DE19654946A1 - Verfahren zum Nachweis von resistenten Pilzzellen in klinischem Material - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von resistenten Pilzzellen in klinischem Material.

Das Interesse allgemein an Verfahren zum Nachweis von Pilz­ zellen ist vor dem Hintergrund zu sehen, daß insbesondere in den letzten Jahren Pilzspezies als nosokomiale Pathogene eine erhebliche Bedeutung bei immunsupprimierten Patienten erlangt haben.

Die bisher bekannten Verfahren zur Analyse von Pilzinfektionen zielen vor allem darauf ab, eine Diagnose der Pilzinfektion und eine Identifizierung der pathogenen Pilzspezies zu ermöglichen. Dazu bedient man sich z. B. einer Anzüchtung von Pilzspezies aus klinischem Material auf geeigneten Nährmedien und ggf. mole­ kularbiologischer Verfahren.

Zu den medizinisch bedeutsamsten fakulativ pathogenen Pilz­ gattungen zählt die zu den Fungi imperfecti gehörende Gattung Candida. Sie ruft die sogenannten Candida-Mykosen, auch Candi­ dosen genannt, hervor. Der wichtigste Erreger innerhalb der Gattung Candida ist dabei die Spezies Candida albicans, die ne­ ben den meist weniger schwerwiegend verlaufenden Infektionen der Haut und Schleimhäute auch tiefe Organ-Mykosen oder System-Mykosen hervorruft. Unter System-Mykosen versteht man Pilzin­ fektionen, von denen nicht nur die Haut oder Schleimhäute, son­ dern auch weitere Organe, Organsysteme oder sogar der ganze Or­ ganismus betroffen sind. Im letzteren Fall spricht man auch von "generalisierten" Pilzinfektionen.

Der Erregernachweis bei System-Mykosen ist außerordentlich pro­ blematisch und erfolgt in der Praxis häufig erst post mortem. Eine wesentliche Verbesserung haben hier molekularbiologische Analyseverfahren gebracht, mit deren Hilfe es möglich ist, schnell und zuverlässig Pilzinfektionen nachzuweisen und ver­ schiedene Pilzspezies voneinander zu unterscheiden.

In der Veröffentlichung "Rapid, polymerase chain reaction-based identification assays for Candida species" von Niesters et al. (1993), Journal of Clinical Microbiology, Seiten 904 bis 910, wird ein auf der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) beruhendes Verfahren beschrieben, mit dem ver­ schiedene Candida-Spezies nachgewiesen und differenziert werden können.

Bei diesem Verfahren werden die Pilz-spezifischen Nukleinsäuren zunächst aus klinischem Material extrahiert und danach weiter analysiert. Zur Analyse wird der 18ssuRNA-Genbereich näher un­ tersucht. Mit Hilfe geeigneter Primer wird dazu ein Abschnitt dieses Genbereichs in der PCR amplifiziert und die daraus her­ vorgehenden PCR-Produkte werden entweder sequenziert, mit Hilfe von Restriktionsenzymen analysiert oder mit spezifischen Hybri­ disierungssonden hybridisiert. Im letzteren Fall werden die Hy­ bridisierungssonden durch Einbau radioaktiver Nukleotide mar­ kiert und durch Autoradiographie nachgewiesen. Aufgrund der Se­ quenzen, der Restriktions- oder Hybridisierungsmuster können dann verschiedene Candida-Spezies voneinander unterschieden werden.

Ein weiteres Verfahren, mit dem Candida albicans-Infektionen diagnostiziert werden können, ist in der Veröffentlichung "Detection of surgical pathogens by in vitro DNA amplifi­ cation. Part I. Rapid identification of Candida albicans by in vitro amplification of a fungus pecific gene" von Buchman et al. (1990), Surgery 108, Seiten 338 bis 347, beschrieben.

Bei diesem Verfahren erfolgt der Nachweis einer Candida albi­ cans-Infektion durch PCR-Amplifikation eines anderen Pilz­ spezifischen Genbereiches, nämlich des Gens für das Enzym 14-α- Lanosterol-Demethylase.

