JP3447302B2 - 臨床試料における耐性菌細胞の検出法 - Google Patents
臨床試料における耐性菌細胞の検出法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、臨床試料における耐性菌細胞の検出法に関
する。
する。
菌細胞検出法における全般的な興味は、特に近年、免
疫抑制患者において、菌種が院内病原体として極めて重
大なものとなってきたという点から考慮しなければなら
ない。
疫抑制患者において、菌種が院内病原体として極めて重
大なものとなってきたという点から考慮しなければなら
ない。
これまでに公知の菌感染分析のための方法は、主とし
て菌感染の診断および病原性菌種の同定を可能にするこ
とを目的としている。これは、例えば適切な栄養培地上
ので臨床試料由来の菌種の培養、および分子生物学的方
法の使用により行われる。
て菌感染の診断および病原性菌種の同定を可能にするこ
とを目的としている。これは、例えば適切な栄養培地上
ので臨床試料由来の菌種の培養、および分子生物学的方
法の使用により行われる。
医学上最も重要な任意病原性菌類の中には、不完全菌
属に属するカンジダ属がある。これはカンジダ症とも呼
ばれる、いわゆるカンジダ菌症を引き起こす。カンジダ
属の中で最も重要な病原体はカンジダ・アルビカンス
（Candida albicans）種であり、これは通常あまり重症
にはならない皮膚および粘膜の感染ばかりでなく、深在
性臓器菌症または全身性菌症を引き起こす。「全身性菌
症」とは、皮膚または粘膜ばかりでなく、さらに臓器、
臓器系、またそれどころか生体全体を冒す菌感染を意味
すると理解される。後者の場合、「全身性」菌感染とい
う用語もまた使用される。
属に属するカンジダ属がある。これはカンジダ症とも呼
ばれる、いわゆるカンジダ菌症を引き起こす。カンジダ
属の中で最も重要な病原体はカンジダ・アルビカンス
（Candida albicans）種であり、これは通常あまり重症
にはならない皮膚および粘膜の感染ばかりでなく、深在
性臓器菌症または全身性菌症を引き起こす。「全身性菌
症」とは、皮膚または粘膜ばかりでなく、さらに臓器、
臓器系、またそれどころか生体全体を冒す菌感染を意味
すると理解される。後者の場合、「全身性」菌感染とい
う用語もまた使用される。
全身性菌症における病原体の検出は極めて不確実であ
り、実際には、しばしば死後にのみ行われる。分子生物
学的分析法はここで実質的進歩を遂げてきた：それらに
より、菌感染の迅速かつ確実な検出、および種々の菌種
の互いの識別が可能となる。
り、実際には、しばしば死後にのみ行われる。分子生物
学的分析法はここで実質的進歩を遂げてきた：それらに
より、菌感染の迅速かつ確実な検出、および種々の菌種
の互いの識別が可能となる。
Niesters et al.（1993）,Journal of Clinical Micr
obiology,pp.904−910,「カンジダ種のための、迅速
な、ポリメラーゼ鎖反応に基づく同定分析」という文献
には、種々のカンジダ種の検出および識別が可能なポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく方法が記載されてい
る。
obiology,pp.904−910,「カンジダ種のための、迅速
な、ポリメラーゼ鎖反応に基づく同定分析」という文献
には、種々のカンジダ種の検出および識別が可能なポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく方法が記載されてい
る。
この方法では、まず、臨床試料から菌特異的核酸を抽
出し、次いで、さらなる分析を行う。分析は、18ssuRNA
遺伝子領域の詳細な検査により行う。これは、PCRによ
る、この遺伝子領域のセグメントの増幅のために適切な
プライマーを使用することにより行われ；その結果得ら
れるPCR生成物は、制限酵素を用いて配列決定する、分
析する、または特異的ハイブリダイゼーションプローブ
とハイブリダイズする。後者の場合、ハイブリダイゼー
ションプローブは、放射性ヌクレオチドを組み込むこと
により標識し、オートラジオグラフィーにより検出す
る。次いで、配列決定、制限パターン、またはハイブリ
ダイゼーションパターンに基づき、種々のカンジダ種を
互いに識別する。
出し、次いで、さらなる分析を行う。分析は、18ssuRNA
遺伝子領域の詳細な検査により行う。これは、PCRによ
る、この遺伝子領域のセグメントの増幅のために適切な
プライマーを使用することにより行われ；その結果得ら
れるPCR生成物は、制限酵素を用いて配列決定する、分
析する、または特異的ハイブリダイゼーションプローブ
とハイブリダイズする。後者の場合、ハイブリダイゼー
ションプローブは、放射性ヌクレオチドを組み込むこと
により標識し、オートラジオグラフィーにより検出す
る。次いで、配列決定、制限パターン、またはハイブリ
ダイゼーションパターンに基づき、種々のカンジダ種を
互いに識別する。
カンジダ・アルビカンス感染の診断が可能なさらなる
方法は、Buchman et al.（1990）,Surgery 108,pp.338
−347による公表、「In vitroDNA増幅による外科的病原
体の検出。PartI.菌特異的遺伝子のin vitro増幅による
カンジダ・アルビカンスの迅速な同定法」に記載されて
いる。
方法は、Buchman et al.（1990）,Surgery 108,pp.338
−347による公表、「In vitroDNA増幅による外科的病原
体の検出。PartI.菌特異的遺伝子のin vitro増幅による
カンジダ・アルビカンスの迅速な同定法」に記載されて
いる。
この方法により、カンジダ・アルビカンス感染の検出
は、種々の菌特異的遺伝子領域、すなわち酵素14−α−
ラノステロールデメチラーゼの遺伝子のPCR増幅により
達成される。
は、種々の菌特異的遺伝子領域、すなわち酵素14−α−
ラノステロールデメチラーゼの遺伝子のPCR増幅により
達成される。
このPCR生成物は、この場合、ハイブリダイゼーショ
ンによるだけでなく、アガロースゲルでの分離および臭
