1.2)において白血球の酵素消化が、200μg/mlプロテイナーゼK、10mM Tris pH7.6、10mM EDTA pH8.0、50mM NaClおよび0.2% SDSの最終濃度の溶液で行われる、請求項2または3に記載の方法。
- 白血球の酵素消化に用いられる溶液が60〜70℃で100〜140分間にわたりインキュベートされる、請求項4に記載の方法。
- 工程b1.1)が
-50mM NaOH含有溶液中において、90〜95℃で5〜15分間にわたる、工程a2.1)からのペレット中に存在する真菌細胞のインキュベート
-1M Tris-HCl pH7.0による中和
-30〜40℃で50〜70分間にわたるザイモリアーゼでの酵素処理
-60〜70℃で10〜30分間にわたるTris/EDTAとのインキュベートによるタンパク質変性
の工程を含む、請求項5に記載の方法。 - 工程b2)が
-5M酢酸カリウムによるタンパク質沈降、および
-氷冷イソプロパノール中で上澄のDNA沈降
の工程を含む、請求項6に記載の方法。 - c)ポリメラーゼ連鎖反応による、検出される真菌DNAの少くとも1つのセグメントの増幅;および
d)増幅産物の検出
の工程を含み、
工程c)において、配列番号1および配列番号2のヌクレオチド配列がプライマーとして用いられる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の試験溶液中における真菌細胞の検出方法。 - 工程c)において、ポリメラーゼ連鎖反応が下記サイクル:
c1)90〜96℃で0.3〜1分間の変性;
c2)58〜64℃で0.5〜1.5分間のハイブリッド形成;
c3)68〜75℃で1.5〜2.5分間の伸長
で行われる、請求項8に記載の方法。 - 90〜96℃で3〜9分間の変性工程がサイクル工程の開始前に行われる、請求項9に記載の方法。
- 工程d)において、増幅産物がゲル電気泳動を用いて検出されて、染色される、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 下記追加工程:
e)真菌種に特徴的である、試験溶液中に含有されたDNAのヌクレオチド配列セグメントの決定
を含み、
工程e)において、工程c)により既に増幅された真菌DNAまたは真菌DNAセグメントを、ある真菌株および/または種に特異的なDNAプローブとハイブリッド形成させ、成功したハイブリッド形成の試験により真菌種を同定し、配列番号3〜配列番号8の1以上のヌクレオチド配列がDNAプローブとして用いられる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の真菌種の同定方法。 - プローブがジオキシゲニンで標識され、ハイブリッドが成功するハイブリッド形成の試験のために例えばサザンブロット法により検出される、請求項12に記載の方法。
- DNAプローブが順番に用いられて、各ハイブリッド形成が試験される、請求項12または13に記載の方法。
- DNAプローブが、下記順序:配列番号3、配列番号8、配列番号6、配列番号7、配列番号4および配列番号5で連続順に用いられて、各ハイブリッド形成が試験される、請求項12または13に記載の方法。
- -全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離
-単離された真菌細胞からDNAの抽出
-配列番号1および2のヌクレオチド配列を用いる、抽出された真菌DNAの少くとも1つのセグメント(これは18ssu-rRNAに関する真菌遺伝子のセグメントである)の増幅
-yes/no決定による増幅産物の検出、および
-DNAプローブとしてヌクレオチド配列配列番号3〜8の1以上とのハイブリッド形成による、単一真菌種についての増幅産物の分類
の工程を含む、全血中における真菌細胞の検出方法。
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