Die PCR-Produkte werden hier nicht durch Hybridisierung, son­ dern durch Auftrennung im Agarose-Gel und Anfärbung der DNA mit Ethidiumbromid nachgewiesen.

In beiden oben beschriebenen Verfahren werden molekularbiolo­ gische Techniken dazu eingesetzt, Pilzinfektionen in Patienten­ material nachzuweisen und, wie in der Publikation von Niesters beschrieben, zusätzlich verschiedene Spezies der Gattung Candi­ da voneinander zu unterscheiden.

Ein weiteres, auf molekularbiologischen Techniken beruhendes Verfahren zur Therapie und zum Nachweis von Candida-Infektionen ist in der WO 92/03455 beschrieben. Hier werden Antisense-Oli­ gonukleotide vorgeschlagen, also solche Oligonukleotide, die spezifisch mit mRNAs hybridisieren. Eine der hier vorge­ schlagenen Target-mRNAs ist die Cytochrom P450-Lanosterol-14-α- Demethylase-mRNA. Diese Oligonukleotide sollen vornehmlich zur Therapie, also zur Bekämpfung von Candida-Infektionen einge­ setzt werden. Dazu sollen sie direkt dem mit Candida infizier­ ten menschlichen oder tierischen Körper verabreicht werden und dort in vivo die Aktivität der Candida-Zellen beeinflussen.

In Chemical Abstracts 126 Nr. 11, 1996, Abstract 133745t wird über auf PCR beruhenden Verfahren zum Nachweis von Non-albicans Candida-Spezies berichtet. Unter anderem werden PCR-Primer er­ wähnt, die komplementär zu dem Lanosterol-14-α-Demethylase-Gen der Spezies C. glabrata, C. krusei und C. tropicalis sind.

In Chemical Abstracts 124 Nr. 4, 1996, Abstract 50359y werden Untersuchungen zu den Auswirkungen der Deletion des 14-α- Methylstyrol-Demethylase-Gens von C. glabrata auf die Lebensfä­ higkeit und weitere Eigenschaften dieser Candida-Spezies vorge­ stellt.

In Chemical Abstracts 122, 1995, Abstract 2077s wird ein auf PCR beruhendes Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von verschiedenen Candida-Spezies in klinischen Proben be­ schrieben. Mit den Spezies-spezifischen Primern werden Bereiche des Cytochrom P450-L1A1-Gens der Candida-DNA amplifiziert.

In Chemical Abstracts 118, 1993, Abstract 206705x werden Unter­ suchungen zu dem Lanosterol-14-α-Demethylase-Gen und seiner Re­ gulation in Saccharomyces cerevisiae vorgestellt.

Aus dem Stand der Technik sind somit Verfahren bekannt, die sich auf den Nachweis und ggf. die Identifizierung von Candida-Spezies bei Pilzinfektionen beziehen. Der spezifische Nachweis bestimmter Eigenschaften der Pilz-Spezies, bspw. einer Anti­ mykotika-Resistenz, ist mit den bekannten Verfahren jedoch nicht möglich.

Ist eine systemische Pilzinfektion einmal nachgewiesen, so kann sie mit verschiedenen Antimykotika, also das Wachstum von Pil­ zen hemmenden Mitteln, bekämpft werden. Die zur systemischen Anwendung eingesetzten Wirkstoffe sind dabei Azolderivate, das Polyen Amphotericin B, Flucytosin, Griseofulvin und Terbinafin. Dabei sind die überlicherweise eingesetzten Antimykotika die Azolderivate, zu denen bspw. das Fluconazol gehört.

Durch den häufigen Einsatz dieser Klasse der Antimykotika bil­ den sich in jüngster Zeit resistente Pilzstämme aus, deren Wachstum mit diesen Therapeutika nicht mehr gehemmt werden kann. Von dem Einsatz dieses Mittels kann jedoch nicht allge­ mein abgesehen werden, da es neben der guten Wirksamkeit gegen System-Mykosen im Gegensatz zu den anderen Antimykotika nur ge­ ringe und darüber hinaus harmlose Nebenwirkungen hervorruft. Das wesentliche Problem dabei ist, daß solche Resistenzen nicht frühzeitig erkannt werden können, da keine schnellen Tests zur Überprüfung des Vorliegens von resistenten Pilzzellen zur Ver­ fügung stehen.