化エチジウムによるDNA染色によっても検出される。
ンによるだけでなく、アガロースゲルでの分離および臭
化エチジウムによるDNA染色によっても検出される。
前記の２つの方法では、Niesters et al.の公表に記
載されたように、分子生物学的技術を用いて、患者試料
における菌感染を検出し、さらに種々のカンジダ属の種
を互いに識別する。
載されたように、分子生物学的技術を用いて、患者試料
における菌感染を検出し、さらに種々のカンジダ属の種
を互いに識別する。
ひとたび全身性菌感染が検出されれば、種々の抗菌
薬、すなわち菌の増殖を阻害する薬剤を用いて中和する
ことができる。全身適用に有効な成分としては、アゾー
ル誘導体、ポリエンアンホテリシンＢ、フルシトシン、
グリセオフルビンおよびタービナフィンがある。通常使
用される抗菌薬は、例えばフルコナゾールを含むアゾー
ル誘導体である。
薬、すなわち菌の増殖を阻害する薬剤を用いて中和する
ことができる。全身適用に有効な成分としては、アゾー
ル誘導体、ポリエンアンホテリシンＢ、フルシトシン、
グリセオフルビンおよびタービナフィンがある。通常使
用される抗菌薬は、例えばフルコナゾールを含むアゾー
ル誘導体である。
このクラスの抗菌薬の頻繁な使用は、最近、これらの
治療薬ではその増殖がもはや阻害できない耐性菌株の発
達をもたらした。しかしながら、その全身性菌症に対す
る優れた効果に加え、他の抗菌薬とは対照的に、軽い、
さらには無害の副作用しか引き起こさないため、この薬
剤の使用を完全にやめることはできない。このような状
況のおける重大な問題は、耐性菌細胞の存在を決定する
ための迅速な試験が利用できないため、この種の耐性が
早期に検出できないということである。
治療薬ではその増殖がもはや阻害できない耐性菌株の発
達をもたらした。しかしながら、その全身性菌症に対す
る優れた効果に加え、他の抗菌薬とは対照的に、軽い、
さらには無害の副作用しか引き起こさないため、この薬
剤の使用を完全にやめることはできない。このような状
況のおける重大な問題は、耐性菌細胞の存在を決定する
ための迅速な試験が利用できないため、この種の耐性が
早期に検出できないということである。
従って、アゾール誘導体が最初に「選択薬」として用
いられ；高用量かつ長期治療にもかかわらず、患者に好
転の兆しが見られない場合にはじめて、その患者はアゾ
ール誘導体に耐性を持つ菌細胞に感染していると結論づ
けることが可能である。しかしながら、このような特定
の症例には有効でないアゾール誘導体での治療にもかか
わらず、患者における感染の経過に劇的な変化が起こる
まで、このような診断がなされないことがしばしばであ
る。
いられ；高用量かつ長期治療にもかかわらず、患者に好
転の兆しが見られない場合にはじめて、その患者はアゾ
ール誘導体に耐性を持つ菌細胞に感染していると結論づ
けることが可能である。しかしながら、このような特定
の症例には有効でないアゾール誘導体での治療にもかか
わらず、患者における感染の経過に劇的な変化が起こる
まで、このような診断がなされないことがしばしばであ
る。
前記の観点から、本発明の目的は、アゾール誘導体耐
性菌細胞を特異的に検出できる、迅速かつ確実な方法を
創出することである。
性菌細胞を特異的に検出できる、迅速かつ確実な方法を
創出することである。
本発明によれば、この目的は以下の工程：
ａ）臨床試料からの菌特異的核酸の抽出；および
ｂ）菌特異的核酸と、アゾール誘導体耐性菌細胞の核酸
セグメントに向けられるハイブリダイゼーションプロー
ブとのハイブリダイゼーション を有する方法により達成される。
セグメントに向けられるハイブリダイゼーションプロー
ブとのハイブリダイゼーション を有する方法により達成される。
アゾール誘導体感受性菌細胞由来ではなく、アゾール
誘導体耐性菌細胞由来の核酸セグメントを特異的に検出
するハイブリダイゼーションプローブを用いて菌特異的
核酸をハイブリダイズすることにより、耐性菌株の検出
が、いまや迅速、再現可能かつ容易に実施できる分子生
物学的方法が利用できるようになった。これにより、検
出は、迅速かつ微量の臨床試料を基に達成できる。陽性
所見が得られた場合、すなわち耐性菌株が存在する場
合、菌感染が最終的に中和される、異なる抗菌薬に変更
することができる。
誘導体耐性菌細胞由来の核酸セグメントを特異的に検出
するハイブリダイゼーションプローブを用いて菌特異的
核酸をハイブリダイズすることにより、耐性菌株の検出
が、いまや迅速、再現可能かつ容易に実施できる分子生
物学的方法が利用できるようになった。これにより、検
出は、迅速かつ微量の臨床試料を基に達成できる。陽性
所見が得られた場合、すなわち耐性菌株が存在する場
合、菌感染が最終的に中和される、異なる抗菌薬に変更
することができる。
この方法のためには、菌特異的核酸を、好ましくは血
液からだけでなく、生検試料、痰、粘膜スワブ、または
他の患者試料から抽出することができる。
液からだけでなく、生検試料、痰、粘膜スワブ、または
他の患者試料から抽出することができる。
菌特異的DNAまたはRNAのいずれかを単離することが可
能であり；次いでそれをDNA/DNA、DNA/RNAまたはRNA/RN
Aハイブリダイゼーションにより検出する。
能であり；次いでそれをDNA/DNA、DNA/RNAまたはRNA/RN
Aハイブリダイゼーションにより検出する。
溶液中または固形担体、例えば膜またはカラムでのハ
イブリダイゼーションを検出することができ；使用する
ハイブリダイゼーションプローブは放射性または非放射
性標識し、次いで、特異的ハイブリダイゼーションをオ
ートラジオグラフィーまたは酵素が触媒する呈色反応に
より検出する。
イブリダイゼーションを検出することができ；使用する
ハイブリダイゼーションプローブは放射性または非放射
性標識し、次いで、特異的ハイブリダイゼーションをオ
ートラジオグラフィーまたは酵素が触媒する呈色反応に
より検出する。
これにより、本発明の目的は完全に達成される。
本発明の方法の場合、ハイブリダイゼーションプロー
ブを14−α−ラノシトールデメチラーゼ遺伝子由来のDN
Aセグメントに対して向けることが好ましい。
ブを14−α−ラノシトールデメチラーゼ遺伝子由来のDN