So werden zunächst Azolderivate als "Mittel der Wahl" gegeben, wobei dann nur daraus, daß sich beim Patienten trotz hoher Do­ sierung und langanhaltender Behandlung keine Besserung ein­ stellt, geschlossen werden kann, daß er mit Azolderivat­ resistenten Pilzzellen infiziert ist. Häufig wird diese Diagno­ se erst dann gestellt, wenn der Infektionsverlauf beim Patien­ ten trotz Behandlung mit den hier jedoch unwirksamen Azolderi­ vaten einen dramatischen Verlauf nimmt.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfin­ dung, ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zu schaffen, mit dem gegen Azolderivate resistente Pilzzellen spezifisch nachgewiesen werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den folgenden Schritten gelöst:

• a) Extraktion von Pilz-spezifischen Nukleinsäuren aus klinischem Material; und
• b) Hybridisierung der Pilz-spezifischen Nukleinsäuren mit Hybridisierungssonden, die gegen Nukleinsäure­ abschnitte aus Azolderivat-resistenten Pilzzellen gerichtet sind.

Durch die Hybridisierung Pilz-spezifischer Nukleinsäuren mit Hybridisierungssonden, die spezifisch Nukleinsäureabschnitte aus Azolderivat-resistenten Pilzzellen, nicht jedoch solche aus Azolderivat-sensitiven Pilzzellen erkennen, wird das Auffinden resistenter Pilzstämme jetzt einem schnellen, reproduzierbaren und einfach durchzuführenden molekularbiologischen Verfahren zugänglich gemacht. Damit kann in kurzer Zeit und ausgehend von geringen Mengen klinischen Materials ein Nachweis erfolgen. Bei positivem Befund, also dem Vorliegen resistenter Pilzstämme, kann dann auf ein anderes Antimykotikum übergegangen werden, mit dem die Pilzinfektion letztlich bekämpft wird.

Zu diesem Verfahren können Pilz-spezifische Nukleinsäuren vor­ zugsweise aus Blut, jedoch auch aus Biopsiematerial, Sputum, Schleimhautabstrichen oder sonstigem Patientenmaterial extra­ hiert werden.

Dabei kann entweder die Pilz-spezifische DNA oder RNA isoliert werden, die dann durch DNA/DNA-, DNA/RNA- oder RNA/RNA-Hybridi­ sierung nachgewiesen werden.

Es ist möglich, die Hybridisierung in Lösung oder an festen Trägern, wie beispielsweise Membranen oder Säulen, nachzuwei­ sen, wobei die verwendeten Hybridisierungssonden radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert und dann die spezifische Hybri­ disierung durch Autoradiographie bzw. Enzym-katalysierte Far­ breaktionen detektiert werden.

Somit wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe vollkom­ men gelöst.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn die Hybridisierungssonden gegen einen DNA-Abschnitt aus dem 14-α- Lanosterol-Demethylase-Gen gerichtet sind.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten nämlich zeigen, daß bei Pilzspezies, die eine Resistenz gegenüber Azolderivaten aufweisen, Mutationen in dieser Genregion der Pilz-DNA auftre­ ten, die überraschenderweise hochsignifikant mit dem klinischen und mikrobiologischen Befund einer Azolderivat-Resistenz korre­ lieren.

Eine mögliche Erklärung für diese Korrelation geht von der Er­ kenntnis aus, daß die Azolderivate die Ergosterolsynthese von Pilzen hemmen. Ergosterol ist ein Steroid, das in das sogenann­ te Plasmalemma, die Phospholipidschicht, die der Zellwand der Pilze innen anhaftet, eingelagert wird. Ergosterol wird in der Zelle aus Lanosterol, einer Vorstufe, synthetisiert. Der ent­ scheidende Schritt bei der Ergosterolsynthese aus Lanosterol wird von dem Enzym 14-α-Lanosterol-Demethylase, kurz 14-DM, ka­ talysiert.

Da das Ergosterol ein essentieller Baustein des Plasmalemmas ist, kann in Abwesenheit von Ergosterol keine Zellteilung mehr stattfinden. Für Zellteilungen ist immer eine Neusynthese von Zellwand und Plasmalemma notwendig.

Weil das Steroid Ergosterol spezifisch bei Pilzen, nicht jedoch bei menschlichen Zellen oder Bakterien auftritt, kann die Inhi­ bition der für das Wachstum der Pilzzellen essentiellen Er­ gosterol-Synthese erfolgreich zur Bekämpfung von Pilzin­ fektionen eingesetzt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist somit von Vorteil, daß Hybridisierungs-Sonden gegen das Gen eingesetzt werden, das für das Protein codiert, an dem die Azolderivate direkt angreifen. Bei den resistenten Pilzzellen treten in diesem Gen gehäuft Än­ derungen der Nukleinsäure-Sequenz auf. Die spezifischen Hybri­ disierungssonden sind dann so ausgelegt, daß sie diese Sequenz­ änderungen erkennen, also nur an Genabschnitte von Pilzzellen binden, die eine Resistenz gegen Azolderivate aufweisen.

Bei diesem Verfahren ist es weiterhin bevorzugt, wenn die Hy­ bridisierungssonden gegen einen DNA-Abschnitt aus dem 14-α- Lanosterol-Demethylase-Gen der Spezies Candida albicans gerich­ tet sind. Dieses Gen wird bei Candida albicans auch ERG16-Gen genannt.

Hierbei ist von Vorteil, daß die Hybridisierungssonden es mög­ lich machen, resistente Stämme der am weitesten verbreiteten pathogenen Pilzspezies, nämlich Candida albicans, zu diagnosti­ zieren.

In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zwischen Schritt a) und b) eine PCR-Reaktion durchgeführt, in der Abschnitte des 14-α-Lanosterol-Demethylase-Gens amplifi­ ziert werden.

Diese Maßnahme hat also den Vorteil, daß das Verfahren sowohl an Sensitivität als auch an Spezifität gewinnt, da große Mengen an Ausgangsmaterial erzeugt werden, in dem spezifisch nur der benötigte Genabschnitt enthalten ist. Das mit PCR amplifizierte Material wird dann z. B. in die Southern-Hybridisierung ein­ gesetzt.

Es ist von Vorteil, wenn in der PCR-Reaktion als Primerpaare Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 oder Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 3 und SEQ ID-No: 4 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll eingesetzt werden.

Dabei ist vorteilhaft, daß nach Erkenntnis der Erfinder mit diesen Primerpaaren DNA-Abschnitte amplifiziert werden, in de­ nen für resistente Pilzspezies charakteristische DNA-Sequenzen enthalten sind. Die dabei entstehenden Amplifikationsprodukte sind deutlich kürzer als das ganze Gen und ermöglichen somit eine einfachere Weiterverarbeitung.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es weiterhin vorteil­ haft, wenn in Schritt b) eines oder mehrere der Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 5 bis 8 des beiliegenden Sequenzprotokolls als Hybridisierungssonden eingesetzt werden.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, daß mit diesen Hybridisierungssonden überraschenderweise resi­ stente Candida-Spezies, deren Resistenz nur durch jeweils einen einzelnen Basenaustausch im ERG16-Gen zustandegekommen ist, von sensitiven Stämmen, die diese Mutation nicht aufweisen, unter­ schieden werden können.

In einer vorteilhaften Ausführung werden in Schritt b) die Hy­ bridisierungssonden mit Digoxigenin markiert und in die Southern-Hybridisierung eingesetzt. Der Nachweis einer spezifi­ schen Hybridisierung erfolgt dann durch Enzym-konjugierte Anti-Digoxigenin-Antikörper, wobei die Enzyme Farbreaktionen kataly­ sieren.