Aセグメントに対して向けることが好ましい。
これは、本出願の発明者らが、アゾール誘導体に対す
る耐性を表す菌種において、菌DNAのこの遺伝子領域に
突然変異が起こり、これが意外にもアゾール誘導体耐性
の臨床所見および微生物学的所見と極めて重要な様式で
相関していることを証明できたからである。
る耐性を表す菌種において、菌DNAのこの遺伝子領域に
突然変異が起こり、これが意外にもアゾール誘導体耐性
の臨床所見および微生物学的所見と極めて重要な様式で
相関していることを証明できたからである。
この相関の可能な説明は、アゾール誘導体は菌におけ
るエルゴステロール合成を阻害するという認識に基づい
ている。エルゴステロールは、菌細胞壁の内部に付着す
るリン脂質層である、いわゆる原形質膜に包埋されてい
るステロイドである。エルゴステロールは、細胞内で前
駆体であるラノステロールから合成される。ラノステロ
ールからエルゴステロールを合成する決定的な工程は、
14−DMと略記される酵素、14−α−ラノステロールデメ
チラーゼにより触媒される。
るエルゴステロール合成を阻害するという認識に基づい
ている。エルゴステロールは、菌細胞壁の内部に付着す
るリン脂質層である、いわゆる原形質膜に包埋されてい
るステロイドである。エルゴステロールは、細胞内で前
駆体であるラノステロールから合成される。ラノステロ
ールからエルゴステロールを合成する決定的な工程は、
14−DMと略記される酵素、14−α−ラノステロールデメ
チラーゼにより触媒される。
エルゴステロールは原形質膜の不可欠な構成要素であ
るため、エルゴステロール不在下では細胞分裂は起こり
得ない。細胞分裂には、細胞壁および原形質膜の継続的
な合成が必要である。
るため、エルゴステロール不在下では細胞分裂は起こり
得ない。細胞分裂には、細胞壁および原形質膜の継続的
な合成が必要である。
ステロイドエルゴステロールが菌では特異的に生じる
が、ヒト細胞または細菌においては生じないことから、
菌感染の中和のために菌細胞の増殖に不可欠なエルゴス
テロール合成の阻害を首尾よく使用することができる。
が、ヒト細胞または細菌においては生じないことから、
菌感染の中和のために菌細胞の増殖に不可欠なエルゴス
テロール合成の阻害を首尾よく使用することができる。
従って、本発明の方法の有利な点は、アゾール誘導体
により直接攻撃されるタンパク質をコードする遺伝子に
対して、ハイブリダイゼーションプローブが使用される
ことである。耐性菌細胞では、この遺伝子において核酸
配列の変化がしばしば起こる。次いで、特異的ハイブリ
ダイゼーションプローブは、これらの配列変化を検出す
るように、すなわちアゾール誘導体に耐性を示す菌細胞
の遺伝子セグメントにのみ結合するように設計される。
により直接攻撃されるタンパク質をコードする遺伝子に
対して、ハイブリダイゼーションプローブが使用される
ことである。耐性菌細胞では、この遺伝子において核酸
配列の変化がしばしば起こる。次いで、特異的ハイブリ
ダイゼーションプローブは、これらの配列変化を検出す
るように、すなわちアゾール誘導体に耐性を示す菌細胞
の遺伝子セグメントにのみ結合するように設計される。
さらにこの方法において、ハイブリダイゼーションプ
ローブがカンジダ・アルビカンス種の14−α−ラノステ
ロールデメチラーゼ遺伝子由来のDNAセグメントに対し
て向けられることが好ましい。カンジダ・アルビカンス
では、この遺伝子はまたERG16遺伝子とも呼ばれる。
ローブがカンジダ・アルビカンス種の14−α−ラノステ
ロールデメチラーゼ遺伝子由来のDNAセグメントに対し
て向けられることが好ましい。カンジダ・アルビカンス
では、この遺伝子はまたERG16遺伝子とも呼ばれる。
本明細書において、ハイブリダイゼーションプローブ
が、最も一般的な病原性菌種、すなわちカンジダ・アル
ビカンスの耐性菌株の診断を可能にすることが有利であ
る。
が、最も一般的な病原性菌種、すなわちカンジダ・アル
ビカンスの耐性菌株の診断を可能にすることが有利であ
る。
本発明の方法の改良法では、14−α−ラノステロール
デメチラーゼ遺伝子のセグメントを増幅するPCR反応を
工程ａ）およびｂ）の間に行う。
デメチラーゼ遺伝子のセグメントを増幅するPCR反応を
工程ａ）およびｂ）の間に行う。
このようにこの特性は、必要とされる遺伝子セグメン
トのみを特異的に含有する大量の開始試料が作製される
ので、本法が感受性および特異性の双方を得るという利
点を有する。次いで、PCRにより増幅された試料を例え
ばサザンハイブリダイゼーションに使用する。
トのみを特異的に含有する大量の開始試料が作製される
ので、本法が感受性および特異性の双方を得るという利
点を有する。次いで、PCRにより増幅された試料を例え
ばサザンハイブリダイゼーションに使用する。
本発明の方法の改良法では、PCR反応におけるプライ
マーとして、配列番号１および配列番号２のヌクレオチ
ド配列、または配列番号３および配列番号４のヌクレオ
チド配列を用いることが好ましい。
マーとして、配列番号１および配列番号２のヌクレオチ
ド配列、または配列番号３および配列番号４のヌクレオ
チド配列を用いることが好ましい。
本明細書において、発明者が認識しているように、こ
れらのプライマー対を用いて耐性菌種の特徴的なDNA配
列を含むDNAセグメントを増幅できることが有利であ
る。得られる増幅生成物は、完全な遺伝子よりもかなり
短く、従って、次の工程をより簡単にすることができ
る。
れらのプライマー対を用いて耐性菌種の特徴的なDNA配
列を含むDNAセグメントを増幅できることが有利であ
る。得られる増幅生成物は、完全な遺伝子よりもかなり
短く、従って、次の工程をより簡単にすることができ
る。
本発明の方法では、さらに、配列番号５〜８の１以上
のヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションプローブ
として工程ｂ）で使用することが好ましい。
のヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションプローブ
として工程ｂ）で使用することが好ましい。
これは、本出願の発明者が、驚くべきことに、各場合