Hierbei ist von Vorteil, daß die Markierung der Hybridisie­ rungssonden nicht radioaktiv erfolgen muß. Außerdem können gro­ ße Mengen an Hybridisierungssonden gleichzeitig markiert wer­ den, die dann aliquotiert und bei -20°C gelagert werden können, da sie über lange Zeit stabil sind. Für die individuellen Nach­ weisreaktionen können dann Aliquots aus der gleichen Markie­ rungsreaktion aufgetaut und eingesetzt werden, so daß eine hohe Reproduzierbarkeit über lange Zeiträume hinweg gewährleistet ist.

Selbstverständlich sind jedoch auch radioaktive Markierungs­ methoden und weitere nicht-radioaktive Markierungsmethoden, wie bspw. die Markierung mit Biotin möglich.

Bei der Southern-Hybridisierung ist vorteilhaft, daß die zu analysierende Nukleinsäure schnell auf eine Membran, bspw. eine Mikrozellulose- oder Nylonmembran aufgebracht werden kann. Die schnellste Methode ist dabei die dem Fachmann geläufige "Blot- Blot" oder "Dot-Blot"-Methode.

Es ist jedoch auch möglich, die zu analysierende DNA zunächst im Agarose-Gel aufzutrennen und erst dann auf die Membran zu transferieren.

Die Pilz-DNA kann direkt, oder zuvor durch PCR amplifiziert in die Southern-Hybridisierung eingesetzt werden.

Es versteht sich jedoch, daß es auch möglich ist, Pilz-spezi­ fische RNAs zu analysieren. Diese können entweder direkt aus dem Zytoplasma von Pilzzellen isoliert werden, oder erst durch Reverse Transkription hergestellt werden. Die Analyse kann dann durch Northern-Blot oder weitere RNA-Nachweisreaktionen erfol­ gen.

Die Hybridisierung muß nicht auf Membranen, wie bspw. bei Southern- oder Northern-Hybridisierung, erfolgen, sondern kann auch in Lösung oder an Säulen durchgeführt werden.

Wenn in Schritt b) die Hybridisierungssonden mit den Nuklein­ säure-Sequenzen SEQ ID-No: 4 bis 8 eingesetzt werden, ist es vorteilhaft, wenn nach dem Hybridisieren ein Waschschritt bei einer Temperatur durchgeführt wird, die um ca. 1°C unter der Schmelztemperatur (Tm) der jeweils eingesetzten Hybridisie­ rungssonde liegt.

Hierbei ist von Vorteil, daß in diesem Waschschritt wegen der relativ hohen Temperatur nur solche Doppelstrang-Regionen sta­ bil sind, die keine Fehlpaarung aufweisen. Somit werden alle gepaarten Hybridisierungssonden, deren DNA-Sequenzen nicht völ­ lig mit dem entsprechenden Pilz-DNA-Abschnitt übereinstimmen, in dem Waschschritt weggewaschen und geben daher in der Nach­ weisreaktion kein Signal mehr. Ein Signal wird auf diese Art und Weise nur dann erhalten, wenn die Pilz-DNA aus einer resi­ stenten Pilzzelle stammt, in der die Mutation enthalten ist.

Auf diese Weise ist es also möglich, mit Hilfe der spezifischen Hybridisierungssonden Genabschnitte zu unterscheiden, die nur in einer einzigen Base voneinander abweichen.

Es ist ferner vorteilhaft, wenn die Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 1 und 2 als Primer für die PCR-Reaktion und die Nukleotid­ sequenzen SEQ ID-No: 5 und/oder 6 als Hybridisierungssonden in das Verfahren zur Detektion von Azolderivat-resistenten Pilz­ zellen eingesetzt werden.