においてその耐性がERG16遺伝子のただ１つの塩基置換
に起因する耐性カンジダ種と、この突然変異を示さない
感受性株を識別するために、これらのハイブリダイゼー
ションプローブを使用できることを認識しているからで
ある。
においてその耐性がERG16遺伝子のただ１つの塩基置換
に起因する耐性カンジダ種と、この突然変異を示さない
感受性株を識別するために、これらのハイブリダイゼー
ションプローブを使用できることを認識しているからで
ある。
有利な具体例では、工程ｂ）でハイブリダイゼーショ
ンプローブをジゴキシゲニンで標識し、サザンハイブリ
ダイゼーションに使用する。次いで、呈色反応を触媒す
る酵素と複合体を形成している抗ジゴキシゲニン抗体に
より、特異的ハイブリダイゼーションの検出を達成す
る。
ンプローブをジゴキシゲニンで標識し、サザンハイブリ
ダイゼーションに使用する。次いで、呈色反応を触媒す
る酵素と複合体を形成している抗ジゴキシゲニン抗体に
より、特異的ハイブリダイゼーションの検出を達成す
る。
ここでの利点は、ハイブリダイゼーションプローブの
標識が放射活性により達成される必要はないことであ
る。それに加えて、大量のハイブリダイゼーションプロ
ーブが同時に標識できる；さらに、これらは長期間安定
なので、アリコートに分け−20℃で保存できる。その
後、同じ標識反応から得られたアリコートを解凍して個
々の検出反応に使用することができ、かくして長期間に
わたる良好な再現性が保証される。
標識が放射活性により達成される必要はないことであ
る。それに加えて、大量のハイブリダイゼーションプロ
ーブが同時に標識できる；さらに、これらは長期間安定
なので、アリコートに分け−20℃で保存できる。その
後、同じ標識反応から得られたアリコートを解凍して個
々の検出反応に使用することができ、かくして長期間に
わたる良好な再現性が保証される。
もちろん、放射活性標識法および、例えばビオチンに
よる標識のような他の非放射活性標識法もまた使用でき
る。
よる標識のような他の非放射活性標識法もまた使用でき
る。
サザンハイブリダイゼーション法では、分析される核
酸が、例えばマイクロセルロースまたはナイロン膜のよ
うな膜に迅速に塗布できることは有利である。本明細書
における最も迅速な方法は、当業者によく知られている
「ブロット−ブロット」または「ドット−ブロット」法
である。
酸が、例えばマイクロセルロースまたはナイロン膜のよ
うな膜に迅速に塗布できることは有利である。本明細書
における最も迅速な方法は、当業者によく知られている
「ブロット−ブロット」または「ドット−ブロット」法
である。
しかしながら、まず分析されるDNAをアガロースゲル
上で分離し、次いでそれを膜上へ転移するだけというこ
ともまた可能である。
上で分離し、次いでそれを膜上へ転移するだけというこ
ともまた可能である。
菌DNAはサザンハイブリダイゼーションにおいて、直
接、または先のPCR増幅の後に用いることができる。
接、または先のPCR増幅の後に用いることができる。
しかしながら、菌特異的RNAを分析することもまた可
能であることも理解される。これらは菌細胞の細胞質か
ら直接単離するもできるし、または逆転写によって作製
することもできる。次いで、ノーザンブロットまたは他
のRNA検出反応を用いて分析を行うことができる。
能であることも理解される。これらは菌細胞の細胞質か
ら直接単離するもできるし、または逆転写によって作製
することもできる。次いで、ノーザンブロットまたは他
のRNA検出反応を用いて分析を行うことができる。
例えば、サザンまたはノーザンハイブリダイゼーショ
ンの場合のように、ハイブリダイゼーションを膜上で行
う必要はなく、溶液中もしくはカラム上でも実施でき
る。
ンの場合のように、ハイブリダイゼーションを膜上で行
う必要はなく、溶液中もしくはカラム上でも実施でき
る。
もし核酸配列配列番号４〜８を有するハイブリダイゼ
ーションプローブを、工程ｂ）で用いるのであれば、ハ
イブリダイゼーション後、用いた特定のハイブリダイゼ
ーションプローブの融解温度（Tm）より約１℃低い温度
にて、洗浄工程を行うことが望ましい。
ーションプローブを、工程ｂ）で用いるのであれば、ハ
イブリダイゼーション後、用いた特定のハイブリダイゼ
ーションプローブの融解温度（Tm）より約１℃低い温度
にて、洗浄工程を行うことが望ましい。
ここでの有利な点は、この洗浄工程では、比較的高温
度のためにいかなる誤対合も示さないそれらの二本鎖領
域のみが安定であるということである。このように、そ
のDNA配列が対応する菌DNAセグメントとは完全には適合
しない対合ハイブリダイゼーションプローブは総て、こ
の洗浄工程で洗い去られ、それゆえ、検出反応における
シグナルはもはや生じない。このように、もし菌DNA
が、突然変異を含む耐性菌細胞に由来する場合にだけ、
シグナルが得られる。
度のためにいかなる誤対合も示さないそれらの二本鎖領
域のみが安定であるということである。このように、そ
のDNA配列が対応する菌DNAセグメントとは完全には適合
しない対合ハイブリダイゼーションプローブは総て、こ
の洗浄工程で洗い去られ、それゆえ、検出反応における
シグナルはもはや生じない。このように、もし菌DNA
が、突然変異を含む耐性菌細胞に由来する場合にだけ、
シグナルが得られる。
それゆえ、このように特異的ハイブリダイゼーション
プローブを用いて、ただ１つの塩基により互いに異なる
遺伝子セグメントを識別することが可能である。
プローブを用いて、ただ１つの塩基により互いに異なる
遺伝子セグメントを識別することが可能である。
本発明はさらに、配列番号１〜８のヌクレオチド配列
に関する。
に関する。
本明細書では、配列番号１および２のヌクレオチド配
列を、PCR反応用プライマーとして用い、かつ、配列番
号５および／または６のヌクレオチド配列を、アゾール
誘導体耐性菌細胞の検出法においてハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして用いれば好ましい。
列を、PCR反応用プライマーとして用い、かつ、配列番
号５および／または６のヌクレオチド配列を、アゾール
誘導体耐性菌細胞の検出法においてハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして用いれば好ましい。
本発明の方法において、配列番号３および４のヌクレ
オチド配列をプライマーとして用い、かつ、配列番号７
または８のヌクレオチド配列をハイブリダイゼーション
プローブとして用いれば、それもまた望ましい。
オチド配列をプライマーとして用い、かつ、配列番号７
または８のヌクレオチド配列をハイブリダイゼーション
プローブとして用いれば、それもまた望ましい。
この特徴で有利な点は、そのポリメラーゼ連鎖反応に
より、300〜400塩基対を含む簡単に取扱える多量のDNA
断片が初めて困難なく利用可能になるということであ
り、さらに、それらのPCR断片に存在すると考えられる
塩基置換をハイブリダイゼーションプローブを用いて同
定できるということである。
より、300〜400塩基対を含む簡単に取扱える多量のDNA
断片が初めて困難なく利用可能になるということであ
り、さらに、それらのPCR断片に存在すると考えられる
塩基置換をハイブリダイゼーションプローブを用いて同
定できるということである。
具体的には、本出願の発明者らは、アゾール誘導体感
受性菌株と比較して、アゾール誘導体耐性菌株では、別
個の塩基置換が多数生じるということを証明することに
成功した。例えば、ERG遺伝子のＴからＧへの塩基置換
は、酵素14−DMの105番のアミノ酸であるフェニルアラ
ニンをロイシンへと変異させる。このT/G置換は、配列
番号５のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーシ
ョンプローブを用い、遺伝子レベルで検出できる。発明
者らは、耐性菌株でＡからＣへの塩基置換が起こり、こ
れが142番のアミノ酸であるグルタミンをプロリンへと
変異させることができることもまた認識している。この
変異は、配列番号６のヌクレオチド配列を有するハイブ
リダイゼーションプローブを用いて検出できる。双方と
もＧからＡへのさらに２つの塩基置換もまた見出され
た。これらは、14−DMの464番のグリシンをセリンへと
変異させ、また488番のバリンをイソロイシンへと変異
させる。これらの２つの点突然変異は、各々配列番号７
および８のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼー
ションプローブを用いて検出される。
受性菌株と比較して、アゾール誘導体耐性菌株では、別
個の塩基置換が多数生じるということを証明することに
成功した。例えば、ERG遺伝子のＴからＧへの塩基置換
は、酵素14−DMの105番のアミノ酸であるフェニルアラ
ニンをロイシンへと変異させる。このT/G置換は、配列
番号５のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーシ
ョンプローブを用い、遺伝子レベルで検出できる。発明
者らは、耐性菌株でＡからＣへの塩基置換が起こり、こ
れが142番のアミノ酸であるグルタミンをプロリンへと
変異させることができることもまた認識している。この
変異は、配列番号６のヌクレオチド配列を有するハイブ
リダイゼーションプローブを用いて検出できる。双方と
もＧからＡへのさらに２つの塩基置換もまた見出され
た。これらは、14−DMの464番のグリシンをセリンへと
変異させ、また488番のバリンをイソロイシンへと変異
させる。これらの２つの点突然変異は、各々配列番号７
および８のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼー
ションプローブを用いて検出される。
耐性菌株は、特に増幅されたPCR断片上に１またはい
くつかの塩基置換を含むため、その対応するハイブリダ
イゼーションプローブが、同時にサザンハイブリダイゼ
ーションに使用されれば有利である。さらに、あらゆる
場合において、陽性シグナルが耐性菌種が存在すること
を示す。もしハイブリダイゼーションが、ただ１つのハ
イブリダイゼーションプローブを用いて行われるのであ
れば、この耐性菌株でどの変異が起こるのか、また１ま
たは数種の変異が存在するかどうかを検出することがで
きる。
くつかの塩基置換を含むため、その対応するハイブリダ
イゼーションプローブが、同時にサザンハイブリダイゼ
ーションに使用されれば有利である。さらに、あらゆる
場合において、陽性シグナルが耐性菌種が存在すること
を示す。もしハイブリダイゼーションが、ただ１つのハ
イブリダイゼーションプローブを用いて行われるのであ
れば、この耐性菌株でどの変異が起こるのか、また１ま
たは数種の変異が存在するかどうかを検出することがで
きる。
しかしながら、配列番号１および４のヌクレオチド配
列をプライマーとして組み合わせることも可能であり、
さらにその結果、増幅された約1,400塩基対のPCR断片
が、配列番号５〜８のヌクレオチド配列を有するハイブ
リダイゼーションプローブを用いて検出可能なあらゆる
変異を含むことが理解される。
列をプライマーとして組み合わせることも可能であり、
さらにその結果、増幅された約1,400塩基対のPCR断片
が、配列番号５〜８のヌクレオチド配列を有するハイブ
リダイゼーションプローブを用いて検出可能なあらゆる
変異を含むことが理解される。
さらに本発明は、アゾール誘導体耐性菌株による菌感
染の分析用のキットに関し、このキットには配列番号１
〜８のヌクレオチド配列の１以上が含まれる。
染の分析用のキットに関し、このキットには配列番号１
〜８のヌクレオチド配列の１以上が含まれる。
この方法を実施する実験室自身が、プライマーおよび
ハイブリダイゼーションプローブを作製する必要がない
ので、この種のキットには、特に迅速かつ簡便ににこの
方法を実施できるという利点がある。
ハイブリダイゼーションプローブを作製する必要がない
ので、この種のキットには、特に迅速かつ簡便ににこの
方法を実施できるという利点がある。
このキットはまた、ポリメラーゼ連鎖反応およびハイ
ブリダイゼーションを行うために必要な総ての溶液を含
む。これにより、熟練していない技術者によるルーチン
実験室においてさえ、本発明の方法を行うことができ