Außerdem ist von Vorteil, wenn die Oligonukleotide mit den Nu­ kleotidsequenzen SEQ ID-No: 3 und 4 als Primer und die Oligonu­ kleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 7 oder 8 als Hy­ bridisierungssonden in das erfindungsgemäße Verfahren einge­ setzt werden.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß auf diese Art und Weise zu­ nächst in der PCR ohne Schwierigkeiten amplifizierbare, leicht handhabbare DNA-Fragmente von 300-400 Basenpaaren in großen Mengen bereitgestellt werden, und danach die ggf. in diesen PCR-Fragmenten enthaltenen Basenaustausche mit den Hybridi­ sierungssonden identifiziert werden können.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten nämlich zeigen, daß in Azolderivat-resistenten Pilzstämmen eine Reihe von ein­ zelnen Basenaustauschen gegenüber den Azolderivat-sensitiven Pilzstämmen auftreten. So führt ein Basenaustausch von T nach G im ERG16-Gen dazu, daß die Aminosäure Phenylalanin Nr. 105 des Enzyms 14-DM zu einem Leucin mutiert wird. Dieser T/G-Austausch ist auf Genebene mit Hilfe der Hybridisierungssonde mit der Nu­ kleotidsequenz SEQ ID-No: 5 nachzuweisen. Weiterhin haben die Erfinder erkannt, daß bei resistenten Pilzstämmen ein Basenaus­ tausch von A nach °C auftreten kann, wodurch die Aminosäure Glutamin Nr. 142 zu einem Prolin mutiert wird. Diese Mutation ist mit Hilfe der Hybridisierungssonde mit der Nukleotidsequenz SEQ ID-No: 6 detektierbar. Darüber hinaus wurden zwei weitere Basenaustausche, beide von G nach A, gefunden. Dies führt dazu, daß das Glycin Nr. 464 der 14-DM zu einem Serin und das Valin Nr. 488 zu einem Isoleucin mutiert wird. Diese beiden Punkt­ mutationen werden mit den Hybridisierungssonden mit den Nukleo­ tidsequenzen SEQ ID-No: 7 bzw. 8 nachgewiesen.

Da resistente Pilzstämme auf dem spezifisch amplifizierten PCR-Fragment entweder eine oder mehrere der Basenaustausche ent­ halten, ist es vorteilhaft, wenn die entsprechenden Hybridi­ sierungssonden gleichzeitig in die Southern-Hybridisierung ein­ gesetzt werden. Bei einem positiven Signal liegt dann in jedem Fall eine resistente Pilzspezies vor. Wird nur mit einer der Hybridisierungssonden hybridisiert, so kann man nachweisen, welche Mutation bei diesem resistenten Pilzstamm aufgetreten ist und ob eine oder mehrere Mutationen vorliegen.

Es versteht sich jedoch, daß als Primer auch die Oligonukleoti­ de mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 4 kombiniert werden können, so daß dann auf dem amplifizierten PCR-Fragment von ca. 1.400 Basenpaaren alle mit den Hybridisie­ rungssonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 5 bis 8 de­ tektierbaren Mutationen enthalten sind.

Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Analyse von Pilzin­ fektionen mit Azolderivat-resistenten Pilzstämmen.

In dem Kit können sämtliche erforderlichen Lösungen zur Durch­ führung der PCR-Reaktion und der Hybridisierung, auch die Pri­ mer und Hybridisierungssonden, enthalten sein. Dadurch wird es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren auch in einem Routi­ nelabor von angelernten Kräften durchführen zu lassen. Außerdem kann das Verfahren schnell und ohne langwierige Vorbereitungen mit hoher Reproduzierbarkeit durchgeführt werden, wenn alle be­ nötigten Stoffe für viele Reaktionen in dem Kit bereitgestellt werden.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschrei­ bung.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachste­ hend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils an­ gegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Beispiele für die Durchführung der einzelnen Verfahrensschritte sind in der folgenden Beschreibung angegeben.

Beispiel 1 Anzucht von Candida albicans-Stämmen

Zur Analyse und zum Vergleich resistenter Candida albicans-Stämme mit sensitiven Candida albicans-Stämmen werden Patien­ ten-Material oder Hefe-Proben für 48 Stunden bei 30°C auf einem zur Hefeanzucht standardmäßig verwendeten Medium, dem Sabou­ raud-Glukose-Agar, bebrütet. Danach werden mehrere Kolonien ab­ geimpft und in steriler 0,9%iger Natriumchloridlösung aufge­ nommen.