る。もし多くの反応に必要な総ての物質がこのキットで
提供されるのであれば、この方法はさらに、時間を消費
する調製なしに高度な再現性をもって迅速に行うことが
可能である。
ブリダイゼーションを行うために必要な総ての溶液を含
む。これにより、熟練していない技術者によるルーチン
実験室においてさえ、本発明の方法を行うことができ
る。もし多くの反応に必要な総ての物質がこのキットで
提供されるのであれば、この方法はさらに、時間を消費
する調製なしに高度な再現性をもって迅速に行うことが
可能である。
さらなる利点は下記の説明から明らかである。
本発明の範囲を逸脱することなく、前記の特徴および
以下に説明する特徴は、示した各々の組み合わせだけで
なく、他の組み合わせまたは単独においても用いること
ができることが理解されよう。
以下に説明する特徴は、示した各々の組み合わせだけで
なく、他の組み合わせまたは単独においても用いること
ができることが理解されよう。
以下、この方法の個々の工程を行う実施例を説明す
る。
る。
実施例1:カンジダ・アルビカンス株の培養
耐性および感受性カンジダ・アルビカンス株の分析、
および比較のため、患者試料または酵母サンプルを、Sa
bouraudグルコース寒天、酵母培養用に用いられる標準
培地上で、30℃にて48時間インキュベートする。次い
で、いくつかのコロニーを採取し、無菌の0.9％塩化ナ
トリウム溶液に入れる。
および比較のため、患者試料または酵母サンプルを、Sa
bouraudグルコース寒天、酵母培養用に用いられる標準
培地上で、30℃にて48時間インキュベートする。次い
で、いくつかのコロニーを採取し、無菌の0.9％塩化ナ
トリウム溶液に入れる。
実施例2:菌細胞の分解および菌DNAの単離
菌細胞をアルカリ溶解（50mM NaOH、10分、95℃）、
次いで中和およびザイモラーゼ（Zymolase）（Sigma）
での酵素処理により分解する。このタンパク質を、Tris
/EDTAおよび10％SDS溶液中で65℃にて変性させる。
次いで中和およびザイモラーゼ（Zymolase）（Sigma）
での酵素処理により分解する。このタンパク質を、Tris
/EDTAおよび10％SDS溶液中で65℃にて変性させる。
得られた溶液は、遊離菌DNAのみならず菌細胞片を含
み、ここでそれを単離しなければならない。
み、ここでそれを単離しなければならない。
これを、まず5M酢酸カリウムを用いたタンパク質沈
降、次いで氷冷イソプロパノールの添加によるDNA沈降
により行う。この沈降生成物を次の処理工程に用いる。
降、次いで氷冷イソプロパノールの添加によるDNA沈降
により行う。この沈降生成物を次の処理工程に用いる。
実施例3:ERG16遺伝子由来のDNA断片の増幅
PCR反応の目的は、まず特異的ハイブリダイゼーショ
ンプローブが結合するERG16遺伝子のセグメントを増幅
することである。ERG16遺伝子は全長1,851塩基対を有し
ており、これによりPCRによって容易に増幅され得る、
取扱いの容易なセグメントに細分される。
ンプローブが結合するERG16遺伝子のセグメントを増幅
することである。ERG16遺伝子は全長1,851塩基対を有し
ており、これによりPCRによって容易に増幅され得る、
取扱いの容易なセグメントに細分される。
配列番号５および／または６のDNA配列をハイブリダ
イゼーションプローブとして用いるのであれば、配列番
号１（上流プライマー）および２（下流プライマー）の
ヌクレオチド配列を有するプライマーを用いてPCRを行
う。
イゼーションプローブとして用いるのであれば、配列番
号１（上流プライマー）および２（下流プライマー）の
ヌクレオチド配列を有するプライマーを用いてPCRを行
う。
次いで、前記プライマーは、ERG16遺伝子の塩基379〜
塩基676の領域、すなわち約300塩基対を含んでなるPCR
生成物を生じる。
塩基676の領域、すなわち約300塩基対を含んでなるPCR
生成物を生じる。
配列番号７および／または８のDNA配列をハイブリダ
イゼーションプローブとして用いるのであれば、PCRに
は配列番号３（上流プライマー）および４（下流プライ
マー）のヌクレオチド配列を用いる。
イゼーションプローブとして用いるのであれば、PCRに
は配列番号３（上流プライマー）および４（下流プライ
マー）のヌクレオチド配列を用いる。
これらのプライマーは、ERG16遺伝子の塩基1360〜塩
基1774の領域、すなわち約400塩基対の断片を増幅す
る。
基1774の領域、すなわち約400塩基対の断片を増幅す
る。
PCR条件は下記のとおりである：
緩衝液（50μｌ）：
10mM Tris（pH9.6）
50mM NaCl
10mM MgCl2
0.2mg/ml BSA
ポリメラーゼ
0.5mMの各ヌクレオチド
100pMの各プライマー
初期変性 94℃にて３分
循環変性 94℃にて0.5分
アニーリング:62℃にて１分
伸長:72℃にて２分
末端伸長:72℃にて５分
サイクル数:34
緩衝液中の高濃度のマグネシウムが、ポリメラーゼに
対する高い特異性を保証し、このポリメラーゼは、伸長
工程ではその至適温度72℃で取り扱うことができる。
対する高い特異性を保証し、このポリメラーゼは、伸長
工程ではその至適温度72℃で取り扱うことができる。
PCR反応は十分に大量な開始物質をもたらし、その結
果、さらなる分析を行って、DNAが耐性または感受性菌
細胞のいずれに由来するかの決定することができる。
果、さらなる分析を行って、DNAが耐性または感受性菌
細胞のいずれに由来するかの決定することができる。
ERG16遺伝子上のプライマーおよびハイブリダイゼー
ションプローブの位置を、「詳細な説明」の末尾の表Ｉ
に示す。
ションプローブの位置を、「詳細な説明」の末尾の表Ｉ
に示す。
実施例4:PCR断片のサザンハイブリダイゼーション
実施例３で得られたPCR生成物を熱変性させ、例えば
当業者に公知のスロット−ブロット法を用いてナイロン
膜上に塗布する。このDNAをナイロン膜上で架橋する。
ハイブリダイゼーションプローブは、当業者に公知の方
法（例えば、ニックトランスレーションまたはランダム
プライミング）を用い、ジゴキシゲニンで標識したヌク
レオチドを組み込むことにより標識する。
当業者に公知のスロット−ブロット法を用いてナイロン
膜上に塗布する。このDNAをナイロン膜上で架橋する。
ハイブリダイゼーションプローブは、当業者に公知の方
法（例えば、ニックトランスレーションまたはランダム
プライミング）を用い、ジゴキシゲニンで標識したヌク
レオチドを組み込むことにより標識する。
膜上に固定化したDNAを、まず0.4N NaOHで20分間変性
させた後、2xSSPE（1xSSPE＝150mM NaCl、10mM二水素リ
ン酸ナトリウム、1mM EDTA、pH7.7）で中和する。この
膜のプレハイブリダイゼーションは、6xSSPE、5xデンハ
ルト溶液、0.1％Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム、
0.02％SDS中で、42℃にて20分間行う。
させた後、2xSSPE（1xSSPE＝150mM NaCl、10mM二水素リ
ン酸ナトリウム、1mM EDTA、pH7.7）で中和する。この
膜のプレハイブリダイゼーションは、6xSSPE、5xデンハ
ルト溶液、0.1％Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム、
0.02％SDS中で、42℃にて20分間行う。
その後、ハイブリダイゼーションを、30pMのジゴキシ
ゲニン化ハイブリダイゼーションプローブを添加した前
記ハイブリダイゼーション溶液中で、42℃にて20分間行
う。用いるハイブリダイゼーションプローブは、別個の
連続した、またはいくらかの一致を有する、配列番号５
〜８の配列の１または数個である。
ゲニン化ハイブリダイゼーションプローブを添加した前
記ハイブリダイゼーション溶液中で、42℃にて20分間行
う。用いるハイブリダイゼーションプローブは、別個の
連続した、またはいくらかの一致を有する、配列番号５
〜８の配列の１または数個である。
ハイブリダイゼーションの特異性は、後に続く洗浄工
程により決定する。第一に、２回の洗浄工程を42℃にて
５分間、2xSSPE、0.1％SDS中で行う。次ぎに、２回の洗
浄工程を6xSSPE、１％SDS中で各７分間行い、洗浄温度
はおよそ、好ましくは厳密にTm値より１℃低くする。
程により決定する。第一に、２回の洗浄工程を42℃にて
５分間、2xSSPE、0.1％SDS中で行う。次ぎに、２回の洗
浄工程を6xSSPE、１％SDS中で各７分間行い、洗浄温度
はおよそ、好ましくは厳密にTm値より１℃低くする。
ハイブリダイゼーションプローブの融解温度、および
ハイブリダイゼーションプローブにより検出可能な塩基
置換を表Ｉに示す。
ハイブリダイゼーションプローブにより検出可能な塩基
置換を表Ｉに示す。
ハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列
が、正確にPCR断片の対応配列と適合しなければ、その
ハイブリダイゼーションプローブはこの工程で洗い去ら
れる。
が、正確にPCR断片の対応配列と適合しなければ、その
ハイブリダイゼーションプローブはこの工程で洗い去ら
れる。
その後、検出反応を行う；これはジゴキシゲニン化し
たハイブリダイゼーションプローブが膜上に存在するか
否かを決定する。これは、the Boehringer Mannheim co
mpanyの製造者のプロトコールに従う方法で、酵素複合
化抗ジゴキシゲニン抗体を用いて行う。次いで、この酵
素は不溶性有色複合体の生成する反応を触媒する。
たハイブリダイゼーションプローブが膜上に存在するか
否かを決定する。これは、the Boehringer Mannheim co
mpanyの製造者のプロトコールに従う方法で、酵素複合
化抗ジゴキシゲニン抗体を用いて行う。次いで、この酵
素は不溶性有色複合体の生成する反応を触媒する。
配列番号５〜８の配列を有する特異的ハイブリダイゼ
ーションプローブの１つが、特異的に臨床試料由来の菌
DNAとハイブリダイズすれば、その患者は、アゾール誘
導体に耐性を持つ菌細胞を含んでいる。従って、アゾー
ル誘導体抗菌薬での治療は、この種の菌細胞による感染
に対しては不適当であり、カンジダ感染を中和するため
には、違う治療を施さなければならない。
ーションプローブの１つが、特異的に臨床試料由来の菌
DNAとハイブリダイズすれば、その患者は、アゾール誘
導体に耐性を持つ菌細胞を含んでいる。従って、アゾー
ル誘導体抗菌薬での治療は、この種の菌細胞による感染
に対しては不適当であり、カンジダ感染を中和するため
には、違う治療を施さなければならない。
配列表
配列番号１
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル:YES
配列
配列番号２
配列の長さ:19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル:YES
配列
配列番号３
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル:YES
配列
配列番号４
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル:YES
配列
配列番号５
配列の長さ:30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル:YES
配列
配列番号６
配列の長さ:28
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル:YES
配列
配列番号７
配列の長さ:30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル:YES
配列
配列番号８
配列の長さ:32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル:YES
配列
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．17，Ｎｏ．２,
ｐ．804（1989)
Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ．108，Ｎｏ.