Beispiel 2 Aufschließen der Pilzzellen und Isolation der Pilz-DNA

Der Aufschluß der Pilzzellen erfolgt durch alkalische Lyse (50 mM NaOH, 10 Minuten, 95°C) und darauf folgende Neutrali­ sation und enzymatische Behandlung mit Zymolyase der Firma Sig­ ma. Die Denaturierung der Proteine wird in Tris/EDTA und 10%iger SDS-Lösung bei 65°C durchgeführt.

In der nunmehr vorliegenden Lösung befinden sich Trümmer der Pilzzellen sowie freie Pilz-DNA, die nun isoliert werden muß.

Hierzu erfolgt zunächst eine Proteinpräzipitation mit 5 M Kali­ umacetat und eine Fällung der DNA durch Zugabe von eiskaltem Isopropanol. Das Fällungsprodukt wird für die weiteren Ver­ fahrensschritte verwendet.

Beispiel 3 Amplifikation eines DNA-Fragmentes aus dem ERG16-Gen

Die PCR-Reaktion dient dazu, zunächst Abschnitte aus dem ERG16-Gen zu amplifizieren, an die die spezifischen Hybridisierungs­ sonden binden. So wird das insgesamt 1851 bp lange ERG16-Gen in leicht handhabbare und ohne Schwierigkeiten in der PCR amplifi­ zierbare Abschnitte unterteilt.

Wenn als Hybridisierungssonde die DNA-Sequenz SEQ ID-No: 5 und/oder 6 eingesetzt werden soll, wird eine PCR mit Primern mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 1 (Upstream Primer) und 2 (Downstream Primer) durchgeführt.

Mit den genannten Primern wird dann ein PCR-Produkt erhalten, das den Bereich von Base 379 bis Base 676, also ca. 300 Basen­ paare des ERG16-Gens umfaßt.

Wenn als Hybridisierungssonden die DNA-Sequenzen SEQ ID-No: 7 und/oder 8 eingesetzt werden sollen, werden in die PCR Primer mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 3 (Upstream Primer) und 4 (Downstream Primer) eingesetzt.

Mit diesen Primern wird der Bereich von Base 1360 bis Base 1774 des ERG16-Gens, also ein ca. 400 Basenpaar-Fragment, ampli­ fiziert.

Die PCR-Bedingungen sind dabei die folgenden:

Puffer (50 µl):
10 mM Tris pH 9,6
50 mM NaCl
10 mM MgCl₂
0,2 mg/ml BSA
Polymerase
je 0,5 mM Nukleotide
je 100 pM Primer
Anfängliche Denaturierung: 3 min bei 94°C
Zyklus-Denaturierung: 0,5 min bei 94°C
Annealing: 1 min bei 62°C
Extension: 2 min bei 72°C
Terminale Extension: 5 min bei 72°C
Zykluszahl: 34.

Die hohe Magnesiumkonzentration im Puffer sorgt für eine hohe Spezifität der Polymerase, die mit 72°C im Extensions-Schritt bei ihrem Temperaturoptimum arbeiten kann.

Durch die PCR-Reaktionen wird Ausgangsmaterial in genügend gro­ ßer Menge erhalten, um nun weiter zu analysieren, ob die DNA aus resistenten oder sensitiven Pilzzellen stammt.

Die Lage der Primer und der Hybridisierungssonden auf dem ERG16-Gen sind in der am Schluß der Beschreibung aufgeführten Tabelle I enthalten.

Beispiel 4 Southern-Hybridisierung der PCR-Fragmente

Die in Beispiel 3 erhaltenen PCR-Produkte werden hitzedenatu­ riert und auf Nylonmembranen aufgebracht, bspw. in dem dem Fachmann geläufigen Slot-Blot-Verfahren eingesetzt. Auf der Ny­ lonmembran wird die DNA vernetzt. Die Markierung der Hybridi­ sierungssonden erfolgt durch Einbau Digoxigenin-markierter Nu­ kleotide in Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind (bspw. "Nick-translation" oder "Random priming").