２，ｐ．338−347（1990)
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ
ａｃｔ．，Ｖｏｌ．18，ｐ．56−59
（1990)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00
C12Q 1/68
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
Claims (17)
- 【請求項１】臨床試料におけるアゾール誘導体耐性菌細
胞の検出法であって、 ａ）臨床試料由来の菌特異的核酸を抽出した後、 ｂ）菌特異的核酸をアゾール誘導体耐性菌の核酸セグメ
ントに向けられたハイブリダイゼーションプローブとハ
イブリダイズさせる。 工程を含んでなり、 ハイブリダイゼーションプローブが14−α−ラノステノ
ールデメチラーゼ遺伝子由来のDNAセグメントに対して
向けられ、 工程ａ）と工程ｂ）の間に、14−α−ラノステノールデ
メチラーゼ遺伝子のセグメントを増幅するPCR反応を行
い、 PCR反応でプライマー対として配列番号１および配列番
号２のヌクレオチド配列または配列番号３および配列番
号４のヌクレオチド配列を用いる検出法。 - 【請求項２】ハイブリダイゼーションプローブがカンジ
ダ・アルビカンス（Candida albicans）種の14−α−ラ
ノステノールデメチラーゼ遺伝子（ERG16遺伝子）由来
のDNAセグメントに対して向けられている、請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】工程ｂ）でハイブリダイゼーションプロー
ブとして配列番号５〜８の１以上のヌクレオチド配列を
用いる、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】工程ｂ）で、ハイブリダイゼーションをジ
ゴキシゲニンで標識し、次いでサザンハイブリダイゼー
ションで用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項５】ハイブリダイゼーション後、用いる特定の
ハイブリダイゼーションプローブの融解温度（Tm）より
もおよそ１℃低い温度で少なくとも１回の洗浄工程を行
う、請求項３または４記載の方法。 - 【請求項６】配列番号１のヌクレオチド配列。
- 【請求項７】配列番号２のヌクレオチド配列。
- 【請求項８】配列番号３のヌクレオチド配列。
- 【請求項９】配列番号４のヌクレオチド配列。
- 【請求項１０】配列番号５のヌクレオチド配列。
- 【請求項１１】配列番号６のヌクレオチド配列。
- 【請求項１２】配列番号７のヌクレオチド配列。
- 【請求項１３】配列番号８のヌクレオチド配列。
- 【請求項１４】請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
法における、プライマーとしての配列番号１および配列
番号２のヌクレオチド配列、ならびにハイブリダイゼー
ションプローブとしての配列番号５および／または配列
番号６のヌクレオチド配列の使用。 - 【請求項１５】請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
法における、プライマーとしての配列番号３および配列
番号４のヌクレオチド配列、ならびにハイブリダイゼー
ションプローブとしての配列番号７および／または配列
番号８のヌクレオチド配列の使用。 - 【請求項１６】請求項６〜13の配列番号１〜８のヌクレ
オチド配列の１以上を含む、アゾール誘導体耐性菌株に
よる菌感染の分析用キット。 - 【請求項１７】請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
法を行うためのキット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19643486A DE19643486C1 (de) | 1996-10-22 | 1996-10-22 | Nachweis von resistenten Pilzzellen in klinischem Material |
| DE19643486.6 | 1996-10-22 | ||
| PCT/EP1997/005454 WO1998017825A1 (de) | 1996-10-22 | 1997-10-04 | Verfahren zum nachweis von resistenten pilzzellen in klinischem material |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000516100A JP2000516100A (ja) | 2000-12-05 |
| JP3447302B2 true JP3447302B2 (ja) | 2003-09-16 |
Family
ID=7809396
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51888298A Expired - Fee Related JP3447302B2 (ja) | 1996-10-22 | 1997-10-04 | 臨床試料における耐性菌細胞の検出法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0948642A1 (ja) |
| JP (1) | JP3447302B2 (ja) |
| AU (1) | AU731424B2 (ja) |
| CA (1) | CA2268791A1 (ja) |
| DE (1) | DE19654946A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| CA2623181A1 (en) | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Advandx, Inc. | Reagents, methods and kits for selection of anti-fungal therapy for candida species fung i |
| WO2010040374A1 (en) * | 2008-10-10 | 2010-04-15 | Stichting Ter Bevordering Van De Farmacodynamiek | Method for determining the resistance status of fungi and yeasts, in particular of aspergillus fumigatus |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2089665A1 (en) * | 1990-08-16 | 1992-02-17 | Glenn D. Hoke | Inhibition of candida |
| US5426026A (en) * | 1993-09-15 | 1995-06-20 | University Of Pittsburgh | PCR identification of four medically important candida species using one primer pair and four species-specific probes |
-
1996
- 1996-10-22 DE DE19654946A patent/DE19654946A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-10-04 CA CA002268791A patent/CA2268791A1/en not_active Abandoned
- 1997-10-04 EP EP97909359A patent/EP0948642A1/de not_active Withdrawn
- 1997-10-04 JP JP51888298A patent/JP3447302B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-04 AU AU47074/97A patent/AU731424B2/en not_active Ceased
- 1997-10-04 WO PCT/EP1997/005454 patent/WO1998017825A1/de not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔ．，Ｖｏｌ．１８，ｐ．５６−５９（１９９０） |
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２，ｐ．８０４（１９８９） |
| Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．２，ｐ．３３８−３４７（１９９０） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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