Die auf der Membran immobilisierte DNA wird dann zunächst für 20 Minuten mit 0,4 N NaOH denaturiert und danach mit 2 × SSPE (1 × SSPE = 150 mM NaCl, 10 mM Natriumdihydrogenphosphat, 1 mM EDTA, pH 7,7) neutralisiert. Die Prähybridisierung der Membran erfolgt für 20 Minuten in 6 × SSPE, 5 × Denharts-Lösung, 0,1% N-Lauryl-Sarcosin-Na, 0,02% SDS bei 42°C.

Die Hybridisierung wird danach in der oben beschriebenen Prähy­ bridisierungslösung durchgeführt, der 30 pM digoxigenierte Hy­ bridisierungssonde zugesetzt wurde, und zwar für 20 Minuten bei 42°C. Als Hybridisierungssonde werden eine oder mehrere der Se­ quenzen SEQ ID-No: 5 bis 8, einzeln, aufeinanderfolgend oder mehrere zugleich eingesetzt.

Die Spezifität der Hybridisierung wird durch dann erfolgende Waschschritte bestimmt. Die ersten beiden Waschschritte werden für 5 Minuten in 2 × SSPE, 0,1% SDS bei 42°C durchgeführt. Dann werden zwei Waschschritte jeweils für 7 Minuten in 6 × SSPE, 1% SDS durchgeführt, wobei die Waschtemperatur in etwa, vorzugsweise genau um 1°C unter dem Tm-Wert liegt.

Die Schmelztemperaturen der Hybridierungssonden sowie die durch die Hybridisierungssonden detektierbaren Basenaustausche sind in Tabelle I angegeben.

Stimmt die Nukleotidsequenz der Hybridisierungssonde nicht ex­ akt mit der entsprechenden Sequenz des PCR-Fragments überein, so wird die Hybridisierungssonde in diesem Schritt weggewa­ schen.

Anschließend wird die Nachweisreaktion durchgeführt, bei der untersucht wird, ob digoxigenierte Hybridisierungssonde auf der Membran enthalten ist oder nicht. Dies erfolgt in einem Verfah­ ren nach dem Herstellerprotokoll der Firma Boehringer Mannheim mit Hilfe Enzym-konjugierter Anti-Digoxigenin-Antikörper. Das Enzym katalysiert dann eine Reaktion, die zur Erzeugung eines unlöslichen Farbkomplexes führt.

Hat eine der spezifischen Hybridisierungssonden mit den Sequen­ zen SEQ ID-No: 5 bis 8 spezifisch mit der Pilz-DNA aus klini­ schem Material hybridisiert, so sind bei dem Patienten Pilzzel­ len enthalten, die gegen Azolderivate resistent sind. Bei einer Infektion mit solchen Pilzzellen ist eine Therapie mit Azol­ derivat-Antimykotika also sinnlos und die Therapie zur Bekämp­ fung der Candida-Infektion muß umgestellt werden.

Tabelle I

Sequenzprotokoll

Claims (6)

1. Verfahren zum Nachweis von resistenten Pilzzellen in kli­ nischem Material, mit den Schritten:

• a) Extraktion von Pilz-spezifischen Nukleinsäuren aus klinischem Material; und
• b) Hybridisierung der Pilz-spezifischen Nukleinsäuren mit Hybridisierungssonden, die gegen Nukleinsäure­ abschnitte aus Azolderivat-resistenten Pilzzellen gerichtet sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungssonden gegen einen DNA-Abschnitt aus dem 14-α-Lanosterol-Demethylase-Gen gerichtet sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungssonden gegen einen DNA-Abschnitt aus dem 14-α-Lanosterol-Demethylase-Gen (ERG16-Gen) der Spe­ zies Candida albicans gerichtet sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß zwischen Schritt a) und b) eine PCR-Reaktion durchgeführt wird, in der Abschnitte des 14-α- Lanosterol-Demethylase-Gens amplifiziert werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in Schritt b) die Hybridisierungssonden mit Digoxigenin markiert werden und in die Southern-Hybridisierung eingesetzt werden.

6. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der An­ sprüche 1 bis 5.